CH653053A5 - Verfahren zur herstellung von l-isoleucin auf mikrobiologischem weg. - Google Patents

Description

dieser Erfindung eingesetzt werden können. Diese Analoga Die folgenden Beispiele illustrieren bevorzugte Ausführungs-

zeigen Toxizität gegenüber Stämmen, welche nicht L-Isoleucin formen des erfindungsgemässen Verfahrens.

überproduzieren. Solche Analoga umfassen a-Amino-ß-hydro- 5

xyvaleriansäure, Methylglycin, y-Dehydroisoleucin, 3-Cyclo- Beispiel 1

pentin-l-glycin, 2-Cyclopenten-l-glycin, o-Methylthreonin und Reagenzgläser mit je 10 ml 0,1M Phosphatpufferlösung bei pH ß-Hydroxyleucin. 7,0 wurden mit Kulturen von Brevibacterium thiogenitalis

Die Mutationsabart, welche resistent ist gegenüber Analoga (ATCC 19 240) inokuliert. Die erhaltenen Suspensionen wurden von Isoleucin, kann durch UV-Bestrahlung von nicht spezifi- io geschüttelt. Je 9 ml aus jedem Rohr wurden in ein steriles sehen Stämmen von Brevibacterium thiogenitalis oder durch Zentrifugenrohr gegeben und mit 1 ml wässrigem Äthylmethan-Behandlung der genannten Stämme mit einem Mutagen erhalten sulfonat versetzt. Dies führte, in den Suspensionen, zu einer werden. Beispiele für Mutagene sind: Äthylmethansulfonat, N- Äthylmethansulfonatkonzentration von 0,06 M. Die Suspensio-Methyl-Nrnitro-N-nitrosoguanidin usw. Anschliessend kann der nen wurden 18 h lang bei 30° C inkubiert und zentrifugiert, um die Stamm in Anwesenheit des Analogons kultiviert werden, man 15 Zellen zu isolieren. Die letzteren wurden anschliessend in entio-erhält so Kolonien mit einer Überproduktionskapazität an L- nisiertem Wasser wieder aufgenommen und nochmals zentrifu-Isoleucin. Beispielsweise kann der unspezifische Stamm kulti- giert. Dieses Vorgehen wurde mehrere Male wiederholt, um so viert werden bei 30° C, 2 bis 7 Tage lang auf Agar-Platten, wobei das Äthylmethansulfonat zu entfernen.

die letzeren die folgende Zusammensetzung haben: Gelatinehy-

drolysat, Pepton, 5,0 g/1; Rindfleischextrakte, 3,0 g/1; Agar 15 g/1; 20 Beispiel 2

Natriumsalz der 2-Hydroxy-ß-valeriansäure 25 g/1. Die mutierten Mikroorganismen aus dem Beispiel 1 wurden

Eine wachstumsfähige Kultur eines Mutationsstammes von auf Gradient-Platten gebracht, die aus zwei Schichten bestand. Brevibacterium thiogenitalis, welcher L-Isoleucin zu produzie- Die untere Schicht umfasste a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure ren vermag und resistent ist gegenüber a-Amino-ß-hydroxy vale- und zwar 25 g/1 und hatte die folgende Zusammensetzung: riansäure, ist am 23.9.80 beim American Type Culture Collée- 25 Gelatinhydrolysat, Pepton 5,0 g/1; Rindfleischextrakte 3,0 g/1; tion, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, Agar 15 g/1. Die obere Schicht hatte eine ähnliche Zusammenset-unter der Nr. ATCC 31723 hinterlegt worden. zung, enthielt aber keine a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure.

Die Fermentation des isolierten Mutationsstammes von Brevi- Repräsentative Kolonien von derjenigen Seite der Platte, auf der bacterium thiogenitalis kann in Schüttelkulturen oder in Tauch- sich langsam wachsende Organismen befanden, wurden verwen-fermentierungen unter aeroben Bedingungen ausgeführt wer- 3" det, um die folgenden Medien zu inokulieren: Gelatinhydrolysat-den. Die Fermentation wird bei Temperaturen zwischen 20 und pepton 5,0 g/1; Rindfleischextrakte 3,0 g/1 und Agar 15 g/1. 45° C ausgeführt und bei einem pH-Wert von 5 bis 9. Zur Die Fermentation wurde 4 Tagelang bei 30° C aufrechterhal-

Einstellungdes pH-Wertes können Kalziumkarbonat oder ten. Die Medien befanden sich in Erlenmeyer-Kolben und

Ammoniak verwendet werden. Das Fermentationsmedium ent- rotierten mit einer Geschwindigkeit von 300 Umdrehungen pro hält mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stick- 35 min. Die Medien enthielten Glukose 100 g/1; KH2P04 3 g/1; stoffquelle und weitere Elemente. Geeignete Kohlenstoffquellen MgS04-7 H20 14 g/1; FeS04-7 H20 0,01 g/1; MnS04-4 H20 0,01 für die Fermentation umfassen fermentierbare Zucker, Protein- g/l;(NH4)2S0450 g/1; Biotin 100 mg/1; Thiamin-HCl 1000 mg/1; hydrolysate und Proteine. Beispiele für geeignete Stickstoffquel- Soytone 0,63 g/1; CaC0350g/l. DerpHwurdemitNaOHauf7,2 len sind Harnstoff, Ammoniumsalze von organischen Säuren eingestellt. Zusätzlich enthielt die Lösung 10 g/1 a-Amino-n-(beispielsweise Ammoniumacetat oder Ammoniumoxalat) und 40 Buttersäure. Lyophilisierte Kulturen, die mittels der oben ange-Ammoniumsalze von anorganischen Säuren (beispielsweise führten Fermentationstechnik erhalten wurden, wurden bei der

Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumchlorid). American Type Culture collection unter der Nr. ATCC 31723 Die Mengen der Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquellen in den hinterlegt. Nach Analyse mittels Hochdruckflüssigkeits-Chro-

Medien variieren von 0,001 bis 20 % (Gewicht pro Volumen). matographie, enthielten Kultivierungsmedien mit ATCC 31723 Auch organische Nährstoffe (beispielsweise Com Steep Liquor, 45 im allgemeinen um die 6 mg/1 L-Isoleucin. In Abwesenheit von Pepton, Hefeextrakte) und/oder anorganische Elemente DL-a-Amino-n-buttersäure betrug die Ausbeute an L-Isoleucin

(Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Vitamine wie Biotin und viel weniger, beispielsweise ungefähr 0,2 mg/1.

Thiamin) und Aminosäuren (beispielsweise Isoleucin und Valin)

können den Medien zugegeben werden. Die Menge an L- R . .

Isoleucinpräkursor variiert zwischen 0,001 bis 20 % (Gew./Vol.) 50 eispie im Medium. Die Fermentation wird in einer Zeit von 16 bis 176 h Gemäss den Angaben von Beispiel 2 wurde als Präkursor a-ausgeführt, wobei das L-Isoleucin sich im Fermentationsmedium Ketobutyrat (Natriumsalz) eingesetzt. Die Ausbeute an L-Iso-anreichert. leucin war wiederum 6 g/1.

Nachdem die Fermentation abgeschlossen ist, d. h. wenn zwischen0,lund6%(Gew./Vol.)anIsoleucinimMedium 55 Beispiel 4

vorliegt, werden die Zellen und die anderen festen Kulturbe- Die Fermentierung von Brevibacterium thiogenitalis ATCC

standteile aus dem Fermentationsmedium entfernt. Die Abtren- Nr. 31723 wurde im folgenden Medium ausgeführt: Glucose nung kann beispielsweise dadurch geschehen, dass die Fermen- 10 % ; Ammoniumsulfat 5 %, KH2P04 0,30 % ; Magnesiumsul-tationsbrühe erwärmt und anschliessend filtriert oder zentrifu- fat-7 H20 0,04 % ; Kalziumkarbonat 12 % ; Soytone 0,3 % ; Biotin giert wird. Bekannte Verfahren können verwendet werden, um ® 100 jxg/1; Thiamin 1 (xg/1; a-Hydroxybuttersäure (Natriumsalz) 30 das L-Isoleucin aus der Vorlage zu gewinnen und/oder zu reini- g/1 und 1 ml/1 einer wässrigen Grundlösung von Spurenelemen-gen. Beispielsweise kann die abgefilterte Fermentationsbrühe ten, enthaltend ZnS04-7 H20 8,8 g/1; FeS04-7*H2010,0 g/1; mit einem starken Kationenaustauscherharz behandelt werden. CaS04-5 H20 0,06 g/1; Na2B407-10 H20 0,088 g/1; Na2Mo204-2 Das Harz wird nachher mit einer verdünnten alkalischen Lösung, H20 0,053 g/1; MnS04-H20 7,5 g/1; CoCl-6 H20 0,12 g/1; CaCl beispielsweise wässrigem Ammoniak, eluiert. Die Eluate, die 65 q,055 g/1; die Spurenelementenlösung war mit H2S04 auf einen das L-Isoleucin enthalten, werden dann kombiniert und konzen- pH von 2,0 eingestellt.

triert. Ein Alkanol, wie Methanol oder Äthanol wird dann zur Nach der Zugabe wurde der pH des Kulturmediums auf 7,0 "

konzentrierten Lösung gegeben. Die ausgefallenen kristallinen eingestellt und zwar mittels Zugabe von NaOH-Lösung.

653 053 4

Je 50 ml des genannten Mediums wurden nun in 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben. Die Medien wurden 5 Tage lang bei 30° C und bei einer Geschwindigkeit von 300 Umdrehungen pro min inokuliert. Die anschliessende Analyse mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie ergab einen Gehalt von 15,8 g/1 an L-Isoleucin, welches in diesem Gehalt im Filtrat der Fermentationsbrühe festgestellt werden konnte.

Claims (3)

653 053 2 PATENTANSPRÜCHE Szentirmai, A. andI. Horvath. (1976). Regulationof branch- ed-chain amino acid biosynthesis. Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung., 23,137-149.

1. Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin, umfassend die Umbarger, H.E. (1974). The elementsinvolvedin the multiva-Kultivierung, unter aeroben Bedingungen, einer Mutationsabart 5 lent régulation of the isoleucine and valine biosynthetic enzymes vonBrevibacteriumthiogenitalis, welche Abart resistent ist oftheenterobacteriaceae. Proceedingsof the Ist. Intersectional gegenüber einem Analogen von L-Isoleucin, wobei die genannte Congress of IAMS, 1, Tokyo.

Kultivierung in Anwesenheit von a-Ketobuttersäure, a-Aceto-ß- Umbarger, H.E. (1973). Genetic and physiological régulation hydroxybuttersäure, a,ß-Dihydroxy-ß-methylvaleriansäure, a- of isoleucine, valine and leucine formation in the Enterobacteria-Keto-ß-methylvaleriansäure, a-Hydroxybuttersäure, a-Amino- 10 ceae. From «Genetics of Industriai Microorganisms». n-buttersäure oder deren wasserlöslichen Salze als Präkursoren von L-Isoleucin ausgeführt wird, um das Fermentationsmedium Die Biosynthese für die Herstellung von L-Isoleucin in Serratia zu erhalten, und weiter umfassend die Gewinnung des angereich- marcescens ist ebenfalls ausgiebig untersucht worden, wobei erten L-Isoleucins aus dem genannten Medium. verschiedene Antagonisten wie Isoleucinhydroxamat und a-

2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, in dem die Mutations- is Aminobuttersäure eingesetzt wurden. Eine Methode für die abart das Brevibacterium thiogenitalis ATCC 31723 ist. Herstellung von L-Isoleucin in E. coli ist ebenfalls veröffentlicht

3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, in dem die Konzentra- worden; als Antagonist wurde dabei Thiaisoleucin eingesetzt, tion des Präkursoren im Fermentationsmedium zu Beginn der Auch a-Aminobuttersäure wurde als Antagonist eingesetzt und Fermentation zwischen 0,001 und 15 % (Gew./Volumen) liegt. zwar bei der Untersuchung der Herstellung von L-Isoleucin in

4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, in dem die Fermentie- 20 Bifidobacterium. Die Herstellung von L-Isoleucin wurde auch rung bei einer Temperatur zwischen 20 und 45° C und während 8 untersucht in Mikroorganismen der Geni Pseudomonas, Salmo-bis 176 h ausgeführt wird. nella(unterVerwendungvon51,51,51-Trifluorleucinals Antago-

5. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, in dem der pH-Wert nist) und in Streptomyces rimosus.

des Fermentationsmediums während der Kultivierung zwischen Zusätzlich zu den obigen Veröffentlichungen sind verschie-5 und 9 liegt. 25 dene Patente bekannt, welche die Herstellung von L-Isoleucin

6. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, in dem die Mutations- betreffen. Siehe dazu beispielsweise die US-PS 3 058 888 (Pseu-abart das Brevibacterium thiogenitalis ATCC 31723 ist, in dem domonas Stämme; unter Einsatz von a-Aminobuttersäure), US-die Fermentation bei 20 bis 45° C ausgeführt wird und zwar 8 bis PS 3 231478 (Brevibacterium, unter Verwendung von Threonin), 176 h lang und bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9. US-PS3262861 (Brevibacterium, unter Verwendung von a-

7. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, in dem der Präkursor 30 Aminobuttersäure), US-PS 3532600 (Arthrobacter citreus, ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe: a-Hydroxybutter- unter Verwendung von a-Aminobuttersäure) ; US-PS 3 671396 säure, a-Aceto-ß-hydroxybuttersäure, a,ß-Dihydroxy-ß-methyl- (Brevibacterium, unter Verwendung von a-Aminobuttersäure, valeriansäure, a-Ketobuttersäure und D ,L-a-Amino-n-Butter- a-Hydroxybuttersäure oder Threonin) und US-PS 3 841968 (Sersäure sowie aus Alkalimetallsalzen davon. ratia marcescens, unter Verwendung von L-Threonin, L-Homo-

8. Verfahren gemäss Patentanspruch 7, in dem der Präkursor 35 serin oder L-Asparaginsäure mit Resistenz gegenüber Isoleucin-die a-Ketobuttersäure oder ein Alkalimetallsalz davon ist. hydroxamat und/oder a-Aminobuttersäure).

9. Verfahren gemäss Patentanspruch 7, in dem der Präkursor Diese Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von D,L-a-Amino-n-buttersäure oder ein Alkalimetallsalz davon ist. L-Isoleucin.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von L-

40 Isoleucin auf mikrobiologischem Wege ist im vorangehenden

Patentanspruch 1 charakterisiert.

Die Herstellung von L-Isoleucin, L-Valin und anderen Amino- Unspezifische Stämme von Brevibacterium thiogenitalis (beisäuren mittels Fermentationsverfahren ist Gegenstand von vie- spielsweise ATCC 19240), die für die Mutation ausgewählt len Untersuchungen und Forschungsarbeiten. Eine grosse Zahl werden, sind durch eine Überproduktion von Glutaminsäure von Arten von Mikroorganismen sind zusammen mit verschiede-45 charakterisiert. Die Mutationsstämme, die mit Vorteil in dieser nen Anologon von L-Isoleucin, Threonin, Valin usw. untersucht Erfindung eingesetzt werden, benötigen keine Präkursoren für worden. Aus der US-PS 3 893 888 ist es beispielsweise bekannt, die Kultivierung; hingegen benötigen sie den Präkursoren für die dass L-Valin erhalten werden kann mittels eines Mutationsstam- Herstellung von L-Isoleucin. In Abwesenheit des Präkursors mes von Brevibacterium, welcher Stamm resistent ist gegenüber verlagert sich die Produktion in Richtung L-Valin. Die Biosyn-der a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure (AHV). Die Biosynthese 50 these, mittels derer Mikroorganismen L-Isoleucin produzieren, unter Benutzung von Brevibacterium für die Herstellung von L- ist im allgemeinen bekannt, siehe beispielsweise dazu Umbarger, Isoleucin, ausgehend von Ethionin und AHV als Antagonist ist «Amino Acid Biosynthesis and Its Regulation», Ann. Rev. ebenfalls untersucht worden. Siehe dazu: Biochem. 1978,47:533-606. Wie in der genannten Referenz ausgeführt wird, verläuft die Synthese wahrscheinlich über die

Ikeda, S., I. Fujita and Y. Hirose. (1976). Culture conditions 55 folgenden Stufen:

of L-isoleucinefermentation from acetic acid. Agr. Biol. Chem., Threonin, a-Ketobutyrat, a-Aceto-ß-hydroxybutyrat, a,ß-40 (3), 517-522. Dihydroxy-ß-methylvalerat, a-Keto-ß-methylvalerat, L-Iso-

Ikeda, S., I. Fugita and F. Yoshinaga. (1976). Screening of L- leucin.

isoleucine producers among ethionine résistant mutants of L- Als Präkursoren im erfindungsgemässen Verfahren kommen threonine producing bacteria. Agr. Biol. Chem., 40 (3), 511-516.60 die in der oben aufgeführten Folge nach Threonin angegebenen

Shiio, Isamu, A. Sasaki, S. Nakamori and K. Sano. (1973). Verbindungen in Frage, wie auch a-Hydroxybuttersäure und a-Production of L-isoleucine by AHV résistant mutants of Brevi- Amino-n-Buttersäure. Die Präkursoren können sowohl in ihrer bacterium flavum. Agr. Biol. Chem., 37 (9).2053-2061. Säureform wie auch als wasserlösliche Salze, beispielsweise

Alkalimetallsalze, eingesetzt werden. Bevorzugt werden die

Verschiedene weitere allgemeine Veröffentlichungen betref- 65 Natriumsalze. Die Mutationsabarten, die zum erfindungsgemäs-fend Biosynthesen zur Herstellung von L-Isoleucin wie auch zur sen Verfahren gehören, sind alle dadurch charakterisiert, dass Herstellung von anderen Aminosäuren liegen vor. Siehe dazu die Umwandlung von Threonin zu a-Ketobutyrat verhindert beispielsweise: wird.

3 653 053

Gewisse Analoga der natürlich vorkommenden Aminosäuren Feststoffe können aus wässrigen Alkanollösungen rekristallisiert sind geeignet für die Isolierung der Mutationsstämme, die in werden, womit reines, kristallines L-Isoleucin erhalten wird,