DE1792403C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L Lysin - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L LysinInfo
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Description
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch aerobes Züchten
von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und die Tür ihr Wachstum
erforderlichen Aminosäuren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-1 erhältnissen.
Es ist bekannt, zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin verschiedene Mikroorganismen-Mutanten zu
verwenden, die Homoserin, Threonin + Methionin, Threonin .+ Cystathionin oder Threonin + Homocystein
für ihr Wachstum benötigen (USA.-Patent- 3c schrift 1979 439). In der deutschen Auslegeschrift
1 177 104 werden zur Herstellung von L-Lysin die Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC
13 286 oder Micrococcus glutamicus ATCC 13 287 gezüchtet, in der französischen Patentschrift 1 486 235
wird die beste Ausbeute an L-Lysin durch Züchten von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19 350
erzielt.
Nachteilig bei den bisherigen Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin ist, daß die Ver-Wendung
der genannten Mikroorganismen-Mutanten zu unbefriedigenden L-Lysinausbeuten führt, insbesondere
hinsichtlich der im Ausgangsmaterial verwendeten Zuckermenge. Außerdem sind diese Verfahren
in ihrer Durchführung relativ kostspielig, da verhältnismäßig große Mengen an Aminosäuren oder
Nährsubstanzen, die Aminosäuren enthalten, zum Züchtungsmedium gegeben werden müssen.
Aufgabe der Erfindung war die Entwicklung eines
Verfahrens zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin. mit welchem merklich höhere Ausbeuten zu
erreichen sind und die Nachteile und Mängel der bekannten Verfahren überwunden werden.
Eriindungsgegenstand ist ein Verfahren zur biolecLiischen
Herstellung von i.-Lysin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate,
Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und die für ihr Wachstum erforderlichen Aminosäuren enthaltenden
Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Verhältnissen, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253,—ATCC 21 254, —ATCC
21 255, — ATCC 21 299 oder — ATCC 21 300 einsetzt.
Nach Prüfung zahlreicher Mikroorganismen auf ihre Einsatzmöglichkeit zur Produktion von i.-Lysin
wurde gefunden, daß Corynebactcrium glutamicum ATCC 13 287 und — ATCC 14 296 außerordentlich
eut zur Produktion von L-Lysin mittels Fermentation eeeignet ist (USA.-Patentschrift 2 979 439).
Diese Stämme, welche die Ausgangsstämme für die beim erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden
Mikroorganismen darstellen, sind Mutanten mit Nährstoffbedürftigkeitseigenschaften
für Homoserin, Threonin + Methionin, Threonin -t- Cystathionin oder
Threonin + Homocystein für ihr Wachstum. Durch Bestrahlung dieser Ausgangsstämme mit UV-Strahlen
ergab sich erfindungsgemäß, daG spezielle mutante Stämme erhalten werden, die sowohl die für die Ausgangsstämme
beschriebenen Nährstoffbedürfnisse als auch weiterhin eine Nährstoffbedürftigkeit für Leucin.
Histidin oder Isoleucin + Valin aufweisen. Diese neuen Mutanten besitzen nun überraschenderweise
eine größere Fähigkeit zur Produzierung von L-Lysin ais die ursprünglichen Stämme. Speziell werden die
Ausbeute, bezogen auf die Ausgangsmenge an Zucker, und die L-Lysin-Konzentration in der erhaltenen
Kulturflüssigkeit durch Verwendung der neuartigen Mutanten bis zu etwa 10 bis 25% erhöht.
Die neuartigen, erfindungsgemäß einzusetzenden
Mutanten sind:
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253,
Corynebacterium glutamicum AT<~C 21 254,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 255,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 299,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 300.
Corynebacterium glutamicum AT<~C 21 254,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 255,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 299,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 300.
Wenn man in einem Vergleichsversuch (s. Beispiel 6) die erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismenstämme
von Corynebacterium glutamicum einerseits und die Mikroorganismenstämme der deutschen
Auslegeschrift 1177104 (Micrococcus glutaminus
ATCC 13 286 und -13 287) bzw. Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19 350 der französischen
Patentschrift 1 486 235 unter gleichen Bedingungen züchtet, erbringen die erfindungsgemäß verwendeten
Stämme wesentlich höhere Ausbeuten an L-Lysin.
In Tabelle 1 sind die Nährstoffbedürfnisse der Ausgangsstämme und der neuartigen erfindungsgemäß
angewendeten Stämme zusammengefaßt.
Mikroorganismus
Corynebacterium
glutamicum
glutamicum
ATCC 13 287 (Ausgangsstamm)
Corynebacterium
glutamicum
glutamicum
ATCC 21 253
Corynebactcrium
glutamicum
glutamicum
ATCC 21 254
Coiynebacterium
glutamicum
glutamicum
ATCC 21 255
Nährsl -.flbedürfnisse
(Homoserin) oder
(Threonin
+ Methionin) oder
(Threonin
+ Cystathionin) oder
(Threonin
+ Homocystein)
Nährstoffbedürfnisse des Ausgangsstammes + Leucin
Nährstoffbedürfnissc des Ausgangsstammes + Histidin
Nährstoffbedürfnisse des Ausgangsstammes + Isoleucin + Valin
Fortsetzunii
Mikroorganismus
Corynebacterium
glutamicum
glutamicum
ATCC 14 296 (Ausgangsstamm)
Corynebacterium
glutamicum
glutamicum
ATCC 21 299
Corynebacterium
glutamicum
glutamicum
ATCC 21 300
Nährstoflbedürfnisse
Threonin
NährstofTbedürfnisse des Ausgangsstammes + Histidin
Nährstoffbedürfnisse des Ausgangsstammes
+ Leucin
Diese Mutanten sind neuartige, bisher unbekannte L-Lysin produzierende Mikroorganismen. Bei der
Durchführung einer L-Lysin-Fermentation unter Verwendung
der erfindungsgemäß einzusetzenden Mutanten sind die Zusammensetzung des Grundmediums
und die Züchtungsbedingungen praktisch dieselben, wie sie üblicherweise angewendet werden und z. B.
in der USA.-Patentschrift 2 979 439 beschrieben sind. So ist entweder ein natürliches oder ein synthetisches
Nährmedium geeignet, solange es die für das Wachstum
des verwendeten Mikroorganismus notwendigen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind in der
Technik bekannt und umfassen Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstof.quelle, anorganische
Verbindungen u. dgl. in angemessenen Mengen, die von dem verwendeten Mikroorganismus ausgenutzt
werden. So kommen als Kohlenstoffquellen beispielsweise
Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen
usw. oder jede andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie Glycerin. Sorbit, ferner organische Säuren, wie
Essigsäure usw., in Frage. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Gemischen zweier oder
mehrerer verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder
organischen Stickstoffverbindungen verwendet werden. wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat,
Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat usw.. oder natürliche stickstoThaltige Substanzen,
wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate,
Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleie· extrakt usw. Auch diese Stoffe können einzeln oder
in Gemischen zweier oder mehrerer verwendet werden. Anorganische Verbindungen, die zu dem Züchtungsmedium
hinzugegeben werden können, sind
z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat. Kaliummonohydr^genphosphat,
Eisensulfat. Mangansulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Calciumcarbcnat, Natriumchlorid usw. Wenn
jedoch Rohmaterialien, wie z. B. Abfallmelassen, verwendet werden, die größere Mengen anorganischer
Stoffe enthalten, kann die Züchtung ohne Zugabe zusätzlicher anorganischer Substanzen zu dem Medium
durchgeführt werden.
Darüber hinaus ist es für die biotechnische Herstellung von L-Lysin gemäß der Erfindung natürlich
notwendig, die entsprechenden, für das Wachstum der Mikroorganismen benötigten Aminosäuren als
Nährsubstanzen zu dem Züchtungsmedium hinzuzufügen. Man kann die Aminosäuren als solche oder
als Gemische verschiedener Arten von Aminosäuren, die aus natürlichen Substanzen gewonnen werden,
verwenden. Vorzugsweise werden jedoch im allgemeinen verschiedene Proteinhydrolysate, mikrobielle
Hydrolysate, Sojabohnenkuchenhydrolysate, Weizenglutenkuchenhydrolysate u. dgl. verwendet.
Wie man aus Tabelle 2 ersehen kann, sind die benötigten Mengen erheblich geringer als diejenigen,
die bei Verwendung der Aussangsstämme notwendig sind. Dies ist ein überraschendes und unerwartetes
Resultat und ein hervorstechendes Merkmal der Erfindung:
Nährsubstanz
Tabelle 2 | Produzierte Menge | an L-Lysin (mg/ml) | ATCC 21253 | |
Zugegebene Menge | ATCC 21 255 | ATCC 21 254 | 48,6 | |
(g,v:i) | ATCC 13 287 (Ausgangsstamm) |
48,6 | 50,9 | 52,1 |
2.0 | 37,4 | 52,1 | 49,5 | 49,9 |
3.0 | 40.3 | 49,9 | 47,9 | 48,7 |
4,0 | 44.1 | 48,7 | 47.5 | 50,4 |
5,0 | 43.4 | 51,4 | 49,2 | 45,2 |
1.5 | 38.5 | 48,1 | 46,0 | |
2,0 | 42.4 | |||
Getrocknetes Weizenglutenkuchenhydrolysat
Proteinhydrolysat
Anmerkung I: Zusammensetzung des G rund medi ums: Melasse (als Glucose) 18 g/dl und Ammoniumsulfat 4 g/dl.
Anmerkung 2: Züchtungsverfahren: 3 I des Züchtungsmediums werden in einen 5-l-Jarfermenter eingebracht und sterilisiert. Die oben
angegebenen Stämme werden eingeimpft und bei einem pH-Wert von 7.0. einer Temperatur von 300C, einer Belüftung mit 3 l/Min, und einer
Rührgeschwindigkeit von 4(Xl Upm 70Slunden lang gezüchtet.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, wie z. B. aeroben Schütteln der Kultur oder durch
Rühren einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa 24 bis 37° C, vorzugsweise etwa 30" C, und
einem pH-Wert von etwa 5 bis 8,5, vorzugsweise etwa 7,0. durchgerührt. Nach 2- bis 5tägigcr Züchtung
werden unter diesen Bedingungen wesentliche Mengen an i.-Lysin in der erhaltenen Kühlflüssigkeit
gefunden.
Nach Abschluß der Züchtung kann das i.-Lysin aus der Fermentationsflüssigkeit mit den üblichen
Methoden, wie z. B. durch Behandlung mit einem loncnaustauschcrharz, Extraktion mit Lösungsmitteln.
Ausfüllung mit Metallsalzen. Chromatoeranhie
od. dgl. abgetrennt werden. Ein wesentliches Merkmal
der Erfindung besteht darin daß fast kein i.-Valin als Nebenprodukt entsteht, womit eines der
Probleme ausgeschaltet wird, welche bei Verwendung der Ausgangsstämme zur Produzierung von ι -Lysin
auftreten. Dieser Vorteil zeigt sich besonders bei Verwendung von Corynebacterium glutamicum
ATCC 21 253 und Corynebacterium glutamicum ATCC 21 255. Das Reinigungsverfahren wird auf
diese Weise wesentlich vereinfacht. ;o
Die folgenden Beispie'e sollen die Erfindung erläutern.
Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.
Eine Impfkulturtii'.asigkeit wird hergestellt, indem
man 200 ml einr., Züchtungsmediums, enthaltend
5 g dl Abfallmehssen (als Glucose). ύ.ΰ5 g di Kaliumhydrogenphosphat.
0.05 g dl Dikaliumhydr.)gcnpnosphat, 0.3 g dl Harnstoff und 4 g dl Sojabohnen-Proteinhydrolysat.
in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gibt. Corynebacterium glutamicum ATCC 21 255
wird in den Kolben eingeimpft. Die Züchtung wird dann unter aeroben Schütteln 24 Stunden lang bei
30C durchgeführt. 2s
3 1 eines Züchtungsmediums, enthaltend 18 g dl Abfallmelassen (als Glucose). 4 g dl Ammoniumsulfat
und 1,5 g dl Sojabohnen-Proteinhydrolysat. werden in einen 5-1-Jarfermenter eingebracht und sterilisiert.
Anschließend werden 500 ml des obigen Inoculums in das Fermentationsmedium eingeimpft und die
Züchtung begonnen. Während der Züchtung werden eine Belüftung mit etwa 3 1 min und eine Rührgeschwint'igkeit
von etwa 400 Upm sowie eine Temperatur von 30 C aufrechterhalten. Der pH-Wert
wird mit Ammoniakwasser auf etwa 6,8 bis 7.0 eingestellt. Nach 70 Stunden der Züchtung beträgt die
Konzentration an 1.-Lysin in der erhaltenen KulturflüsSigkeit
48.7 mg/ml (als Hydrochlorid) und die Ausbeute, bezogen auf die Zuckermenge. 27.0%. Die
Konzentration des als Nebenprodukt erzeugten 1.-Valin beträgt weniger als 0.3 mg ml. Wenn man die
Züchtung in derselben Weise, jedoch unter Verwendung des Ausgangsstammes Corynebacterium glutamicum
ATCC 13 287 als Kontrollversuch durchführt, betragen die Konzentrationen an produziertem
i.-Lysin bzw. 1-Valin 37.2 bzw. 1,8 mg, ml.
Nach Abschluß der Züchtung wird die Kulturfiüssigkeit
filtriert und mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz nach üblichen Arbeitsweisen behandelt.
Anschließend wird das Eluat auf einen pH-Wert von 5.0 eingestellt und konzentriert, um die Kristallisation
zu bewirken. Als Ergebnis werden 120 g rohe Kristalle von 1 -Lysinhydrochlorid erhalten.
55
3 1 eines Züchtungsmediums, enthaltend 16 g/dl
Saccharose, 0.15 g/dl Kaliumhydrogenphosphat. 0,05 g/dl Dikaliumhydrogcnphosphat. 4 g/dl Ammo- fio
niumsulfat. 0.05 g/dl Magnesiumsulfat. 0,002 g.-dl
Mangansulfat, 0,002 g/'.ί! Eiscnsnlfat, 30 rj.g/1 Biotin.
120 [ig/ml Methionin. 300 [/.g/ml Threonin, 500 (ig/ml
Leucin und 100 μg ml Cystin, werden in einen 5-1-Jarfermenter
eingebracht ,/nd sterilisiert. 500 ml des (15
Inoculums von Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253, das zuvor durch Züchtung in der gleichen
Weise wie im Beispiel 1 erhalten worden ist. werden in das Züchtungsmedium eingeimpft. Die Züchtung
wird dann unter denselben Bedingungen wie im Beispiel I durchgeführt.
Nach 70stündiger Züchtung beträgt die Konzentration an i.-Lysin in der erhaltenen kulturflüssigkeit
54.6 mg ml (als Hydrochlorid). Die Ausbeute, bezogen auf die Zuckermenge, beträgt 34.2"«. Die Menge an
! -Valin, die als Nebenprodukt in dem Medium produziert worden .ist. beträgt weniger als 0.5 mg ml.
Wenn man die Züchtung bei einem Kontrollversuch in derselben Weise wie es oben beschrieben worden
ist. jedoch mit d:r Abwandlung, daß der Ausgangsstamm
Corynebacterium glutamicum ATCC 13 287 als Mikroorganismus verwende» wird, und daß in
dem Ausgangsfermentationsmedium kein Leucin enthalten ist. durchführt, beträgt die erhaltene Konzentration
an 1-Lysin 42.1 mg ml. nie Menge des beim
Kontrollversuch als Nebenproduh' erzeugten i.-Valins
beträgt 1.7 mg ml.
Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß Corynebacterium
glutamicum ATCC 21 254 als Impfstamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit
erhalten, die 50.7 mg,ml 1-Lysin (als Hydrochlorid)
enthält. Die Ausbeute beträgt 28.1%. bezogen auf die eingesetzte Zuckermenge.
Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß Corynebacterium
glutamicum ATCC 21 299 als Impl'sUimm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit
erhalten, die 53.2 mg ml i.-Lysin (als Hydrochlorid) enthält.
Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß Corynebacterium
glutamicum ATCC 21 300 als !mpfstamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit
erhalten, die 51,6 mg ml 1.-Lysin (als Hydrochlorid)
enthält.
In diesem Beispiel werden zu Vcrgleichszwecken die Versuchsstämme Micrococcus glutamicus ATCC
'3 2:i6 und ATCC' 13 287 der deutschen Auslegeschrift
1 177 104 sowie der Mikroorganismenstamm Brevibaclcriurn ammoniagcnes ATCC '9 350 (französische
Patentschrift 1 486 235) gezüchtet.
Die Züchtung erfolgte innerhalb 70 Stunden in der gleichen Weise wie im Beispiel f. Es wurden die
foliienden Ergebnisse erhalten:
Tabl lic 3
Mikroorganismenstamm
Micrococcus glutamicus
ATCC 13 286
ATCC 13 287
Brevibacterium ammoniagcnes
ATCC 19 350
ATCC 19 350
i.-Lysin-Ausbcutc
(mg ml)
(mg ml)
37.0
37.2
37.2
27.0
Forlsetzung
Corynebacterium glutamicum
ATCC 21 253
ATCC 21 254
ATCC 21 255
ATCC 21 299
-Lysin-Ausbeulc
(mg/ml)
54,6 50.7 48,7 53,2
Fortsetzung
Mikroorganismenstamm
ATCC 21 300
Mikroorganismenstamm
ATCC 21 300
I -I.ysin-Ausbeutc (mg mil
51.6 """
Aus den Ergebnissen wird ersichtlich, daß dk
ι -Lysin-Ausbcutcn mit den crlindungsgcmäß einzusetzenden
Mikroorganismenstämmen bedeutend höher sind als mit Mikroorganismenstämmen, deren
Einsatz von der Technik bereits vorgeschlagen worden ist.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur biotechnischen Herstellung vDn t-Lysin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und die für ihr Wachstum erforder-Bchen Aminosäuren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Vcrtältnissen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Corynebacterium flutamicum ATCC 21 253, — ATCC 21 254 — ATCC 21 255, — ATCC 21 299 oder — ATCC 21 300 einsetzt.!5
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5521367 | 1967-08-30 | ||
JP5521367 | 1967-08-30 |
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DE1792403A1 DE1792403A1 (de) | 1972-02-10 |
DE1792403C true DE1792403C (de) | 1973-04-05 |
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