DE3123001C2

DE3123001C2 -

Info

Publication number: DE3123001C2
Application number: DE3123001A
Authority: DE
Inventors: Takeo Musashine Tokio/Tokyo Jp Akashiba; Akira Kawasaki Kanagawa Jp Nakayama; Atsuhiko Tokio/Tokyo Jp Murata
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1980-06-10
Filing date: 1981-06-10
Publication date: 1988-01-28
Also published as: JPS6262156B2; DE3123001A1; JPS575694A; GB2078731B; US4363875A; FR2483947B1; GB2078731A; FR2483947A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, bei dem eine L-Tryptophan erzeugende Mu tante von Bacillus subtilis unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, welches Anthranilsäure, eine Koh lenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralien quelle enthält, gezüchtet wird und das entstehende L-Tryptophan aus der Kulturbrühe isoliert wird.

Es ist bekannt, daß Bacillus subtilis die Fähigkeit be sitzt, L-Tryptophan zu erzeugen (vgl. beispielsweise US-PS 38 01 457 und 37 00 558). Seine Fähigkeit ist je doch relativ niedrig. Es wurden viele Vorschläge gemacht, die Ausbeute zu verbessern, und man hat versucht, ver schiedene L-Tryptophan erzeugende Mutanten von Bacillus subtilis zu verwenden oder zu dem Nährkulturmedium eine Vorstufe zuzugeben. Beispielsweise wird in der JP-OS 20 391/1974 ein Verfahren für die Herstellung von L-Trypto phan beschrieben, bei dem eine L-Tryptophan erzeugende Mutante von Bacillus subtilis in einem Nährkulturmedium verwendet wird, welches Anthranilsäure, eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle ent hält und bei dem das entstehende L-Tryptophan aus der Kulturbrühe isoliert wird. Als Mutante wird ein Stamm ver wendet, der gegenüber 5-Fluortryptophan resistent ist, wie ein Bacillus-subtilis-SD-9-Stamm (FERM-P 1483, Fermen tation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan).

Die Anmelderin hat Untersuchungen durchgeführt, um ein verbessertes Verfahren zur Erzeugung von L-Tryptophan durch Fermentation zu finden. Die Anmelderin hat gefunden, daß ein Stamm, der gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Aza guanin resistent ist und der in der Literatur nicht be schrieben wird, aus Bacillus subtilis erhalten werden kann und daß diese neue Mutante die Fähigkeit besitzt, L-Tryptophan in gesteigerter Geschwindigkeit bei der L-Tryptophanakkumulierung und in erhöhter Ausbeute, bezo gen auf die verbrauchte Kohlenstoffquelle (Kohlenhydrat), zu bilden.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrun de, ein verbessertes Verfahren für die Erzeugung von L-Tryptophan durch Fermentation zur Verfügung zu stellen.

Weiterhin soll erfindungsgemäß eine reine Kultur des Stammes des Mikroorganismus zur Verfügung gestellt werden, der bei dem zuvor erwähnten Verfahren verwendet werden kann.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mutante Bacillus subtilis FERM BP-4 eingesetzt wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin Bacillus subtilis FERM BP-4, mit der Fähigkeit, L-Tryptophan durch Fermentation in einem Anthranilsäure, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle enthaltenden Nähr kulturmedium unter aeroben Bedingungen zu bilden.

Die neue L-Tryptophan erzeugende Mutante von Bacillus sub tilis, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein 5-Fluortryptophan- und 8-Azaguanin-resistenter Stamm, welcher sich von bekannten und frei verfügbaren Stämmen von Bacillus subtilis ableitet.

Beispiele des obigen Mutterstamms sind Bacillus subtilis IAM-1026 (Institute of Applied Microbiology, Japan); Bacillus subtilis ATCC 9466 (American Type Culture Collection, USA); und verschiedene andere Stämme, bei spielsweise ATCC 4925, ATCC 6051 und ATCC 6633, die in dem Agriculture Handbook Nr. 427 The Genus Bacillus (Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Oktober 1973), Seiten 182 bis 183, be schrieben werden.

Der Stamm Bacillus subtilis SD-10, nämlich der erfindungs gemäße 5-Fluortryptophan- und 8-Azaguanin-resistente Stamm, ist im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Hinter legungsnummer FERM BP-4 als international hinterlegter Stamm, entsprechend dem Budapest-Vertrag, hinterlegt.

Der 5-Fluortryptophan- und 8-Azaguanin-resistente Stamm, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann leicht aus dem obigen als Beispiel aufgeführten bekann ten und frei verfügbaren Mutterstamm Bacillus subtilis nach bekannten künstliche Mutationen induzierenden Ver fahren, beispielsweise gemäß bekannten Verfahren, bei denen Mutagene verwendet werden, d. h. mutationsinduzie rende Substanzen, oder durch Bestrahlung, wie mit UV- Strahlen und Röntgenstrahlen, hergestellt werden.

Das Verfahren zur Herstellung eines Stammes aus Bacillus subtilis, der L-Tryptophan bilden kann und der gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist, wird wie folgt durchgeführt:

(i) Bacillus subtilis wird einer künstlichen muta tionsinduzierenden Behandlung unterworfen,
(ii) der behandelte Stamm wird in einem Kulturmedium, welches 5-Fluortryptophan in einer Menge ent hält, die größer ist als die minimale Wachs tumsinhibitorkonzentration des Stammes, ge züchtet,
(iii) der gezüchtete Stamm wird in einem Kulturme dium, welches 8-Azaguanin in einer Menge ent hält, die größer ist als die minimale Wachstums inhibitorkonzentration des Stammes, weiterge züchtet, und
(iv) der entstehende Stamm mit verbesserter Fähigkeit, L-Tryptophan zu bilden, wird isoliert.

Die Stufen (i) bis (iv) des obigen Verfahrens können so oft wie erforderlich wiederholt werden.

Gemäß einer Ausführungsform des obigen Verfahrens wird der Mutter stamm, wie Bacillus subtilis IAM-1026, einer künstlichen muta tionsinduzierenden Behandlung unterworfen. Beispielsweise be strahlt man mit einer mutationsinduzierenden Dosis einer künst lichen mutationsinduzierenden Bestrahlung, wie UV-Strahlen und Röntgenstrahlen, oder man züchtet in einem Kulturmedium, welches eine mutationsinduzierende Menge eines Mutagens enthält, wie Acridinorange oder N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin. Der so gewonnene Stamm wird dann in einem Kulturmedium gezüchtet, wel ches 5-Fluortryptophan in einer Menge enthält, die größer ist als die minimalen Wachstumshemmkonzentration bzw. Wachstumsinhi bitorkonzentration (MIC) des Stammes, und die gewachsenen bzw. gezüchteten Kolonien werden dann gesammelt. Die L-Tryptophan er zeugende Fähigkeit der gezüchteten Kolonien wird geprüft, und die Kolonie des Stammes mit erhöhter Fähigkeit, L-Trypophan zu bilden, wird ausgewählt. Normalerweise wird diese Züchtung meh rere Male wiederholt, bis man einen 5-Fluortryptophan-resistenten Stamm von Bacillus subtilis erhält, der eine erhöhte Fähigkeit aufweist, L-Tryptophan zu bilden. Die L-Tryptophan erzeugende Mutante von Bacillus subtilis, die auf die zuvor erwähnte Weise erhalten wird, ist bekannt und wird beispielsweise in der JP-OS 20 391/1974, die bereits oben erwähnt wurde, beschrieben. Die Mu tante ist beispielsweise unter der Nummer FERM-P 1483 beim Fer mentation Research Institure, Agency of Industrial Science and Technology, Japan hinterlegt.

Zur Herstellung der Mutante, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird und die die Fähigkeit besitzt, L-Tryptophan zu er zeugen, und gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist, wird der 5-Fluortryptophan-resistente Stamm, der wie oben beschrieben erhalten wurde, in einem Kulturmedium gezüchtet, wel ches 8-Azaguanin in einer Menge enthält, die größer ist als die MIC des Stammes, und die gewachsenen Kolonien werden gesammelt.

Die L-Tryptophan erzeugenden Fähigkeiten der gewachsenen Kolo nien werden geprüft, und eine Kolonie des Stammes mit erhöhter Fähigkeit, L-Tryptophan zu bilden, wird gesammelt. Im allgemei nen wird diese Züchtung mehrere Male wiederholt, und ein Stamm mit einer erhöhten L-Tryptophan erzeugenden Fähigkeit, der ge genüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist, wird erhalten.

Die Mutante, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird und die leicht aus Bacillus subtilis oder dem 5-Fluortryptophan- resistenten Stamm von Bacillus subtilis erhalten wird, ist be vorzugt gegen mindestens etwa 5000 ppm 5-Fluortryptophan und mindestens etwa 1000 ppm 8-Azaguanin resistent.

Die Dosis an ultravioletter Strahlung, die oben erwähnt wurde, beträgt beispielsweise etwa 300 bis etwa 800 erg/mm², und die Dosis an Röntgenstrahlen beträgt z. B. etwa 150 000 bis etwa 200 000 Röntgen. Die Menge an Mutagen beträgt beispielsweise 0,1 bis 0,5 Gew.-%, und die Behandlungszeit liegt beispielswei se innerhalb einer Stunde.

Bei der obigen Ausführungsform kann die Züchtung bei aeroben Bedingungen in dem gleichen Kulturmedium und bei den gleichen Temperatur- und pH-Bedingungen wie im folgenden bei dem erfin dungsgemäßen Verfahren für die L-Tryptophan-Herstellung durch geführt werden.

Erfindungsgemäß wird eine biologisch reine Kultur von dem Stamm Bacillus subtilis SD-10 zur Verfügung gestellt. Dieser besitzt die Eigenschaften, die bei FERM BP-4 beschrieben werden. Dieser Mikroorganismus wurde unter dem Budapester Vertrag hinterlegt, und er besitzt die Fähigkeit, L-Tryptophan durch Fermentation in einem Kulturnährmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle enthält, unter aeroben Bedingungen zu bilden.

Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete L-Tryptophan er zeugende Mutante, die gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azagua nin resistent ist, besitzt im wesentlichen die gleichen morpho logischen Eigenschaften wie der Mutterstamm oder der 5-Fluor tryptophan-resistente Stamm selbst und unterscheidet sich nur, daß ihre Fähigkeit, L-Tryptophan zu bilden, wesentlich verbes sert ist, und daß sie Anthranilsäure (Vitamin L₁) für die Bildung von L-Tryptophan benötigt.

Genauer ausgedrückt, werden die morphologischen Eigenschaften der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Mutante in dem obenerwähnten Agriculture Handbook Nr. 427, The Genus Bacillus, Seiten 182 bis 183 beschrieben.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der L-Tryptophan er zeugende Stamm, der gegenüber 5-Fluortryptophan und 8-Azaguanin resistent ist, bei aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium ge züchtet, welches Anthranilsäure, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle enthält, und das ent stehende L-Tryptophan wird aus der Kulturbrühe isoliert.

Die Kohlenstoffquelle kann irgendeins der Kohlenstoff enthalten den Materialien sein, welche von dem Stamm assimiliert werden kann. Beispiele sind Kohlehydrate, wie Glucose, Melassen, Saccha rose, Stärke, verzuckerte Stärkelösung und Zersetzungsprodukte von Cellulose, organische Säuren, wie Essigsäure, und Alkohole, wie Äthanol. Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, Am moniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat, Harnstoff und Nitratsalze. Beispiele für eine Mineralquelle sind Salze von P, Na, K, Mg, Fe und Mn, bei spielsweise anorganische Salze, wie Ammoniumphosphat, Kalium phosphat, Natriumphosphat, Kaliumsulfat, Kaliumhydroxid, Magne siumsulfat, Eisen-II-sulfat und Mangansulfat. Anorganische Sal ze von Ca, Zn, B, Cu, Co, Mo usw. können ebenfalls als Spuren elementkomponenten zugegeben werden. Weiterhin können Spuren or ganischer Nährstoffe, wie Vitamine und Aminosäuren, die für das Wachstum des Stammes besonders erforderlich sind, und andere organische Materialien, wie Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt und Pepton, zugegeben werden.

Anthranilsäure kann in Form einer wäßrigen Lösung aus Natrium-, Kalium- oder Ammoniumanthranilat oder als Lösung der freien Anthranilsäure in Äthanol oder Aceton zugegeben werden.

Die Züchtung erfolgt bei aeroben Bedingungen, beispielsweise werden Schüttelkulturverfahren, Züchtungsverfahren mit Durch perlen und Rühren oder andere Züchtungsverfahren bei aeroben Bedingungen verwendet.

Die Züchtung kann bei einer Temperatur von 25 bis 45°C und ei nem pH-Wert von 5 bis 9, bevorzugt 6 bis 8, durchgeführt werden. Die Züchtungszeit kann auf geeignete Weise ausgewählt werden und beträgt beispielsweise etwa 15 bis etwa 60 Stunden.

Die geeignete Konzentration der Anthranilsäure, die in dem Nähr kulturmedium vorhanden ist, beträgt bis zu der minimalen Wachs tumshemmkonzentration (MIC) des Stammes, beispielsweise bis zu etwa 0,1 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 300 ppm, bezogen auf das Ge wicht des Kulturmediums. Vorzugsweise wird die Anthranilsäure zu einem frühen Zeitpunkt der Züchtung zugegeben. Sie kann perio disch oder kontinuierlich zu dem Züchtungsmedium zugegeben wer den, so daß ihre Konzentration in dem Züchtungsmedium die mini male Wachstumshemmkonzentration des Stammes nicht übersteigt. Etwas höhere Konzentrationen an Anthranilsäure als die minimale Wachstumshemmkonzentration des Stammes beeinflussen das Wachstum des Stammes selbst nicht so stark, sie inhibieren aber die Er zeugung von L-Tryptohan. Dementsprechend wird Anthranilsäure bevorzugt periodisch oder kontinuierlich entsprechend der Ge schwindigkeit ihres Verbrauchs zugegeben, damit die Akkumulierung im Kulturmedium oder eine zeitweilige Erhöhung ihrer Konzentra tion darin vermieden wird. Wird keine Anthranilsäure zu dem Kul turmedium zugegeben, zeigt der obige erfindungsgemäße Mutanten stamm ein normales Wachstum der Zellen, aber eine Akkumulation von L-Tryptophan wird kaum festgestellt.

Das entstehende L-Tryptophan wird in an sich bekannter Weise aus der Kulturbrühe nach der Züchtung isoliert. Beispielsweise wird die Kulturbrühe bei 80°C während 30 Minuten sterilisiert und zentrifugiert, und dann wird zur Erniedrigung des pH-Werts der überstehenden Flüssigkeit auf 2 oder weniger eine Säure zugegeben. Sie wird dann auf eine Säule gegeben, die mit einem stark sauren Kationenaustauschharz gefüllt ist, um eine Adsorption des L- Tryptophan zu bewirken. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit verdünnter Ammoniaklösung zur Abtrennung von L-Trypto phan eluiert. Das Eluat wird dann mit Ammoniak bei verringertem Druck abgestreift, um rohe Kristalle des entstehenden L-Trypto phans zu sammeln. Die rohen Kristalle werden in einem 70%igen Äthanol bei erhöhter Temperatur gesammelt. Eine geringe Menge an Aktivkohle wird verwendet, und die Lösung wird heiß filtriert. Das Filtrat wird abgekühlt, und die entstehenden L-Tryptophan kristalle werden abfiltriert.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1

2 l eines flüssigen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung:
10% Glucose, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,5% Na₂HPO₄ · 12 H₄O, 0,2% KH₂PO₄x · H₂O, 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5 mg% FeSO₄ · 7 H₂O und 0,1 mg% MnSO₄ · 4-6 H₂O, werden in den 5-Liter-Kolben einer Fermentations vorrichtung gegeben und bei 115°C während 15 min sterilisiert. Bacillus subtilis SD-10 (FERM BP-4), der unter Schütteln bei 30°C während 12 h in einem Nährmedium kultiviert wurde, wird in einer Menge von 5% zur Inokulation des Mediums in der obigen Fermenta tionsvorrichtung verwendet, und dann wird bei 35°C unter Belüf tung durch Rühren kultiviert, während die Menge an gelöstem Sauer stoff bei 0,5 ppm oder höher gehalten wird. Eine 5%ige wäßrige Lösung von Natriumanthranilat wird kontinuierlich so zugegeben, daß seine Konzentration in dem Kulturmedium unterhalb der mini malen Wachstumshemmkonzentration des obigen Mutterstamms des Mi kroorganismus gehalten wird. Die Züchtung wird während 30 h wei tergeführt, während der pH-Wert der Kulturbrühe bei 7,0 gehalten wird. Es bildet sich L-Tryptophan, und dies wird in einer Konzen tration von 14,6 g/l angesammelt. Die Ausbeute an L-Tryptophan beträgt 16,5%, bezogen auf die verbrauchte Glucose, und 99 Mol.-%, bezogen auf die Anthranilsäure.

Zum Vergleich wird das obige Verfahren wiederholt, ausgenommen, daß die wäßrige Lösung von Natriumanthranilat nicht verwendet wird (Vergleichsbeispiel 1). Die Menge an L-Tryptophan, die sich gegen Ende der 30stündigen Züchtung gebildet und akkumuliert hat, beträgt 250 mg/l.

Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2

Bacillus subtilis SD-10 wird während 20 h in dem gleichen Kultur medium, wie es in Beispiel 1 verwendet wird, in eine Fermenta tionsvorrichtung mit einem 5-Liter-Kolben gezüchtet. Dann werden 750 ml der entstehenden Kulturbrühe in 15 l des gleichen Kultur mediums in einer Fermentationsvorrichtung mit einem 30-Liter- Kolben inokuliert, und züchtet man bei 35°C unter Belüftung durch Rühren, während die Menge an gelöstem Sauerstoff bei 0,5 ppm oder höher gehalten wird. Eine 10%ige wäßrige Lösung aus Natriumanthranilat wird kontinuierlich zugegeben, so daß die Konzentration an Anthranilsäure im Kulturmedium unterhalb der minimalen Wachstumshemmkonzentration des Mikroorganismusstamms gehalten wird. Die Züchtung wird während 24 h weitergeführt, während der pH-Wert der Kulturbrühe bei 7,0 gehalten wird. L- Tryptophan bildet und sammelt sich in einer Konzentration von 15,6 g/l an. Die Ausbeute an L-Tryptophan beträgt 17,4%, bezo gen auf die verbrauchte Glucose, und 99 Mol.-%, bezogen auf die Anthranilsäure.

Zum Vergleich wird das obige Verfahren wiederholt, ausgenommen, daß Bacillus subtilis SD-9 (FERM-P 1483, beschrieben in der JP- OS 20 391/1974) als Impfstamm verwendet wird. L-Tryptophan wird gebildet und akkumuliert sich in einer Konzentration von 4,8 g/l. Die Ausbeute an L-Tryptophan beträgt 5,2%, bezogen auf die verbrauchte Glucose, und 92 Mol.-%, bezogen auf die Anthranil säure.

Beispiel 3

Herstellung einer biologisch reinen Kultur von Bacillus subtilis:

Bacillus subtilis IAM-1026 (Institute of Applied Microbiology) wird zur Bildung einer künstlichen Mutante aus dem Mutterstamm in einem Nährmedium in an sich bekannter Weise der ultraviolet ten Bestrahlung unterworfen. Die entstehende Mutante wird zur Inkubation eines Nähragars, welcher 5-Fluortryptophan enthält, verwendet. Mehrere hundert Kolonien, die auf der Agarplatte ge züchtet wurden, wurden auf ihre Fähigkeit, L-Tryptophan durch Fermentation zu bilden, geprüft. Die Kolonie des Stammes, die die beste Fähigkeit aufwies, L-Tryptophan zu erzeugen, wurde ausgewählt. Der ausgewählte Stamm wurde gemäß dem oben beschrie benen künstlichen Mutationsverfahren behandelt, und die Auswahl der 5-Fluortryptophan-resistenten Mutante folgte darauf. Die obige Behandlung und Selektion wurde mehrere Male wiederholt, wobei man eine Mutante erhielt, die im wesentlichen gegenüber bis zu 5000 ppm 5-Fluortryptophan resistent ist.

Danach wurde diese 5-Fluortryptophan-resistente Mutante erneut gemäß dem gleichen künstlichen Mutationsverfahren, wie oben be schrieben, behandelt, und die Auswahl der 8-Azaguanin-resisten ten Mutante erfolgte auf gleiche Weise wie die Auswahl der 5- Fluortryptophan-resistenten Mutante. Die letztlich erhaltene Mutante ist schließlich gegenüber 5-Fluortryptohan resistent. Sie ist weiterhin gegenüber bis zu 1000 ppm 8-Azaguanin resistent.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, bei dem eine L-Tryptophan erzeugende Mutante von Bacillus subtilis unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, welches Anthranilsäure, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralienquelle enthält, gezüchtet wird und das entstehende L-Tryptophan aus der Kulturbrühe isoliert wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutante Bacillus subtilis FERM BP-4 eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur von 25 bis 45°C und einem pH-Wert von 5 bis 9 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die Konzentration der Anthranilsäure in dem Kulturmedium bis zu der minimalen Wachstumshemmkon zentration des Stammes liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Konzentration der Anthranil säure bis zu etwa 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums, beträgt.

5. Bacillus subtilis FERM BP-4, mit der Fähigkeit, L-Tryptophan durch Fermentation in einem Anthranilsäure, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und eine Mineralquelle enthaltenden Nährkulturmedium unter aeroben Bedingungen zu bilden.