DE1900492C

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Publication number: DE1900492C
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zu. biochemischen Herstellung von L-Leucin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in assimilierbare Kohlen- und StickstofTquellen, anorganische Salze und Wuc'.isstoffe enthaltenden Nährmedien, die einen Gehalt an Isoleucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin aufweisen, bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten.

!.-'..euciii ist eine Aminosäure, die Lebensmitteln für Menschen und Futtermitteln für Tiere als Nährstoff zugesetzt werden kann.

Es ist bekannt (vgl. japanische Patentschrift 14395/ 63), daß L-Leucin durch Züchten eines Mutanten-Stammes von Micrococcus glutamicus in einem Valin enthaltenden Nährmedium gebildet werden kann; über die erreichbare Ausbeute wurden keine Angaben gemacht. Auch ist bekannt (vgl. Zeitschrift »Amino Acids and Nucleic Acids«, 8 [1964], S. 53), daß die Vermehrungsgeschwindigkeit von Mutantenstämmen von Corynebacterium glutamicum (Synonym für Micrococcus glutamicus) durch Gegenwart von I.·*?- leucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin beachtlich gesteigert werden kann. Schließlich ist bekannt (vgl. britische Patentschrift 1 071 935, französische Patentschrift 1 367 815), daß man Aminosäuren im allgemeinen, insbesondere auch L-Leucin, durch Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquellen enthaltenden Nährmedium herstellen kann; dabei wird mit Brevibacterium flavum ATCC 14067 eine Ausbeute an L-Leucin von 24,4 mg/Liter erreicht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von L-Leuein mit hoher Ausbeute zu schaffen.

Ausgehend von der biochemische!.; Herstellung von L-Leucin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in assimilierbare Kohlen- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und Wuchsstoffe enthaltenden Nährmedien, die einen Gehalt an Isoleucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin aufweisen, bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Cornyebacterium glutamicum ATCC21301 oder ATCC 21335 einsetzt. — Kulturen dieser Mikroorganismen sind für die öffentiichkeit in der »American Type Culture Collection« hinterlegt.

In dem Nährmedium können als Kohlenstoffquellen Fruktose. Mannose, Galaktose, Maltose, Saccharose, Stärkehydrolysat, Melasse, Glycerin, Essigsäure od. dgl. verwendet werden; vorzuziehen ist jedoch die Verwendung von Glukose. Als Stickstoffquellen kommen im wesentlichen Ammoniak, Harnstoff, Ammonsulfat, Ammonchlorid, Ammonacetat oder Ammonsalze von anderen organischen Säuren in Frage. Als anorganische Salze für sind das Nährmedium Eisen-, Mangan-, Magnesium-, Kobalt-, Zink-, Nickel-, Chromsalze u. dgl. ebenso verwendbar wie Phosphorsäureverbindungen. Als Wuchsstoffe können Aminosäuren (Cystin, Cystein, Glutaminsäure), Vitamine (Biotin, Thiamin), Hefeextrakt, handelsübliche Sojabohnenmehl-HydroIysatlösung, Maisquellwasser, Pepton, Eiweißhydrolysat, Fleischextrakt, Hydrolysate mikrobieller Zellen u. dgl. verwendet werden. Die M~nge des zusetzenden Isoleucins, Methionins, Phen\lalanins und/oder Valins hängt von den Zuchtbedingungen und der Art der verwendeten Aminosäuren ab; ah Richtwert wird 50 bis 1000y/ml angegeben.

Die L-Leucin-Fermentation ist unter aeroben Bedingungen durchzuführen. Die Züchtungstemperatur liegt bei 25 bis 40 "C, vorzugsweise zwischen 27 und 37 C. Der pH-We-t wird während des Züchtens zweckmäßigerweise mit Hilfe eines geeigneten Neutralisierungsmittels, wie z. B. Ammoniak, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Harnstoff u. dgl., auf 5,5 bis 8,5 eingestellt. Nach 3- bis otägigem Züchten hat sich das L-Leucin angesammelt. Nach dem Züchten werden die Mikroorganismenzellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Das Filtrat wird beispielsweise durch Behandlung mit einem stark sauren Kationen-Austauscherharz gereinigt, wonach das dabei absorbierte L-Leucin zur Gewinnung von Rohkristallen eluiert, konzentriert und in üblicher Weise gekühlt wird.

Der durch das erfindungsgemäße Verfahren erreichte technische Fortschritt besteht darin, daß das L-Leucin in einer Menge von mehr als 10 mg/ml, also in wesentlich höherer Ausbeute als bei den bekannten Verfahren gewonnen wird.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Ein Nährmedium wurde mit Corynebacterium glutamicum ATCC 21301 beimpft; das Nährmedium enthielt Pepton (lg/dl). Fleischextrakt (lg/dl), Hefeextrakt (0,5 g/dl), Natriumchlorid (0,3 g/dl) und Glukose (2 g/dl); es hatte ein pH von 7,0. Die Züchtung wurde zur Bildung einer Impfkultur 24 Stunden fortgesetzt.

Die Fermentation wurde unter Verwendung eines Nährmediums ausgeführt, das Glukose (10 g/dl), Ammonsulfat (2 g/dl), KH₂PO₁ (0,15 g/dl), K,HPO₄ (0,05 g/dl), MgSO₄-7 HjO (0,05 g/dl), Phenylalanin (150 y/ml), Isoleucin (lOOy/ml), Methionin (100 y/ml), Valin (100 y/ml), Biotin (100 y/ml) und CaCO₃ (2 g/dl) enthielt. Jeweils 20 ml dieses Nährmediums wurden in 250-ml-ErlenmeyerkoIben gefüllt und jeweils sterilisiert. Das sterile Nährmedium in jedem dieser Kolben wurde mit 1 ml der Impfkultur beimpft, deren Herstellung oben beschrieben wurde. Die Fermentation wurde unter 5tägigem Schütteln bei 28°C durchgeführt. Es sammelte sich in dem Fermenta-

tionsmedium jedes Kolbens durchschnittlich eine Menge von 9,5 mg/ml L-Leucin an.

1 Liter Fermentationsmedium wurde gesammelt und zur Entfernung der Mikroorganismenzellen zentrifugiert. Das Filtrat wurde durch eine Harzkolonne, die mit einem handelsüblichen, stark sauren Kationen-Austauscherharz in seiner Η-Form gefüllt war, geschickt. Dann wurde das Harz mit wäßriger 0,2n-Ammoniaklösung gewascüen, um das L-Leucin zu eluieren. Die Fraktionen, die das eluierte L-Leucin enthielten, wurden vereinigt und konzentriert. Nach Stehenlassen erhielt man Rohkristalle (6,5 g) von L-Leucin, welchen man Methanol zusetzte (700 ml, 70gewichtsprozentig). Man erhitzte und ließ dann die Lösung abkühlen. Der erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt und mit Methanol (70gewichtsprozentig) gewaschen, um gereinigtes L-Leucin zu erhalten.

Die analytischen Ergebnisse durch Papierchromatographie uno lutomatische Aminosäure-Analysen bewiesen, daß das L-Leucin, das nach dem obengenannten Verfahren erhalten wurde, ähnliche Eigenschaften aufwies wie L-Leucin, welches man nach bekannten Verfahren erhalten hatte. Das nach dem obengenannten Verfahren erhaltene Produkt war biologisch aktiv und für das Wachstum von Stämmen verwendbar, die für die biologische Prüfung von L-Leucin brauchbar waren. Der Schmelzpunkt lag bei 298° C (zersetzt).

Beispiel 2

Eine Fermentation wurde in ähnlicher Art — wie

im Beispiel 1 beschrieben — ausgeführt, nur mit dem Unterschied, daß ein Medium verwendet wurde, welches Glukose (12 g/dl), Hefeextrakt (0,5 g/dl), Ammonsulfat (2g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HPO₄ (0,05g/dl), MgSo₄-7H₂O (0.05g/dl), IeSO₄-7H₂O (0,002 g/dl), MnSO₄ - 4H_aO (0,002 g/dl), Biotin (50 y/ϊ)

ίο und CaCO₃ (2 g/dl) enthielt.

Die Fermentation wurde 4 Tage lang bei 29 ⁰C durchgeführt. Im Fermentationsmedium eines jeden Kolbens sammelten sich durchschnittlich 11,0 mg/ml L-Leucin an.

B e i s ρ ι e I 3

Eine Fermentation wurde in ähnlicher Art — wie im Beispiel 1 beschrieben — mit dem Unterschied durchgeführt, daß Corynebacterium glutamicum

ao ATCC 21335 und ein Medium verwendet wurden, das FeSo₄ · 7H₂O (0,002 g/dl), MnSo₄ · 4H₂O (0,002 g/dl), Glukose (12 g/dl), Pepton (1 g/dl), Ammonsulfat (2 g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HPO₄ (0,05 g/dl), MgSO₄ · 7H₂O (0,002 g/dl), Biotin (50y/l) und Cat. J₃ (2 g/dl) enthielt. Im Fermentationsmedium eines jeden Kolbens sammelten sich durchschnittlich 11,4 mg/ml L-Leucin an.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biochemischen Herstellung von L-Leucin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in assimilierbare Kohlen- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und Wuchsstoffe enthaltenden.Nährmedien, die einen Gehalt Isoleucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin _xo aufweisen, bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Corynebacterium glutamicum ATCC 21301 oder ATCC 21335 einsetzt.