DE69110060T2

DE69110060T2 - In der humantherapie nützliche substanzen peptidischer natur.

Info

Publication number: DE69110060T2
Application number: DE69110060T
Authority: DE
Inventors: Alberto I-20135 Milano Bartorelli; Angela I-20129 Milano Turiano
Original assignee: Zetesis SpA
Current assignee: Zetesis SpA
Priority date: 1990-12-11
Filing date: 1991-12-09
Publication date: 1995-09-28
Anticipated expiration: 2011-12-10
Also published as: IT9022341A1; IT9022341A0; HU217615B; ATE122890T1; CA2098113C; DE69110060D1; WO1992010197A1; ES2073277T3; US5824640A; CZ283037B6; JPH06504039A; JP3213942B2; DK0574394T3; HU9301677D0; IT1244879B; KR100196028B1; NO932101L; EP0574394A1; EP0574394B1; RU2113224C1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Substanzen, die durch Extraktion aus tierischen Geweben, insbesondere aus Ziegengeweben, erhältlich sind und die in der Therapie und bei der Diagnose nützlich (verwendbar) sind. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Substanzen mit überraschenden biologischen Eigenschaften, die sie nützlich (verwendbar) machen für die onkologische Therapie (oder mindestens bei der Unterstützung der Therapie einer neoplastischen Erkrankung) und für die Verwendung bei der Diagnose der immunohistologischen und immunoserologischen Art.
Neben der weitergehenden Erforschung "exogener" Antitumor-Arzneimittel synthetischen, halbsynthetischen, fermentativen oder extraktiven Ursprungs, wurde in jüngster Zeit einem neuen Versuch der Erforschung physiologischer Verbindungen mehr und mehr Aufmerksamkeit gewidmet, die im Körper in natürlicher Weise vorkommen und in der Lage sind, das Wachstum von Tumorzellen durch direkte zytotoxische Effekte oder durch komplexe Wechselwirkungen mit den humoralen oder zellulären Komponenten des Immunsystems zu hemmen.
Innerhalb dieses Trends sind bemerkenswerte Bemühungen gerichtet auf die Erforschung beispielsweise von Interferonen, des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF), der Zytokine und Lymphokine, wie der Interleukine, Immunotoxine, die von Konjugaten von monoklonalen Antikörpern mit zytotoxischen Substanzen verschiedener Art abgeleitet sind, und dgl.
Wenig Aufmerksamkeit wurde bisher gewidmet der Erforschung von Verbindungen, die aus xenogenen Geweben extrahiert werden können. Ein Faktor, als AF2 bezeichnet, der erhältlich ist durch Extraktion aus Schaf- und Lamm- Embryos, wird seit 1940 untersucht, offensichtlich jedoch ohne anwendbare Ergebnisse, die eine weitere Untersuchung rechtfertigen würden ("Schweiz.-Rundsch.-Med. Prax." 1990, 79 (16); 498-502). In "Chem. Abstr.", Band 106, 1987, 194775g ist ein Antitumor-Polypeptid beschrieben, das aus Makrophagen-artigen Zellen extrahiert wurde, die eine Tumor-Nekrose-Faktor-Aktivität aufweisen.
Ausgehend von früheren Studien des Erfinders über die Anwesenheit von Substanzen, die ungewöhnliche immunologische Eigenschaften haben ("Biomed. Pharmacother.", 1987, 41 2-5), im Serum von Patienten, die von Tumoren befallen sind, wurde nun gefunden, daß Substanzen vom Polypeptid- Typ (mit Polypeptid-Natur) aus der Leber oder dem Intestinum von Ziegen extrahiert werden können, wobei diese Substanzen die folgenden überraschenden Eigenschaften haben:
- sie können die Bildung von Antikörpern induzieren, die Human-Tumor-Antigene erkennen können;
- sie können neoplastische Schmerzen mindern oder verhindern und sie können einen Zellenauflösungs-Effekt induzieren und inhibieren oder das Tumor-Wachstum verlangsamen, wenn sie an Menschen verabreicht werden, die von malignen Tumoren verschiedener Arten befallen sind.
Der hier verwendete Ausdruck "Substanzen vom Polypeptid-Typ" ist so zu verstehen, daß er jede Art von Polypeptid-Verbindung, z.B. Proteine, Glycoproteine, Mucoproteine und dgl., umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Substanzen können erhalten werden durch Extrahieren von Ziegenleber- oder Ziegenintestinum-Homogenaten unter sauren Bedingungen.
Extraktionstests der Leber und des Intestinums bestätigten, daß in diesen Organen Substanzen vorhanden sind, welche die obengenannten Eigenschaften haben; deshalb kann angenommen werden, daß ihre Verteilung (Verbreitung) allgemein ist und nicht nur auf ein Organ oder auf Organgruppen beschränkt ist. Aus praktischen Gründen wird nachstehend insbesondere Bezug genommen auf Ziegenleber, die leichter zu behandeln und leichter verfügbar ist als andere Organe.
Die Extraktion der erfindungsgemäßen Substanzen umfaßt die folgenden Stufen:
a) Homogenisieren von Geweben und Organen unter Anwendung üblicher Verfahren;
b) Behandeln der Homogenate mit 2N HClO&sub4; bei Temperaturen unterhalb 10ºC;
c) Zentrifugieren und Dialysieren gegen Wasser;
d) Behandeln mit einer hypertonischen Lösung, Zentrifugieren oder Membranfiltrieren und Dialysieren gegen Wasser und dann gegen einen Salz-Puffer (PBS);
e) Ultrafiltrieren auf Membranen mit einem Cut-off (Ausblendung) von 10 000 D bis zu einer Konzentration von etwa 1 mg/ml Proteinen; und
f) gegebenenfalls weiteres Reinigen durch Gelchromatographie.
In der Stufe (b) wird vorzugsweise 2N Perchlorsäure bei einer Temperatur von etwa 4ºC verwendet.
In der Stufe (d) wird vorzugsweise eine 3M KCl-Lösung verwendet und die Behandlung wird etwa 24 h bei 4ºC durchgeführt. Die Dialyse-, Filtrations- oder Zentrifugierungs- Arbeitsgänge werden unter Anwendung üblicher Methoden durchgeführt.
Die erhaltene Substanz kann direkt erfindungsgemäß verwendet werden.
Sie wird dann unter Anwendung üblicher Verfahren behandelt, um sie steril und pyrogenfrei zu machen für die Verabreichung an Menschen oder Tiere in Form von geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen, z.B. solchen, wie sie in "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook" Mack Pub. Co., N.Y., USA, beschrieben sind.
Beispiele der genannten Zusammensetzungen umfassen Phiolen von lyophilisierten aktiven Prinzipien (Wirkstoffen), die vor der Verwendung in sterilen Salzlösungen aufgelöst werden können, Lösungen oder Suspensionen in wäßrigen oder öligen sterilen Lösungsmitteln und ähnliche Zusammensetzungen, die für die in vivo-Verabreichung geeignet sind.
Vorläufige klinische Tests, die nachstehend zusammengefaßt sind, erlauben die Annahme, daß die erfindungsgemäßen Substanzen in einem breiten Dosierungsbereich, beispielsweise von 0,1 bis 100 mg/Tag an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen oder in anderen Zeitabständen (beispielsweise einmal pro Woche, einmal pro Monat oder auch in längeren Zeitabständen) verabreicht werden können. Es wurde insbesondere festgestellt, daß bei Verwendung von Substanzen, die aus Ziegenleber extrahiert worden sind, nachstehend als LGE bezeichnet, eine einzige Verabreichung einer Menge von 1 bis 3 mg Trockensubstanz (1 bis 3 ml Lösung) ausreichend sein kann, um überraschende und sehr schnelle Ergebnisse bei Patienten zu erzielen, die von Tumor-Pathologien befallen sind.
Eine zweite Verabreichung nach etwa 30 Tagen kann manchmal vorteilhafte Effekte erzeugen. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß die andauernden Tests Änderungen in der Dosierung und im Behandlungsplan mit sich bringen können, je nach Pathologie und Zustand der Patienten.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern.

Beispiel

100 g männliche Ziegenleber wurden in einem Schaufel- Homogenisator homogenisiert, das Homogenat wurde in destilliertem Wasser wieder suspendiert bis auf ein Endvolumen von 400 ml.
Innerhalb von etwa 20 min wurden bei 4ºC 400 ml 2N HClO&sub4; in die genannte Suspension getropft und es wurde 30 min lang gerührt. Nach dem 20-minütigen Zentrifugieren bei 10 000 g wurde der Niederschlag verworfen und die überstehende Flüssigkeit wurde gegen Leitungswasser und danach gegen destilliertes Wasser dialysiert.
Nach der Dialyse wurde zu der erhaltenen Flüssigkeit pulverförmiges KCl zugegeben, bis eine 3 molare Lösung erhalten worden war, und die Mischung wurde 24 h lang bei 4ºC gerührt. Nach 1-stündigem Zentrifugieren mit 100 000 g wurde die überstehende Flüssigkeit gegen destilliertes Wasser und einen Phosphatpuffer (PBS) dialysiert.
Die erhaltene Lösung (800 ml) wies nach der Lowry-Methode eine mittlere Proteinkonzentration von 200 ug/ml auf.
Die Lösung wurde durch Ultrafiltration bis auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingeengt, sie wurde als LGE bezeichnet und direkt für klinische Tests verwendet, die nachstehend zusammengefaßt sind, in denen stets auf die Abkürzung LGE Bezug genommen wird.
Dieses Produkt wurde in PAGE 4/30 analysiert, wobei vier Hauptbanden erkennbar waren (Fig. 1): aus der Eichkurve, die aus den Parametern der Standards erhalten wurde, wurden die Molekulargewichte der vier Hauptbanden errechnet:
1. Bande = etwa 50 000 d
2. Bande = etwa 20 000 d
3. Bande = etwa 14 800 d
4. Bande = etwa 12 000 d
Als Reinigungsstufe nach der LGE-Extraktion wurde eine Ionenaustausch-Chromatographie unter Anwendung des folgenden Verfahrens angewendet: etwa 20 ml LGE wurden gegen einen Phosphatpuffer (0,01 M Na&sub2;HPO&sub4;-NaH&sub2;PO&sub4;, pH 6,5) dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Probe durch ein 0,45 um-Filter filtriert und dann auf einer TSK DEAE SPW 7,5x75 mm-Säule ionenausgetauscht, die mit dem gleichen Dialyse-Puffer äquilibriert worden war, mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/h.
Die Säulen-Elution wurde 100 min lang mit der gleichen Fließgeschwindigkeit und dem gleichen Puffer fortgesetzt.
Ein linearer Gradient des Phosphat-Puffers mit pH 6,5 wurde gestartet bei einer anfänglichen Molarität von 0,01 M bis zu einer End-Molarität von 0,1 M, wobei der genannte Gradient eine Dauer von 100 min aufwies und die operative Fließgeschwindigkeit bei 30 ml/h gehalten wurde.
Aus dem Eluat wurden 0,5 ml-Fraktionen gesammelt und die den verschiedenen Peaks entsprechenden verschiedenen Zonen wurden zusammengefaßt.
Wie aus dem Chromatogramm (Fig. 2) ersichtlich, wurden verschiedene Proteinfraktionen erhalten, die einzeln durch PAGE PAA4/30 analysiert wurden, um ihre Komponenten zu bestimmen. Der Ausgangs-Puffer, definiert als Zone A, und die Gradienten-Fraktion mit der höchsten Protein- Konzentration, definiert als Zone B, wurden vorläufig als interessanter angesehen, da die Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht meistens in der Zone A vorlagen, während die Proteine mit einem Molekulargewicht von 50 000 Dalton in höheren Konzentrationen in der Zone B vorhanden waren.
Diese beiden Proben, die Zonen A und B, wurden anschließend mit J¹²&sup5; markiert (Fig. 3 und 4) und in dem RIA verwendet. Um in der Praxis verwendbare Mengen der Zonen A und B, die getrennt verabreicht werden sollen, für den klinischen Versuch zugänglich zu machen, war die Reinigung von größeren Mengen LGE erforderlich.
Bei der FPLC wurde eine präparative Zonen-Gel-DEAE- Sephadex-Säule, die unter den gleichen Bedingungen wie die DEAE SPW-Säule äquilibriert und eluiert worden war, verwendet.
Mit dieser Kolonne wurden 800 mg LGE gereinigt und man erhielt 42 mg Zone A und 15 mg Zone B.
Anschließend wurde ein Teil der LGE-Charge 2/90 in der Umkehrphase analysiert mit einem Aguapore Butyl (30 x 4,6 mm 7U) von Applied Biosystem unter Verwendung von Wasser und Acetonitril, enthaltend 0,05 % TFA in einem linearen Gradienten von Acetonitril von 25 bis 55 % als Eluierungsmittel innerhalb von 15 min. Das bei 220 mm aufgezeichnete Chromatogramm ist in Fig. 5 dargestellt. Ein Teil der Zone A- und Zone B-Proben, die aus DEAE Sephacell stammten, wurde in der Umkehrphase unter den gleichen Bedingungen wie sie für rohes LGE angegeben sind chromatographiert, (Fig. 6 und 7).
Aufgrund der Überprüfung der Chromatogramme von rohem LGE und derjenigen der Zonen A und B konnte festgestellt werden, daß die signifikanteren Protein-Komponenten, die in dem Ausgangsprodukt gefunden wurden, die gleichen sind in den beiden Proben, die aus den Zonen A und B stammen, wenn auch in unterschiedlichen Konzentrationen.

Isoelektrischer Punkt

Es wurden PAGE-Platten LKB 3,5-9,5 nach den Angaben des Lieferanten verwendet.
Nicht-fraktionierter LGE ergab eine schwache Bande bei pH 8,3, eine ausgeprägte Bande bei pH 6,7 bis 7 und mehrere schmale Banden zwischen pH 6 und 4,5, die das typische Aussehen von Isoantigenen hatten.
Die LGE-Zone A ergab eine ausgepragte Bande bei pH 8,2, eine ausgeprägte Bande bei pH 6,7 und einige Banden in der Säurezone mit einer bestimmten Prävalenz von drei speziellen Banden bei pH 5,6; 5 und 4,9.
Die LGE-Zone B wies eine ausgeprägte Intensität der Färbung der Zone in der Säurezone bei pH < 6 mit dem typischen Aussehen von Isoantigenen auf.

Biochemische, immunochemische und radioimmunologische Ergebnisse

Aus der vor der Konzentrationsstufe erhaltenen Lösung wurden 5 ml-Dosen (entsprechend 1 mg Trockenextrakt) hergestellt und mit dem vollständigen Freund-Adjuvans emulgiert. Zwei Kaninchen wurden mit einer Dosis alle 15 Tage immunisiert.
Von den beiden ursprünglichen Kaninchen ging eines nach der ersten Immunisierung verloren. Aus dem zweiten Tier wurde ein Aliquot Serum (RF4 genannt) erhalten, das dann für biochemische, immunochemische, radioimmunologische und immunocytochemische Untersuchungen verwendet wurde. Der RF4-Antikörper wurde nach dem Western Blot-Verfahren gegen LGE getestet. Das Antigen wurde PAGE SDS PAA 4/30-Platten (Pharmacia) unterworfen und anschließend in Nitrocellulose übertragen. Letztere wurde dann mit RF4-Serum inkubiert und die Reaktion wurde mit Anti-Kaninchen- Peroxidase nachgewiesen (PIERCE). Wie in Fig. 8 dargestellt, erkennt der Antikörper Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 D.
Eine zweite Gruppe von Kaninchen wurde mit LGE wie vorstehend beschrieben immunisiert (5 ml entsprechend 5 mg Trockenextrakt, emulgiert mit 2,5 ml vollständigem Freund- Adjuvans).
Diese Kaninchen ergaben 14 Antiseren, als Anti-LGE 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 bezeichnet, die auf die gleiche Weise wie RF4 getestet wurden.
Die aus den biochemischen Verfahren (insbesondere dem Western Blot-Verfahren) erhaltenen Daten lassen vermuten, daß diese Antiseren, anders als das RF4-Antiserum, alle Protein-Komponenten von LGE erkennen (Fig. 9).
Darüber hinaus wurden 10 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse immunisiert für die Bildung von monoklonalen Antikörpern. Insbesondere wurden zwei Mäuse mit LGE (1 mg/ml) immunisiert und zwei wurden mit LGE-Zone A aus DEAE 5PW (1 mg/ml) immunisiert durch subkutane Verabreichung von 100 ul Antigen + 100 ul Freund-Adjuvans.
Das Immunisierungsverfahren ist nachstehend beschrieben:
Erste Verabreichung: 100 ul Ag + 100 ul vollständiges Freund-Adjuvans.
Zweite Verabreichung: 100 ul Ag + 100 ul vollständiges Freund-Adjuvans 7 Tage nach der ersten Verabreichung
Dritte Verabreichung: wie die zweite Verabreichung, 7 Tage nach der zweiten Verabreichung
Vierte Verabreichung: wie die dritte Verabreichung, 7 Tage nach der dritten Verabreichung.
Nach Beendigung der Immunisierungen wurde ein Aliquot Blut aus jeder Maus entnommen und die erhaltenen Seren wurden dem Bindungstest gegen LGE (Fig. 10) und immunozytochemischen Tests unterworfen.
Auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse wurde entschieden, die Maus Nr. 2 zu töten, die mit LGE-Zone A immunisiert worden war, um monoklonale Antikörper zu erhalten.
Die nach Milstein durchgeführt Fusion ergab 250 Klone.
Eine erste Reihenuntersuchung (Screening) zeigte, daß viele Klone gegen die auf den LGE-Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht exprimierten Determinanten gerichtet waren, während eine geringere Anzahl von Klonen das 50 000 d-Protein erkannte. Eine zweite Reihenuntersuchung, durchgeführt nach der Klon-Expansion, ergab negative Ergebnisse für alle Klone, weshalb entschieden wurde, die Milz aus einer anderen immunisierten Maus zu fusionieren. Die Fusion ergab 400 Klone (100 %). In dem ersten Test nach etwa 10 Tagen erwiesen sich 64 Klone als positiv gegenüber LGE.
Die überstehende Flüssigkeit dieser 64 Klone wurde anschließend in bezug auf LGE, LGE-Zone A und LGE-Zone B getestet. Die Reihenuntersuchung ergab, daß 4 Klone eine starke Bindung an drei Antigene, besonders ausgeprägt an LGE-Zone A, aufwiesen. Diese 4 Klone wurden geklont und dann erneut auf die gleiche Weise gegenüber den drei Antigenen getestet. Parallel dazu wurden die Klone auch nach dem Western Blot-Verfahren gegenüber LGE getestet.
Die Ergebnisse dieser beiden Tests veranlaßten uns zu einer Erweiterung und Bildung der Ascites von 9 Klonen. Die erhaltenen Ascites wurden titriert mit dem Bindungstest gegen LGE, LGE-Zone A und LGE-Zone B. Alle Ascites wiesen einen guten Grad der Bindung an die drei Antigene auf mit einer gewissen Prävalenz für LGE-Zone A.
Dagegen zeigte der Western Blot-Test, daß nur ein monoklonaler Antikörper in der Lage war, eine 50 000 D-Bande zu binden, während alle übrigen Antikörper eine Bande mit einem Molekulargewicht von geringfügig mehr als 50 000 D erkannten. Bei einer Abänderung des Bindungstests ergab keiner dieser monoklonalen Antikörper eine Bindung an die Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht. Es wurde eine Studie mit "nackten" Mäusen durchgeführt, die einer Tumor- Implantation (Human-Colon-Adenocarcinom-Zellinie mit der Bezeichnung HT29) unterworden wurden.
In jedes Tier wurden 10 000 000 Zellen in 0,5 ml Medium inokuliert. 17 Tage nach der Inokulation wurden die Tiere mit RF4-Antiserum behandelt, das vorher durch Ionenaustausch gereinigt worden war, um die Immunglobulin-Fraktion zu isolieren, und dann wurden sie mit ¹²&sup5;J radioaktiv markiert. Jedes Tier erhielt auf intraperitonealem Wege 10 000 000 cpm in 0,5 ml PBS + 1 % BSA.
Die Tiere wurde nach 24, 48 und 72 h getötet und nekropsiert, um den Antikörper-Lokalisierungsindex zu errechnen.
Mit Human-Geweben wurde die Fähigkeit der Antigen-Erkennung durch die Seren von mit LGE immunisiereten Kaninchen getestet.
Die Antiseren wurden auf Humangewebe-Schnitten unter Anwendung der ABC-Immunperoxidase- und der Immungalactosidase-Verfahren und mit RIA auf Human-Gewebe-Extrakten getestet.
Es wurden Schnitte von mit Formal in fixierten, in Paraffin eingebetteten Carcinomen des Magens, des Dickdarms, der Brust, der Lunge, der Prostata und der Ovarien sowie Tumor-Explantate (die aus nackten Mäusen erhalten wurden) von HT29-Zellen (aus einem Intestinal-Carcinom), Brustkrebs MCF7- und GTL16-Zellen verwendet. Zur Kontrolle wurden verschiedene normale Human-Gewebe verwendet.
Aus den erhaltenen Ergebnissen konnte folgedes entnommen werden:
a) Kaninchen-Anti-LGE-Seren, die braun gefärbt waren, erkannten oberflächliche und zytoplasmatische Antigen- Strukturen in neoplastischen Zellen mit variablen Titer- Gehalten und variabler Spezifität in den Fällen der Magen- Dickdarm- und Brust-Carcinome und der HT29-, GTL16-Zellen.
b) Es trat keine Reaktion auf zwischen den Kaninchen- Anti-LGE-Seren und normalen Human-Leberzellen in der Immunzytochemie und mit CEA in der Immunzytochemie und RIA.
c) Nicht alle getesteten Tumore waren positiv.
Die LGE-, die ¹²&sup5;J-LGE-, die Kaninchen-Anti-LGE- und die Kaninchen ¹²&sup5;J-Anti-LGE-Systeme wurden in vivo getestet in nackten Mäusen und in nackten Mäusen, auf die HT29Zellen aufgepfropft worden waren.
Die erhaltenen Ergebnisse waren die folgenden:
1) In beiden Gruppen zeigte ¹²&sup5;J-LGE in vivo einen sehr schnellen Umsatz; 24 bis 48 h nach der subkutanen Injektion war die gesamte Radioaktivität in dem Harnwegssystem lokalisiert.
2) Die LGE und die Anti-LGE-Immunoglobuline induzierten keine Abnahme der Tumor-Belastung in nackten Mäusen, selbst wenn in einigen Fällen eine ausgeprägte Hyperämie des Tumors beobachtet wurde.
3) Die mit ¹²&sup5;J markierten Anti-LGE-Immunoglobuline zeigten 3-5 Tage nach der Injektion in nackte Mäuse, die mit HT29-Zellen bepfropft worden waren, eine signifikante LGE-Lokalisierung in der neoplastischen Masse.
Die obengenannten Ergebnisse geben in vivo die immunzytochemischen Daten wieder.
Der Extrakt (LGE) und die Anti-LGE-Seren wurden in vitro getestet mit:
1) Primär-Kulturen von neoplastischen Human-Pleural- Effusionen:
2) neoplastischen Zellinien: des Menchen (Zellinien HMF7 und HT29) und der Ratte (R3230Ac).
4) Basophilen-Degranulationstest.
Die Ergebnisse waren die folgenden:
1) der LGE und die Anti-LGE-Seren zeigten keinen direkten toxischen Effekt auf neoplastische Zellen;
2) der LGE und die Anti-LGE-Seren zeigten in vitro keine TNF (Tumor-Nekrose-Faktor)-Aktivität auf Ziel-Zellen;
3) eine zytotoxische Aktivität, wahrscheinlich vermittelt durch Lymphozyten und/oder Makrophagen, wurde nachgewiesen für Brust-Krebszellen in Primärkulturen der neoplastischen Effusion;
4) bei Verwendung von K562 und HL60 als Ziel-Zellen wirkte der LGE als starker LAK (Lymphokin-aktivierte Killerzellen)-Auslöser auf Human-Leukozyten.
Dieses Ergebnis war variabel im Vergleich mit der IL2-Antwort. Lymphozyten aus verschiedenen Donoren (Spendern) zeigten nämlich unterschiedliche zytotoxische Effekte, wenn sie mit LGE behandelt wurden.
Dagegen bewirken LGE und IL-2 gemeinsam eine starke Zunahme dieser Aktivität (+ 27,2 %).
Versuche, die mit CTLL-Zellen (Il2-sensiiv) durchgeführt wurden, schließen jede Art von Ähnlichkeit zwischen LGE und I1-2 aus.
Es konnte kein Vergleich vorgenommen werden zwischen LGE und irgendeinem BRM (biologischen Antwort-Modifizierungsmittel), insbesondere solchen der Gruppe 2. LGE war nämlich inaktiv in vitro gegenüber Tumorzellen und in vivo gegenüber Tumorzellen in dem "nackten" Mäuse-Modell. Die mit LGE auf die metastatische Human-Pleural-Effusion erhaltene in vivo-Antwort zeigt an, daß die Anwesenheit der Immunitäts-Mediator-Zellen erforderlich war.
Andererseits schloß die Extraktion von LGE in einem stark sauren Medium jede Ähnlichkeit mit BRM und mit Interferonen aus.
5) LGE inhibierte "in vitro" die Proliferation von PBL. Dies könnte in Beziehung stehen zu einer direkten Inhibierungswirkung auf Lymphozyten oder es könnte vermittelt sein durch die Induktion unterschiedlicher Inhibierungsfaktoren. Die Inhibierungseffekte scheinen dosis- und zeitabhängig zu sein.
LGE wurde in dem Basophilen-Degranulationstest untersucht. Dieser Test wird angewendet, um ein spezifisches Antigen gegen Basophile und/oder gebundene Antikörper, die ein Immungedächtnis erworben haben, zu erkennen. Der Test wird für Werte über 30 % als positiv angesehen. Bei Blutproben eines Patienten mit Lungencarcinom ergab LGE in einer sehr niedrigen Konzentration (1 ug - 0,1 ug/ml) eine signifikante dosisabhängige Basophilen-Degranulation ( > 80 %). Tests, die in weiteren fünf Fällen durchgeführt wurden, zeigten, daß 50 % Patienten, die an Neoplasie litten, in diesem Test positiv waren. Es trat keine Degranulation bei Kontrollen auf, die mit nicht-gewaschenen Proben (d.h. in Gegenwart von zirkulierenden Antikörpern und Antigenen und nicht nur mit an Basophilen gebundenen Faktoren) und kein Calcium enthaltenden Proben durchgeführt wurden (Tabelle 1). Eine Degranulation von Basophilen liegt nicht vor bei Verwendung des Blutes von gesunden Spendern. Tabelle 1 Basophile/Granulozyten % % degranulierte B. - Gesamtblut Kontrolle kein Ca++ - gewaschenes Blut

Toxikologie

Bei Mäusen und Kaninchen wurden die akute und die chronische Toxizität in Tieren getestet.
Zur Bestimmung der aktuten Toxizität wurde Mäusen und Kaninchen täglich eine LGE-Lösung entsprechend einer Dosis von 7,1 mg/kg subkutan injiziert (10 Tage lang).
Chronische Toxizitätstests laufen zur Zeit mit Kaninchen für 6 Monate mit wöchentlichen Dosen von 1,2 mg/kg.
Es konnten weder toxische Effekte noch nachweisbare Veränderungen festgestellt werden.
Vorläufige Studien mit LGE, der mit ¹²&sup5;J markiert war, ergaben eine vollständige Ausscheidung in 24/48 h durch den Urin.
Es konnten keine toxischen Effekte nachgewiesen werden durch Injektion von LGE in verschiedenen Konzentrationen bei Tieren. Eine tödliche Dosis konnte nicht ermittelt werden.

Klinische Tests

Erste Phase

29 Patienten im Endstadium wurden auf einer Mitlieds- Basis und mit Zustimmung der Patienten behandelt. Bei allen von ihnen waren vorher mehrfache Antikrebs-Behandlungen (chirurgische Behandlung, Radiotherapie, Chemotherapie) sowie danach eine unterstützende Behandlung, beispielsweise Verabreichung von antiinflammatorischen Arzneimitteln (FANS und Steroide) und Opioiden und anderen wichtigen Analgetika durchgeführt worden.
Die meisten Patienten waren kachektisch und sogar in einem Präkoma-Zustand mit einer mittleren Lebenserwartung von < 7 Tage.
Dennoch wurde eine positive Antwort (Response, Ansprechen) bei 70 % der Patienten festgestellt, der häufigste Effekt war das Verschwinden der Schmerzen und die Induktion eines subjektiven Wohlfühlens bei den Patienten; bei 48 % der Patienten wurde eine deutliche Verlängerung der Lebenserwartung ( > 2 Monate) beobachtet und es traten keine Schmerzen mehr auf.
Bei 5 von 14 Patienten, die mehr als 2 Monate überlebten, wurde eine Abnahme der Tumormasse festgestellt (Tabelle 2). Tabelle 2 Erste Phase Metastasen von und Anzahl der Fälle Anwort auf subkutane LGE-Injektion (1,5 mg) positiv nach Tage negativ Magen-Darm-Krebs Lungenkrebs Brustkrebs Pankreaskrebs Urogenital-Krebs Sarcome verschiedene Krebsarten ingesamt * In fünf Fällen trat ein Verschwinden von neoplastischen Massen auf (klinisch-instrumentale Demonstration)
In der ersten Gruppe von Patienten wurde die Behandlung mit einem höchst vorteilhaften subaktiven Effekt durchgeführt, es konnte jedoch keine weitere Analyse vorgenommen werden wegen der Heterogenität der pathologischen und klinischen Zustände, daher wurden die Patienten keiner instrumentellen oder labormäßigen Beurteilung unterzogen.
Darüber hinaus reichte die LGE-Behandlungen von einer täglichen bis zu einer wöchentlichen Verabreichung (0,025 mg/kg). Bei diesem Versuch trat keine anaphylaktische Reaktion auf.
In diesem ersten Teil der Untersuchungen wurden die folgenden Beobachtungen gemacht:
1) der LGE wies keine Toxizität bei Menschen auf, auch nicht nach wiederholter täglicher Verabreichung;
2) unterschiedliche Chargen induzierten die gleichen klinischen Effekte;
3) LGE rief eine starke Schmerzminderung hervor mit einem besseren körperlichen Wohlgefühl, einem besseren Appetit und einer verbesserten Darmfunktion.
Nach Meinung des klinischen Arztes induzierte er bei sehr kranken Patienten eine unerklärliche "Euphorie".

Zweite Phase

Während dieser Periode wurden 141 neue Krebspatienten im Endstadium behandelt. Die Haltung der klinischen Ärzte war jedoch unterschiedlich in bezug auf die Versicherung der Unschädlichkeit des LGE und die Notwendigkeit, die positiven Effekte, die beobachtet wurden, zu dokumentieren. Das Arzneimittel wurde jedoch nur noch an Patienten im Endstadium verabreicht, bei denen jede andere Behandlung versagt hatte, und nur auf einer Mitleidsbasis.
Fast alle Patienten erhielten eine subkutane Einzelinjektion von 1,5 mg LGE (etwa 0,025 mg/kg). In einigen Fällen (in den letzten drei Monaten) wurde einen Monat später eine zweite Dosis verabreicht.
Nachstehend wurden die Patienten in zwei Gruppen unterteilt, die als "N" und "U" bezeichnet wurde.
Die "N"-Patienten-Sammlung repräsentierte 108 Fälle. Die "U"-Versuche wurden bei 33 Patienten durchgeführt. Die Definition der Responder (ansprechenden Patienten) basierte nur auf dem subjektiven und objektiven generellen Zustand, d.h. auf dem Leistungsfähigkeits-Status, da alle Patienten nur eine sehr kurze Lebenserwartung hatten.

"U"-Gruppe (Tabelle 3)

Nach 4 Monaten waren 33 Krebspatienten im Endstadium, die mit LGE behandelt worden waren, alle noch am Leben, unter ihnen wurden 11 als noch nicht einschätzbar angesehen und unter den übrigen 22 Patienten waren 13 Responder (ansprechende Patienten) (3 für eine Zeitdauer von weniger als 1 Monat).
Unter den übrigen 10 Respondern (ansprechenden Patienten) ( > 30 Tage) waren 5 noch am Leben mit einer Lebenserwartung von 6 Monaten.
Bei zwei Patienten von fünf dieser Gruppe trat eine Abnahme ( > 25 %) und/oder ein Verschwinden der Tumormasse auf. Die 9 Non-Responder (nicht-ansprechenden Patienten) waren alle tot.
Unter den Patienten der Gruppe "U" wurden Kontrollen durchgeführt mit 21 Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der LGE-Verabreichung.
Bei 13 Patienten war die Granulozyten-Zunahme statistisch signifikant ohne irgendeine andere lymphozytische Populations-Zunahme. Tabelle 3 Zweite Phase - "U"-Gruppe Klinische Situation Anzahl der Fälle am Leben tot Regression oder Verschwinden der Massen ( > 25%) Non-Responder (nicht-ansprechende Patienten) Responder (ansprechende Patienten) 30 Tage in der Bewertung Gesamtanzahl
Bei der Bewertung dieser Daten muß daran erinnert werden, daß es sich bei diesen Patienten um Krebspatienten im Endstadium handelte, die eine hohe Immunsuppression aufwiesen, weshalb die Blutchemie-Modifizierung, die durch LGE induziert wurde, versteckt oder verändert sein könnte durch vorher durchgeführte Immunsuppressions-Therapien (chemische Therapie, Radiotherapie und dgl.).

"N"-Gruppe (Tabellen 4 - 5 - 6)

Es wurden 108 Krebspatienten im Endstadium behandelt. Für jeden dieser Patienten wurde jede Antitumor-spezifische Therapie (chemische Therapie, Radiotherapie, Hormontherapie) suspendiert, da sie sich als unwirksam erwiesen hatte. Die Patienten erhielten nur eine Schmerztherapie, häufig Opioide und FANS, die zu Beginn dieses Versuchs abgesetzt wurde.
Alle Patienten erhielten eine subkutane Einzeldosis von LGE (1,5 mg). In einigen Fällen wurde die Dosis 30 Tage nach der ersten Verabreichung wiederholt.
Nur 82 Patienten von 108 behandelten Patienten wurden bewertet (Tabelle 4) und unter ihnen waren nach 5-tägiger LGE-Behandlung 27 (32,9 %) Non-Responder (nicht-ansprechende Patienten) und 52 (63,4 %) waren Responder (ansprechende Patienten).
11 Non-Responder (nicht-ansprechende Patienten) (13,4 %) und 37 (45,1 %) Responder (ansprechende Patienten) überlebten innerhalb der ersten 30 Tage ab einer Einzel- Injektion von LGE (Tabelle 4). Tabelle 4 Zweite Phase - "N"-Gruppe Metastasen von Anzahl der Fälle Anzahl der bewertbaren Fälle Tage -Massen Magen-Darm-Krebs Lungenkrebs Brustkrebs Urogenital-Krebs Kehlkopf-Krebs Gewebe-Sarcome Knochen-Sarcome Gesamtanzahl - Non-Responder (nicht-ansprechende Patienten) + Responder (ansprechende Patienten) - Massen: Abnahme ( > 25 %) oder Verschwinden
Nach dem ersten Monat und in den folgenden vier Monaten überlebten vier (4,8 %) Non-Responder (nicht-ansprechende Patienten) und 30 (36,5 %) Responder (ansprechende Patienten). Bei 24 (80 %) der 30 Responder (ansprechenden Patienten) mit einer Überlebensdauer von mehr als 1 Monat trat auch eine Abnahme ( > 25 %) oder ein Verschwinden der neoplastischen Masse auf (Fig. 11 und Tabelle 5). Tabelle 5 Zweite Phase - "N"-Gruppe LGE-Therapie - Beziehung zwischen Respondern (ansprechenden Patienten) und neoplastischen Massen Metastasen von Anzahl der Fälle Non-Responder (nicht-ansprechende Patienten) Responder (ansprechende Patienten) ( > 1 Monat) - Massen* Magen-Darm-Krebs Lungenkrebs Brustkrebs Urogenital-Krebs Kehlkopf-Krebs Schilddrüsen-Krebs weiche Gewebe-Sarcome Knochen-Sarcome Gesamtanzahl * - Massen: Abnahme ( > 25 %) oder Verschwinden
Bei diesen Patienten wurde das Symptom "neoplastische Schmerzen" unabhängig von allen anderen Symptomen, die festgestellt wurden, untersucht, um den Patient als Responder (ansprechenden Patient) zu definieren.
Die folgende Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse dieser Studie bei 82 Patienten, welche die vorherige Beobachtung bestätigten: in einem bemerkenswerten Prozentsatz der Fälle, 37/82 (45,1 %), bei denen die Schmerzen trotz stärkster Opioide und trotz moderner Schmerztherapien häufig anhielten, verschwanden die Schmerzen innerhalb von 12/24 Stunden und in jedem Falle immer innerhalb der ersten Tage.
Bei einer anderen kleineren Gruppe von Patienten (24/82) verschwanden die neoplastischen Schmerzen stets vollständig, sie verschwanden jedoch später (innerhalb von 30 Tagen). Tabelle 6 Zweite Phase - "N"-Gruppe LGE-Therapie - Verschwinden der neoplastischen Schmerzen Metastasen von Anzahl der bewertbaren Fälle bis zu Tagen Magen-Darm-Krebs Lungenkrebs Brustkrebs Urogenital-Krebs Kehlkopf-Krebs Schilddrüsen-Krebs weiche Gewebe-Sarcome Knochen-Sarcome Gesamtanzahl

Dritte Phase

Obgleich die Patienten unter Anwendung der gleichen Kriterien wie oben aufgezählt kontrolliert wurden, wurde eine anatomisch-pathologische Bewertung der Behandlung vorgenommen. 6 Patienten, die an verschiedenen Krebsarten litten, die eine einzige LGE-Injektion erhalten hatten, wurden einem chirurgischen Eingriff unterzogen zur Entfernung der Tumormasse nach einem Zeitintervall in dem Bereich von 4 bis 51 Tagen.
Es wurden insgesamt 8 Proben von 6 Patienten untersucht. Zwei Gewebeproben (beide von Patienten, die von einem Dickdarmkrebs befallen waren, wurden vor der Behandlung erhalten.
Aus den gleichen Patienten sowie aus weiteren vier Patienten, die Magenkrebs (zwei Fälle), Analtrakt-Krebs und Pankreas-Krebs hatten, wurden die Gewebe geprüft nach einer LGE-Behandlung (ihnen wurde 4 bis 51 Tage vorher eine Injektion verabreicht).
Die Gewebe wurden in Paraffin eingebettet und histologisch untersucht. Außerdem wurde eine Immunfärbung mit monoklonalen Antikörpern gegen Lymphozyten (das übliche Leukozyten-Antigen CLA), mit einem PAN P-Marker (L26 monoklonal), einem PAN T-Marker (UCHL1 monoklonal) durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, daß:
die vor der LGE-Behandlung erhaltenen neoplastischen Gewebe nur ein bescheidenes Entzündungs-Infiltrat aufwiesen.
Die gleichen Patienten wurden mit LGE behandelt. Die 15 Tage nach der LGE-Behandlung geprüften Gewebe zeigten große Nekrose-Flächen und ein herausragendes Infiltrat von Granulozyten.
Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten mit Geweben aus verschiedenen Patienten 51 Tage nach der LGE-Behandlung.
In allen Fällen war, unabhängig von dem Zeitpunkt der Prüfung nach der LGE-Behandlung, die Granulozyten- Infiltration durch eosinophile Granulozyten ganz offensichtlich. Die Färbung verschiedener Typen von Lymphozyten zeigte die Anwesenheit von CLA-positiven Zellen, hauptsächlich Lymphozyten vom B-Typ, während die UCHL1-Zellen (T-Lymphozyten) selten waren.
Diese geringe Anzahl von T-Lymphozyten in Kombination mit der Anwesenheit von Granulozyten und Eosinophilen scheint extrem interessant zu sein im Vergleich zu den hämatochemischen Werten der Patienten in der Therapie (Granulozyten-Anstieg während der ersten Tage nach der LGE-Verabreichung) und zu den Ergebnissen aus den PBL-Kulturen in Gegenwart von LGE, bei denen eine Inhibierung der PBL-Proliferation beobachtet worden war, und zu den Ergebnissen des Basophilen-Degranulations-Tests.

Klinische Schlußfolgerungen

Die in drei multizentrischen Experimenten erhaltenen Ergebnisse waren sehr homogen.
Der Mengenanteil der Responder (ansprechenen Patienten) nach 1-monatiger Beobachtung betrug jeweils 48,2 %, 45,4 % bzw. 45,1 %, obgleich Unterschiede vorlagen in bezug auf Zeitpunkt, Verfahren und Doktor-Kultur.
Die Gesamtantwort nach jedem Beobachtungszeitraum einschließlich der < 7 Tage-Gruppe betrug jeweils 68,9 %, 59 % bzw. 63,4 %.
Es wurde eine Gesamt-Ansprech-Rate (Fig. 12) von 46 % (Beobachtungszeitraum 1 Monat) und 63,4 % Gesamt-Responder erhalten.
Es ist interessant daran zu erinnern, daß in der "N"- Gruppe (Tabellen 4 und 5) 80 % der Responder (ansprechenden Patienten) mit einer Überlebenszeit von mehr als 1 Monat eine Verminderung ( > 25 %) oder ein Verschwinden der Tumormasse aufwiesen. In dem gleichen Beobachtungszeitraum überlebten nur 4,8 % der Nicht-Responder (nicht ansprechenden Patienten).
Ein sehr ungewöhnliche und erstaunliche Beobachtung ist das dramatische Verschwinden (Tabelle 7) der neoplastischen Schmerzen auch bei Patienten, die nicht auf ein Opioid ansprachen. Dieser Effekt beginnt vor der Abnahme der Tumormasse und liegt auch bei den Patienten vor, bei denen kein objektiver Effekt zu erkennen war. Tabelle 7 LGE-Therapie: einzelne subkutane Injektion (1,5 mg) klinische Ergebnisse bei 134 Patienten Abnahme oder Verschwinden der Tumormassen RESPONDER NON-RESPONDER Tage
Es lohnt sich, diese klinische Beobachtung näher zu untersuchen.
Die Ergebnisse des dritten Experiments zeigen eine starke Granulozytose und perivasculäre Nekrose in dem neoplastischen Gewebe nach der Verabreichung einer einzigen LGE-Dosis und bestätigen vom histopathologischen Standpunkt aus betrachtet die Aktivität der Substanz in bezug auf die Induktion der Lysis der neoplastischen Zellen beim Menschen mit einem Tumor-spezifischen Mechanismus und in bezug auf die Induktion eines immunogenen Musters in dem Wirt.

Claims

1. Substanzen vom Polypeptid-Typ, die erhältlich sind durch

a) Homogenisieren von Ziegenleber oder Ziegenintestinum unter Anwendung üblicher Methoden;

b) Behandeln der Homogenate mit 2N HClO&sub4; bei Temperaturen unterhalb 10ºC;

c) Zentrifugieren und Dialysieren gegen Wasser;

d) Behandeln mit einer hypertonischen Lösung, Zentrifugieren oder Membranfiltrieren und Dialysieren gegen Wasser und anschließend gegen einen Salz-Puffer (PBS);

e) Ultrafiltrieren auf Membranen mit einem Cut-off (Ausblendung) von 10 000 D bis zu einer Konzentration von etwa 1 mg/ml Proteinen; und

f) gegebenenfalls weiteres Reinigen durch Gelchromatographie,

wobei die Substanzen die folgenden Charakteristika aufweisen:

- Elektrophorese-Banden auf Polyacrylamid-Gel bei etwa 50 000, 20 000, 14 800 und 12 000 Dalton.

2. Substanzen nach Anspruch 1, die ein Molekulargewicht auf Polyacrylamidgel bei 50 000 aufweisen.

3. Substanzen nach Anspruch 1, die ein Molekulargewicht auf Polyacrylamidgel bei 20 000 aufweisen.

4. Substanzen nach Anspruch 1, die ein Molekulargewicht auf Polyacrylamidgel bei 14 800 aufweisen.

5. Substanzen nach Anspruch 1, die ein Molekulargewicht auf Polyacrylamidgel bei 12 000 aufweisen.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) die Substanzen vom Polypeptid-Typ nach den Ansprüchen 1 bis 5 enthält.

7. Substanzen nach den Ansprüchen 1 bis 5 für die Verwendung als Agens zur Herstellung eines Arzneimittels mit einer Antitumor-Aktivität und für die Bekämpfung von Schmerzen in Verbindung mit einer Tumorerkrankung.

8. Verwendung der Substanzen nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung von mono- oder polyklonalen Antikörpern gegen die in Tumorzellen vorhandenen Antigene.