DE2115514A1

DE2115514A1 - Verfahren zur Herstellung von Citronensäure

Info

Publication number: DE2115514A1
Application number: DE19712115514
Authority: DE
Inventors: Takashi; Sumino Yasuhiro; Hyogo; Akiyama Shunichi Kyoto; Fukuda Hideo Osaka; Suzuki (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1970-04-02
Filing date: 1971-03-31
Publication date: 1971-10-21
Also published as: IL36509A0; IL36509A; NL172340C; JPS5324516B1; DE2115514C2; IT1050434B; BE765165A; IE35607B1; FR2089025A5; IE35607L; NL172340B; NL7104372A; CA939284A; ZA711993B; GB1353480A

Description

PATENTAtNWAtTE DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCKDNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR, FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH

KQLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 25.3.1971 Kl/Ax/Hz

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27j Doshomachi 2-chome» Higashi-ku, Osaka (Japan).

Verfahren zur Herstellung von Citronensäure

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, für die ein größer Bedarf besteilt, und die beispielsweise als Säueiningsraittel in Getränken und in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet wird·

Bö ist bekannt, daß gewisse Hefen während der Kultivierung Citronensäure und C+)-ISöcitronenöäurö anreichern, Jedoch sind die Ausbeuten an diesen Säuren, bezögen auf die ver*- brauchten Kohlenstoffquellen, nicht unbedingt zufriedenstellend* Da ferner gleichzeitig C+^Isöcitrönensäure gebildet wird, tritis eine entsprechende wesentliche Verschlechterung der Ausbeute an Citronensäure ein.

ferner erfordert die Kötwendigkeit der Abtrennung der Citronensäure von der C+)-Isoeitrönensäure eine zusätzliche Arbeitsstufe, die eine weitere Senkung der Ausbeute an Citronensäure mit sich bringt» Das vorstehend beschrie-bene Verfahren ist' somit mm wirtschaftlichen und technischen Standpunkt unbefriedigend für die Herstellung von Citronensäure·

Die Bemühungen der Anmelderin, den Nachteil des oben genannten Verfahrens auszuschalten, führten zur Isolierung einer großen Zahl von Mikroorganismen, die einzigartige metabolische Eigenschaften aufweisen. Während dieser Untersuchungen wurde gefunden, daß sich unter den hierbei isolierten Mikroorganismen einige befinden, die eine erheblich größere Fähigkeit zur Anreicherung von Citronensäure bei gleichzeitiger geringerer Fähigkeit zur Anreicherung von (+)-Isocitronensäure haben, und daß das Wachstum dieser Mikroorganismen durch einen Gitronensäure-Antimetaboliten oder seine Vorstufe gehemmt wird. Diese Feststellungen liegen der Erfindung zugrunde·

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, das dadurch gekennzeichnet is;t, daß man Hefen, Kleinpilze oder Bakterien, deren Wachstum durch einen Citronensäure-Antimetaboliten oder dessen Vorstufe gehemmt wird, und die Citronensäure in erheblicher Menge in einem Kulturmedium anzuhäufen vermögen, kultiviert und die hierbei angehäufte Citronensäure aus dem Medium isoliert.

Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Medium, das einen Citronensäure-Antimetaboliten oder dessen Vorstufe enthält, und ein Medium, das diesen Antimetaboliten oder seine Vorstufe nicht enthält, mit einer Hefe, einem Kleinpilz oder ein Bakterium impft, einen Stamm auswählt, dessen Wachstum durch das erstgenannte Medium gehemmt wird, der aber auf dem letztgenannten Medium gut wächst, diesen ausgewählten Stamm in einem Medium zur Anhäufung von Citronensäure im Medium kultiviert und die auf diese; Weise angehäuifte Citronensäure aus dem Medium

Die vorstehend genannte "Hemmung des Wachstums" hängt von verschiedenen Emtturfaktoren des jeweils verwendeten Stammes,; von der Zusammensetzung und Konzentration des

Mediums usw» ab. Im Rahmen der Erfindung hat jedoch dieser Ausdruck die folgende Bedeutung:

1) Im Falle eines Stammes eines Mikroorganismus, dessen Wachstum von Natur aus durch einen Citronensäure-Antimetaboliten oder seine Vorstufe gehemmt wird, bezeichnet der Ausdruck den Fall, in. dem die Wachstums geschwindigkeit dieses Stammes in Gegenwart von wenigstens 1 mMol dieser Substanz in einem statistisch bedeutenden Ausmaß unterdrückt und in Abwesenheit der gleichen Substanz auf nicht mehr als 75% unterdrückt wird.

2) Im Falle eines Mutanten-Stamms des Mikroorganismus, der von einem Ursprungsstamm erhalten worden ist, der von Hatur aus verhältnismäßig resistent gegenüber einem Citronensäure-Antimetaboliten oder seiner Vorstufe ist, jedoch durch Mutation eine Empfindlichkeit gegenüber dieser Substanz erworben hat, ist unter dem Ausdruck die Situation zu verstehen, in der die Wachs turns geschwindigkeit des Mutanten in einem statistisch bedeutsamen Ausmaß unterdrückt und bei der höchsten Konzentration dieser Substanz, die das Wachstum des Ursprungsstamms nicht hemmt, auf praktisch nicht mehr als 75£6 der Wachstumsgeschwindigkeit des Ursprungsstamms unterdrückt wird.

Das Verfahren gemäß der Erfindung hat zahlreiche Vorteile gegenüber den bisher bekannten Verfahren. Erstens wird beim Verfahren gemäß der Erfindung eine bei weitem höhere Ausbeute erzielt. Da zweitens (>)-Isocitronensäure nicht oder nur in einer Spurenmenge als Hebenprodukt gebildet wird, wird die Reinigung der Citronensäure vereinfacht. Dies hat zur Folge, daß nicht nur die Ausbeute der Reinigung, sondern auch die Qualität des Endprodukts gesteigert wird.

Die Erfxndung ermöglicht somit die Herstellung von Citronensäure in guter Ausbeute. Sie macht ferner ein Verfahren

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1 til

zur Auswahl eines zur Bildung von Citronensäure in hoher Ausbeute fähigen Mikroorganismus verfügbar und erleichtert die Reinigung der gewünschten Citronensäure.

Wie bereits erwähnt, werden für das Verfahren gemäß der Erfindung beliebige Hefen, Kleinpilze und Bakterien verwendet, deren Wachstum durch einen Citronensäure-Antinietaboliten oder seine Vorstufe gehemmt wird, und die unabhängig davon, ob sie aus natürlichen Quellen isoliert oder durch künstliche Mutation erzeugt worden sind, die Fähigkeit haben, außerhalb der Zellen eine bedeutende Menge Citronensäure anzuhäufen.

Geeignet sind beispielsweise Hefen der Gattungen Candida, Trichosporon, Pichia, Debarymömyces, Hansenula, Torulopsis, Endömycopsis, Saccharomyces, Kloeckera usw. Geeignete Bakterien sind beispielsweise solche der Gattungen Brevibacterium, Escherichia, Corynebacterium, Ar throb ac ter, Alkaligenes, Achromobacter, Mierococcus usw. Als Kleinpilze können Stämme der Gattungen Aspergillus, PeniciIlium, Mucor u.dergl. verwendet werden.

Als Beispiele von Spezies dieser Gattungen seien genannt: Hefespezies: Candida rugosa, Candida lipolytica, Candida ehaimersii, Candida tropiealis, Candida guilliermondii, Candida parapBilosis, Candida albicans, Trichosporon behrendii, Pichia farinosa, Pichia halophila, Debaryoiayces hansenii, Debaryomyces kloeckeri, Hansenula sübpelliculosa, Hansenula miso, Hansenula saturnus, Torulopsis famata, Torulopsis Candida, Saecharomyces acidifaciens, Saccharomyces cerevisiäe, Saccharomyces willianus, Kloeckera apiculata.

Bakterienspezies: Brevibacterium thiogenitalis, Brevibacterium ammbniagenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium debaricatum, Mierococcus glutamicus, Micrococcus ammoniaphilum, Corynebacterium facians, Corynebacterium hydrocarboclustus, Arthrobacter-Spezies, Achromobacter

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nucleoacidives, Alkaligenes martiarie*

Kleinpilz-Spezies: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus saitoi, Aspergillus glaucus, Penicillium elegans, Penicillium. citrinum und Mucor pyriformis.

Als Citronensäure-Antimetaboliten und ihre Vorstufen eignen sich für die Zwecke der Erfindung bexspielsweise halogenierte niedere Alkylcarbonsäuren, die entsprechenden Ketocarbonsäuren und ihre Salze, Ester und wasserlöslichen Amide. Speziell geeignet sind beispielsweise Halogencitronensäure, z.B. Monofluorcitronensäure, Monochlorcitronensäure und ihre Salze, Amide und Ester.

Als Vorstufen dieser Antimetaboliten eignen sich beispielsweise Halogenessigsäuren, z.B. Monofluoressigsäure, Monochloressigsäure, Halogenbrenztraubensäure, z.B. Monochlorbrenztraubensäure, Halogenoxalessigsäure, z.B. Fluoroxalessigsäure, Halogenbernsteinsäure, z.B. Monofluorbernsteinsäure, oder ihre Salze, Amide, Ester, z.B. Monofluoracetamid, und Monofluoracetylcoenzym A.

Zur Isolierung oder Auswahl eines geeigneten Mikroorganismus aus natürlichen Quellen oder aus den künstlich erzeugten Mutanten wird vorzugsweise wie folgt verfahren: Ein Kulturmedium, dem ein Citronensäure-Antimetabolit oder dessen Vorstufe zugesetzt worden ist,-und ein Kulturmedium, das keinen Antimetaboliten oder seine Vorstufe enthält, werden mit einem Mikroorganismus geimpft. Gewählt wird ein Mikroorganismus, dessen Wachstum auf dem erstgenannten Medium gehemmt wird, der aber auf dem letztgenannten Medium gut wächst.

Zur Gewinnung eines Mikroorganismus mit solchen Eigenschaften durch induzierte Mutation kann vorteilhaft eine Behandlung iait energiereicher Strahlung, z.B. Ultraviolett-

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strahlung, Co -Strahlung, Röntgenstrahlung usw. oder eine Behandlung mit einem geeigneten chemischen Mutagen, z.B.

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Natriumnitrit, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Acriflavin, 8-Azaguanin oder Stickstofflost angewandt werden. Unter den hierbei erhaltenen Mikro- · Organismen können sich Stämme befinden, die gleichzeitig gewisse physiologische oder morphologische Mutationen erfahren haben, z.B. den Erwerb der Eigenschaft, daß sie Vitamine, Aminosäuren, Nucleinsäuren usw. zum Wachstum benötigen, und fehlende Respiration, jedoch können auch diese Stämme für die Zwecke der Erfindung verwendet werden, soweit ihr Wachstum durch einen Citronensäure-Antimetaboliten oder seine Vorstufe gehemmt wird und sie gleichzeitig die Fähigkeit haben, Citronensäure anzuhäufen.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird ein Mikroorganismus mit den vorstehend genannten Eigenschaften auf einem Kulturmedium gezüchtet. Im allgemeinen wird ein wässriges Medium verwendet, das entweder nach der stationären Kulturmethode oder nach der Schüttelkultürmethode bebrütet wird. Bevorzugt wird im allgemeinen die Submerskultur mit Belüftung und Bewegung. Dem Medium werden Kohlenstoff quellen, Stickstoffquellen und andere geringere Wachstumselemente zugesetzt.

Geeignet sind alle Kohlenstoffquellen, die vom jeweils verwendeten Mikroorganismus assimilierbar sind, z.B. Glucose, Glycerin und organische Säuren, jedoch sind Kohlenwasserstoff e vom technischen und wirtschaftlichen Standpunkt am vorteilhaftesten. Als Kohlenwasserstoffe können beispielsweise n-Alkane mit 10 bis 20 C-Atomen allein oder in Kombination und Materialien, die solche Kohlenwasserstoffe enthalten, verwendet werden.

Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise organische und anorganische Stoffe, z.B. viele Ammoniumsalze, Nitrate, AminostickfliiOfiverb indungen sowie eine Anzahl von natürlichen Substanzen wie Trockenhefe, Fleischextrakt, Soja— bohnenraehl, Fischmehl, Maisquellwasser und Brennereirückstände. Außer diesen Nährstoffen können anorganische und

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organische Metallsalze, z.B. die Salze von Eisen, Magnesium, Calcium und Mangan, dem Medium nach Bedarf zugesetzt werden. Wenn der verwendete Mutant einen bestimmten Nährstoff zum Wachstum benötigt, kann eine geeignete Menge des jeweiligen Nährstoffs dem Medium zugesetzt werden.

Der Mikroorganismus wird auf einem solchen Medium bei einem Pjj-Wert von 2 bis 8, zweckmäßig zwischen 4 und 7» und· bei. einer Temperatur von 20 bis 35°C, vorzugsweise zwischen 25 und 3Ö°G kultiviert. Während der Kultivierung kann es zweckmäßig sein, nach Bedarf ein Antischaummittel, das die Fermentation nicht hemmt, z.B. ein Siliconöl, Polyoxypropylenderivate, Sojabohnenöl u.dergl., zuzusetzen. Auf diese Weise wird eine erhebliche Citronensäuremenge in der Gärmaische angehäuft.

Diese Gärmaische ist frei von Isocitronensäure und anderen Nebenprodukten oder enthält davon nur Spurenmengen. Daher kann die Citronensäure in Kristallform nach üblichen Verfahren der Isolierung von Citronensäure, die allein oder in geeigneter Kombination angewandt werden, isoliert werden.

Die z.Z. bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen erläutert. In diesen Beispielen sind die Prozentsätze auf Gewicht/Volumen bezogen, und die Ausbeuten sind in Gewichtseinheiten der gebildeten Citronensäure pro Gewichtseinheit der verbrauchten Kohlenstoff quellen berechnet.

In den Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Die IFO-Nummern nach den in den Beispielen gebrauchten Bezeichnungen der Mikroorganismen sind die jeweiligen Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan.

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Beispiel 1

1) Auswahl von Mikroorganismen

Eine Schrägkultur von Candida lipolytica IPO 14-37 auf einem Malzagar-Medium wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung bis zu einer Zahl lebensfähiger Zellen von etwa 10' bis 10 /ml suspendiert. 10 ml der Suspension werden in einer Petrischale ausgebreitet und mit Ultraviolettstrahlung bestrahlt. 0,25 ml der bestrahlten Sus- . pension v/erden auf ein Malzagar-Medium überführt, das dann etwa 30 Stünden bei 28⁰C bebrütet wird. Dieses Impfmaterial wird dann nach der Plattenabdruckmethode (replica plate method) auf ein Medium (A), das aus 0,5% Natriumacetat, 0,1% KH₂PO₄, 0,1% NH₄HO₅, 0,1% ITH₄Cl, 0,05% MgSO₄.7H₂O, 0,1 mg Thiamin/1 und 2,2% Agar besteht, und auf ein ähnliches Medium (B), das aus den Bestandteilen des Mediums (A) plus 0,1% Natriummonofluoracetat besteht, übertragen'. Die beiden Medien werden 48 Stunden bei 28°C bebrütet. Aus den Kolonien, die auf dem Medium (A) wachsen, aber ,auf dem Medium (B) nicht erscheinen, wird ein Mutantenstamm F-12 (IFO 1545) gewonnen.

2) Herstellung von Citronensäure

Der Ursprungsstamm und der Mutant werden dann jeweils zur Beimpfung von Fermentern verwendet, die je 120 Raumteile eines wässrigen Mediums enthalten, das aus 6% n-Hexadecan, 0,01% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄.7H₂O, 0,1% Trockenhefe und 0,3% (NH₄)₂S0₄ und 5% zugesetztem CaCO,, das getrennt unter trockenen Bedingungen sterilisiert worden ist, besteht.

Die Mikroorganismen werden 6 Sage bei 28°C bebrütet, wobei Citronensäure gebildet wird. Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.

Citronensäure (+)—Isocitronensäure Ursprungs stamm 4-2 mg/ml 3I mg/ml Mutantenstamm . 78 mg/ml 2,5 mg/ml

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Zu je 100 Raumteilen der Kulturen dieser beiden Stämme wird Ca(OH^ gegeben, bis ein p^-Werfr von 7»0 erreicht ist· Die jeweiligen Gärmaischen werden dann 60 Minuten auf 8O⁰O erhitzt und im heißen Zustand zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die Sedimente werden mit Schwefelsäure gelöst. Das erhaltene Calciumsulfat und die Hefezellen werden durch Zentrifugieren entfernt, wobei eine überstehende Flüssigkeit erhalten wird, die durch eine Säule von 5 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes "Amberlite IR-120(H⁺)" (Hersteller Rohm and Haas Company) geleitet wird. Each Zusatz von 1 Gew.-Teil Aktivkohle wird der Ablauf filtriert* Das erhaltene Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Produkt von Sirupkonsistenz erhalten wird, das über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen wird.

Auf diese Weise werden 5 »4- Gew.-Teile Kristalle aus der Kulturbrühe des Mutanten erhalten. Durch die gleiche Behandlung der Mutterlauge werden weitere 1,2 Gev/.-Teile Kristalle erhalten.

Dagegen werden aus der Kulturbrühe des Ursprungsstamms, die in der gleichen Weise behandelt wird, praktisch keine Kristalle gewonnen. Die Gärmaische wird durch tropfenweise zugesetztes 30%iges KOH auf p„ 3,5 eingestellt und über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Die Fällung wird entfernt, worauf eine geringe Menge Impfkristalle von Citronensäure der Mutterlauge zugesetzt wird, wobei 2,8 Gew.-% kristalline Citronensäure erhalten werden.

Beispiel 2

Debaryomyces sp. (IFO 0064) und Pichia halophila (IFO 0?A7) werden der in Beispiel 1 beschriebenen mutagenen Behandlung unterworfen. Der erhaltene Mutant HF-79 (IFO 154-7) des Ursprungsstamms Pichia halophila (IFO 0947) und der Mutant DF-04 (IFO 1546) von Debaryomyces sp. (IFO 0064) werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise kultiviert.

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Die Ergebnisse sind nachstehend genannt·

Stamm Citronensäure <, mp;/inl

Piehia halophila (IFG Q94-7) 7

Bebaryomyces ap* (IFQ 0064·) ' ' 0,4-

Pichia halophila ΗΡ~79 (IFO 154?) " 4-8

Debaryomyces sp_ö 'EF-(W- (IFO .1546) 36

Beispiel 5

Brettanomyees clauaenii- (IFO 0627) wird der in Beispiel 1 !beschriebenen mutagenen Behandlung unterworfen- Der erhaltene Mutantenstamm ΒΚΓ-62 (IFO 15*4) hat eine erhöhte Fähigkeit j. Citronensäure zu "bilden.

Die beiden Stäsme werden getrennt auf den in Beispiel 1. beschriebenen Medien kultiviert, v/obei jedoch die Kohlenstoff quelle durch 1Q% Glucose ersetzt worden ist. Hierbei werden die folgenden Ergebnisse erhaltens

■ Gitronensäure, lag/ml

Ursprungsstamm IFO 0627 - 4-5

Mutantenstaam IFO 15^4 ■ 73

Beispiel 4-

Eine Zellsuspension von Brevibacterium flavuia ITr. I5II (ATCC 14-067) wird mit Ultraviolettlicht bestrahlt, wobei ein gegen Fluoressigsäure empfindlicher Mutant BF 11 (IFO I5144-) erhalten wird. Dieser Mutant und dev Ursprungsstamm werden getrennt auf dem in Beispiel 3 beschriebenen Medium kul ti viert« Während der Ursprungsstaom keine nachweisbare Citronensäuremenge in der Gärmaische anhäuft, werden durch den Mutantenstamm 4-5 mg/ml Citronensäure angehäuft.

Beispiel 5

Achromobacter nuc 1 eo acido ve s ITr. 106 (IFO 13268) und Oorynebacterium facians ITr. 803 (ATGC 214-61) werden mit dem in Beispiel 1 verwendeten Mutägen behandelt, wobei gegen Fluorcitronensäure empfindliche Stämme ITF-06

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(IFO 13145) und CF-03 (IFO 1314-5) erhalten werden. Diese Stämme werden zur Beimpfung von Fermentern verwendet, die 120 Raumteile eines Mediums (pjr 7,0) enthalten, das 6% η-Paraffin (Gemisch von C/^-^q)» °»5# HH₄NO₅, 0,2?£ KH₂PO₄, 0,0% MgSO₄, 0,0173 FeSO^.7H₂O, 0,1# Harnstoff, 0,1# Trokkenhefe und Ψ/σ CaCO₅ enthält und 5 Tage bei 28°C bebrütet wird. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:

Ursprungsstämiae: Nr. 106 - 0,6 mg/ml

Nr. 803 4-3 mg/ml

Mutanten: NF-06 (IFO 1314-5) 72 mg/ml

CF-03 (IFO 1314-5) 61 mg/ml

Beispiel 6

Eine Suspension der Sporen von Penicillium chermisinum IFO-58OO wird auf die in·Beispiel 4- beschriebene Weise behandelt, wobei ein gegen Fluoressigsäure empfindlicher Mutant PF-100 (IFO-9230) erhalten wird.

Mit dem Ursprungsstamm und dem Mutanten werden Fermenter beimpft, die 120 Raumteile eines wässrigen Llediums (pjj 7jO) enthalten, das ΛΟβΌ n-Paraffin, 0,1% NH₄NO₅, 0,02³Zo MgSO₄, 0,03$ KH₂PO₄, 0,03% Ϊ^ΗΡ0₄.12Η₂0 und 4-% CaCO₅ (p_H 5,0) enthält und 14 Tage bei 28⁰C bebrütet wird. Auf diese Weise werden ausgezeichnete Ergebnisse erhalten:

Citronensäure

Ursprungsstamm 32 mg/ml

Mutant 77 mg/ml

Beispiel 7

Arthrobactor paraffineus ATCC 15591 wird in der gleichen Weise behandelt, wobei Arthrobacter paraffineus Hr. AF-51 (IFO 13269), ein gegen Fluoressigsäure empfindlicher Mutant, erhalten wird.

Der Ursprungsstamm und der Mutant werden getrennt 3 Tage bei 28°G in 120 Raumteilen eines wässrigen Llediums (p_Tj 7*0) bebrütet, das 4% n-Hexadecan, 0,1# Natriumacetat, 0,3/s

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NH₄NO₃, 0,05% Harnstoff, 0,01% CSl, 0,05% MgSO₄, 0,001% MnSO., 0,01% FeSO₂₁^H₉O, 0,05% KHoPO₂,, 0,15% K₂HPO₄ und 3% CaCO₃ enthält. Der Mutant häuft 28 mg und der Usprungsstamm 0,9 mg Citronensäure/ml an.

Beispiel 8

Candida lipolytiea IFO 1463 (ATCC 20237) wird mit N-Methyl N¹-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt, wobei ein gegen Fluoressigsäure empfindlicher Mutant Nr. S-22 (IFO I566) erhalten wird*

Der Ursprungsstamm und der Mutant werden getrennt 6 Tage bei 28⁰C auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise kultiviert. Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.

Stamm Citronensäure Ausbeute

·* mg/ml %

Ursprungsstamm (IFO 1463) 87 145

Mutant (IFO 1566) 71 118,3

Beispiel 9

Im Vergleich zu den Ursprungs stammen wird das Wachstum der gemäß den Beispielen 1 bis 8 verwendeten Mutantenstämme unter den folgenden Bedingungen untersucht:

1· Medium:

Grundzusammensetzung: 0,3% (NH₄>₂S0₄, 0,3% NH₄NO₃, 0,2% KH₂PO₄, 0,2% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄.7H₂O, 0,0003% FeSO₄.7H₂O, 0,0003% MnS0₄.4H₂0, 0,0001% CaCl₂.2H₂0, 0,1% CSL, 0,05% Schmalzöl. "

Medium (I): Grundmedium + 1% Natriumacetat Medium (II): Grundmedium + 1% Glucose Medium (III): Grundmedium + 0,2% Hefeextrakt

2. Citronensäure-Antimetaboliten oder Vorstufen:

30 mMol Fluoressigsäure oder Fluorcitronensäure werden den Medien zugesetzt.

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3· Kultivierungsbedingungen: 48 Stunden bei 28⁰O.

4· Bestimmung des Wachstums:

Ermittlung des Gewichts der trockenen Zellen.

5. Ergebnisse: ·

Mutant . Medium Verwendeter Wachstum

Antimetabolit . (%)* - oder Vorstufe**

Candida lipolytioa

F-12 (IFO 154-5) (I) PAA I3 Pichia halophila

HF-79 (U¹O 1547) (II) FAA 21

Debaryomyces sp.

(IFO 15^6) (II) FAA 36

Brettanomyces clausenii

BN-62 (IFO 1544) (II) FAA 42 Brevibacterium flavum

BF-11 (IFO 13144) (I) FAA 1?

Arthrobacter

nucleoacideves HF-06 \

(IFO 13143) (III) FCA 32

Corynebacterium fäcians

CF-03 (IFO 13145) (HI) FCA 60 Penicillium chermisinum

PF-100 (IFO 923O) (I) FAA 63 Arthrobacter paraffineus

AF-Sl (IFO 13269) (I) FAA 41 Candida lipolytica

S-22 (IFO 1566) (I) FAA 12

* Berechnet auf Basis des Gewichts der Zellen des

unter den gleichen Bedingungen gezüchteten Ursprungsstamms·

♦* FAAi Fluoressigsäure
FCAi Fluorcitroiieösäure

Claims

·- 14 - Patent ansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man Hefen, Pilze oder Bakterien, deren Wachstum durch einen Citronensäure-Antimetaboliten oder dessen Vorstufe gehemmt wird, und die eine erhebliche Citronensäuremenge in einem Kulturmedium anhäufen, kultiviert und die hierbei angehäufte Citronensäure aus dem Medium isoliert.

2. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium, das einen Citronensäure-Antimetaboliten oder dessen Vorstufe enthält und ein Medium, das keinen Antimetäboliten oder eine Vorstufe enthält, mit einer Hefe, einem Kleinpilz "*oder einem Bakterium impft, einen Stamm auswählt, dessen Wachstum auf dem erstgenannten Medium gehemmt wird, der aber auf dem letztgenannten Medium gutes Wachstum zeigt, diesen ausgewählten Stamm in einem Medium kultiviert und die hierbei vom Mikroorganismus angehäufte Citronensäure aus dem Medium isoliertφ

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe die Gattungen Candida, Pichia, Debaryomyces, Hansenula, Torulopsis, Endomycopsis, Saccharomyees oder Kloeckera verwendet werden.

4· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien der Gattungen Brevibacterium, Eseherichia_r Gorynebacterium, Arthrobacter, Alkaligenes, Achromobacter oder Micrococcus verwendet werden»

5. Verfahren nach Anspruch: 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet^ daß) Pilze der Gattungen Aspergillus, Penicillium oder Mueor verwendet werden.;

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6. Verfahren nacii Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Candida lipolytica (IFO 1545) verwendet wird.

7· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Candida lipolytica (IFO 1566) ver- . wendet wird.

8· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Pichia halophila (IFO 1547) verwendet wird.

9· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Debaryomyces sp. (IFO 1546) verwendet wird·

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Brettanomyces claussenii (IFO 1544)
verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterium Brevibacteriuin flavum (IFO 13144) verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterium Achromobacter nucleoacidives

verwendet wird.

13· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterium Corynebacterium facians
(IFO 13145) verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterium Arthrobacter paraffineus
(IFO 13269) verwendet wird.

15· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Pilz Penicillium chermisinum (IFO 9230)
verwendet wird.

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16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 1ß, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 20 und 35⁰C durchgeführt wird.

17· Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem p_H-V/ert zwischen 2 und 8 durchgeführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17» dadurch gekennzeichnet, daß als Citronensäure-Antimetabolit eine Halogencitronensäure verwendet wird.

19· Verfahren nach Anspruch 1 bis 17» dadurch gekennzeichnet, daß als Vorstufe, des Citronensäure-Antimetaboliten eine Halogenessigsäure, Halogenbrenztraubensäure, ^ Halogenoxalessigsäure oder Halogenbernsteinsäure verwendet wird.

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