DE3784988T2

DE3784988T2 - Methode fuer selektiven zuwachs des anteils der gewoenlichen hauptkomponente des antibiotischen komplexes a/16686.

Info

Publication number: DE3784988T2
Application number: DE8787112861T
Authority: DE
Inventors: Piero Antonini; Angelo Borghi; Giancarlo Lancini
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1986-09-11
Filing date: 1987-09-03
Publication date: 1993-07-08
Anticipated expiration: 2007-09-04
Also published as: JPS6377891A; IL83736A0; CA1301689C; IE60223B1; IE872421L; DK166628B1; US5925550A; DK461787A; EP0259780A2; HUT46362A; ATE87335T1; ES2038974T3; ZA876773B; DK461787D0; KR960013576B1; EP0259780B1; GB8621911D0; IL83736A; JP2728406B2; KR880004094A

Description

Das Antibiotikum A/16686 ist eine Depsipeptidsubstanz, die aus einer Actinoplanes-Kultur sp. ATCC 33076 isoliert wurde.
Dieser hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien wirksame Stoff wurde in der US-Patentschrift 4,303,646 zusammen mit dem Verfahren zu seiner Gewinnung und den entsprechenden Arzneimitteln beschrieben.
Man konnte aus dem Antibiotikum A/16686 drei eng verwandte Bestandteile isolieren, die Faktor A&sub1;, A&sub2; und A&sub3; genannt wurden. Faktor A&sub2; ist der in überwiegender Menge gewinnbare Bestandteil und ist vorwiegend für die biologische Aktivität verantwortlich, während die Faktoren A&sub1; und A&sub3; in geringerer Menge anfallen. Diese Stoffe sowie auch ihre Herstellung und Verwendung wurden in der US-Patentschrift 4,427,656 beschrieben.
Aufgrund der wachsenden Toleranz und sogar Resistenz gegenüber geläufigen antibiotischen Behandlungen ist der Bedarf für neue antibiotische Stoffe weiterhin hoch. Besonders wünschenswert sind einzeln oder komplex isolierte Antibiotika mit eindeutiger und standardisierter Zusammensetzung.
Ein Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur selektiven Erhöhung der Produktion des Faktors A&sub2; und/oder A&sub3; des Antibiotikums A/16686, entweder um diese Einzelkomponenten zu isolieren oder um den Komplex hinsichtlich einer oder beider vorstehender Bestandteile anzureichern, das die Zugabe einer geeigneten Vorstufe des gewünschten antibiotischen Faktors zu einer A/16686 erzeugenden Kultur während der Fermentation umfaßt.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung ist es tatsächlich möglich, z. B. das Verhältnis der einzelnen Hauptbestandteile des Antibiotikum A/16686-Komplexes bei der industriellen Großfermentation zu modulieren. Dieses Verfahren stellt daher ein nützliches Werkzeug zur Einstellung der Zusammensetzung des Endproduktes im Rahmen von Standardspezifikationen dar.
Darüber hinaus ist es möglich, durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens direkt aus der Fermentationsmasse des produzierenden Stammes ein Rohprodukt zu erhalten, das mit Antibiotikum A/16686 Faktor A&sub2; angereichert ist und das in reiner Form mit höhere Ausbeuten und weniger zeitaufwendigen Schritten isoliert werden kann.
Die zur Erhöhung des Anteils an Faktor A&sub2; im Antibiotikum A/16686-Komplex geeignete Vorstufe wird ausgewählt aus Leucin, dessen Salzen mit Säuren und Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, Isovaleriansäure, deren Salzen mit Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, deren Estern mit Mono- und Polyhydroxyniederalkanolen, α-Ketoisocapronsäure, deren Salzen mit Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, deren Estern mit Mono- und Polyhydroxyniederalkanolen, Isoamylalkohol oder dessen Ester mit Säuren, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind.
Die für die Erhöhung des Anteils an Faktor A&sub3; im Antibiotikum A/16686-Komplex geeignete Vorstufe wird ausgewählt aus Valin, dessen Salzen mit Säuren und Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, α-Ketoisovaleriansäure, deren Salze mit Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, deren Estern mit Mono- und Polyhydroxyniederalkanolen, Isobuttersäure, deren Salzen mit Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, deren Estern mit Mono- und Polyhydroxyniederalkanolen, Isobutanol und dessen Estern mit Säuren, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind.
Salze mit Basen, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, sind Salze, bei denen Art und Konzentration des gegebenen Kations so gestaltet sind, daß sie weder das Wachstum der Mikroorganismusanzucht noch dessen Produktion der gewünschten antibiotischen Substanz im merklichem Ausmaß bei der in der Fermentationsmasse angewendeten Konzentration beeinträchtigen. Beispiele der Kationen sind jene von Alkalimetallen und Erdalkalimetallen, wie Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium sowie jene von Aminen, wie Ammonium, primäres, sekundäres oder tertiäres (C&sub1;-C&sub4;)-Alkylammonium und Hydroxy(C&sub1;-C&sub4;)-alkylammonium. Bevorzugte Salze sind jene mit Natrium-, Kalium- oder Ammoniumionen.
Beispiele für Salze mit Säuren, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, d. h. Salze mit Säuren, die in merklichem Ausmaß weder das Wachstum der Mikroorganismusanzucht noch die Produktion der gewünschten antibiotischen Substanz bei Konzentrationen, wie sie in der Ferientationsmasse vorliegen, beeinträchtigen, sind Salze mit vorzugsweise Mineralsäuren, wie Salzsäure, jedoch können in einigen Fällen auch organische Säuren vorliegen.
Ester einer wie vorstehend definierten geeigneten Vorstufe mit Mono- und Polyhydroxyniederalkanolen sind Ester mit (C&sub1;-C&sub6;)-Alkanolen mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Hydroxyfunktionalitäten je Molekül. Falls (C&sub1;-C&sub4;)-Alkanole verwendet werden, so müssen sie sich von jenen unterscheiden, die als Vorstufen für den anderen antibiotischen Faktor (d. h. Isobutanol oder Isoamylalkohol) dienen, sofern nicht die gleichzeitige Erhöhung beider Faktoren erwünscht ist.
Bevorzugte Beispiele für Polyhydroxyalkanole sind Glycerin und Propylenglykol.
Falls Niederalkanole in verschiedenen enantiomeren oder epimeren Formen auftreten können, so wird darunter in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen jede einzelne Form getrennt sowie das Gemisch jeder einzelnen Form in beliebigem Verhältnis verstanden.
Ester einer wie vorstehend definierten geeigneten hydroxylgruppenhaltigen Vorstufe, die nicht toxisch für den Mikroorganismus sind, sind (C&sub2;-C&sub2;&sub2;)-Alkanoylester, wobei Art und Konzentration des Alkanoylrestes im Fermentationsmedium so gestaltet werden, daß das Wachstum der Mikroorganismusanzucht oder die Produktion des gewünschten antibiotischen Stoffes nicht in merkbarem Ausmaß beeinträchtigt ist. Im allgemeinen sind geradkettige (C&sub2;-C&sub4;)-Alkanoyl Ester bevorzugt.
Eine Antibiotikum A/16686 produzierende Kultur ist eine Kultur eines Stammes wie Actinoplanes sp. ATCC 33076 oder einer produzierenden Mutante oder Variante davon, die in der Lage ist, nach Anzucht gewinnbare Mengen des Antibiotikums A/16686 zu produzieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren schließt die Anzucht einer Antibiotikum A/16686 produzierenden Kultur in einer wäßrigen Nährlösung mit einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle, einer assimilierbaren Stickstoffquelle und anorganischen Salzen unter den zur Anzucht von Actinoplanes allgemeinen und für jene A/16686 produzierenden im besonderen (vgl. US-A-4,303,646) gebräuchlichen Bedingungen und die Zugabe einer wirksamen Menge einer zur Erhöhung der Produktion von Antibiotikum A/16686-Faktor A&sub2; und/oder Faktor A&sub3; geeigneten Vorstufe ein.
Die geeignete Vorstufe kann zu der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich während laufender der Fermentation zugegeben werden, oder kann dem Züchtungsmedium vor der Fermentation zugegeben werden. Es kann, falls bei Fermentationstemperatur ausreichend fluid, direkt zugegeben werden oder es kann als Lösung, Suspension oder Emulsion und vorzugsweise als wäßrige Lösung oder Suspension zugegeben werden.
Eine "wirksame Menge" einer geeigneten Vorstufe bedeutet eine wie vorstehend definierte Vorstufenmenge, die zu der Fermentation zugegeben eine Konzentration einer selektiven Vorstufe ergibt, die ausreicht, um den speziellen Faktor des Antibiotikums A/16686 selektiv zu erhöhen, ohne toxische Wirkungen auf die wachsende Kultur des produzierenden Mikroorganismus auszuüben.
Die Zugabegeschwindigkeit der Vorstufe muß hoch genug sein, um die Ausbeute an gewünschtem Faktor in merklichem oder optimalem Ausmaße zu steigern, ohne jedoch eine toxische Wirkung auf die Fermentation auszuüben.
Es kann im allgemeinen nützlich sein, eine wirksame Menge einer geeigneten Vorstufe kontinuierlich oder portionsweise während der Herstellungsstufe der Fermentation zuzugeben.
Im Verlaufe der Fermentation können, falls gewünscht, der Antibiotikum A/16686-Komplex oder die Einzelfaktoren A&sub2; oder A&sub3; gemäß bekannten Verfahren oder ersichtlichen Modifizierungen davon, gewonnen werden.
Die für die Fermentation eines A/16686 produzierenden Stammes geeignete Fermentationsnährlösung, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, enthält gewöhnlich eine geeignete Kohlenstoffquelle, die z. B. ausgewählt ist aus Zuckern (z. B. Glucose, Saccharose, Maltose), Polysacchariden (z. B. Stärke, Dextran), Polyalkoholen (z. B. Glycerin, Propylenglykol); eine geeignete Stickstoffquelle, die z. B. ausgewählt ist aus Ammoniumsalzen, Asparagin, Erdnußmehl, Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Trypton, Pepton, Hefehydrolysat, Hefeextrakt oder Maisquellwasser und anorganischen Salzen. Unter den anorganischen Salzen, die in die Nährlösung eingegeben werden können, sind die üblichen, die in der Lage sind, Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-, Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Phosphat-, Nitrat- und ähnliche Ionen zu liefern.
Gewöhnlich wird der Antibiotikum produzierende Stamm in einem Schüttelkolben vorkultiviert und dann die Kultur zum Beimpfen eines Glasfermenters zur Herstellung größerer Mengen der antibiotischen Stoffe verwendet. Die für die Vorkultur verwendete Nährlösung kann mit der für den größeren Fermentationsansatz verwendeten identisch sein, jedoch können auch andere Nährlösungen verwendet werden.
Die Fermentation kann in einem Zeitraum von 50 bis 150 Stunden unter submersen aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 25 und 35ºC, vorzugsweise zwischen 27 und 33ºC durchgeführt werden. Die Zugabe der selektiv wirksamen Menge einer geeigneten Vorstufe kann vor der Beimpfung des produzierenden Stamms zur Fermentationslösung gegeben werden, jedoch erfolgt dies vorzugsweise 24 bis 48 Stunden nach Beginn der Fermentation. Die Zugabe kann in einer oder mehreren Teilen oder kontinuierlich erfolgen.
Gemäß einer typischen erfindungsgemäßen Versuchsausführungsform wird eine Kultur des A/16686 produzierenden Stamms, gehalten als Hafermehl-Schrägkultur, zur Beimpfung eines 100 ml eines vegetativen Mediums enthaltenden Kolbens verwendet. Nach 36 Stunden werden 5 ml Proben der Kultur zum Beimpfen einer Reihe von Fermentationskolben mit 100 ml fermentativem Medium verwendet. Nach 24 bis 48 Stunden Fermentation wird eine selektiv wirksame Menge der Vorstufe in geeigneter Weise zugegeben. Falls die Steigerung zweier Faktoren des A/16686-Komplexes gleichzeitig erwünscht ist, werden die zwei geeigneten Vorstufen zu dem gleichen Fermentationskolben gegeben. Die Fermentation wird für weitere 60 bis 150 Stunden fortgeführt, anschließend wird der Fermentationskuchen entfernt und die Proben der Brühe werden mit HPLC analysiert.
Die Gewinnung der antibiotischen Stoffe kann in herkömmlicher Weise erfolgen. Für veterinäre Anwendungen können der gesamte Fermentationskuchen oder die konzentrierte Brühe verwendet werden.
Die Zugabe der Vorstufe zur Fermentation erfolgt so, daß ein vorgegebener pH-Bereich nicht merklich beeinflußt wird. Falls daher freie Säure-Vorstufen direkt zu dem Medium zugegeben werden, wird der pH-Wert unter Regelung des Pufferstatus des Mediums oder durch unmittelbare Neutralisation mit Basen, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, aufrechterhalten.
Falls die zuzugebende Vorstufe eine Aminosäure ist, so kann sie als wäßrige Lösung oder deren Salz mit Säuren oder Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, z. B. als Hydrochloride oder Natriumsalze, zugegeben werden. In einigen Fällen können die Aminosäuren zweckmäßigerweise sogar als Lösung eines inneren Salzes zugegeben werden. Sowohl racemische Gemische als auch optisch aktive Isomere können als Vorstufen verwendet werden.
Im allgemeinen liefert jedoch die Zugabe der L-Form höhere Ausbeuten als die der entsprechenden D-Form.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Verwendung der L-Form der Aminosäurevorstufe zur Erhöhung der Konzentration des Faktors A&sub3; (L- Valin, ein Salz oder ein Ester davon), und/oder Faktors A&sub2; (L-Leucin, ein Salz oder ein Ester davon) des Antibiotikum A/16686-Komplexes. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform ist es auch möglich, den prozentualen Anteil an Faktor A&sub2; im Fermentationsprodukt auf über 80 % von dem des Komplexes zu erhöhen.
Mit Vorstufen aus Niederalkansäuren (Isobuttersäure, Isovaleriansäure, α-Keto-isovaleriansäure und α-Keto-isocapronsäure) kann die Zugabe über eine wäßrige Lösung oder deren Salze mit nicht-toxischen Basen erfolgen, wobei Ammonium- und Natriumsalze gewöhnlich bevorzugt sind.
Falls Ester der vorstehend genannten Niederalkansäuren und ungesättigte Fettsäureester mit Monohydroxyniederalkanolen als Vorstufen verwendet werden, so leiten sich die Ester gewöhnlich von Methanol, Ethanol und Propanol ab, obwohl Ester mit C&sub4;-C&sub6;-Alkanolen ebenfalls verwendbar sind. In diesem Falle muß der C&sub4;-C&sub6;-Alkanol sich von jenem unterscheiden, der als Vorstufe für den anderen Faktor (Isobutanol oder Isoamylalkohol) dient, sofern nicht die gleichzeitige Steigerung des anderen Faktors erwünscht ist.
Alkanolvorstufen, wie Isobutanol und Isoamylalkohol werden gewöhnlich als solche zur Fermentation zugegeben. Sie können jedoch auch als Ester von Säuren, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, zugeführt werden. Diese Säuren müssen sich von jenen unterscheiden, die als Vorstufen für den anderen A/16686-Faktor wirken, sofern nicht eine gleichzeitige Steigerung des anderen Faktors erwünscht ist. Gewöhnlich sind Ester mit linearen (C&sub2;-C&sub4;)-Alkansäuren wie Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure bevorzugt.
Die erfindungsgemäß zu dem Fermentationsmedium zuzugebende "selektiv wirksame Menge" hängt von der Vorstufenart ab. Gewöhnlich werden Ester der Niederalkansäuren (Isobuttersäure, Isovaleriansäure) in Mengen für eine Konzentration der Säure im Fermentationsmedium zwischen 0,1 g/l und 5 g/l verwendet, wobei der Bereich zwischen 0,1 g bis 1 g/l bevorzugt ist. Niederalkanole (Isobutanol, Isoamylalkohol) oder deren Ester mit Säuren, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, werden gewöhnlich in Mengen für eine Alkoholkonzentration im Bereich zwischen 0,5 g/l und 5 g/l verwendet, wobei der Bereich zwischen 1 g/l und 2 g/l bevorzugt ist.
Bei den Aminosäuren (Valin, Isoleucin) und den Ketosäuren (α-Keto-isovaleriansäure, α-Keto-Isocapronsäure) oder deren Salzen mit Säuren und Basen, bewegt sich die zu dem Fermentationsmedium zugegebene "selektiv wirksame Menge" zwischen 0,2 g/l und 5 g/l und vorzugsweise zwischen 0,5 g/l und 4 g/l und am meisten bevorzugt im Bereich zwischen 2 und 4 g/l.
Falls die Niederalkansäuren (z. B. Isobuttersäure, Isovaleriansäure) oder deren Salze direkt zu dem Fermentationsmedium gegeben werden, bewegt sich die "selektiv wirksame Menge" zwischen 0,1 g/l und 2,5 g/l, wobei der Bereich zwischen 0,3 g/l und 1,5 g/l bevorzugt ist.
Höhere als vorstehend angegebene Konzentrationen können zu einer Erhöhung des prozentualen Anteils eines der A/16686-Faktoren führen. Im allgemeinen wird jedoch die Gesamtausbeute aufgrund der toxischen Wirkungen auf die Kultur herabgesetzt.
Ein weiteres Ziel und eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ist durch ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion des Antibiotikum A/16686-Komplexes, Antibiotikum A/16686-Faktors A&sub2; oder Faktors A&sub3; gegeben, umfassend die Zugabe eines Buttersäurederivats oder einer Vorstufe, die unter Fermentationsbedingungen Buttersäure freisetzen kann, zu einer A/16686-produzierenden Kultur.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die selektive Erhöhung der Produktion eines A/16686-Faktors nach dem erfindungsgemäßen Verfahren weiter gesteigert wird, falls ein Buttersäurederivat oder eine -Vorstufe zusammen mit der für einen A/16686-Faktor geeigneten Vorstufe zugegeben wird.
Bevorzugte Beispiele für Buttersäurederivate oder -Vorstufen sind (C&sub1;-C&sub6;)-Alkylester, mono- und Polyhydroxyalkylester.
Besonders bevorzugt sind Buttersäureethylester und Tributyrin.
Bezüglich der Zugabe eines Stoffes zur Fermentationslösung und insbesondere der Zugabe einer geeigneten Vorstufe und Buttersäure oder eines Derivates oder einer Vorstufe davon, schließt der Ausdruck "zusammen" die gleichzeitige oder nacheinander erfolgende Zugabe der Stoffe (eines nach dem anderen oder umgekehrt) in einem solchen Zeitraum ein, daß die kombinierten Wirkungen der zugegebenen Substanzen sich noch bei der Fermentation auswirken.
Die vorliegende Definition umfaßt natürlich auch den Fall, bei dem eine oder beide "zusammen" zugegebene Stoffe vorher zur Nährlösung zugegeben wurden oder schon in ihr vorhanden sind.
Im allgemeinen wird ein Buttersäurederivat oder eine -Vorstufe in einer solchen Menge zugegeben, daß eine Konzentration der Säure in der Fermentationslösung von 0,5 g/l bis 2 g/l erreicht wird.
Die Ausbeuten an antibiotischem Komplex sind im allgemeinen merklich gesteigert und falls noch die richtige Vorstufe zugegeben wurde, kann der prozentuale Anteil des vorgegebenen antibiotischen Faktors auf etwa 95 bis 98 % gesteigert werden.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum A/16686-Faktor A&sub2; in hohen Ausbeuten und hoher Reinheit, umfassend die Zugabe von Leucin und am meisten bevorzugt L-Leucin zusammen mit Tributyrin oder Essigsäurebutylester zu einer A/16686 produzierenden Kultur während der Fermentation.
Die nachstehenden Beispiele beschreiben in weiteren Einzelheiten spezielle Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens:

Beispiel 1

Eine Hafermehl/Schrägkultur von Actinoplanes sp. ATCC 33076 wird zur Beimpfung einer 500 ml Flasche, enthaltend 100 ml des nachstehenden Vegetativmediums (g/l) verwendet:
Sojabohnenmehl 13
Glucose 12
Stärke 13
CaCO&sub3; 4
Nach 36 Stunden auf einem rotierenden Schüttler bei 28 bis 30ºC, werden 5 ml der Kultur zur Beimpfung in 500 ml Kolben, enthaltend 100 ml der nachstehenden Fermentationslösung (g/l) verwendet:
Sojabohnenmehl 30
Glycerin 20
Stärke 4
Glucose 4
Maltose 20
Saccharose 20
CaCO&sub3; 6
Nach der Anzucht bei 28-30ºC auf einem rotierenden Schüttler für 24 Stunden wird die geeignete Vorstufe zugegeben. Nach 90 bis 96 Stunden Anzucht wird der Fermentationskuchen durch Zentrifugieren entfernt und die Brühe wird hinsichtlich ihres Gehalts an Antibiotikum A/16686-Faktoren gemäß nachstehender HPLC-Methode analysiert:

a. Trennung durch Gradienten-Umkehrphasen-Verteilung

Instrument: Pumpe Varian 5000 A Detektor Varian bei 254 Nanometer Injektor: Rheodyne Modell 7125; Integrator: Spectra Physics Modell 4000;
Säule: Silanisiertes Kieselgel; Brownlee Lab. RP 18 Spheri 5
Mobile Phase: 0,05 M NaH&sub2;PO&sub4;/Acetonitril, 65:35, pH 6
Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/min
Injektion: 20 Mikroliter
Betriebsbedingungen: Isocratische Bedingungen
Retentionszeiten: A/16686-Faktor A&sub1; 6,69 min
A/16686-Faktor A&sub2; 10,16 min
A/16686-Faktor A&sub3; 16,29 min.

b. Prozentuale Verteilung

Die Bestandteile werden mit dem vorstehenden Verfahren getrennt und ihre relative Verteilung wird als Prozentsatz, bezogen auf die Gesamtfläche der drei Peakflächen nach der Flächenprozentmethode erhalten. Die Ergebnisse der dargelegten Versuche sind nachstehend angeführt. Vorstufenzugabe Faktor Gesamtausbeute % Faktor A&sub1; A&sub2; A&sub3; Keine Valin Isobuttersäure Leucin Isovaleriansäure Buttersäureethylester Tributyrin Leucin plus Tributyrin

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines in seinen Faktoren A&sub2; und/oder A&sub3; angereicherten A/16686-Komplexes, umfassend die Zugabe einer selektiv wirksamen Menge einer geeigneten Vorstufe zu einer Kultur von Actinoplanes sp. ATCC 33076 oder einer A/16686 produzierende Mutante davon, wobei die geeignete Vorstufe zur Erhöhung des Verhältnisses von Faktor A&sub2; im Antibiotikum A/16686-Komplex ausgewählt ist aus Leucin, dessen Salzen mit Säuren und Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, Isovaleriansäure, deren Salzen mit Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, deren Estern mit Mono- und Polyhydroxyniederalkanolen, α-Keto-isocapronsäure, deren Salzen mit Basen, die für den produzierenden Organismus nicht toxisch sind, deren Estern mit Mono- und Polyhydroxyniederalkanolen, Isoamylalkohol und dessen Estern mit Säuren, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, und die geeignete Vorstufe zur Erhöhung des Verhältnisses von Faktor A&sub3; im Antibiotikum A/16686-Komplex ausgewählt ist aus Valin, dessen Salzen mit Säuren und Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, α-Ketoisovaleriansäure, deren Salzen mit Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, deren Estern mit Mono- und Polyhydroxyniederalkanolen, Isobuttersäure, deren Salzen mit Basen, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind, deren Estern mit Mono- und Polyhydroxyniederalkanolen, Isobutanol und dessen Estern mit Säuren, die für den produzierenden Mikroorganismus nicht toxisch sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zugegebene geeignete Vorstufe Valin ist oder deren Salze mit Säuren und Basen, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, und die entsprechende selektiv wirksame Menge im Bereich zwischen 0,2 g/l und 5 g/l, vorzugsweise zwischen 0,5 g/l und 4 g/l liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zugegebene geeignete Vorstufe Isobuttersäure ist oder deren Salze mit Basen, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, und die betreffende selektiv wirksame Menge im Bereich zwischen 0,1 g/l und 2,5 g/l, vorzugsweise zwischen 0,3 g/l und 1,5 g/l liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zugegebene geeignete Vorstufe ein Ester der Isobuttersäure mit einem Mono- oder Polyhydroxyniederalkanol ist, und die entsprechende selektiv wirksame Menge im Bereich zwischen 0,1 g/l und 5 g/l, und vorzugsweise zwischen 0,1 g/l und 1 g/l liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zugegebene geeignete Vorstufe Isobutanol ist oder dessen Ester mit Säuren, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, und die betreffende selektiv wirksame Menge im Bereich zwischen 0,5 g/l und 5 g/l, vorzugsweise zwischen 1 g/l und 2 g/l liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zugegebene geeignete Vorstufe Leucin ist oder dessen Salze mit Säuren und Basen, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, und die betreffende selektiv wirksame Menge im Bereichen zwischen 0,2 g/l und 5 g/l, vorzugsweise zwischen 0,5 g/l und 4 g/l liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zugegebene geeignete Vorstufe Isovaleriansäure ist oder deren Salze mit Basen, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, und die entsprechende selektiv wirksame Menge im Bereich zwischen 0,1 g/l und 2,5/l, vorzugsweise zwischen 0,3 g/l und 1,5 g/l liegt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zugegebene geeignete Vorstufe ein Ester der Isovaleriansäure mit einem Mono- oder Polyhydroxyniederalkanol ist und die entsprechende selektiv wirksame Menge im Bereich zwischen 0,1 g/l und 5 g/l, vorzugsweise zwischen 0,1 g/l und 1 g/l liegt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zugegebene geeignete Vorstufe Isoamylalkohol ist oder dessen Ester mit Säuren, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, und die entsprechende selektiv wirksame Menge im Bereich zwischen 0,5 g/l und 5 g/l, vorzugsweise zwischen 1 g/l und 2 g/l liegt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zugegebene geeignete Vorstufe α-Keto-isocapronsäure, deren Salze mit Basen, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, oder deren Ester mit Mono- oder Polyhydroxyniederalkanolen ist, und die entsprechende selektiv wirksame Menge im Bereich zwischen 0,2 g/l und 5 g/l, vorzugsweise zwischen 0,5 g/l und 4 g/l liegt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 6, 7 oder 10, wobei die Salze mit Basen, die für den Mikroorganismus nicht toxisch sind, Natrium- oder Ammoniumsalze sind.

12. Verfahren nach Anspruch 1, 4, 8 oder 10, wobei der Ester ein Ester der nachstehenden Alkanole ist: Methanol, Ethanol, Propanol, Ethylenglykol und Glycerin.

13. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 6, wobei die Aminosäure in der L-Form vorliegt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 6, wobei das Salz mit einer Säure, die für den Mikroorganismus nicht toxisch ist, das Hydrochlorid oder das Sulfat ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 5 oder 9, wobei der Ester mit einer Säure, die nicht-toxisch für den Mikroorganismus ist, ein Ester mit einer der nachstehenden Säuren ist: Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure.

16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Stamm Actinoplanes sp. ATCC 33076 ist.

17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Fermentation bei einer Temperatur zwischen 25ºC und 35ºC, vorzugsweise zwischen 27ºC und 33ºC ausgeführt wird.

18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zugabe der geeigneten Vorstufe 24 bis 48 Stunden nach Beginn der Fermentation durchgeführt wird.

19. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe eine wirksame Menge einer Vorstufe oder eines Derivats von Buttersäure in Zusammenhang mit der geeigneten Vorstufe von A/16686-Faktor A&sub2; oder A&sub3; erfolgt.

20. Verfahren zur Steigerung der Produktion eines Antibiotikum A/16686-Komplexes, umfassend die Zugabe einer wirksamen Menge einer Vorstufe oder eines Derivats von Buttersäure zu einer Kultur von Actinoplanes sp. ATCC 33076 oder einer produzierenden Mutante davon.