DE1900492B - Verfahren zur biochemischen Herstellung von L-Leucin - Google Patents

Description

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tionsmedium jedes Kolbens durchschnittlich eine Beispiel 2
Menge von 9,5 mg/ml L-Leucin an.

1 Liter Fermentationsmedium wurde gesammelt und Eine Fermentation wurde in ähnlicher Art — wie

zur Entfernung der Mikroorganismenzellen zentrifu- im Beispiel 1 beschrieben — ausgeführt, nur mit dem

giert. Das Filtrat wurde durch eine Harzkolonne, die 5 Unterschied, daß ein Medium verwendet wurde,

mit einem handelsüblichen, stark sauren Kationen- welches Glukose (12 g/dl), Hefeextrakt (0,5 g/dl),

Austauscherharz in seiner Η-Form gefüllt war, ge- Ammonsulfat (2 g/dl), KH₈PO₄ (0,15 g/dl), K₈HPO₄

schickt. Dann wurde das Harz mit wäßriger 0,2n-Am- (0,05 g/dl), MgSo₄-7H₂O (0,05 g/dl), FaSO₄-7 H.O

moniaklösung gewaschen, um das L-Leucin zu (0,002 g/dl)_: MnSO₄ · 4 H_SO (0,002 g/dl), Biotin (50 y/1)

eluieren. Die Fraktionen, die das eluierte L-Leucin io und CaCO₃ (2 g/dl) enthielt.

enthielten, wurden vereinigt und konzentriert. Nach Die Fermentation wurde 4 Tage lang bei 29" C

Stehenlassen erhielt man Rohkristalle (6,5 g) von durchgeführt. Im Fermentationsmedium eine; jeden

L-Leucin, welchen man Methanol zusetzte (700 ml, Kolbens sammelten sich durchschnittlich 11,0 mg/ml

70gewichtsprozentig). Man erhitzte und ließ dann die L-Leucin an.

Lösung abkühlen. Der erhaltene Niederschlag wurde 15 B e i s d i e 1 3
abgetrennt und mit Methanol (70gewichtsprozentig)

gewaschen, um gereinigtes L-Leucin zu erhalten. Eine Fermentation wurde in ähnlicher Art — wie

Die analytischen Ergebnisse durch Papierchromato- im Beispiel 1 beschrieben — mit dem Unterschied

graphie und automatische Aminosäure-Analysen be- durchgeführt, daß Corynebacterium glutamicum

wiesen, daß das L-Leucin, das nach dem obengenann- ao ATCC 21335 und ein Medium verwendet wurden, das

ten Verfahren erhalten wurde, ähnliche Eigenschaften FeSo₄ · 7H₂O (0,002 g/dl), MnSo₄ · 4H₂O (0,002 g/dl),

aufwies wie L-Leucin, welches man nach bekannten Glukose (12 g/dl), Pepton (1 g/dl), Ammonsulfat

Verfahren erhalten hatte. Das nach dem obengenann- (2 g/dl), KH₂PO₄ (0,15 g/dl), K₂HPO₄ (0,05 g/dl),

ten Verfahren erhaltene Produkt war biologisch aktiv MgSO₄ · 7H₂O (0,002 g/dl), Biotin (50 y/1) und CaCo₃

und für das Wachstum von Stämmen verwendbar, as (2 g/dl) enthielt. Im Fermentationsmedium eines jeden

die für die biologische Prüfung von L-Leucin brauchbar Kolbens sammelten sich durchschnittlich 11,4 mg/ml

waren. Der Schmelzpunkt lag bei 298° C (zersetzt). L-Leucin an.

Claims (1)

1. ι 2

   In dem Nährmedium können als Kohlenstoffquellen Fniktose, Mannose, Galaktose, Maltose, Saccharose,

   Patentanspruch: Stärkehydrolysat, Melasse, Glycerin, Essigsäure od.

   dgl. verwendet verden; vorzuziehen ist jedoch die

   Verfahren zur biochemischen Herstellung von 5 Verwendung von Glukose. Als Stickstoffquellen kom-L-Leucin durch aerobes Züchten von Mtkro- _roen im wesentlichen Ammoniak, Harnstoff, Ammonorganismen in assimilierbare Kohlen- und Stick- sulfat, Ammonc.'ilorid, Aramonacetat oder Arr.monstoffquellen, anorganische Salze und Wuchsstoffe _sai_ze von anderen organischen Säuren in Frage. Als enthaltenden Nährmedien, die einen Gehalt Iso- anorganische Salze für sind das Nahrmedium Eisen-, leucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin ₁₀ Mangan-, Magnesium-, Kobalt-, Zink-, Nickel-, aufweisen, bei hierfür üblichen Temperatur- und Chromsalze u. dgl. ebenso verwendbar wie PhosphorpH-Werien, dadurch gekennzeichnet, säureverbindungen. Als Wuchsstoffe können Aminodaß man als Mikroorganismen Corynebacter.uin säuren (Cystin, Cystein, Glutaminsäure), Vitamine glutamicum ATCC 21301 oder ATCC 21335 ein- (Biotin, Thiamin), Hefeextrakt, handelsübliche Sojasetzt. _1S bohnenmehl'Hydrolysatlösung, Maisquellwasser, Pep-

   ton, Eiweißhydrolysat, Fleischextrakt, hydrolysate mikrobieller Zellen u. dgl. verwendet werden. Die

   Menge des zusetzenden Isoleucins, Methionins, Phenylalanine und/oder Valins hängt von den Zuchtbedin-20 gungen und der Art der verwendeten Aminosäuren ab; als Richt-vert wird 50 bis 1000 y/ml angegeben.

   Die L-Leucin-Fermentation ist unter aeroben Be-

   Die Erfindung betrifft ein Verfahrer, zur biochemi- dingungen durchzuführen. Die Züchtungstemperatur sehen Herstellung von L-Leucin durch aerobes Züchten liegt bei 25 bis 40' C, vorzugsweise zwischen 27 und von Mikroorganismen in assimilierbare Kahlen- und 25 37^c C. Der pH-Wert wird während des Züchtens Stickstoffquellen, anorganische Salze und Wuchs- zweckmäßigerweise mit Hilfe eines geeigneten Neuetoffe enthaltenden Nährmedien, die einen Gehalt an tralisieiungsmittels, wie z. B. Ammoniak, Natrium-Isoleucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin hydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Harnaufweisen, bei hierfür üblichen Temperatur- und stoff u. dgl., auf 5,5 bis 8,5 eingestellt. Nach 3- bis pH-Werten. 30 ötägigem Züchten hat sich das L-Leucin angesammelt.

   L-Leucin ist eine Aminosäure, die Lebensmitteln Nach dem Züchten werden die Mikroorganismenlür Menschen und Futtermitteln für Tiere als Nähr- zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt, stoff zugesetzt werden kann. Das Filtrat wird beispielsweise durch Behandlung mit

   Es ist bekannt (vgl. japanische Patentschrift 14395/ einem stark sauren Kationen-Austauscherharz ge-63), daß L-Leucin durch Züchten eines Mutanten- 35 reinigt, wonach das dabei absorbierte L-Leucin zur Stammes von Micrococcus glutamicus in einem Valin Gewinnung von Rohkristallen eluiert, konzentriert enthaltenden Nahrmedium gebildet werden kann; und in üblicher Weise gekühlt wird,
   über die erreichbare Ausbeute wurden keine Angaben Der durch das erfindungsgemäße Verfahren ergemacht. Auch ist bekannt (vgl. Zeitschrift »Amino reichte technische Fortschritt besteht darin, daß das Acids and Nucleic Acids«, 8 [1964], S. 53), daß die 40 L-Leucin in einer Menge von mehr als 10 mg/ml, also Vermehrungsgeschwindigkeit von Mutantenstämmen in wesentlich höherer Ausbeute als bei den bekannten von Corynebacterium glutamicum (Synonym für Verfahren gewonnen wird.

   Micrococcus glutamicus) durch Gegenwart von Iso- Im folgenden wird die ErHndung an Hand einiger

   leucin, Methionin, Phenylalanin und/oder Valin be- Ausführungsbeispiele näher erläutert,
   achtlich gesteigert werden kann. Schließlich ist be- 45
   kannt (vgl. britische Patentschrift 1 071 935, französische Patentschrift 1 367 815), daß man Aminosäuren Beispiel 1
   im allgemeinen, insbesondere auch L-Leucin, durch

   Züchte») von Mikroorganismen in einem Kohlen- Ein Nährmedium wurde mit Corynebacterium gluta-

   wasserstoff als Kohlenstoffquellen enthaltenden Nähr- 50 micum ATCC 21301 beimpft; das Nahrmedium entmedium herstellen kann; dabei wird mit Brevibacterium hielt Pepton (lg/dl), Fleischextrakt (lg/dl), Hefefla\um ATCC 14067 eine Ausbeute an i.-Leucin von extrakt (0,5 g/dl), Natriumchlorid (0,3 g/dl) und 24,4 mg/Liter erreicht. Glukose (2 g/dl); es hatte ein pH von 7,0. Die Züch-

   Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein tung wurde zur Bildung einer Impfkultur 24 Stunden wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von i.-Leu- 55 fortgesetzt.

   ein mit hoher Ausbeute zu schaffen. Die Fermentation wurde unter Verwendung eines

   Ausgehend von der biochemischen Herstellung von Nährmediums ausgeführt, das Glukose (10 g/dl), L-Leucin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen Ammonsulfat (2 g/dl), KH₄PO₄ (0,15 g/dl), K₁₁HPO₄ in assimilierbare Kohlen- und Stickstoffquellen, an- (0,05 g/dl), MgSO₄ · 7H_aO (0,05 g/dl), Phenylalanin organische Salze und Wuchsstoffe enthaltenden Nähr- 60 (ISOy/ml), Isoleucin (i00y/ml), Methionin (lOOy/ml), medien, die einen Gehalt an Isoleucin, Methionin, Valin (100y/ml), Biotin (lOOy/ml) und CaCO₃ Phenylalamin und/oder Valin aufweisen, bei hierfür (2 g/dl) enthielt. Jeweils 20 ml dieses NShrmediums üblichen Temperatur- und pH-Werten ist die ErHn- wurden in 250-ml-Erlenmeyerkolben gefüllt und jedung dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikro- weils sterilisiert. Das sterile Nährmedium in jedem Organismen Cornyebacterium glutamicum ATCC213O1 65 dieser Kolben wurde mit 1 ml der Impfkultur beimpft, oder ATCC 21335 einsetzt, — Kulturen dieser Mikro- deren Herstellung oben beschrieben wurde. Die Ferorganismen sind für die Öffentlichkeit in der »American mentation wurde unter 5tägigem Schütteln bei 28⁰C Tvne Culture Collection« hinterlegt. durchgeführt. Es sammelte sich in dem Fermenta-