DE2116412C3 - Biotechnisches Verfahren zur Gewinnung von 1-Serin - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von 1-Serin durch Züchten eines Mikroorganismus, der imstande ist, 1-Serin in einem Nährmedium zu produzieren, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Substanzen enthält, und durch Isolierung des 1-Serins in an sich bekannter Weise. Derartige Verfahren sind bekannt (vergleiche z. B. die französische Offenlegungsschrift 2 006 437 und die britische Patentschrift 1 207 096). Die Ausbeute an 1-Serin ist dort allerdings verhältnismäßig gering.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Gattung anzugeben, bei dem die Ausbeute an 1-Serin beachtlich erhöht wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von 1-Serin durch Züchten eines Mikroorganismus der imstande ist, 1-Serin in einem Nährmedium zu produzieren, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen lind anorganische Substanzen enthält, und durch Isolierung des I-Serins in an sich bekannter Weise. Die Erfindung besieht darin, daß man dem Nährmedium Wenigstens eine Verbindung aus der Gruppe Glyzin, 1-Threonin und !-Homoserin zu einer Gesamtkonzentration in Höhe von mehr als 1 mg/ml zusetzt.

Zur Züchtung der 1-Serin produzierenden Stämme ist entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium geeignet, sofern es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des jeweiligen Stammes enthält. Solche Nährstoffe sind gut bekannt und schließen Substanzen ein, wie z. B. eine C-Quelle, eine N-Quelle Und aiiorganische Verbindungen, welche durch den Verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen benutzt werden. So können als C-Quelle z. B. Kohlenhydrate, wie Glukose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melasse, Mannose, Glyzerin, Sorbit oder Mannit oder irgendeine andere geeignete C-Quelle erwähnt werden, wie Zucker, Alkohole irganische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure, renztraubensäure, Fumarsäure oder Aminosäuren, Wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Im Falle der Verwendung von I-Serin produzierenden Mikroorganislicn, welche Kohlenstoffe assimilieren, können Kohfcnwasscrstoffe, z. B. η-Paraffine, Kerosin oder Erdölfraktioncn, einschließlich der Leichtöle, Schweröle, Paraffinölc und dergl. imNährstoffmediumalsC-Quelle •der in Kombination mit einer oder mehreren der hier •rwähnten C-Quellen verwendet werden. Es können entweder eine C-Quelle oder ein Gemisch von zwei oder ■lchrcrcn C-Quellen verwendet werden.

Als N-Qiielle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen verwendet werden, wie Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie z. B. Ammonchlorid, Ammonsulfat, Ammonitrat, Ammonacctat,' Ammonphosphat und Ammoncarbonat oder natürliche Substanzen die Stickstoff enthalten, wie MaisquellHüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Peptone, Fischmehl oder auch Bouillon, Caseinhydrolysat, Fischpreßwas-

ser, Reiskleieextrakt, entfettete Sojabohnenabfälle oder deren Digerierungssubstanzen oder Chrysahshydrolysate. Auch diese Substanzen können wieder entweder einzeln, oder in Kombination von zweien oder mehreren verwendet werden.

Anorganische Verbindungen, welche ^m Zuchtmedium zugesetzt werden können, schließen ein: Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaüummonohydrogenphosphat, Ferrosulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid,

Zinksulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat.

Wenn der verwendete Mikroorganismus andere Nährstoffe zum Wachstum benötigt, so sollten selbstverständlich adäquate Mengen der benötigten Nährstoffe zur Befriedigung· der besonderen Erfordernisse

dem Zuchtmedium zugefügt werden. Diese Nährstoffe sind oftmals in den dem Medium als N-Quelle zugesetzten natürlichen Substanzen enthalten und machen es nicht notwendig, daß sie zusätzlich zugesetzt werden. Falls es jedoch nötig sein sollte, so können diese Sub-

stanzen dem Medium als solche zugefügt werden, sie schließen auch Wachstumsfaktoren mit ein, wie z. B.

Aminosäuren, Vitamine, wieThiamin, Cobalamin oder Biotin.

Erfindungsgemäß sind dem Zuchtmedium mehr als

1 mg/ml Glyzerin, 1-Threonin oder 1-Homoserin zuzusetzen. Hierdurch wird die Menge an 1-Serin im Medium erhöht.

Man fühlt die Züchtung mit den erfindungsgemäßen Zusätzen unter aeroben Bedingungen durch, z. B.

unter aerobem Schütteln der Kultur oder unter Belüftung und Rühren einer Unterwasser-Kultur, bei einer Temperatur von 20 bis 40° C und einem pH-Wert von 4,0 bis 9,5. Die Temperatur und der pH-Wert können variiert werden — sogar außerhalb der angegebenen Grenzen. Man richtet sich hierbei nach den Wachstumserfordernissen des verwendeter. Mikroorganismus. Um hohe Ausbeuten an 1-Serin zu bekommen, ist es wünschenswert, während des Züchtens den pH-Wert des Kulturmeuiums etwa auf dem Neutralpunkt (7,0) zu halten. Nach 1- bis 5tägigem Züchten sind unter diesen Bedingungen betiächtliche Mengen an 1-Serin produziert und in dem anfallenden Kulturmedium angehäuft worden.
Nach Vollendung der Züchtung werden die Mikroorganismenzellen und unerwünschte Niederschläge aus der Zuchtbrühe entfernt, und man gewinnt das 1-Serin aus der Brühe mit konventionellen Mitteln, z. B. durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung, Adsorption, Chromatographie oder Konzentration. Eine besonders geeignete Methode zur Gewinnung ist die Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Stämme stehen von Seiten der American Type CuI-

6; ture Collection der Öffentlichkeit frei zur Verfügung. Das 1-Serin wurde aus dem Kulturmedium in jedem Falle in solch einer Weise gewonnen, daß man nach der Entfernung der bakteriellen Zellen aus der Brühe

durch Filtration das Filtrat ein stark saures !onenaustauscherharz zwecks Adsorption des I-Serins passieren ließ, und daß man anschließend das !-Serin mit wäßrigem Ammoniak eluierte. Das Eluat wurde dann konzentriert, um rohes !-Serin auskristallisieren zu lassen. Das rohe kristalline !-Serin kann — falls erforderlich — umkristallisiert werden und ergibt gereinigtes kristallines I-Serin.

Bei sp ie ! 1

Es wurde der 1-Serin produzierende Stamm Arthrobacter paraffines ATCC 21 218, welcher zum Wachstum Isoleucin und Methionin benötigt, verwendet.

Man impfte den Saatgut-Stamm auf 20 ml eines sterilisierten Kulturmediums (pH-Wert 7,4) in einem 250 ml Erlenmeyerkolben. Das Medium setzte sich zusammen aus 2% Sorbit, 1% Rindfleischextrakt, 1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt und 0,3% NaCI.

Das Saatgut wurde in 24 Std. bei 30⁰C unter Schütteln gezüchtet, und die entstandene Saatkultur ao (1 ml) wurde dann auf 10 ml eines sterilisierten Fermentationsmediums in einem großen Reagenzglas geimpft. Das Saatgut wurde dann unter Schütteln 96 Stunden lang bei 30⁰C weiter gezüchtet.

Als Fermentationsmedium wurde ein Medium (pH-Wert 7,4) verwendet, das zusammengesetzt war aus 10% eines n-Alkangemisches (C₁₁-C₁₄), 2% 0 K

0,1%

(NHj₂SO₄, 0,1 % K₂HPO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄-7H₂G, 2% CaCO₃, 1 mg/ml Thiamin, 100 mg/i i-Methionin und 1 ml/1 Spurenelementlösung (Zusammensetzung: 83 mg/1 Na₂B₄O₇ · 10H_ÄO, 37mg/l (NH₄)_eMo₇O₂₄ · 4H₂O, 97U mg/1 'CCl₃-OH₂O, 8,8 mg/1 ZnSO₄-7H₂O, 20 mg/1 CusO₄-5H₂O und 7,2 mg/1 MnCl₂ · 4H₂O). Verschiedene Mengen an Glyzin wurden, wie in Tabelle 1 gezeigt, jeweils dem Medium zugefügt.

Dre 1-Serin-Mengen, die unter Verwendung dieses Mediums produziert wurden, sind aus Tabelle 1 zu ersehen.

Tabelle 1

Menge an

zugefügtem Glyzin

(mg/ml)

10

(Kontrast)

Menge an

produziertem 1-Serin
(mg/ml)

40

45

4,8
5,6
3,1
2,3

Beispiel 1 beschriebenen Züchtung ähnliche Züchtung durch und erhielt 5,2 mg/ml I-Serin. im Gegensatz dazu erhielt man unter Verwendung des Mediums ohne !-Threonin 2,3 mg/ml I-Serin. Die Menge an' produziertem !-Serin unter Verwendung von ,10 mg/ml !-Homoserin an Stelle von !-Threonin betrug 4,8 mg/ml.

Beispiel 3

Es wurde als Saatkultuir der I-Serin produzierende Stamm Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21 222 verwendet. Diese wurde ähnlich wie im Beispiel 1 beschrieben, jedoch mit dem Unterschied, daß 5% des Sorbits durch n-Alkan substituiert wurden, erhalten.

Unter Verwendung des Fermentationsmediums wurden 1,1 mg/ml 1-Serin produziert, während 3,2 mg/ml !-Serin in einem Medium produziert wurden, welchem 5 mg/ml Glyzin zugefügt worden waren.

Beispiel 4

Die Züchtung wurde in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben ausgeführt unter Verwendung des 1-Serin produzierenden Stammes Corynebacterium hydrocraboclasturs ATCC 21 221 als Saatgut. Wenn man dem Fermeritationsmedium kein Glyzin zusetzte, so wurden 2,1 mg/ml I-Serin produziert, verwendete man jedoch ein Medium unter Zusatz von 5 mg/ml Glyzin, so wurden 4,7 mg/ml 1-Serin produziert.

Vergleichsversuche

Die nachfolgenden Vergleichsversuche zeigen, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders hohe Ausbeuten von 1-Serin erzielt werden konnten. Die Verg'eichsversuche wurden in der gleichen Form durchgeführt, wie sie in der Französischen Offenlegungsschrift 2 006 347 in den Beispielen 1 bis 6 beschrieben worden sind. Erfindungsgemäß wurden lediglich die beanspruchten Substanzen zugefügt, nämlich Glyzin in Mengen von 5 mg/ml, I-Threonin in Menge von 10 mg/ml und 1-Homoserin in Mengen von 10 mg/ml. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt, wobei die Beispiele 1 bis 5 den in der französischen Offenlegungsschrift 2 006 347 beschriebenen Beispielen entsprechen.

Ausbeute an 1-Serin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Zusatz von:

Beispiel	F*)	Glyzin	1-Threonin	1-Homoserjne
1	3,3	6,7	6,0	5,8
2	2,3	5,7	5,2	4,9
3	2,5	6,0	5,2	4,5
4	1,8	3,8	4,1	3,6
5	1,9	4,4	4,2	3,6

*) Ergebnisse, wie sie in den Beispielen der französischen Offenlegungsschrift 2 006 347 erhalten worden sind.

Dieses Beispiel zeigt, daß die Anwesenheit von Glyzerin die Produktion an 1-Serin erhöhte. Im Bereich von etwa 4 bis 10 mg/ml ergaben sich besonders gute Resultate.

Beispiel 2

Zu dem im Beispiel 1 beschriebenen Fermentations- 60 Diese Vergleichsversuche zeigen deutlich, daß mit medium wurde 1-Threonin (10 mg/ml) zugefügt. Unter dem erfindungsgemäßen Verfahren die Ausbeute an Verwendung dieses Mediums führte man eine der im 1-Serin beachtlich gesteigert werden konnte.

Claims (1)

1. ' ' Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung von 1-Serin durch Züchten eines Mikroorganismus, der imstande ist, I-Serin in einem Nährmedium zu produzieren, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Substanzen enthält, und durch Isolierung des 1-Serins in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium wenigstens eine Verbindung aus der Gruppe Glyzin, !-Threonin und 1-Homoserin zu einer Gesamtkonzentration in Höhe von mehr als 1 mg/ml zusetzt.