CN107429230B - 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了将多能细胞分化为造血细胞的培养平台、细胞培养基和方法。本发明进一步提供了使用本文公开的培养平台和方法产生的多能干细胞来源的造血细胞，其能够无饲养、单层培养和不进行EB形成。特别的，本发明的多能干细胞来源的造血细胞包括和不限于iHSC、永久造血内皮、造血专能祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、T细胞和NK细胞。

Description

用于诱导造血细胞分化的方法和组合物
关联申请
本申请要求2015年1月26日提交的美国临时申请号62/107,517和2015年11月4日提交的美国临时专利申请号62/251,016的优先权，其在此全文引入作为参考。
技术领域
本发明一般涉及用于从多能干细胞生产所有造血谱系细胞的组合物和方法。特别的，本发明涉及从多能干细胞，包括人诱导性多能干细胞生产所有造血谱系细胞的改进的培养平台。
背景
人诱导性多能干细胞(hiPSC)技术代表了用于治疗包括癌症在内的许多血液学和非血液学恶性肿瘤的治疗上可行的造血细胞的非常有希望和可能无限的来源。为了推进hiPSC和基因工程改造的hiPSC技术作为造血细胞治疗的同种异体来源的前景，必须能够不仅有效和可重复地产生造血干细胞和祖细胞(HSC)，而且还产生免疫效应物种群，包括T、B、NKT和NK淋巴样细胞及其祖细胞的多样性子集。
由于在胚胎发育期间存在至少两个在时间和空间上不同的血液形成阶段(waves)——原始(primitive)造血和永久(definitive)造血——的原因，具有产生淋巴细胞潜能的HSC的体外衍生是复杂的。原始造血发生在胚外卵黄囊中，并产生主要包括原始红细胞和骨髓细胞而不是HSC的瞬时和限制性造血细胞。最初的HSC仅在来自称为永久造血内皮(HE)的动脉血管内的特异性内皮祖细胞的最终阶段中才出现。然后永久HE经历内皮细胞-造血过渡以产生HSC，然后HSC在整个成年期间最终迁移到骨髓，在那里它们维持多系血细胞生成，包括T、B、NKT和NK淋巴样细胞。因此，来自多能干细胞的HSC和淋巴样效应细胞的产生取决于通过精心设计和验证的方法和组合物，将早期胚胎造血发育的复杂阶段准确地重整(recapitulate)为永久程序的能力。
有限数量的研究已经描述了hiPSC在体外向永久的HE的直接分化。将hiPSC用于治疗目的的主要障碍是需要在存在不明确含血清培养基的情况下，首先将这些细胞与鼠源或人源性基质细胞共培养，以保持多能性并诱导分化。此外，现有的方案还采用了包括将iPSC培养形成胚状体(EB)的策略，后者是包含外胚层，中胚层和内胚层细胞的各种分化细胞的细胞的不均匀聚集体。这些方法需要通过例如旋转来聚集多能细胞以形成团块，允许细胞沉降并聚集在孔中或允许悬浮培养物中的被动聚集和团块形成。形成的EB在分化诱导培养***中保持一定持续时间，通常为7至10天，以允许适当的分化，然后将EB转移至贴壁培养以进一步成熟，或解离成单个细胞用于细胞类型选择，以便进行到随后的分化步骤。(Kennedy等，Cell Reports 2012:1722-1735；Knorr等，Stem Cell TranslationalMedicine 2013(2):274-283)。例如，Kennedy等教导产生用于iPSC分化的EB，其中多能细胞用胶原酶和胰蛋白酶处理以允许剥下(scraping)细胞形成小的聚集体，然后将其培养形成EB。已经显示EB的形成促进多能干细胞分化，然而，形成聚集体和随后的EB的需求是劳动密集型的，细胞数量在该过程中最小程度地增加，三维EB聚集体中的细胞内容物不一致并且不均匀地暴露于培养基因子，这导致形成处于不同分化阶段的异质细胞产品，并且极大地阻碍了要求有效和流水线的制造过程的可扩展性和可再现性。
因此，需要不依赖于共培养或含血清培养基且不需要形成胚状体聚集体作为中间体的将干细胞分化为永久性造血细胞的方法和组合物。
发明概述
本发明一般涉及用于培养和将干细胞分化为造血细胞命运(fate)的细胞培养条件、培养基、培养平台和方法。
具体而言，本发明提供了在血清/无饲养条件下，且在可扩展和单层培养平台中，不需要EB形成的情况下，通过来自多能干细胞(包括hiPSC)的永久造血内皮(HE)和永久造血干细胞(HSC)产生造血细胞谱系的方法和组合物。可以根据本发明的方法分化的细胞的范围从多能干细胞到确定为特定末端分化细胞和转分化细胞的祖细胞，各种谱系的细胞不通过多能中间体直接转化成造血命运。类似地，通过干细胞分化产生的细胞范围从专能干细胞或祖细胞到终末分化的干细胞，以及所有中间的造血细胞谱系。
本发明提供了用于在单层培养中从多能干细胞分化和扩增造血谱系细胞的方法和组合物，其包括使多能性固体细胞与BMP途径激活剂和任选的bFGF接触。从而，获得并扩增了多能干细胞来源的中胚层细胞，而不从多能干细胞形成胚状体。然后使中胚层细胞与BMP途径激活剂、bFGF和WNT途径激活剂接触，以获得具有永久造血内皮(HE)潜能的扩增的中胚层细胞，而不从多能干细胞形成胚状体。随后通过与bFGF和任选的ROCK抑制剂和/或WNT途径激活剂接触，具有永久HE潜能的中胚层细胞被分化成永久HE细胞，其在分化过程中也被扩增。
本文提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化，因为EB的形成导致中等至最小的细胞扩增，不允许对需要均匀扩增的许多应用是重要的的单层培养以及细胞在群体中的均一分化，并且是费力和低效率的。
本文提供了利于分化为永久造血内皮的单层分化平台，导致造血干细胞和分化后代如T、B、NKT和NK细胞的衍生。所示单层分化策略将增强的分化效率与大规模扩增结合起来，可以递送治疗相关数量的多能干细胞来源的造血细胞用于各种治疗应用。此外，本发明公开了使用本文提供的方法的单层培养导致功能性造血谱系细胞，其能够进行全范围的体外分化，离体调节和体内长期造血自我更新、重建和移植。
本发明的一个方面提供了用于获得多能干细胞来源的造血细胞系的培养平台，其包含：第I组：(i)培养基，其包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中该培养基可选的不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂，并适于从永久造血内皮分化和扩增永久HSC；(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮；以及(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞。
可替代的，用于获得多能干细胞来源的造血细胞系的培养平台包含第II组：(i)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，且可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从中胚层细胞分化和扩增具有永久造血内皮潜能的永久造血内皮；(ii)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，并可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于获得具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞；以及(iii)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞。在一些实施方式中，上述培养平台的多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述培养平台的第(II)组进一步包含：(iv)培养基，其包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，且不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于接种和扩增多能干细胞。
在上述培养平台的一些实施方式中，每个第(I)组和第(II)组进一步包含附加培养基。
第(I)组可进一步包含：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子；以及一种或多种Notch途径激活剂；其中该培养基不含BMP激活剂，并适于将多能干细胞来源的T祖细胞分化为T细胞，或(ii)培养基，其包含BMP激活剂；一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子；以及一种或多种Notch途径激活剂，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久HSC分化为T祖细胞。这些附加培养基适于产生多能干细胞来源的T细胞系。
第(II)组可进一步包含：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，但不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种，其中该培养基适于将多能干细胞来源的前-T祖细胞分化为T祖细胞或T细胞；或(ii)培养基，其包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久造血内皮分化为前-T祖细胞；且这些附加的培养基适于产生多能干细胞来源的T细胞系。
在上述培养平台的一些实施方式中，每个第(I)组和第(II)组还进一步包含附加培养基：
第(I)组可进一步包含：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含BMP激活剂，并适于将多能干细胞来源的NK祖细胞分化为NK细胞；或(ii)培养基，其包含BMP激活剂；一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久HSC分化为NK祖细胞；且这些附加培养基适于产生多能干细胞来源的NK细胞系。
关于第(II)组，除了上述培养基外，其可进一步包含：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种并适于将多能干细胞来源的前-NK祖细胞分化为NK祖细胞或NK细胞；或(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久造血内皮分化为前-NK祖细胞；且这些附加培养基适于产生多能干细胞来源的NK细胞系。
在又一实施方式中，提供的培养平台的第(II)组进一步包含：(i)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，但不含ROCK抑制剂，其中该培养基适于将多能干细胞来源的前-HSC分化为造血专能祖细胞；(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久造血内皮分化为前-HSC；且这些培养基被提供用于产生多能干细胞来源的造血专能祖细胞。
本发明的另一方面提供了用于分化和扩增多能干细胞来源的造血细胞的组合物，其包含一种或多种下述第(I)组或第(II)组。
第(I)组：(i)培养基，其包含BMP激活剂；一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子；以及多能干细胞来源的永久造血内皮，其中该培养基可选的不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂，并适于从多能干细胞来源的永久造血内皮分化和扩增永久HSC；(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂；以及多能干细胞来源的中胚层细胞，其中该培养基适于从多能干细胞来源的中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮；以及(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂；以及iPSC，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞。
第(II)组：(i)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞，其中该培养基可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从具有造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮；(ii)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，但不含TGFβ受体/ALK抑制剂；以及多能干细胞来源的中胚层细胞，其中该培养基适于从多能干细胞来源的中胚层细胞分化和扩增具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞；以及(iii)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；以及iPSC，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞。
在用于分化和扩增多能干细胞来源的造血细胞的组合物的一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
在用于分化和扩增多能干细胞来源的造血细胞的组合物的一些实施方式中，第(II)组包含附加组分，例如(vi)培养基，其包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，且不含TGFβ受体/ALK抑制剂；以及多能干细胞；其中该培养基适于接种和扩增多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
在上述用于分化和扩增多能干细胞来源的造血细胞的组合物的一些实施方式中，第(I)组另外包含：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子；以及一种或多种Notch途径激活剂；以及多能干细胞来源的T祖细胞，其中该培养基不含BMP激活剂，并适于将多能干细胞来源的T祖细胞分化为T细胞，或(ii)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子；一种或多种Notch途径激活剂；以及多能干细胞来源的永久HSC，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久HSC分化为T祖细胞；且这些附加培养基适于产生多能干细胞来源的T细胞系。
关于上述用于分化和扩增多能干细胞来源的造血细胞的组合物的第(II)组，在一些实施方式中，其进一步包含：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，但不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；以及多能干细胞来源的前-T祖细胞，其中该培养基适于将多能干细胞来源的前-T祖细胞分化为T祖细胞或T细胞；或(ii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子和多能干细胞来源的永久造血内皮，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-T祖细胞。这些附加培养基适于产生多能干细胞来源的T细胞系。
在上述用于分化和扩增多能干细胞来源的造血细胞的组合物的又一实施方式中，第(I)组进一步包含(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；以及多能干细胞来源的NK祖细胞，其中该培养基不含BMP激活剂，并适于将NK祖细胞分化为NK细胞；或(ii)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；以及多能干细胞来源的永久HSC，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久HSC分化为NK祖细胞。这些附加的培养基适于产生多能干细胞来源的NK细胞系。可替代的，上述用于分化和扩增多能干细胞来源的造血细胞的组合物的第(II)组进一步包含：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；以及多能干细胞来源的前-NK祖细胞，其中该培养基适于将前-NK祖细胞分化为NK祖细胞或NK细胞；或(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子和多能干细胞来源的永久造血内皮，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-NK祖细胞。这些培养基适于产生多能干细胞来源的NK细胞系。
在又一些实施方式中，上述用于分化和扩增多能干细胞来源的造血细胞的组合物的第(II)组进一步包含一种或多种培养基，用于产生多能干细胞来源的造血专能祖细胞，其中培养基包含：(i)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，但不含ROCK抑制剂，和多能干细胞来源的前-HSC，其中该培养基适于将前-HSC分化为造血专能祖细胞；和/或(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，和多能干细胞来源的永久造血内皮，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-HSC。
本发明的一个方面提供了用于产生多能干细胞来源的T细胞系的培养平台，其包含：第I组-(i)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增多能干细胞来源的中胚层细胞；(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮；(iii)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子；其中该培养基可选的不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂，并适于从永久造血内皮分化和扩增永久HSC；以及(iv)培养基，其包含BMP激活剂；一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子；以及一种或多种Notch途径激活剂，其中该培养基适于从永久HSC分化T祖细胞；以及可选的，(v)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子；以及一种或多种Notch途径激活剂；其中该培养基不含BMP激活剂，并适于从T祖细胞分化T细胞。
可替代的，用于产生多能干细胞来源的T细胞系的培养平台包含：第II组-(i)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增多能干细胞来源的中胚层细胞；(ii)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从中胚层细胞获得具有永久HE潜能的中胚层细胞；(iii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮；(iv)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子和多能干细胞来源的永久造血内皮，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-T祖细胞；以及(v)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，但不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；以及多能干细胞来源的前-T祖细胞，其中该培养基适于将前-T祖细胞分化为T祖细胞或T细胞。
在上述用于产生多能干细胞来源的T细胞系的培养平台的一些实施方式中，第II组培养平台进一步包含：(vi)培养基，其包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，且可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于接种和扩增多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
本发明的另一方面提供了用于产生多能干细胞来源的NK细胞的培养平台，其包含：第I组-(i)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂，其中该培养基适于将多能干细胞分化为中胚层细胞；(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于将中胚层细胞分化为永久造血内皮；(iii)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中该培养基可选的不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂，并适于将永久造血内皮分化为永久HSC；(iv)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；其中该培养基适于将永久HSC分化为NK祖细胞；以及可选的，(v)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含BMP激活剂，并适于将NK祖细胞分化为NK细胞。
可替代的，用于产生多能干细胞来源的NK细胞的培养平台包含：第II组-(i)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞；(ii)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从中胚层细胞获得具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞；(iii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化永久造血内皮；(iv)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-NK祖细胞；以及(v)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种并适于将前-NK祖细胞分化为NK祖细胞或NK细胞。
在上述用于产生多能干细胞来源的NK细胞的培养平台的一些实施方式中，第II组培养平台进一步包含：(vi)培养基，其包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，且不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于接种和扩增多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
本发明的又一方面提供了用于产生多能干细胞来源的永久造血内皮(iHE)的培养平台，其包含：(i)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞；(ii)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从多能干细胞来源的中胚层细胞获得具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞；以及(iii)培养基，其包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11的生长因子和细胞因子，其中培养基可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，且其中该培养基适于从具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮。
在用于产生多能干细胞来源的永久造血内皮(iHE)的培养平台的一些实施方式中，培养平台进一步包含(iv)培养基，其包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，且不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于接种和扩增多能干细胞。
本发明的另一方面还提供了用于产生多能干细胞来源的造血专能祖细胞的培养平台，其包含：(i)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增多能干细胞来源的中胚层细胞；(ii)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从多能干细胞来源的中胚层细胞获得具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞；(iii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；其中培养基可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从中胚层细胞分化和扩增具有永久造血内皮潜能的永久造血内皮；(iv)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-HSC；以及(v)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含ROCK抑制剂，其中该培养基适于将前-HSC分化为造血专能祖细胞。在一些实施方式中，培养平台进一步包含(vi)培养基，其包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，且不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于接种和扩增多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
本发明的另一方面提供了一种用于引导多能干细胞分化为永久造血谱系细胞的方法，其包括：第I组-(i)使多能干细胞接触包含GSK3抑制剂、BMP激活剂的组合物，以启动从多能干细胞到多能干细胞来源的中胚层细胞的分化和扩增；(ii)使多能干细胞来源的中胚层细胞接触包含GSK3抑制剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以启动从多能干细胞来源的中胚层细胞到多能干细胞来源的永久造血内皮细胞的分化和扩增；以及(iii)使多能干细胞来源的永久造血内皮接触包含BMP激活剂，一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子的组合物，其中组合物可选的不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂，以启动从造血内皮细胞到多能干细胞来源的永久HSC的分化和扩增。
可替代的，用于引导多能干细胞分化为永久造血谱系细胞的方法包括：第II组-(i)使多能干细胞接触包含BMP激活剂以及可选的bFGF的组合物，以启动从多能干细胞到中胚层细胞的分化和扩增；(ii)使中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物，其中组合物可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，以启动从中胚层细胞到具有永久HE潜能的中胚层细胞的分化和扩增；(iii)使具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物；其中组合物可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，以启动从多能干细胞来源的具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞到永久造血内皮的分化和扩增；以及可选的，使多能干细胞、多能干细胞来源的中胚层细胞、具有造血内皮和/或永久造血内皮的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。
在用于引导多能干细胞向造血谱系细胞的分化的方法的一些实施方式中，第(II)组方法进一步包括使多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂，以接种和扩增多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
在用于引导多能干细胞向造血谱系细胞的分化的方法的一些实施方式中，多能干细胞向造血谱系细胞的分化不产生拟胚体且为单层培养形式。
在上述方法的一些实施方式中，获得的多能干细胞来源的永久造血内皮细胞是CD34+。在一些实施方式中，获得的永久造血内皮细胞是CD34+CD43-。在一些实施方式中，永久造血内皮细胞是CD34+CD43-CXCR4-CD73-。
在上述方法的一些其他实施方式中，第I组进一步包括(i)使多能干细胞来源的永久HSC接触包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂的组合物，以启动多能干细胞来源的永久HSC向T祖细胞的分化以及可选的使T祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子；以及一种或多种Notch途径激活剂的组合物，以启动T祖细胞向T细胞的分化。在一些实施方式中，第II组方法进一步包括(i)使多能干细胞来源的永久造血内皮接触包含ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子的组合物，以启动永久造血内皮向前-T祖细胞的分化；以及可选的，(ii)使前-T祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，但不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种的组合物，以启动前-T祖细胞向T祖细胞或T细胞的分化。在该方法的一些实施方式中，多能干细胞来源的T祖细胞是CD34+CD7+。
在上述用于引导多能干细胞向造血谱系细胞的分化的方法的又一些实施方式中，第I组方法进一步包括：(i)使多能干细胞来源的永久HSC接触包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子的组合物，以启动永久HSC向NK祖细胞的分化；以及可选的，(ii)使NK祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，但不含BMP激活剂的组合物，以启动NK祖细胞向NK细胞的分化；或第II组方法进一步包括：(i)使多能干细胞来源的永久造血内皮接触包含BMP激活剂、ROCK抑制剂、以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子、BMP激活剂的组合物，以启动永久造血内皮向前-NK祖细胞的分化；以及可选的，(ii)使多能干细胞来源的前-NK祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子的组合物，其中该培养基不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种，以启动前-NK祖细胞向NK祖细胞或NK细胞的分化。在一些实施方式中，第II组方法进一步包括：(i)使多能干细胞来源的永久造血内皮接触包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以启动永久造血内皮向前-HSC的分化；(ii)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，但不含ROCK抑制剂，其中该培养基适于将多能干细胞来源的前-HSC分化为造血专能祖细胞。在一些实施方式中，使用上述方法获得的多能干细胞来源的永久HSC是CD34+CD45+并适于长期移植。
本发明的另一方面提供了一种用于产生多能干细胞来源的T细胞系的方法，其包括：第I组-(i)使多能干细胞接触包含GSK3抑制剂、BMP激活剂的组合物，以启动从多能干细胞向中胚层细胞的分化和扩增；(ii)使中胚层细胞接触包含GSK3抑制剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以启动从中胚层细胞向永久造血内皮的分化和扩增；(iii)使永久造血内皮接触包含BMP激活剂，一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子的组合物；其中组合物不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂，以启动从永久造血内皮向永久HSC的分化和扩增；以及(iv)使永久HSC接触包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂的组合物，以启动永久HSC向T祖细胞的分化；以及可选的，(v)使T祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子；一种或多种Notch途径激活剂；但不含BMP激活剂的组合物，以启动T祖细胞向T细胞的分化。
可替代的，用于产生多能干细胞来源的T细胞系的方法包括：第II组-(i)使多能干细胞接触包含BMP激活剂以及可选的bFGF的组合物，以启动从多能干细胞到中胚层细胞的分化和扩增；(ii)使中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，但不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以启动从中胚层细胞向具有永久HE潜能的中胚层细胞的分化和扩增；(iii)使具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物；其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂，以启动从具有永久HE潜能的中胚层细胞向永久造血内皮的分化和扩增；(iv)使永久造血内皮接触包含ROCK抑制剂、一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子的组合物，以启动永久造血内皮向前-T祖细胞的分化；以及(v)使前-T祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子的组合物，其中组合物不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；以启动前-T祖细胞向T祖细胞或T细胞的分化；以及可选的，可以使接种的多能干细胞、中胚层细胞、具有永久HE潜能的中胚层细胞和/或永久造血内皮处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，第II组上述方法进一步包括：使iPSC接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，但不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以接种和扩增多能干细胞；和/或其中多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在该方法的一些实施方式中，多能干细胞向T细胞谱系的分化不产生拟胚体且为单层培养形式。
本发明的又一方面提供了一种用于产生多能干细胞来源的NK细胞系的方法，其包括：第I组-(i)将多能干细胞与包含GSK3抑制剂、BMP激活剂的组合物接触，以启动多能干细胞向中胚层细胞的分化；(ii)使中胚层细胞接触包含GSK3抑制剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以启动中胚层细胞向永久造血内皮的分化；(iii)使永久造血内皮接触包含BMP激活剂，一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子的组合物，其中组合物不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂；以启动多能干细胞来源的永久造血内皮向永久HSC的分化；以及(iv)使永久HSC接触包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子的组合物，以启动永久HSC向NK祖细胞的分化；以及可选的，(v)使多能干细胞来源的NK祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，但不含BMP激活剂的组合物，以启动NK祖细胞向NK细胞的分化。可替代的，用于产生多能干细胞来源的NK细胞系的方法包括：第II组-(i)使多能干细胞接触包含BMP激活剂以及可选的bFGF的组合物，以启动从多能干细胞向中胚层细胞的分化和扩增；(ii)使中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以启动从中胚层细胞向具有永久HE潜能的中胚层细胞的分化和扩增；(iii)使具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及ROCK抑制剂，以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以启动从多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞向多能干细胞来源的永久造血内皮的分化和扩增；(iv)使多能干细胞来源的永久造血内皮接触包含一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子、BMP激活剂和ROCK抑制剂的组合物，以启动多能干细胞来源的永久造血内皮向前-NK祖细胞的分化；以及(v)使多能干细胞来源的前-NK祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，但不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种的组合物，以启动多能干细胞来源的前-NK祖细胞向多能干细胞来源的NK祖细胞或NK细胞的分化；以及可选的，使接种的多能干细胞、多能干细胞来源的-中胚层细胞和/或永久造血内皮处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，用于产生多能干细胞来源的NK细胞系的第II组方法进一步包括使iPSC接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，但不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以接种和扩增iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，用于产生多能干细胞来源的NK细胞系的方法不产生拟胚体且为单层培养形式。
本发明的另一方面提供了一种用于产生多能干细胞来源的永久造血内皮的方法，包括：(i)使iPSC接触包含BMP激活剂以及可选的bFGF的组合物，以启动从多能干细胞向多能干细胞来源的中胚层细胞的分化和扩增；(ii)使多能干细胞来源的中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以启动从多能干细胞来源的中胚层细胞向多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞的分化和扩增；(iii)使多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及ROCK抑制剂，以及可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以启动从多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞向多能干细胞来源的永久造血内皮的分化和扩增；以及可选的，使接种的多能干细胞、多能干细胞来源的中胚层细胞和/或永久造血内皮处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，上述产生多能干细胞来源的永久造血内皮的方法进一步包括：使iPSC接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，但不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以接种和扩增iPSC；和/或其中iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述使iPSC分化为永久造血内皮细胞的方法不产生拟胚体且为单层培养形式。
本发明的另一方面提供了一种用于产生多能干细胞来源的专能造血谱系祖细胞的方法，包括：(i)使iPSC接触包含BMP激活剂以及可选的bFGF的组合物，以启动从iPSC向多能干细胞来源的中胚层细胞的分化和扩增；(ii)使多能干细胞来源的中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂但不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以启动中胚层细胞向具有永久HE潜能的中胚层细胞的分化和扩增；(iii)使具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂，以启动具有永久HE潜能的中胚层细胞向永久造血内皮的分化和扩增；(iv)使永久造血内皮接触包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以启动永久造血内皮向前-HSC的分化；以及(v)使前-HSC接触包含BMP激活剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，但不含ROCK抑制剂的组合物，以启动前-HSC向造血专能祖细胞的分化；以及可选的，使接种的多能干细胞、中胚层细胞和/或永久造血内皮处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，上述产生多能干细胞来源的造血专能祖细胞的方法进一步包括使多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂但不含TGFβ受体/ALK抑制剂的组合物，以接种和扩增多能干细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，使用上述方法将多能干细胞分化为造血专能祖细胞不产生拟胚体且为单层培养形式。
本发明进一步的方面提供了一种组合物，包含：一种或多种产生自本文公开的培养平台的细胞群：多能干细胞来源的(i)CD34+永久造血内皮(iCD34)，其中iCD34细胞能够分化为专能祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、T细胞和NK细胞，且其中iCD34细胞是CD34+CD43-；(ii)永久造血内皮(iHE)，其中iHE细胞是CD34+；(iii)多能干细胞来源的永久HSC，其中iHSC使CD34+CD45+；(iv)造血专能祖细胞，其中iMPP细胞是CD34+CD45+；(v)T祖细胞，其中T祖细胞是CD34+CD7+；(vi)T细胞，其中T细胞是CD4+或CD8+；(vii)NK祖细胞，其中NK祖细胞是CD56+CD7+CD161+；以及(viii)NK细胞，其中NK细胞是CD56+CD57+CD16+CD94-。
本发明又一进一步的方面提供了一种或多种细胞系，或使用本文公开的方法产生的克隆细胞：多能干细胞来源的(i)CD34+永久造血内皮(iCD34)，其中iCD34细胞能够分化为专能祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、T细胞和NK细胞，且其中iCD34细胞是CD34+CD43-；(ii)永久造血内皮(iHE)，其中iHE细胞系或克隆细胞是CD34+；(iii)永久HSC，其中iHSC是CD34+CD45+；(iv)造血专能祖细胞(iMPP)，其中iMPP细胞是CD34+CD45+；(v)T祖细胞，其中T祖细胞是CD34+CD7+；(vi)T细胞，其中T细胞是CD4+或CD8+；(vii)NK祖细胞，其中NK祖细胞是CD56+CD7+CD161+；以及(viii)NK细胞，其中NK细胞是CD56+CD57+CD16+CD94-。
本发明的另一方面提供了使用所公开的方法产生的一种或多种细胞群、细胞系或克隆细胞促进造血自我更新、重建或移植的方法：多能干细胞来源的(i)CD34+永久造血内皮(iCD34)，其中iCD34细胞能够分化为专能祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、T细胞和NK细胞，且其中iCD34细胞是CD34+CD43-；(ii)永久造血内皮(iHE)，其中iHE细胞系或克隆细胞是CD34+；(iii)永久HSC，其中iHSC是CD34+CD45+；(iv)造血专能祖细胞，其中iMPP细胞是CD34+CD45+；(v)T祖细胞，其中T祖细胞是CD34+CD7+；(vi)T细胞，其中T细胞是CD4+或CD8+；(vii)NK祖细胞，其中NK祖细胞是CD56+CD7+CD161+；以及(viii)NK细胞，其中NK细胞是CD56+CD57+CD16+CD94-。
简言之，本发明提供了能够使多能干细胞单层直接分化而不从多能干细胞产生拟胚体的方法和组合物，从而能够进行中胚层细胞、永久HE和永久HSC的分化和扩增，其中其它造血细胞系能够以非常高的效率水平以规模化的、可靠的模式获得。
附图简述
图1显示了人诱导性多能干细胞(hiPSC)向全分化T细胞的造血分化多阶段过程的示例性简图。
图2显示了hiPSC向全分化NK细胞的造血分化多阶段过程的示例性简图。
图3A-3E显示了9天的过程中表明由hiPSC向造血细胞转变的形态变化。
图4A-4D显示了在干细胞由多能干细胞向造血命运完全转变时干细胞的表达谱。
图5A-5C显示了由多种方法和开始条件产生的hiPSC分化的造血细胞的CD34/CD45表达谱。
图6A-6C显示了当在描述的分化培养基中以单层培养时CD34分化效率的改进。
图7显示了单细胞解离后在ROCK抑制下造血分化细胞的存活和增殖。
图8显示了培养22天后由hiPSC分化的造血细胞的CD34表达的维持。
图9A-9B显示了在仅表达人CD45标记的细胞存在下移植的CD34阳性细胞的体内重建和在T和B细胞存在下CD34+细胞的重建。CD34阳性细胞源自用GSK3抑制剂以单层形式且不形成EB或聚集中间体培养的初始hiPSC。
图10显示了CD56阳性细胞和单阳性CD4和CD8细胞，其来自CD56-/CD7+/CD3+/TCRαβ+设门方法(gating strategy)，在不含基质细胞且存在可溶性DLL1和DLL4重组肽(仅T细胞)的分化培养基中进一步培养hiPSC来源的CD34阳性细胞时进行鉴定。
图11显示了如增强的PD-L1表面表达所示，hiPSC来源的CD34阳性细胞能够应答药理学调节。
图12显示了诱导性多能干细胞(iPSC)向永久造血内皮(iHE)和多能专细胞(iMPP)的造血分化多阶段过程的简图。注意该培养可以通过使用MatrigelTM替换玻连蛋白转变为全限定的。
图13显示了诱导性多能干细胞分化为T祖细胞(iproT)和全分化的T(iT)细胞的造血分化多阶段过程的简图。注意该培养可以通过使用MatrigelTM替换玻连蛋白转变为全限定的。
图14显示了诱导性多能干细胞分化为NK祖细胞(iproNK)和全分化的NK(iNK)细胞的造血分化多阶段过程的简图。注意该培养可以通过使用MatrigelTM替换玻连蛋白转变为全限定的。
图15A-C显示了描述10天的过程后iHE的出现和每iPSC分化产生的iCD34和iHE细胞的流式细胞谱。基于代表性培养物和未优化培养物的照片进行计算。
图16A-E显示了对流程的修饰，包括接种密度和生长因子滴定，以改善第10天HE的产生。A)第0天的接种密度影响第10天的HE群。B)第2天-第6天的BMP4浓度影响第10天的HE群。C)第3.75天的CHIR浓度影响第10天的HE群。D)第6天的接种密度影响第10天的HE群。E)在第8天添加IGF1和EPO在第10天减少HE。
图17A-B显示第10天HE表现为专能的并且依赖于Notch信号传导途径的永久造血。A)用新出现的CD45造血细胞的流式细胞谱测定的7天MPP试验的形态学变化。B)iPSC来源的CD34+细胞在iMPP试验期间产生Notch依赖的永久CD45+细胞。
图18A-B显示在缺氧条件下分化对产生iHE和iMPP造血祖细胞的影响。A)缺氧时单层分化在第10天增加iCD34阳性细胞和iHE细胞的百分比。B)第10天在缺氧条件下产生的iCD34+HE细胞可以在iMPP试验中进一步分化。
图19A-D显示了未分选或分选的第10天培养物被冷冻保存并维持造血潜能的能力。A)冷冻保存第10天未分选的分化培养物可以在iMPP试验期间存活并产生CD45+造血细胞。B)、C)和D)冷冻保存的第10天iCD34+分选的细胞可以在iMPP试验期间存活并产生CD45+造血细胞。
图20A-B显示第10天分化培养物可以在环境温度下运输过夜而不损失HE潜能。A)第7天的培养物保持在培养箱(对照组)中，或运输处理过夜，随后再次引入培养箱中另外两天。然后分析第10天的两种培养物中iCD34和iHE细胞的存在。在过夜运输的培养物中，T型烧瓶包含含有70％基质(base)的30％培养基或100％培养基。B)细胞数量计算。
图21A-C显示了利用CD45+CD56-设门方法的源自hiPSC的早期CD34+CD7+T祖细胞和成熟CD4+和CD8+ T细胞亚群。A)早期T细胞谱系标签标记了由CD34+/CD7+定义的iproT细胞的存在。B)成熟T细胞标签标记了由CD4+或CD8+细胞定义的成熟T细胞的存在。C)5天T细胞分化比较来自脐带血的CD34阳性细胞和iCD34阳性细胞产生iproT细胞的潜能。
图22A-C显示了利用CD45+设门方法的源自hiPSC的早期CD56+CD7+CD161+NK细胞祖细胞和成熟CD56+CD16+CD8+NK细胞亚群。A)早期NK谱系标签标记了由CD7和CD56定义的iproNK细胞的存在。B)成熟的NK谱系标签标记了由CD57、CD16、CD94和CD56定义的成熟NK细胞的存在。C)5天NK细胞分化比较来自脐带血的CD34阳性细胞和iCD34阳性细胞产生iproNK细胞的潜能。
图23A-C显示了单层hiPSC造血分化平台允许在EB形成过程中得不到的规模化扩增策略。A.hiPSC聚集形成拟胚体，并在分析CD34和43表达之前分化14天。B.将hiPSC单层接种并分化8天，然后分析CD34、43、CXCR4和CD73。C.对CD34阳性细胞进行计数，按时间绘制单层和EB培养的造血分化。
图24显示了单层hiPSC造血分化平台用于生产成品iNK和iT细胞的规模化扩增策略简图。基于代表性培养物和未优化培养物的照片进行计算。
图25显示hiPSC来源的CD34阳性细胞通过抑制CD3+ T细胞存活而具有免疫调节性质。
图26显示了使用CD45+CD56-设门方法的hiPSC来源的成熟CD4+和CD8+ T细胞亚群。
图27显示基于饲养的悬浮培养支持iCD34来源的NK细胞的成熟。
图28显示iCD34来源的iNK能够以与外周血NK细胞相似的模式应答细胞因子刺激来分泌促炎性细胞因子。
图29显示使用CD45+设门方法源于脐带血CD34阳性细胞的前-NK细胞的无基质分化比常规基于基质的分化平台更为快速。
图30显示了iPSC来源的iCD34+细胞向NK细胞的无基质分化。板结合的DLL4支持CD56+CD7+CD161+NK祖细胞的分化，但不支持CD11b+骨髓细胞。
图31显示了UCB CD34+细胞向T细胞的无基质分化。
图32显示了iPSC来源的iCD34+细胞向T细胞的无基质分化。
图33显示了hiPSC来源的iCD34+细胞的移植。
发明详述
本发明一般涉及用于使干细胞向永久造血细胞命运分化的方法和组合物。更具体的，本发明提供了一种多阶段分化平台，其中在不同发育阶段的iPSC或iPSC来源的细胞能够被诱导产生永久造血表型，范围从永久造血内皮至全分化的造血细胞，后者包括T细胞、B细胞、NKT细胞和NK细胞。即，本发明提供了用于使细胞更容易形成永久造血命运例如CD34+永久造血干细胞的方法和组合物。可替代的，本发明的方法和组合物通过避免形成EB或聚集体而从初始iPSC以规模化的方式产生永久造血内皮(HE)。
A.定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学名词的含义与本发明所属领域中那些技术人员通常理解的含义相同。出于本发明的目的，以下定义了下列术语。冠词“一个”、“一种”和“该/所述”在本文中用于指一个或超过一个(即至少一个)冠词的语法对象。例如，“元件”意指一个元件或超过一个元件。
可替代的(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中任一、两者或其任何组合。
术语“和/或”应理解为意指替代方案中任一或两者。
如本文使用的，术语“约”或“大约”指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度相比较，改变多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度。在一个实施方式中，术语“约”或“大约”指围绕参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。
如本文使用的，术语“基本上”或“大体上”指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度相比较，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度。在一个实施方式中，术语“大体上相同”或“基本上相同”指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。
如本文使用的，术语“基本上不含”和“大体上不含”可互换使用，并且当用于描述组合物例如细胞群或培养基时，指不含指定物质或其来源，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含指定物质或其来源的组合物，或通过常规手段测量是无法检测的。术语在组合物中“不含”或“基本上不含”某种成分或物质还表示该成分或物质(1)没有以任何浓度包含在组合物中，或(2)在组合物中具有惰性功能，但以低的浓度存在。类似含义可应用于术语“不存在”，当指不存在组合物的特定物质或其来源时。
如本文使用的，术语“可评估的”指通过一种或多种标准方法可容易检测的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。术语“不可评估的(not-appreciable)”和“不可评估的(not appreciable)”以及等价物指通过标准方法无法容易检测或无法检测的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。在一个实施方式中，如果事件以小于5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.01％、0.001％或更少的次数(time)发生，则它是不可评估的。
本说明书自始至终，除非上下文另有要求，否则单词“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为暗示包括所述步骤或元件或者步骤或元件组，但不排除任何其他步骤或元件或者步骤或元件组。在特定实施方式中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义使用。
“由……组成”意指包括并限制于在短语“由……组成”后的任何内容。因此，短语“由……组成”指示所列出的元件是必需或强制性的，并且可不存在其他元件。
“基本上由……组成”意指包括在短语后列出的任何元件，并且限制于不干扰或促成所列出的元件的公开内容中指定的活性或动作的其他元件。因此，短语“基本上由……组成”指示所列出的元件是必需或强制性的，但其他元件并非任选的，并且取决于它们是否影响所列出的元件的活性或动作，可存在或不存在。
本说明书自始至终提及“一个实施方式”、“实施方式”、“特定实施方式”、“相关实施方式”、“某个实施方式”、“另外的实施方式”或“进一步的实施方式”或其组合意指与实施方式结合描述的特定特点、结构或特征包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，前述短语在本说明书自始至终的各个地方的出现不一定全部指相同实施方式。此外，特定特点、结构或特征可以任何合适方式在一个或多个实施方式中组合。
术语“离体”一般指在生物外发生的活性，例如在生物外的人工环境中在活组织中或活组织上完成的实验或测量，优选伴随天然条件的最低限度改变。在特定实施方式中，“离体”程序涉及从生物中获得的活细胞或组织，并且在实验室仪器中培养，通常在无菌条件下，且通常为数小时或最高达约24小时，但包括最高达48或72小时，取决于环境。在某些实施方式中，可收集且冷冻此类组织或细胞，并且随后解冻用于离体处理。使用活细胞或组织持续长于几天的组织培养实验或程序通常视为“在体外”，尽管在某些实施方式中，该术语可与离体互换使用。
术语“在体内”一般指在生物内发生的活性。
如本文使用的，术语“中胚层”是指在早期胚胎发生期间出现的三个胚层中的一个，其产生各种特殊的细胞类型，包括循环***的血细胞，肌肉，心脏，真皮，骨骼和其他支持性和***。
如本文使用的，术语“永久造血内皮”(HE)或“多能干细胞来源的永久造血内皮”(iHE)指在称为内皮细胞-造血转变的过程中产生造血干细胞和祖细胞的内皮细胞亚群。胚胎造血细胞的发育依次从侧板中胚层通过成血管细胞到永久造血内皮和造血祖细胞。
如本文使用的，术语“造血干细胞”或“永久造血干细胞”指CD34+干细胞，其能够产生成熟骨髓和淋巴细胞类型，包括T细胞、自然杀伤细胞和B细胞。
如本文使用的，术语“重编程”或“去分化”或“增加细胞潜能”或“增加发育潜能”指增加细胞潜能或使细胞去分化为较少分化状态的方法。例如，与非重编程状态中的相同细胞相比较，具有增加的细胞潜能的细胞具有更多发育可塑性(即可分化成更多细胞类型)。换言之，重编程细胞是处于比非重编程状态中的相同细胞较少分化状态的细胞。
如本文使用的，术语"分化"是非特异性(“自由的”)或较少特异性细胞获得特定细胞(例如血细胞或肌细胞)的特征的过程。分化的或分化诱导性细胞是在细胞谱系中占据更特异性(“决定的”)位置的细胞。术语“决定的”当应用于分化过程时，是指在已经在分化途径中发展至一个点的细胞，其在正常情况下将继续分化为特定细胞类型或细胞类型亚群，并且在正常情况下不能分化为不同的细胞类型或者回复到较差分化的细胞类型。
如本文使用的，术语“分化标志物基因”或“分化基因”指其表达指示在细胞例如多能细胞内发生的细胞分化的基因。分化标志物基因包括但不限于下述基因：FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T基因(Brachyury)、ZIC1、GATA1、GATA2、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH4、PAX5、RBPJ、RUNX1、STAT1和STAT3。
如本文使用的，术语“分化标志物基因谱”或“分化基因谱”、“分化基因表达谱”、“分化基因表达标志”、“分化基因表达组”、“分化基因组”或“分化基因标志”指多重分化标志物基因的表达或表达水平。
如本文使用的，术语“潜能”指细胞可接近的所有发育选项总和(即发育潜能)。细胞潜能的连续体包括但不限于全能细胞、多能细胞、专能细胞、寡能细胞、单能细胞和终末分化细胞。
如本文使用的，术语“多能的”指细胞形成机体或躯体(即胚体)的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是能够形成来自三个胚层各自的细胞的一类多能干细胞：外胚层、中胚层和内胚层。多能性是发展潜能的连续体，范围从不能产生完整器官的不完全或部分多能性细胞(例如，外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整器官的原始的、更为多能的细胞(例如，胚胎干细胞)。
如本文使用的，术语"诱导性多能干细胞"，或iPSC，意味着干细胞由已诱导或改变的分化的成年\新生儿或胎儿细胞产生，即，重编为能够分化成所有三种胚或真皮层：中胚层，内胚层和外胚层的组织的细胞。所生产的iPSC不是指在自然界中发现的细胞。
如本文使用的，术语"胚胎干细胞"指胚胎囊胚的内细胞团的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的，并在发育过程中产生三种主要胚层的所有衍生物：外胚层，内胚层和中胚层。它们对胚胎外膜或胎盘没有贡献，即不是全能的。
如本文使用的，术语"专能干细胞"指具有发育潜能以分化成一个或多个胚层(外胚层，中胚层和内胚层)的细胞的细胞，但不是全部三种。因此，专能细胞也可以称为“部分分化细胞”。专能细胞是本领域公知的，专能细胞的实例包括成体干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。“专能”表示细胞可能在给定谱系中形成许多类型的细胞，但不能形成其他谱系的细胞。例如，专能造血细胞可形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但不能形成神经元。因此，术语“专能性(multipotency)”是指发育潜能程度低于全能和多能(pluripotent)的细胞状态。
多能干细胞的分化需要培养***的变化，例如改变培养基中的刺激剂或细胞的物理状态。最常规的策略是利用拟胚体(EB)的形成作为启动谱系特异性分化的常见和关键中间体。EB是三维团簇，已被证明能模拟胚胎发育，因为它们在其三维区域中产生了许多谱系。通过分化过程，通常几小时到几天，简单的EB(例如，引起分化的聚集多能干细胞)继续成熟并发育成囊性EB，此时通常几天至几周，它们被进一步处理以继续分化。通过使多能干细胞在三维多层细胞簇中彼此紧密接近来启动EB形成，通常这通过几种方法之一实现，包括允许多能细胞在液滴中沉淀，将细胞沉淀至“U”底孔板或通过机械搅动。为了促进EB发育，多能干细胞聚集体需要进一步的分化诱因，因为在多能培养维持培养基中维持的聚集体不形成合适的EB。因此，多能干细胞聚集体需要被转移到分化培养基中，该分化培养基为所选择的谱系提供诱导因素。基于EB的多能干细胞培养通常导致在EB细胞簇内产生适度增殖的分化细胞群(外胚层、中胚层和内胚层胚层)。尽管已证明能促进细胞分化，然而，由于三维结构中的细胞不连续地暴露于来自环境的分化因素，EB在不同的分化状态下引起异质细胞。此外，EB很难创建和维护。此外，通过EB的细胞分化伴随适度的细胞扩增，这也导致低分化效率。
相比之下，不同于“EB形成”的“聚集体形成”可被用于诱导多能干细胞的分化和/或扩增多能干细胞来源的细胞群体。例如，在基于聚集体的多能干细胞扩展期间，选择培养基以维持增殖和多能性。细胞增殖通常增加聚集体的大小，形成更大的聚集体，这些聚集体可以被常规通过机械或酶解离成较小的聚集体以维持培养物内的细胞增殖并增加细胞数量。与EB培养不同，在维持培养物中在聚集体内培养的细胞维持多能性标记。
如本文使用的，“单层分化”是指不同于通过三维多层细胞簇分化，即“EB形成”，的分化方法的术语。单层分化以及本文公开的其它优点避免了需要用于分化启动的EB形成。因为单层培养不能模拟胚胎发育如EB形成，与EB中的所有三个胚层分化相比，向特定谱系的分化是最小的。
多能性可部分通过评价细胞的多能性特征进行测定。多能性特征包括但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜能，(iii)包括但不限于下述多能干细胞标志物的表达：SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化成所有三个体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力，(v)由三个体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；和(vi)由来自三个体细胞谱系的细胞组成的胚状体形成。
两类多能性先前已得到描述：类似于晚期胚泡的上胚层干细胞(EpiSC)的多能性的“引发”或“亚稳”态，以及类似于早期/植入前胚泡的内细胞团的多能性的“初始
Figure GDA0003180521760000231
”或“基”态。虽然两种多能状态均显示出如上所述的特征，但初始或基态还显示出：(i)雌性细胞中的X染色体的预失活或再生，(ii)在单细胞培养期间改善的克隆形成能力和存活，(iii)DNA甲基化的总体减少，(iv)在发育调节基因启动子上的H3K27me3阻遏染色质标志物沉积的减少和(v)相对于引发态多能细胞，分化标志物的减少表达。其中外源多能性基因引入体细胞、表达且随后沉默或从所得的多能细胞中去除的细胞重编程的标准方法一般可见具有多能性引发态的特征。在标准多能细胞培养条件下，此类细胞保持引发态，除非外源转基因表达得到维持，其中观察到基态的特征。
如本文使用的，术语“多能干细胞形态”指胚胎干细胞的典型形态特点。正常胚胎干细胞形态的特征在于圆且小的形状、具有高核质比、核仁的显著存在和典型细胞间间隔。
如本文使用的，术语“饲养细胞”或“饲养者”是用于描述与第二类型的细胞共培养的一个类型的细胞，以提供第二类型的细胞可在其中生长的环境，因为饲养细胞提供用于支持第二细胞类型的生长因子和营养素。饲养细胞任选来自与它们支持的细胞不同的物种。例如，某些类型的人细胞包括干细胞可通过小鼠胚胎成纤维细胞和永生化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物得到支持。当与其他细胞共培养时，饲养细胞通常可通过照射或用抗有丝***剂例如丝裂霉素处理而失活，以防止其生长超过它们支持的细胞。不限于前文，一个具体饲养细胞类型可为人饲养细胞，例如人皮肤成纤维细胞。另一饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。通常，可以部分使用各种饲养细胞以维持多能性，引导向特定谱系的分化并促进向特定细胞类型的成熟，例如效应细胞。
如本文使用的，“无饲养”(FF)环境指大体上不含饲养或基质细胞和/或未通过饲养细胞栽培而预条件化的环境，例如培养条件、细胞培养或培养基。“预条件化的”培养基指在饲养细胞已在培养基内栽培一段时间例如至少一天后收获的培养基。预条件化的培养基含有许多介质物质，包括通过在培养基中栽培的饲养细胞分泌的生长因子和细胞因子。
如本文使用的，术语"受试者"指任何动物，优选人患者、家畜或其它驯养动物。
“多能性因子”或“重编程因子”指单独或与其他试剂组合能够增加细胞的发育潜能的试剂。多能性因子包括但不限于能够增加细胞的发育潜能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多能性因子包括例如转录因子和小分子重编程试剂。
“贴壁”指在适当培养基的存在下，细胞附着至容器，例如细胞附着至无菌塑料(或涂布塑料)细胞培养皿或烧瓶。某些类别的细胞在培养中无法持续或不生长，除非它们贴壁至细胞培养容器。某些类别的细胞(“非贴壁细胞”)无需贴壁在培养中维持和/或增殖。
“培养”或“细胞培养”指在体外环境中的细胞维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在每种情况下单数的“培养基”)、“补充物”和“培养基补充物”指栽培细胞培养物的营养组合物。
“栽培(Cultivate)”或“维持(maintain)”指在组织或机体外，例如在无菌塑料(或涂布塑料)细胞培养皿或烧瓶中的细胞持续、繁殖(生长)和/或分化。“栽培”或“维持”可利用培养基作为营养素、激素和/或帮助使细胞繁殖和/或持续的其他因子的源。
如本文使用的，“解离的”细胞指已与其他细胞或表面(例如培养板表面)基本上分开或者纯化离开其他细胞的细胞。例如，细胞可通过机械或酶促方法与动物或组织解离。可替代地，在体外聚集的细胞可酶促或机械地例如通过解离成簇、单细胞或单细胞和簇的混合物的悬浮液彼此解离。在另外一个可替代实施方式中，贴壁细胞与培养板或其他表面解离。解离因此可涉及破坏细胞与细胞外基质(ECM)和基质(例如培养表面)的相互作用，或破坏细胞之间的ECM。
B.概述
本发明一般涉及初始多能细胞向非多能细胞或部分分化细胞分化的多阶段过程，包括，中胚层细胞，永久造血内皮，永久造血干或祖细胞，CD34+细胞，专能祖细胞(MPP)(能够分化为骨髓，包括嗜中性祖细胞)，T祖细胞、NK祖细胞；或全分化的末端造血细胞，例如，如，T细胞、B细胞、NKT细胞或NK细胞。本发明还涉及所公开的方法中使用的组合物；以及由所公开的方法产生的细胞群、细胞系或克隆细胞。
与本领域中使用的方法相反，本发明避免了在iPSC分化中形成EB。如上所述，通过在无TGFβ培养基中接种克隆iPSC细胞来获得源自iPSC的造血谱系细胞，以保持其多能性的基础或初始状态，将克隆iPSC分化为无EB形成的单层iPSC，并使用分步进行的策略在分化初期和中期应用小化学品，生长因子和细胞因子的适当组合。因此，本发明能够将扩增的克隆iPSC直接转移到单层形式的贴壁培养中，以便立即分化，而不需要从iPSC形成EB。
本发明从而提供了能够高效分化干细胞为永久造血和功能造血细胞系的培养平台，而不使用TGFβ受体/ALK抑制剂，包括SB431532。此外，不同于之前的研究，本发明还提供了使用无饲养，无血清条件的培养平台，其支持iPSC在单层培养中直接分化而不需要来自iPSC的EB或聚集体中间体。
C.培养平台
用于培养多能细胞的现有方法主要依赖于饲养细胞或用饲养细胞预条件化并含有胎牛血清的培养基；然而，这种环境可能不适用于生产用于临床和治疗用途的细胞。例如，在这种异种污染的环境中培养的细胞通常被认为不适合于人类细胞移植，因为暴露于动物组分可能存在严重的免疫排斥风险并将未鉴定的病原体传播给治疗的患者，并且可能潜在地重新激活动物逆转录病毒。使用无动物培养基的培养***，例如本文考虑的无饲养层环境，有助于制造临床级细胞系，特别是hESC、hiPSC和多能干细胞来源的HSC、T、B、NKT或NK细胞系。
在具体实施方式中，无饲养环境基本上不含人饲养细胞，并且不由饲养细胞预条件化，包括但不限于小鼠胚胎成纤维细胞、人成纤维细胞、角质形成细胞和胚胎干细胞。无饲养细胞培养基适用于培养多能细胞，重编程细胞，单细胞培养，多能细胞的解离和传代，多能细胞的细胞分选，基态多能细胞的产生，基态多能性的维持，诱导多能细胞分化。在具体实施方式中，无饲养环境用于诱导多能性，改善重编程的效率，增加或维持细胞的潜能和/或诱导分化。在某些实施方式中，无饲养者环境另外基本上不含细胞因子和生长因子，包括bFGF。
在本发明的一些方面，上述iPSC分化的一个或多个阶段可以在无饲养条件下进行。这种无饲料条件可以是包括但不限于单层培养和悬浮培养的形式。在本发明的一个实施方式中，多能细胞向中胚层细胞的分化是在单层无饲养条件下进行的。在本发明的另一个实施方式中，在单层无饲养条件下进行中胚层细胞向永久造血内皮细胞的分化。在本发明的另一个实施方式中，永久造血内皮细胞向造血干细胞的分化是在单层无饲养条件下进行的。在本发明的一个实施方式中，永久造血干细胞向专能祖细胞、T祖细胞或NK祖细胞的分化是在悬浮无饲养条件下进行的，或者先在单层无饲养条件下进行，随后在悬浮无饲养条件下进行。在本发明的另一个实施方式中，T祖细胞分化为全分化T细胞或NK祖细胞分化为全分化NK细胞是在悬浮无饲养条件下进行的，或者先在单层无饲养条件下进行，随后在悬浮无饲养条件下进行。
任何合适的培养瓶或细胞培养容器可用作基础培养基和/或细胞培养物补充物中的细胞培养物的载体。在一些实施方式中，用粘附促进基质/底物(例如，胶原，纤连蛋白，含RGD的多肽，明胶等)涂覆培养容器的表面会促进细胞的附着，并且在具体实施方式中可以增强本文公开的细胞培养基和补充剂的作用。用于培养和传代细胞的合适底物是本领域已知的，并且包括但不限于玻连蛋白，明胶，层粘连蛋白，纤连蛋白，胶原，弹性蛋白，骨桥蛋白，血小板反应素，天然存在的细胞系产生的基质如MatrigelTM的混合物和合成或人造表面如聚胺单层和羧基封端的单层。在一些实施方式中，提供无饲养条件包括在基质涂覆的表面上培养细胞。在一个实施方式中，本文考虑的培养平台包括含有MatrigelTM或玻连蛋白的基质/底物。在培养的一些实施方式中，使用MatrigelTM，因此培养物被完全限定。
在本发明的一些方面，上述一个或多个分化阶段可在无血清条件下进行。适于细胞贴壁和/或诱导的可商购的无血清培养基的例子包括Stem Cell Technologies(Vancouver,Canada)的mTeSRTM1或TeSRTM2，ReproCELL(Boston,MA)的Primate ES/iPS细胞培养基，Invitrogen(Carlsbad,CA)的
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Invitrogen的
Figure GDA0003180521760000272
hESCSFM，和Lonza(Basel,Switzerland)的X-VIVOTM。
在另外的实施方式中，培养平台的一种或多种培养基是无饲养层的环境，并且任选地基本上不含细胞因子和/或生长因子。在其它实施方式中，细胞培养基含有补充物，例如血清、提取物、生长因子、激素、细胞因子等。通常，培养平台包含一种或多种阶段特异性无饲养、无血清培养基，每种培养基还包含以下一种或多种：营养物/提取物、生长因子、激素、细胞因子和培养基添加剂。合适的营养/提取物可包括例如DMEM/F-12(Dulbecco'sModified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)，其是广泛使用的用于支持许多不同哺乳动物细胞生长的基础培养基；KOSR(剔除血清替代)；L-glut；NEAA(非必需氨基酸)。其他培养基添加剂可以包括但不限于MTG、ITS、βME、抗氧化剂(例如抗坏血酸)。在一些实施方式中，本发明的培养基包含一种或多种以下细胞因子或生长因子：表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、肝细胞生长因子(HGF)、***1(IGF-1)、***2(IGF-2)、角化细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP4)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)转铁蛋白、各种白细胞介素(如IL-1至IL-18)、各种集落刺激因子(如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、各种干扰素(如IFN-γ)和对干细胞有影响的其他细胞因子，如干细胞因子(SCF)和***(EPO)。这些细胞因子可以商购获得，例如购自R&D Systems(Minneapolis，Minn.)，也可以是天然的或重组的。在一些其他实施方式中，本发明的培养基包含一种或多种骨形态发生蛋白(BMP4)、***-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子VEGF)、造血生长因子(例如SCF、GMCSF、GCSF、EPO、IL3、TPO、EPO)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt3L)；和来自白血病抑制因子(LIF)、IL3、IL6、IL7、IL11、IL15的一种或多种细胞因子。在一些实施方式中，生长因子/有丝***原和细胞因子在浓度方面是根据经验确定或由已建立的细胞因子技术指导的阶段和/或细胞类型特异性的。
通常，用于分化诱导性多能细胞的技术涉及使用基于多核苷酸、多肽和/或小分子的方法直接或间接调节特定细胞途径。可以例如通过使细胞与一种或多种调节剂接触来调节细胞的发育潜能。本文所用的“接触”可以涉及在一种或多种因素(例如小分子、蛋白质、肽等)的存在下培养细胞。在一些实施方式中，将细胞与一种或多种试剂接触以诱导细胞分化。这种接触可以例如通过在体外培养期间将一种或多种试剂引入细胞来进行。因此，可以通过将一种或多种试剂引入营养细胞培养基中的细胞来进行接触。细胞可以保持在包含一种或多种试剂的培养基中足以使细胞达到所需分化表型的时间。在一些其它实施方式中，当通过载体将一个或多个因子引入细胞时，发生“接触”。在一些实施方式中，一种或多种载体由逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离体、微环、具有表达盒的载体***或mRNA引入。
在其它实施方式中，如本文所公开的培养平台的一种或多种阶段特异性的无饲养、无血清培养基进一步包含一种或多种小分子。在一些实施方式中，培养平台包括含有GSK-3抑制剂、MEK抑制剂、Rho激酶(ROCK)抑制剂的细胞培养基，并且不包含或不含TGFβ/激活素信号途径的小分子抑制剂，包括但不限于TGFβ受体或ALK5抑制剂。
本文考虑的培养平台还通过利用具有降低的自发分化和/或达到基础状态多能性的工业或临床级多能细胞的均匀群体来提供许多优点。在一个实施方式中，均质iPSC保持在包含GSK-3抑制剂、MEK抑制剂和Rho激酶(ROCK)抑制剂的组合物中；并且该组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂。如本文使用的，术语“均质”是指细胞群，其中每个细胞与群体中的其它细胞相同或基本相同。在一个实施方式中，如果每个细胞表达一种或多种与本文所考虑的相同的多能性标记，例如SSEA4和TRA1-81，则细胞与群体中的其它细胞相同。在一个实施方式中，如果至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多的细胞相同或基本上是与群体中的其他细胞相同，则群体是均质的。
在多个实施方式中，用于通过本发明的永久造血内皮产生造血细胞谱系的培养平台的细胞培养基不包含或基本上不含TGFβ/激活素信号途径的抑制剂，包括TGFβ受体(TGFβR)抑制剂和ALK5抑制剂。在一个实施方式中，培养平台包括用于保持初始hiPSC的接种培养基，该培养基包含GSK-3抑制剂、MEK抑制剂和Rho激酶(ROCK)抑制剂。本发明人不希望受任何具体理论的约束，发现虽然TGFβR/ALK5抑制剂提高了重编程的效率，但这些抑制剂抵消了多能细胞群体的长期维持、质量和均一性。也就是说，虽然TGFβ途径信号传导的抑制改善了细胞重编程的效率，但这种抑制的缓解有助于在体外培养***中随后维持多能细胞群体，特别是在使用无饲养细胞和单细胞、酶消化传代的***中，其中优选具有减少的自发分化并且保持在“基础”或“初始”多能性状态的同质多能群体。如本文所使用的，术语“长期”基于但不限于传代的数量来测量，通常意味着至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多代数。如所界定的那样，“传代”是指当细胞增殖到期望的程度时，将细胞分开并铺展到多细胞培养表面或培养瓶中的行为。另外，在本文所公开的包含GSK3抑制剂和MEK抑制剂和任选的ROCK抑制剂但不含TGFβR/ALK5抑制剂的培养基中培养亚稳态多能细胞，转化多能细胞以实现减少的自发分化，和/或实现基态多能性。
实现iPSC的基础或初始多能性对于通过分化iPSC而不形成EB中间体获得造血谱系细胞也是重要的。此外，初始iPSC分化为永久HE的效率也受到使用单层培养而不形成EB及其聚集体的严重影响。在一些实施方式中，培养平台包括含有ROCK抑制剂并且不含或基本上不含TGFβR/ALK5抑制剂的培养基。在一些其它实施方式中，培养平台包括含有GSK3抑制剂但不含TGFβR/ALK5抑制剂的培养基，该培养基使用本文提供的培养平台促进永久HE和/或永久HSC细胞的产生。
1.TGFβ受体/ALK抑制剂
TGFβ受体(例如ALK5)抑制剂可包括针对TGFβ受体(例如ALK5)的抗体、TGFβ受体的显性失活(阴性)变体和抑制TGFβ受体表达的反义核酸。示例性的TGFβ受体/ALK抑制剂包括但不限于SB431542(参见，例如，Inman等，Molecular Pharmacology 62(1):65-74(2002))；A-83-01，也称为3-(6-甲基-2-吡啶)-N-苯基-4-(4-喹啉)-1H-吡唑-1-硫代酰胺(参见，例如，Tojo等，Cancer Science 96(11):791-800(2005)和可购自，例如，ToicrisBioscience)；2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶；Wnt3a/BIO(参见，例如，Dalton等，WO2008/094597，在此引入作为参考)；GW788388(-{4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-基}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)(参见，例如，Gellibert等，Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210-2221(2006))；SM16(参见，例如，Suzuki等，Cancer Research 67(5):2351-2359(2007))；IN-1130(3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)(参见，例如，Kim等，Xenobiotica 38(3):325-339(2008))；GW6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶)(参见，例如，deGouville等，Drug News Perspective 19(2):85-90(2006))；SB-505124(2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)(参见，例如，DaCosta等，Molecular Pharmacology 65(3):744-752(2004))；以及嘧啶衍生物(参见，例如，列于Stiefl等，WO2008/006583中的那些，在此引入作为参考)。此外，虽然“ALK5抑制剂”不预期涵盖非特异性激酶抑制剂，但“ALK5抑制剂”应理解为涵盖除ALK5之外还抑制ALK4和/或ALK7的抑制剂，例如SB-431542(参见例如Inman等人，J Mol.Pharmacol.62(1):65-74(2002))。不预期限制本发明的范围，我们认为ALK5抑制剂影响间充质至上皮转换/转变(MET)过程。TGFβ/激活素途径是上皮至间充质转变(EMT)的驱动物。因此，抑制TGFβ/激活素途径可有助于MET(即重编程)过程。
考虑到本文显示抑制ALK5的效应的数据，我们认为TGFβ/激活素途径的抑制将具有抑制ALK5的相似效应。因此，TGFβ/激活素途径的任何抑制剂(例如上游或下游)可与ALK5抑制剂组合使用或代替ALK5抑制剂使用，如本文的每个段落中所述。示例性TGFβ/激活素途径抑制剂包括但不限于：TGFβ受体抑制剂、SMAD 2/3磷酸化抑制剂、SMAD 2/3和SMAD 4相互作用抑制剂、以及SMAD 6和SMAD 7激活物/激动剂。此外，下文描述的分类仅用于组构目的，并且本领域技术人员将知道化合物可影响途径内的一个或多个点，并且因此化合物可在超过一个限定类别中起作用。
TGFβ受体(TGFβR)抑制剂可包括针对TGFβ受体的抗体、TGFβ受体的显性失活变体以及靶向TGFβ受体的siRNA或反义核酸。TGFβ受体抑制剂的具体例子包括但不限于SU5416；2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐(SB-505124)；lerdelimumb(CAT-152)；美替木单抗(CAT-192)；GC-1008；ID11；AP-12009；AP-11014；LY550410；LY580276；LY364947；LY2109761；SB-505124；SB-431542；SD-208；SM16；NPC-30345；Ki26894；SB-203580；SD-093；Gleevec；3,5,7,2',4'-五羟基黄酮(Morin)；激活素-M108A；P144；可溶性TBR2-Fc；以及靶向TGFβ受体的反义转染的肿瘤细胞。(参见，例如，Wrzesinski等，Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270(2007)；Kaminska等，ActaBiochimica Polonica 52(2):329-337(2005)；以及Chang等，Frontiers in Bioscience12:4393-4401(2007).)
SMAD 2/3磷酸化抑制剂可包括针对SMAD2或SMAD3的抗体、SMAD2或SMAD3的显性失活变体、以及靶向SMAD2或SMAD3的反义核酸。抑制剂的具体例子包括PD169316；SB203580；SB-431542；LY364947；A77-01；和3,5,7,2',4'-五羟基黄酮(Morin)。(参见例如以引用的方式并入本文的Wrzesinski，同上；Kaminska，同上；Shimanuki等人，Oncogene 26:3311-3320(2007)；和Kataoka等人，EP1992360)。
SMAD 2/3和SMAD4相互作用抑制剂可包括针对SMAD2、SMAD3和/或SMAD 4的抗体，SMAD2、SMAD3和/或SMAD 4的显性失活变体，以及靶向SMAD2、SMAD3和/或SMAD 4的反义核酸。SMAD 2/3和SMAD4相互作用抑制剂的具体例子包括但不限于Trx-SARA、Trx-xFoxH1b和Trx-Lef1。(参见例如Cui等人，Oncogene 24:3864-3874(2005)和Zhao等人，MolecularBiology of the Cell,17:3819-3831(2006))。
SMAD 6和SMAD 7激活物/激动剂包括但不限于针对SMAD 6或SMAD 7的抗体，SMAD6或SMAD 7的显性失活变体，以及靶向SMAD 6或SMAD 7的反义核酸。抑制剂的具体例子包括但不限于SMAD 7-as PTO-寡核苷酸。(参见例如两者均以引用的方式并入本文的Miyazono等人，US6534476，以及Steinbrecher等人，US2005119203)。
2.WNT途径激动剂
如本文使用的，术语“Wnt信号促进试剂”、“Wnt途径激活试剂”或“Wnt途径激动剂”指Wnt信号传导途径的激动剂，包括但不限于Wntl、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wntl0b、Wnt11、Wnt14、Wnt15和Wnt16中的一种或多种的激动剂。Wnt途径激动剂还包括但不限于下述多肽或其片段中的一种或多种：Dkk多肽、crescent多肽、cerberus多肽、axin多肽、Frzb多肽、T细胞因子多肽或显性失活散乱(disheveled)多肽。
Wnt途径激动剂的非限制性例子还包括下述中的一种或多种：包含编码Wnt多肽的核苷酸序列的核酸，包含Wnt多肽的氨基酸序列的多肽，包含编码活化Wnt受体的核苷酸序列的核酸，包含活化Wnt受体的氨基酸序列的多肽，促进Wnt/β-连环蛋白信号传导的小有机分子，抑制Wnt拮抗剂的表达或活性的小有机分子，抑制Wnt拮抗剂表达的反义寡核苷酸，抑制Wnt拮抗剂表达的核酶，抑制Wnt拮抗剂表达的RNAi构建体、siRNA或shRNA，与Wnt拮抗剂结合且抑制Wnt拮抗剂活性的抗体，包含编码β-连环蛋白多肽的核苷酸序列的核酸，包含β-连环蛋白多肽的氨基酸序列的多肽，包含编码Lef-1多肽的核苷酸序列的核酸，包含Lef-1多肽的氨基酸序列的多肽。
Wnt途径激动剂还包括GSK3抑制剂，例如包含编码显性失活GSK-3、GSK3α或GSK3β多肽的核苷酸序列的核酸，包含显性失活GSK-3、GSK3α或GSK3β多肽的氨基酸序列的多肽，与GSK-3、GSK3α或GSK3β结合且抑制GSK-3、GSK3α或GSK3β的表达或活性的小有机分子，与GSK-3、GSK3α或GSK3β结合且抑制GSK-3、GSK3α或GSK3β的表达和/或活性的RNAi构建体、siRNA或shRNA，与GSK-3、GSK3α或GSK3β结合且抑制GSK-3、GSK3α或GSK3β的表达的反义寡核苷酸，与GSK-3、GSK3α或GSK3β结合且抑制GSK-3、GSK3α或GSK3β的表达和/或活性的抗体，与GSK-3、GSK3α或GSK3β结合且抑制GSK-3、GSK3α或GSK3β的表达的核酶，以及在效应上类似于GSK3抑制的活化β-连环蛋白靶基因的任何GSK-3不依赖性试剂。
3.GSK3抑制剂
GSK-3β抑制剂是适用于本文考虑的组合物中的具体示例性Wnt途径激动剂，并且可包括但不限于多核苷酸、多肽和小分子。本文考虑的GSK-3β抑制剂可减少GSK-3β表达和/或GSK-3β活性。本文考虑的GSK-3β抑制剂的举例说明性例子包括但不限于抗GSK-3β抗体，显性失活GSK-3β变体，靶向GSK-3β的siRNA、shRNA、miRNA和反义核酸。
其他举例说明性GSK-3β抑制剂包括但不限于：肯帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、CHIR99021、CHIR98014、AR-A014418、CT 99021、CT 20026、SB216763、AR-A014418、锂、SB415286、TDZD-8、BIO、BIO-丙酮肟、(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺、吡啶卡巴唑-环戊二烯基钌络合物、TDZD-8 4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3-,5-二酮、2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-噁二唑、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、AR-AO 144-18、3-(1-(3-羟丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮；TWSl 19吡咯并嘧啶化合物、L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其肉豆蔻酰化形式；2-氯-1-(4,5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮；GF109203X；RO318220；TDZD-8；TIBPO；和OTDZT。
在特定举例说明性实施方式中，GSK-3β抑制剂是CHIR99021、BIO或肯帕罗酮。
在一个优选实施方式中，GSK-3β抑制剂是CHIR99021。
在另一实施方式中，GSK3抑制剂是BRD0705。
4.ERK/MEK抑制剂
适用于本文考虑的组合物中的ERK/MEK抑制剂包括但不限于多核苷酸、多肽和小分子。本文考虑的ERK/MEK抑制剂可减少MEK或ERK表达和/或MEK或ERK活性。本文考虑的ERK/MEK抑制剂的举例说明性例子包括但不限于抗MEK或抗ERK抗体，显性失活MEK或ERK变体，靶向MEK或ERK的siRNA、shRNA、miRNA和反义核酸。
其他举例说明性ERK/MEK抑制剂包括但不限于PD0325901、PD98059、UO126、SL327、ARRY-162、PD184161、PD184352、舒尼替尼、索拉非尼、凡德他尼、帕唑帕尼、阿西替尼、GSKl120212、ARRY-438162、RO5126766、XL518、AZD8330、RDEAl 19、AZD6244、FR180204和PTK787。
另外的举例说明性MEK/ERK抑制剂包括公开于国际公开专利申请WO 99/01426、WO02/06213、WO 03/077914、WO 05/051301和WO2007/044084中的那些化合物。
MEK/ERK抑制剂的进一步举例说明性例子包括下述化合物：6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2,3-二羟基-丙氧基)-酰胺；6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-(四氢-吡喃-2-基甲基)-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、1-[6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-基]-2-羟基乙酮、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-1,1-二甲基-乙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-(四氢-呋喃-2-基甲基)-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氟-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、6-(2,4-二氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺、6-(4-溴-2-氯-苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-乙氧基)-酰胺，下文被称为MEK抑制剂1；2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺(下文被称为MEK抑制剂2)；和4-(4-溴-2-氟苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺及其药学可接受的盐。
在一个优选实施方式中，MEK/ERK抑制剂是PD98059。
5.ROCK抑制剂
Rho相关激酶(ROCK)是充当Rho激酶的下游效应物的丝氨酸/苏氨酸激酶(其中存在三种同种型--RhoA、RhoB和RhoC)。适用于本文考虑的组合物中的ROCK抑制剂包括但不限于多核苷酸、多肽和小分子。本文考虑的ROCK抑制剂可减少ROCK表达和/或ROCK活性。本文考虑的ROCK抑制剂的举例说明性例子包括但不限于抗ROCK抗体，显性失活ROCK变体，靶向ROCK的siRNA、shRNA、miRNA和反义核酸。
本文考虑的举例说明性ROCK抑制剂包括但不限于：thiazovivin、Y27632、Fasudil、AR122-86、Y27632H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B、N-(4-吡啶基)-N'-(2,4,6-三氯苯基)脲、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚、和(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺以及公开于美国专利号8,044,201中的ROCK抑制剂，所述美国专利以引用的方式全文并入本文。
在一个实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin、Y27632或pyrintegrin。
在一个优选实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin。
在本文考虑的组合物和细胞培养基中的小分子的量可改变，并且可根据具体培养条件进行优化，包括所使用的具体分子和组合、在培养基中培养的细胞类型以及具体应用。在一个实施方式中，小分子存在于组合物中的浓度足以诱导多能性、改善重编程效率、增加或维持细胞的潜能或者诱导或维持基态多能性。
本发明的另一方面涉及用于本发明的Notch激活剂。Notch包括Notch受体家族的所有成员，包括但不限于Notch1。Notch激活剂包括但不限于Notch受体的激动剂。Notch激动剂将结合Notch受体，并且还引发或介导与Notch受体相关的信号传导事件，例如引起Notch的细胞内结构域被切割并易位于细胞核。Notch激活剂包括但不限于Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。Notch激活剂包括但不限于EP 2606884、US 6689744和US 5780300中公开的那些，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，一种或多种Notch配体可以作为可溶性肽引入，或固定在固体材料上。固体材料可以包括但不限于聚苯乙烯板或珠。用于Notch配体固定化的珠可以是琼脂糖珠、磁珠和乳胶珠。在一个实施方式中，Notch配体肽与珠缀合/固定。在另一个实施方式中，Notch配体肽与聚苯乙烯板的表面缀合/固定。在一些实施方式中，Notch配体的固定是非共价的。在一些实施方式中，Notch配体肽由细胞呈递。
本发明的另一方面涉及BMP途径激活剂，其包括在以下出版物中公开的那些试剂，其公开内容通过引用并入本文：WO 2014011540、WO 2014062138和WO 2005117994。用于本发明的BMP途径激活剂包括但不限于BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-2和BMP-4。在本发明的一个非限制性实施方式中，BMP途径激活剂是BMP-4。BMP是转化生长因子-β超家族成员的多功能细胞因子。骨形态发生蛋白(BMP)受体通过激活Smad介导BMP信号传导。BBMP配体结合BMP受体BMPRI和BMPRII。BMPRII磷酸化后，激活BMPRI。磷酸化的BMPRI随后磷酸化受体激活的Smad蛋白(R-Smads)，其与常见介体-SMad(共-Madad)结合并进入细胞核，在那里它们调节基因表达。在一个实施方式中，BMP途径激活剂是BMP4。
本发明提供了用于从iPSC获得造血谱系细胞的组合物，其通过从iPSC分化的永久HSC或通过从iPSC分化的永久造血内皮，并且每种方法都没有用于期望的细胞分化的来自iPSC的的EB形成。
6.hiPSC分化平台
I.iHSC平台
本发明的一个方面提供了用于从多能干细胞包括iPSC获得中胚层细胞的培养基。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一个实施方式中，培养基包含Wnt途径激活剂和BMP激活剂。在一个实施方式中，培养基包含Wnt途径激活剂，iHSC基本培养基包含BMP激活剂。在一个实施方式中，培养基中的Wnt途径激活剂使GSK3抑制剂。在一个实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99021。在一个实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，培养基包含胞外基质蛋白。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表1所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。在一些实施方式中，当使用MatrigelTM代替玻连蛋白时培养基被完全限定。
Figure GDA0003180521760000351
本发明的一个方面提供了用于从中胚层细胞获得永久造血内皮的培养基。在一个实施方式中，培养基包含Wnt途径激活剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂。在一个实施方式中，培养基包含Wnt途径激活剂、BMP激活剂，且该培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一个实施方式中，培养基包含Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂。在一个实施方式中，培养基中的Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一个实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99021。在一个实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一个实施方式中，可选的TGFβ受体/ALK抑制剂是SB431542。在一些实施方式中，本文的培养基包含胞外基质蛋白。在其它实施方式中，培养基包含浓度范围如表2所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。在一些实施方式中，使用MatrigelTM替代玻连蛋白将培养基完全限定。
Figure GDA0003180521760000361
本发明的一个方面提供了用于从造血内皮获得永久HSC的培养基。在一个实施方式中，培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子。在一个实施方式中，培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂。在一个实施方式中，培养基包含iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子。在一个实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，培养基包含胞外基质蛋白。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表3所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。在一些实施方式中，使用MatrigelTM替代玻连蛋白将培养基完全限定。
Figure GDA0003180521760000371
本发明的一个方面提供了用于从永久HSC获得T祖细胞的培养基。在一个实施方式中，培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子。在一个实施方式中，培养基包含SCF、Flt3L、IL7、BMP激活剂和iTC基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂。在一个实施方式中，iTC基本培养基包含组合的IL2、IL3、IL6、一种或多种Notch途径激活剂。在一个实施方式中，iTC基本培养基不含纤连蛋白。在一个实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一个实施方式中，Notch途径激活剂是Notch配体，包括但不限于Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。在一些实施方式中，培养基包含胞外基质蛋白。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表4所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。在一些实施方式中，使用MatrigelTM替代玻连蛋白将培养基完全限定。
Figure GDA0003180521760000372
Figure GDA0003180521760000381
本发明的一个方面提供了用于从T祖细胞获得T细胞的培养基。在一个实施方式中，培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7和IGF的生长因子和细胞因子。在一个实施方式中，培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7和IGF的生长因子和细胞因子，不含BMP激活剂。在一个实施方式中，培养基包含组合的选自SCF、Flt3L、IL7、IGF的生长因子和细胞因子和iTC基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂。在一个实施方式中，iTC基本培养基包含组合的IL2、IL3、IL6，一种或多种Notch途径激活剂。在一个实施方式中，Notch途径激活剂是Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和/或DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。在一些实施方式中，BMP激活剂包括BMP4。在一些实施方式中，培养基包含胞外基质蛋白。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表5所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。在一些实施方式中，使用MatrigelTM替代玻连蛋白将培养基完全限定.
Figure GDA0003180521760000382
Figure GDA0003180521760000391
本发明的一个方面提供了用于从永久HSC获得NK祖细胞的培养基。在一个实施方式中，培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L和VEGF的生长因子和细胞因子。在一个实施方式中，培养基包含SCF、Flt3L、VEGF和BMP激活剂和iNK基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子。在一个实施方式中，iNK基本培养基包含组合的IL2、IL3、IL6和IL15。在一个实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，培养基包含胞外基质蛋白。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表6所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。在一些实施方式中，使用MatrigelTM替代玻连蛋白将培养基完全限定.
Figure GDA0003180521760000392
Figure GDA0003180521760000401
本发明的一个方面提供了用于从NK祖细胞获得NK细胞的培养基。在一个实施方式中，培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IGF和IL7的生长因子和细胞因子。在一个实施方式中，培养基包含SCF、Flt3L、IGF、IL7和iNK基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含BMP激活剂。在一个实施方式中，iNK基本培养基包含组合的IL2、IL3、IL6和IL15。在一些实施方式中，培养基包含胞外基质蛋白。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表7所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。在一些实施方式中，使用MatrigelTM替代玻连蛋白将培养基完全限定。在一些实施方式中，用于刺激NK生长、发育和成熟的人工抗原以微珠缀合、质膜颗粒或抗原呈递细胞的形式引入。
Figure GDA0003180521760000402
本发明的另一方面提供了用于获得T细胞的培养平台，其包含一种或多种(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7和IGF的生长因子和细胞因子和iTC基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂，其中该培养基不含BMP激活剂并适于从T祖细胞产生T细胞；(ii)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子和iTC基本培养基，其中培养基适于从永久HSC产生T祖细胞；(iii)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中该培养基不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从造血内皮产生永久HSC；(iv)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基适于从中胚层细胞产生造血内皮；以及(v)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
在一个实施方式中，用于获得T细胞的培养平台包含(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IGF和IL7的生长因子和细胞因子和iTC基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂，其中该培养基不含BMP激活剂并适于从T祖细胞产生T细胞。在一个实施方式中，包含培养基(i)的培养平台进一步包含(ii)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子和iTC基本培养基，其中培养基(ii)适于从永久HSC产生T祖细胞。在一个实施方式中，包含培养基(i)和(ii)的培养平台进一步包含(iii)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基(iii)不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从造血内皮产生永久HSC。在一个实施方式中，包含培养基(i)，(ii)和(iii)的培养平台进一步包含(iv)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，其中培养基(iv)适于从中胚层细胞产生永久造血内皮。在另一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)、(iii)和(iv)的培养平台，进一步包含(v)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基(v)适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
本发明的一个方面提供了用于获得T祖细胞的培养平台，其包含一种或多种(i)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子和iTC基本培养基，其中培养基适于从永久HSC产生T祖细胞；(ii)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基包含BMP激活剂，其中该培养基不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从永久造血内皮产生HSC；(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，其中培养基适于从中胚层细胞产生永久造血内皮；以及(iv)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
在一个实施方式中，用于获得T祖细胞的培养平台包含(i)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子和iTC基本培养基，其中培养基(i)适于从永久HSC产生T祖细胞。在一个实施方式中，包含培养基(i)的培养平台进一步包含(ii)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基(ii)不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从永久造血内皮产生HSC。在一个实施方式中，包含培养基(i)和(ii)的培养平台进一步包含(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，其中培养基(iii)适于从中胚层细胞产生永久造血内皮。在另一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)和(iii)的培养平台进一步包含(iv)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基(iv)适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
本发明的一个方面提供了用于获得永久HSC的培养平台，其包含一种或多种(i)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中该培养基不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从永久造血内皮产生HSC；(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，其中培养基适于从中胚层细胞产生永久造血内皮；(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
在一个实施方式中，用于获得永久HSC的培养平台包含(i)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基(i)不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从永久造血内皮产生HSC。在一个实施方式中，包含培养基(i)的培养平台，进一步包含(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，其中培养基(ii)适于从中胚层细胞产生永久造血内皮。在另一实施方式中，包含培养基(i)和(ii)的培养平台进一步包含(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基(iii)适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，获得的永久HSC是CD34+HSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
本发明的又一方面提供了用于获得造血内皮的培养平台，其包含一种或多种(i)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基适于从中胚层细胞产生永久造血内皮；以及(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
在一个实施方式中，用于获得造血内皮的培养平台包含(i)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基(i)适于从中胚层细胞产生永久造血内皮。在另一实施方式中，包含培养基(i)的培养平台，进一步包含(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基(ii)适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
本发明的一个进一步的方面提供了用于获得NK细胞的培养平台，其包含一种或多种(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IGF和IL7的生长因子和细胞因子和iNK基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含BMP激活剂并适于从NK祖细胞产生NK细胞；(ii)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和VEGF的生长因子和细胞因子、BMP激活剂和iNK基本培养基，其中培养基适于从永久HSC产生NK祖细胞；(iii)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中该培养基不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从永久造血内皮产生HSC；(iv)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基适于从中胚层细胞产生永久造血内皮；以及(v)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
用于获得NK细胞的培养平台的一个实施方式包括(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子和iNK基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，其中培养基(i)不含BMP激活剂并适于从NK祖细胞产生NK细胞。在一个实施方式中，包含培养基(i)的培养平台，进一步包含(ii)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和VEGF的生长因子和细胞因子、BMP激活剂和iNK基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，其中培养基(ii)适于从永久HSC产生NK祖细胞。在一个实施方式中，包含培养基(i)和(ii)的培养平台进一步包含(iii)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基(iii)不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从永久造血内皮产生HSC。在一个实施方式中，包含培养基(i)、(ii)和(iii)的培养平台进一步包含(iv)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，其中培养基(iv)适于从中胚层细胞产生永久造血内皮。在另一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)、(iii)和(iv)的培养平台进一步包含(v)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基(v)适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
本发明的另一方面提供了用于获得NK祖细胞的培养平台，其包含一种或多种(i)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、VEGF和iNK基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，其中培养基适于从永久HSC产生NK祖细胞；(ii)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中该培养基不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从永久造血内皮产生HSC；(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，其中培养基适于从中胚层细胞产生永久造血内皮；以及(iv)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
用于获得NK祖细胞的培养平台的一个实施方式包括(i)培养基，其包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L和VEGF的生长因子和细胞因子和iNK基本培养基，后者包含一种或多种选自IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子，其中培养基(i)适于从永久HSC产生NK祖细胞。在一个实施方式中，包含培养基(i)的培养平台，进一步包含(ii)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中培养基(ii)不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从永久造血内皮产生HSC。在一个实施方式中，包含培养基(i)和(ii)的培养平台进一步包含(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，其中培养基(iii)适于从中胚层细胞产生永久造血内皮。在另一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)和(iii)的培养平台进一步包含(iv)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基(v)适于从iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
用于获得NK祖细胞的培养平台的一个实施方式包含一种或多种形式为微珠缀合、质膜颗粒和/或抗原呈递细胞的人工抗原，用于刺激NK生长、发育和成熟。
本发明的又一方面提供了用于产生永久CD34+细胞的培养平台，其包含一种或多种(i)培养基，其包含一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子和iHSC基本培养基，后者包含BMP激活剂，其中该培养基不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂并适于从永久造血内皮产生HSC；(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂和iHSC基本培养基，其中培养基适于从中胚层细胞产生永久造血内皮；以及(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂和基本iHSC基本培养基，其中培养基适于从多能干细胞包括iPSC产生中胚层细胞。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
II.iCD34平台
本发明另外的方面提供了一种用于使用多能干细胞获得永久造血内皮的培养平台。如本文使用的，永久造血内皮是指向永久造血的造血细胞群，其具有产生所有造血细胞的能力，包括但不限于永久HSC、造血专能祖细胞(MPP)、T祖细胞、NK祖细胞、成熟T细胞和/或NK细胞。
在一个实施方式中，使用包括iPSC的多能干细胞获得永久造血内皮的培养平台包括含有MEKi、GSKi和ROCKi的接种培养基。在一些实施方式中，接种培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一个实施方式中，本发明的接种培养基中的小分子的组合在表9中显示为命运维持培养基(FMM)。培养基的组分可以以表9所示浓度范围内的量存在于培养基中。在一个实施方式中，用于获得永久造血内皮的iPSC是使用命运重编程培养基(FRM)产生的细胞系，并且进一步维持在FMM中以建立并维持适合于本文所公开的阶段特异性分化的iPSC细胞系的基础或初始状态。如此获得的基础或初始的iPSC适合于低温保存。在本发明中，保存的iPSC细胞系或克隆的iPSC可以接种在FMM中，用于随后分化为永久造血内皮。
表9：初始iPSC接种培养以获得CD34+永久造血内皮、专能祖细胞、T祖细胞和NK祖细胞：
Figure GDA0003180521760000461
本发明的一个方面提供了用于从包括iPSC的多能干细胞分化和扩增中胚层的培养基。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一个实施方式中，培养基包含BMP激活剂，以及可选的bFGF和CD34基本培养基，后者包含如表10所示的小分子组合。在一些实施方式中，培养基包含胞外基质蛋白。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表10所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。在一些实施方式中，使用MatrigelTM替代玻连蛋白将培养基完全限定。
Figure GDA0003180521760000462
Figure GDA0003180521760000471
在一个实施方式中，上述用于从多能干细胞分化和扩增中胚层的培养基进一步包含bFGF 0.2-50ng。
本发明的一个方面提供了用于从包括iPSC的多能干细胞获得具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞的培养基。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一个实施方式中，培养基包含BMP激活剂、GSK3抑制剂和bFGF。在一个实施方式中，包含GSK3抑制剂的培养基仅在中胚层细胞特化后应用，以达到永久HE潜能。在一个实施方式中，包含BMP激活剂、GSK3抑制剂和bFGF的培养基，进一步包含CD34基本培养基，后者包含如表11所示的小分子组合。在一个实施方式中，上述培养基不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，培养基包含胞外基质蛋白。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表11所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。在一些实施方式中，使用MatrigelTM替代玻连蛋白将培养基完全限定.
Figure GDA0003180521760000472
本发明的一个方面提供了用于从中胚层细胞获得永久造血内皮的培养基。在一个实施方式中，培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子。在一个实施方式中，培养基包含VEGF、bFGF、SCF、IL6、IL11和ROCK抑制剂和CD34基本培养基，后者包含如表12所示的小分子组合。在一个实施方式中包含VEGF、bFGF、SCF、IL6、IL11和ROCK抑制剂的培养基不含IGF1和/或EPO。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表12所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。
Figure GDA0003180521760000481
本发明的一个方面提供了用于从永久造血内皮获得专能祖(MPP)细胞的培养平台。MPP可进一步分化为骨髓细胞，包括嗜中性祖细胞。在一个实施方式中，培养平台包含(i)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-HSC(表13)。在另一实施方式中，包含用于将永久造血内皮分化为前-HSC的培养基的培养平台，进一步包含(ii)培养基，其包含BMP激活剂，TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11，其中该培养基不含ROCK抑制剂并适于将前-HSC分化为专能祖细胞。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表13所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。
Figure GDA0003180521760000482
Figure GDA0003180521760000491
本发明的一个方面提供了用于从永久造血内皮产生T祖细胞或T-细胞的培养平台。在一个实施方式中，培养平台包含(i)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-T祖细胞(前-proT)；以及(ii)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种，并适于将前-T祖细胞分化为T祖细胞或T细胞(表14)。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表14所示的小分子、生长因子和/或细胞因子。
Figure GDA0003180521760000492
本发明的一个方面提供了用于从永久造血内皮产生NK祖细胞或NK细胞的培养平台。在一个实施方式中，培养平台包含(i)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-NK祖细胞(前-proNK)；以及(ii)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种并适于将前-NK祖细胞分化为NK祖细胞或NK细胞。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在其它实施方式中，本文的培养基包含浓度范围如表8所示的小分子、生长因子和/或细胞因子.
Figure GDA0003180521760000501
本发明的另一方面提供了用于获得T祖细胞或T细胞的培养平台，其包含一种或多种(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子且不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种，该培养基适于将前-T祖细胞分化为T祖细胞或T细胞；(ii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，并适于将永久造血内皮分化为前-T祖细胞；(iii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子并适于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮；(iv)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂并适于在中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能；(v)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF并适于从iPSC产生和扩增中胚层细胞；以及(vi)培养基，其包含MEKi、GSKi和ROCKi，不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂并适于接种和扩增初始iPSC。在一些实施方式中，所有上述培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012或BIO。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。
在一个实施方式中，用于产生T祖细胞或T细胞的培养平台包含(i)培养基，其包含SCF、Flt3L和IL7，不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种，并适于将前-T祖细胞转化为T祖细胞或T细胞。在另一实施方式中，包含培养基(i)的用于产生T祖细胞或T细胞的培养平台，进一步包含(ii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，并适于将永久造血内皮分化为前-T祖细胞。在另一实施方式中，包含培养基(i)和(ii)的用于产生T祖细胞或T细胞的培养平台，进一步包含(iii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子并适于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮。在又一实施方式中，包含培养基(i)，(ii)和(iii)的用于产生T祖细胞或T细胞的培养平台，进一步包含(iv)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂并适于在中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能。在又一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)、(iii)和(iv)的用于产生T祖细胞或T细胞的培养平台进一步包含(v)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF并适于从iPSC产生和扩增中胚层细胞。在另一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的用于产生T祖细胞或T细胞的培养平台进一步包含(vi)培养基，其包含MEKi、GSKi和ROCKi，不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂并适于接种和扩增初始iPSC。在一些实施方式中，所有上述培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012或BIO。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，用于产生T祖细胞或T细胞的培养平台使用Notch因子。在一些实施方式中，Notch因子包括Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4，可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。
本发明的另一方面提供了用于获得NK祖细胞或NK细胞的培养平台，包含一种或多种：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种并适于将前-NK祖细胞分化为NK祖细胞或NK细胞；(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-NK祖细胞；(iii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子并适于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮；(iv)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂并适于在中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能；(v)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF并适于从iPSC产生和扩增中胚层细胞；(vi)培养基，其包含MEKi、GSKi和ROCKi，不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂并适于接种和扩增初始iPSC。在一些实施方式中，所有上述培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012或BIO。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，使用一种或多种用于刺激NK生长、发育和成熟的人工抗原诱导NK成熟，所述抗原以微珠缀合，质膜颗粒和/或抗原呈递细胞的形式引入。
在一个实施方式中，用于产生NK祖细胞或NK细胞的培养平台包含：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种并适于将前-NK祖细胞分化为NK祖细胞或NK细胞。在一些实施方式中，使用一种或多种用于刺激NK生长、发育和成熟的人工抗原诱导NK成熟，所述抗原以微珠缀合，质膜颗粒和/或抗原呈递细胞的形式引入。在另一实施方式中，包含培养基(i)的用于产生NK祖细胞或NK细胞的培养平台，进一步包含(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将永久造血内皮分化为前-NK祖细胞。在另一实施方式中，包含培养基(i)和(ii)的用于产生NK祖细胞或NK细胞的培养平台，进一步包含(iii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子并适于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮。在又一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)和(iii)的用于产生NK祖细胞或NK细胞的培养平台，进一步包含(iv)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂并适于在中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能。在又一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)、(iii)和(iv)的用于产生NK祖细胞或NK细胞的培养平台，进一步包含(v)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF并适于从iPSC产生和扩增中胚层细胞。在另一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的用于产生NK祖细胞或NK细胞的培养平台进一步包含(vi)培养基，其包含MEKi、GSKi和ROCKi，不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂并适于接种和扩增初始iPSC。在一些实施方式中，所有上述培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012或BIO。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4.
本发明的一个方面提供了用于产生永久造血内皮的培养平台，其包含一种或多种(i)用于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮的培养基，其包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；(ii)用于在中胚层细胞中获得永久造血潜能的培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂；(iii)用于从初始iPSC分化和扩增中胚层细胞的培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；以及(iv)初始iPSC接种和扩增培养基，其包含MEKi、GSKi和ROCKi，且接种培养不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，永久造血内皮是CD34+。在一些实施方式中，所有上述培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012或BIO。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。
在一个实施方式中，用于获得永久造血内皮的培养平台包含(i)培养基，其包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮。在一个实施方式中，包含培养基(i)的培养平台，进一步包含(ii)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，其中培养基(ii)适于在中胚层细胞中获得永久造血潜能。在另一实施方式中，包含培养基(i)和(ii)的培养平台进一步包含(iii)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF，其中培养基(iii)适于从初始iPSC分化和扩增中胚层细胞。在又一实施方式中，包含培养基(i)、(ii)和(iii)的培养平台进一步包含(iv)培养基，其包含MEKi、GSKi和ROCKi，且培养基(v)不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中培养基(v)适于接种和扩增初始iPSC。在一些实施方式中，所有上述培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012或BIO。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。
本发明的一个方面提供了用于产生CD34+永久造血内皮的培养平台，其包含一种或多种(i)用于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮的培养基，其包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，其中永久造血内皮包含CD34+永久造血内皮；(ii)用于在中胚层细胞中获得永久造血潜能的培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂；(iii)用于从初始iPSC分化和扩增中胚层细胞的培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；以及(iv)初始iPSC接种或扩增培养基，其包含MEKi、GSKi和ROCKi，且接种培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，所有上述培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012或BIO。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。
本发明的一个方面提供了用于产生中胚层细胞的培养平台，其包含一种或多种(i)用于从初始iPSC分化和扩增中胚层细胞的培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；以及(ii)初始iPSC接种或扩增培养基，其包含MEKi、GSKi和ROCKi，且该接种培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，所有上述培养基不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012或BIO。在一些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99012。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是thiazovivin或Y27632。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632。在一些实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，用于产生中胚层细胞的培养平台可进一步包含(iii)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，其中培养基用于在中胚层细胞中获得永久造血潜能。在一些实施方式中，培养基包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
C.获得CD34+细胞、永久造血内皮、专能祖细胞、T细胞或NK祖细胞、T细胞和/或NK细胞的方法
本发明提供了使用包含一种或多种培养基的多阶段培养平台产生多能干细胞来源的永久造血细胞的方法。该方法适于无饲养条件。该方法还适于单层培养，并因而与本领域已知方法相比，无需EB形成或聚集体中间物即可进行多能干细胞分化。所提供的方法产生并同时扩增多能干细胞来源的永久造血内皮(iHE)、永久HSC(iHSC)、CD34+HE(iCD34)，其能够被进一步分化为专能祖细胞(iMPP)、自然杀伤祖细胞(ipro-NK)、T祖细胞(ipro-T)、成熟NK细胞(iNK)和T细胞(iT)。本发明另外的方面还提供了从多能干细胞来源的CD34+、HE、HSC和/或MPP分化产生骨髓细胞的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于在单层培养中从多能细胞分化和扩增造血谱系细胞的方法，包括使多能细胞接触BMP途径激活剂以及可选的bFGF，其中不形成拟胚体而从多能干细胞获得并扩增多能干细胞来源的中胚层细胞，其随后接触BMP途径激活剂、bFGF和WNT途径激活剂以从多能干细胞获得扩增的具有永久造血内皮(HE)潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞，而不形成拟胚体。通过随后接触bFGF以及可选的ROCK抑制剂和/或WNT途径激活剂，具有永久HE潜能的中胚层细胞被分化为永久HE细胞，其在分化过程中同样扩增。
所提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB-培养的多能干细胞分化，因为EB形成不能导致细胞扩增，不允许单层培养且是费力和低效的。此外，本发明公开了使用本文提供的方法进行单层培养能导致功能性造血细胞系，后者能够在体内导致长期的造血自我更新、重建和移植。
如下详述，本发明提供了通过获得永久HSC或永久造血内皮从多能细胞获得造血细胞系的方法。特别的，本发明提供了引导多能细胞向造血谱系细胞分化而不为了分化形成EB的方法。
I.iHSC平台
1.从多能干细胞、多能干细胞来源的中胚层或HE分化和扩增
iHSC—iHSC平台
本发明的一个方面提供了使用多阶段过程产生和扩增永久HSC(iHSC)的方法。一般，该方法始于第一阶段，其中多能干细胞被分化为中胚层细胞，然后在第二阶段中胚层细胞被分化和扩增为造血内皮(HE)。在第三阶段，HE细胞被分化为永久HSC(iHSC)，其同时也进行扩增。本发明还提供了产生永久HSC(iHSC)的方法，包括将多能干细胞来源的中胚层细胞分化和扩增为HE和将HE分化为iHSC。可替代的，本发明提供了产生和扩增永久HSC(iHSC)的方法，包括将多能干细胞来源的HE分化为iHSC。在上述方法的一些实施方式中，多能干细胞包括iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。
在从初始多能干细胞产生永久HSC(iHSC)的方法的一个实施方式中，该方法包括：(1)通过使多能细胞接触培养基将多能干细胞分化为中胚层细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和胞外基质蛋白，其中分化的中胚层细胞发生扩增；(2)通过使中胚层细胞接触第二培养基将中胚层细胞分化为永久造血内皮，所述第二培养基，所述第二培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中永久HE细胞发生扩增；以及(3)通过使永久HE细胞接触第三培养基使永久HE细胞分化为永久HSC，其中永久HSC发生扩增，所述第三培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子。在一些实施方式中，多能干细胞包括iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法包括通过使中胚层细胞接触培养基将中胚层细胞分化为永久造血内皮，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和TGFβ受体抑制剂。
在从多能干细胞来源的中胚层细胞产生和扩增永久HSC(iHSC)的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使中胚层细胞接触培养基将中胚层细胞分化为永久HE细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中永久HE细胞发生扩增；以及(2)通过使HE细胞接触第二培养基将获得的HE细胞分化为iHSC，所述第二培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。
在从多能干细胞来源的HE产生和扩增永久HSC(iHSC)的方法的一个实施方式中，该方法包括使HE细胞接触培养基，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC分化和扩增自多能干细胞来源的HE。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。
2.从多能干细胞或多能干细胞来源的中胚层分化和扩增HE—iHSC平台
本发明的一个方面提供了使用多阶段过程产生和扩增永久造血内皮的方法。一般，方法始于第一阶段，其中多能干细胞被分化为中胚层细胞，然后中胚层细胞在第二阶段被扩增和分化为造血内皮。起始多能细胞包括但不限于诱导性基础或初始多能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方式中，产生和扩增的造血内皮是永久的。在一些实施方式中，产生的永久造血内皮是CD34阳性的。可替代的，本发明提供了通过将多能干细胞来源的中胚层细胞分化为永久造血内皮来产生和扩增造血内皮的方法。
在从多能干细胞分化和扩增永久造血内皮的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使细胞接触第一培养基将多能干细胞分化为中胚层细胞，所述第一培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和胞外基质蛋白；(2)通过使中胚层细胞接触第二培养基将中胚层细胞分化为造血内皮，所述第二培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中永久HE细胞发生扩增。在一些实施方式中，从上述方法获得的HE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法包括GSK3抑制剂作为Wnt途径激活剂。在一些实施方式中，上述方法包括CHIR99021或BIO作为GSK3抑制剂。在一些实施方式中，上述方法包括CHIR99021作为GSK3抑制剂。在一些实施方式中，上述方法包括SB431542或A83-01作为TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法包括SB431542作为TGFβ受体抑制剂。
在从多能干细胞来源的中胚层细胞分化和扩增造血内皮的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使中胚层细胞接触培养基将中胚层细胞分化为造血内皮，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，从上述方法获得的永久HE细胞表达CD34。
3.从iPSC分化和扩增中胚层细胞—iHSC平台
本发明的一个方面提供了从多能干细胞产生中胚层细胞的方法。起始多能细胞包括但不限于诱导性基础或初始多能干细胞和胚胎干细胞。
在从多能干细胞产生和扩增中胚层细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使多能干细胞接触培养基将多能干细胞分化为中胚层细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和胞外基质蛋白。在一些实施方式中，上述方法包括GSK3抑制剂作为Wnt途径激活剂。在一些实施方式中，上述方法包括CHIR99021或BIO作为GSK3抑制剂。在一些实施方式中，上述方法包括CHIR99021作为GSK3抑制剂。
4.从多能干细胞，从多能干细胞来源的中胚层细胞，HE，或永久HSC获得T祖细胞–iHSC和iTC平台
本发明的一个方面提供了从多能干细胞使用多阶段过程产生T祖细胞的方法。一般，方法始于第一阶段，其中多能干细胞被分化为中胚层细胞，其中中胚层细胞发生扩增，然后在第二阶段造血内皮分化和扩增。在第三阶段，HE细胞被分化为永久HSC(iHSC)，其中iHSC发生扩增。在第四阶段，iHSC被分化为T祖细胞。本发明还提供了产生T祖细胞的方法，包括将多能干细胞来源的中胚层细胞分化为HE，然后将HE分化为iHSC，然后将iHSC分化为T祖细胞。本发明进一步提供了产生T祖细胞的方法，包括将多能干细胞来源的HE分化为iHSC，然后将iHSC分化为T祖细胞。可替代的，本发明提供了产生T祖细胞的方法，包括将多能干细胞来源的iHSC分化为T祖细胞。
在从多能干细胞产生T祖细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使多能细胞接触培养基将多能干细胞分化为中胚层细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和胞外基质蛋白，其中中胚层细胞发生扩增；(2)通过使中胚层细胞接触第二培养基将中胚层细胞分化为造血内皮，所述第二培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中HE细胞发生扩增；(3)通过使HE细胞接触第三培养基将HE细胞分化为永久HSC，所述第三培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；以及(4)通过使iHSC接触第四培养基将iHSC分化为T祖细胞，所述第四培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一个实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一个实施方式中，Notch途径激活剂是Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。
在从多能干细胞来源的中胚层细胞产生T祖细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使中胚层细胞接触培养基将中胚层细胞分化为HE细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中HE发生扩增；(2)通过使HE细胞接触第二培养基将获得的HE细胞分化为iHSC，所述第二培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；以及(3)通过使iHSC接触第三培养基将iHSC分化为T祖细胞，所述第三培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一个实施方式中，Notch途径激活剂是Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。
在从多能干细胞来源的HE产生T祖细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使HE细胞接触培养基将HE分化为iHSC，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；以及(2)通过使iHSC接触第二培养基将iHSC分化为T祖细胞，所述第二培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。
在从多能干细胞来源的iHSC产生T祖细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使iHSC接触培养基将iHSC分化为T祖细胞，所述培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选和获得多能干细胞来源的HSC(iHSC)。在一个实施方式中，Notch途径激活剂是Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。
5.从多能干细胞，从多能干细胞来源的中胚层细胞，HE，iHSC，或T祖细胞获得T细胞–iHSC和iTC平台
本发明的一个方面提供了使用多阶段过程从多能干细胞产生T细胞的方法。一般，方法始于第一阶段，其中多能干细胞被分化为中胚层细胞，其在分化时扩增，然后在第二阶段中胚层细胞被分化为造血内皮，其中HE细胞发生扩增。在第三阶段，HE细胞被分化为永久HSC(iHSC)，其中iHSC发生扩增。在第四阶段，iHSC被分化为T祖细胞(ipro-T)。在第五阶段，iHSC被分化为T细胞。本发明还提供了产生T细胞的方法，包括将多能干细胞来源的中胚层细胞分化为HE，将HE分化为iHSC，将iHSC分化为T祖细胞和然后将T祖细胞分化为T细胞。本发明进一步提供了产生T细胞的方法，包括将多能干细胞来源的HE分化为iHSC，将iHSC分化为T祖细胞和将T祖细胞分化为T细胞。可替代的，本发明提供了产生T细胞的方法，包括将多能干细胞来源的iHSC分化为T祖细胞和将T祖细胞分化为T细胞。进一步，本发明提供了产生T细胞的方法，包括将多能干细胞来源的T祖细胞分化为T细胞。
在从多能干细胞产生T细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使多能干细胞接触培养基将多能干细胞分化为中胚层细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和胞外基质蛋白，其中中胚层细胞发生扩增；(2)通过使中胚层细胞接触第二培养基将中胚层细胞分化为造血内皮，所述第二培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中HE细胞发生扩增；(3)通过使HE细胞接触第三培养基将HE细胞分化为iHSC，所述第三培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；(4)通过使iHSC接触第四培养基将iHSC分化为T祖细胞，所述第四培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂；以及(5)通过使T祖细胞接触第五培养基将T祖细胞分化为T细胞，所述第五培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6，以及一种或多种Notch途径激活剂。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一个实施方式中，BMP激活剂是BMP4。在一个实施方式中，Notch途径激活剂是Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。
在从多能干细胞产生T细胞来源的中胚层细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使中胚层细胞接触培养基将中胚层细胞分化为HE细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中永久HE细胞发生扩增；(2)通过使HE细胞接触第二培养基将获得的HE细胞分化为iHSC，所述第二培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；(3)通过使iHSC接触第三培养基将iHSC分化为T祖细胞，所述第三培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂；以及(4)通过使T祖细胞接触第四培养基将T祖细胞分化为T细胞，所述第四培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6，以及一种或多种Notch途径激活剂。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一个实施方式中，Notch途径激活剂是Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。
在从多能干细胞产生T细胞来源的HE的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使HE细胞接触培养基将多能干细胞来源的HE分化为iHSC，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；(2)通过使iHSC接触第二培养基将iHSC分化为T祖细胞，所述第二培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂；以及(3)通过使T祖细胞接触第三培养基将T祖细胞分化为T细胞，所述第三培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6，以及一种或多种Notch途径激活剂。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括分选获得的iHSC使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一个实施方式中，Notch途径激活剂是Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。
在从多能干细胞产生T细胞来源的iHSC的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使iHSC接触培养基将iHSC分化为T祖细胞，所述培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种Notch途径激活剂，其中iHSC发生扩增；以及(2)通过使T祖细胞接触培养基将T祖细胞分化为T细胞，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6，以及一种或多种Notch途径激活剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选和获得多能干细胞来源的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一个实施方式中，Notch途径激活剂是Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。
在从多能干细胞产生T细胞来源的T祖细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使T祖细胞接触培养基将T祖细胞分化为T细胞，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6，以及一种或多种Notch途径激活剂。
6.从多能干细胞来源的中胚层细胞，HE，或iHSC获得NK祖细胞多能干细胞，–iHSC和iNK平台
本发明的一个方面提供了使用多阶段过程从多能干细胞产生NK祖细胞的方法。一般，方法始于第一阶段，其中多能干细胞被分化为中胚层细胞，其中中胚层细胞发生扩增；然后在第二阶段中胚层细胞被分化为造血内皮，其中HE细胞发生扩增。在第三阶段，HE细胞被分化为永久HSC，其中永久HSC发生扩增。在第四阶段，iHSC被分化为NK祖细胞。本发明还提供了产生NK祖细胞的方法，包括将多能干细胞来源的中胚层细胞分化为HE，然后将HE分化为iHSC，然后将iHSC分化为NK祖细胞。本发明进一步提供了产生NK祖细胞的方法，包括将多能干细胞来源的HE分化为iHSC和然后将iHSC分化为NK祖细胞。可替代的，本发明提供了产生NK祖细胞的方法，包括将多能干细胞来源的iHSC分化为NK祖细胞。
在从多能干细胞产生NK祖细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使多能干细胞接触培养基将多能干细胞分化为中胚层细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和胞外基质蛋白，其中中胚层细胞发生扩增；(2)通过使中胚层细胞接触第二培养基将中胚层细胞分化为造血内皮，所述第二培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中HE细胞发生扩增；(3)通过使HE细胞接触第三培养基将HE细胞分化为iHSC，所述第三培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；以及(4)通过使iHSC接触第四培养基将iHSC分化为NK祖细胞，所述第四培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。
在从多能干细胞产生NK祖细胞来源的中胚层细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使中胚层细胞接触培养基将多能干细胞来源的中胚层细胞分化为HE细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中HE细胞发生扩增；(2)通过使HE细胞接触第二培养基将获得的HE细胞分化为iHSC，所述第二培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；以及(3)通过使iHSC接触第三培养基将iHSC分化为NK祖细胞，所述第三培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。
在从多能干细胞来源的HE产生NK祖细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使HE细胞接触培养基将多能干细胞来源的HE分化为iHSC，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；以及(2)通过使iHSC接触第二培养基将iHSC分化为NK祖细胞，所述第二培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。
在从多能干细胞产生NK祖细胞来源的iHSC的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使iHSC接触培养基将iHSC分化为NK祖细胞，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选和获得多能干细胞来源的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。
7.从多能干细胞，从多能干细胞来源的中胚层细胞，HE，iHSC，或NK祖细胞获得NK细胞–iHSC和iNK平台
本发明的一个方面提供了从多能干细胞使用多阶段过程产生NK细胞的方法。一般，该方法始于第一阶段，其中多能干细胞被分化为中胚层细胞，其中中胚层细胞发生扩增，然后在第二阶段中胚层细胞被分化为造血内皮，其中HE细胞发生扩增。在第三阶段，HE细胞被分化为永久HSC(iHSC)；其中HSC发生扩增。在第四阶段，iHSC被分化为NK祖细胞(ipro-NK)。在第五阶段，iHSC被分化为NK细胞。本发明还提供了产生NK细胞的方法，包括将多能干细胞来源的中胚层细胞分化为HE，将HE分化为iHSC，将iHSC分化为NK祖细胞和然后将NK祖细胞分化为NK细胞。本发明进一步提供了产生NK细胞的方法，包括将多能干细胞来源的HE分化为iHSC，将iHSC分化为NK祖细胞和将NK祖细胞分化为NK细胞。可替代的，本发明提供了产生NK细胞的方法，包括将多能干细胞来源的iHSC分化为NK祖细胞和将多能干细胞来源的NK祖细胞分化为NK细胞。进一步，本发明提供了产生NK细胞的方法，包括将多能干细胞来源的NK祖细胞分化为NK细胞。
在从多能干细胞产生NK细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使多能干细胞接触培养基将多能干细胞分化为中胚层细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和胞外基质蛋白，其中中胚层细胞发生扩增；(2)通过使中胚层细胞接触第二培养基将中胚层细胞分化为永久造血内皮，所述第二培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中HE细胞发生扩增；(3)通过使HE细胞接触第三培养基将HE细胞分化为iHSC，所述第三培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；(4)通过使iHSC接触第四培养基将iHSC分化为NK祖细胞，所述第四培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；以及(5)通过使NK祖细胞接触第五培养基将NK祖细胞分化为NK细胞，所述第五培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法包括通过使中胚层细胞接触培养基将中胚层细胞分化为永久造血内皮，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和TGFβ受体抑制剂。在一个实施方式中，BMP激活剂是BMP4。
在从多能干细胞来源的中胚层细胞产生NK细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使中胚层细胞接触培养基将多能干细胞来源的中胚层细胞分化为HE细胞，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂以及可选的TGFβ受体抑制剂，其中中胚层细胞发生扩增；(2)通过使HE细胞接触第二培养基将获得的HE细胞分化为iHSC，所述第二培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中永久HE细胞发生扩增；(3)通过使iHSC接触第三培养基将iHSC分化为NK祖细胞，所述第三培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；以及(4)通过使NK祖细胞接触第四培养基将NK祖细胞分化为NK细胞，所述第四培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法包括通过使中胚层细胞接触培养基将中胚层细胞分化为永久造血内皮，所述培养基包含至少一种BMP途径激活剂和Wnt途径激活剂和TGFβ受体抑制剂。
在从多能干细胞来源的HE产生NK细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使HE细胞接触培养基将多能干细胞来源的永久HE分化为iHSC，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中iHSC发生扩增；(2)通过使iHSC接触第二培养基将iHSC分化为NK祖细胞，所述第二培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；以及(3)通过使NK祖细胞接触第三培养基将NK祖细胞分化为NK细胞，所述第三培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHSC细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的HSC(iHSC)。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。
在从多能干细胞来源的iHSC产生NK细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使iHSC接触培养基将iHSC分化为NK祖细胞，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；以及(2)通过使NK祖细胞接触第二培养基将NK祖细胞分化为NK细胞，所述第二培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选和获得多能干细胞来源的HSC(iHSC)。
在从多能干细胞来源的NK祖细胞产生NK细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使NK祖细胞接触第五培养基将NK祖细胞分化为NK细胞，所述第五培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15。
II.iCD34平台
1.得到和扩增永久iHE—iCD34平台
本发明的一个方面提供了使用优化的多阶段过程来产生永久造血内皮(iHE)的方法。一般，方法始于第一阶段，其中接种和扩增多能干细胞。然后将多能干细胞分化为中胚层细胞，其在此阶段扩增。扩增的中胚层群然后分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层群，然后从具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮。可替代的，本发明提供了产生永久造血内皮(iHE)的方法，包括从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞；然后从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮(iHE)。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。本发明进一步提供了产生和扩增永久造血内皮(iHE)的方法，包括分化和扩增多能干细胞来源的中胚层细胞和获得具有永久iHE潜能的中胚层细胞，后者然后分化为iHE。可替代的，本发明提供了产生和扩增永久造血内皮的方法，包括将多能干细胞来源的中胚层细胞分化为iHE。本文公开的方法利用优化的单层iCD34培养平台，没有EB形成且不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在从多能干细胞产生永久造血内皮(iHE)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使细胞接触培养基从多能干细胞分化和扩增中胚层群，所述培养基包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；(2)通过使细胞接触培养基分化和扩增中胚层群以在中胚层细胞中获得永久HE潜能，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF；(3)通过使细胞接触培养基将具有永久HE潜能的中胚层细胞分化和扩增为永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，仅在中胚层细胞特化后使细胞接触包含GSK3抑制剂的培养基，以达到永久HE潜能。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使接种的iPSC和/或中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使多能细胞接触培养基接种多能干细胞，所述培养基包含MEKi、GSKi和ROCKi，其中多能干细胞发生扩增。
在从接种的多能干细胞产生永久造血内皮(iHE)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使多能干细胞接触培养基从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；(2)通过使中胚层细胞接触培养基获得具有永久iHE潜能的中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF；(3)通过使中胚层细胞接触培养基从具有iHE潜能的中胚层细胞分化和扩增永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34阳性分选。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使接种的iPSC和/或中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。
在从多能干细胞来源的中胚层细胞产生永久造血内皮(iHE)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使中胚层细胞接触培养基获得具有永久HE潜能的中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF；(2)通过使中胚层细胞接触培养基从具有永久HE潜能的中胚层细胞分化和扩增永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。
在多能干细胞来源的中胚层细胞中获得永久造血内皮(iHE)潜能的方法的一个实施方式中，该方法包括使中胚层细胞接触培养基，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，其中中胚层细胞发生扩增。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。
2.得到和扩增具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞—iCD34平台
本发明的一个方面提供了使用优化的多阶段过程来产生多能干细胞来源的中胚层细胞的方法。一般，方法始于第一阶段，其中多能干细胞被接种。接种的多能干细胞然后发育成中胚层。在第三阶段，中胚层进一步分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞。可替代的，本发明提供了产生多能干细胞来源的中胚层细胞的方法，包括将接种的多能干细胞分化为中胚层和将中胚层分化为具有永久造血潜能的中胚层细胞的方法。本发明进一步提供了产生多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞的方法，该方法包括将多能干细胞来源的中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。本文公开的方法利用优化的iCD34培养平台，其不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在多能干细胞来源的中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使多能干细胞接触培养基从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；以及(2)通过使细胞接触培养基在中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使多能干细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使细胞接触培养基来接种多能干细胞，所述培养基包含MEKi、GSKi和ROCKi。
在从多能干细胞来源的中胚层产生多能干细胞来源的具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使细胞接触培养基将中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。
3.从多能干细胞得到和扩增中胚层
本发明的一个方面提供了使用优化的多阶段过程来产生多能干细胞来源的中胚层的方法。一般，方法始于第一阶段，其中多能干细胞被接种，然后接种的细胞在第二阶段分化为中胚层。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。本文公开的方法利用优化的iCD34培养平台，其不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在从多能细胞产生多能干细胞来源的中胚层的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使细胞接触培养基从接种的多能干细胞分化和扩增中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂，以及可选的bFGF。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使接种的iPSC处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使多能细胞接触培养基接种和扩增iPSC，所述培养基包含MEKi、GSKi和ROCK。
4.得到造血专能祖细胞(iMPP)—iCD34平台和iMPP平台
本发明的一个方面提供了使用优化的多阶段过程来产生多能干细胞来源的专能祖细胞(iMPP)的方法。一般，方法始于第一阶段，其中多能干细胞被接种。接种的细胞被扩增和分化为中胚层细胞。中胚层被扩增和分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，然后中胚层细胞被分化为永久造血内皮。HE细胞被扩增和分化为前-HSC，然后是专能祖细胞，其能够分化为骨髓细胞，包括嗜中性祖细胞。可替代的，本发明提供了产生多能干细胞来源的专能祖细胞(iMPP)的方法，包括将接种的多能细胞分化为中胚层，将中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，然后将中胚层细胞分化为永久iHE，其然后被分化为iMPP。本发明进一步提供了产生多能干细胞来源的iMPP的方法，包括将多能干细胞来源的中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，然后中胚层细胞被分化为永久iHE，其然后被分化为iMPP。可替代的，本发明提供了产生多能干细胞来源的iMPP的方法，包括将多能干细胞来源的中胚层细胞分化为永久iHE，其然后被分化为iMPP。进一步，本发明提供了产生多能干细胞来源的iMPP的方法，包括将多能干细胞来源的iHE分化为iMPP。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。本文公开的方法利用优化的单层iCD34培养平台，没有EB形成，其不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在从多能干细胞产生造血专能祖细胞(iMPP)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使多能细胞接触培养基从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；(2)通过使中胚层细胞接触培养基在中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF；(3)通过使细胞接触培养基从具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化和扩增永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及(4)通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为iMPP，所述培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子以及可选的ROCK抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使细胞接触培养基接种和扩增多能干细胞，所述培养基包含MEKi、GSKi和ROCKi。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-HSC，所述培养基包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子。在其它实施方式中，该方法包括将永久HE细胞分化为前-HSC，进一步包括通过使前-HSC细胞接触培养基将前-HSC分化为iMPP，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子且该培养基不含或基本上不含ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使接种的多能干细胞、中胚层和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632或thiazovivin。
在从多能干细胞来源的中胚层产生多能干细胞来源的专能祖细胞(iMPP)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使中胚层细胞接触培养基在多能干细胞来源的中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF；(2)通过使细胞接触培养基从具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化和扩增永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；(3)通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为iMPP，所述培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子以及可选的ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-HSC，所述培养基包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子。在其它实施方式中，包括将永久HE细胞分化为前-HSC的方法进一步包括通过使前-HSC细胞接触培养基将前-HSC分化为iMPP，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，且培养基不含或基本上不含ROCK抑制剂。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使中胚层和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。
在从具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞产生多能干细胞来源的专能祖细胞(iMPP)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使细胞接触培养基从具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞分化和扩增永久HE细胞，所述培养基包含一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子和ROCK抑制剂；以及(2)通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为iMPP，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子以及可选的ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-HSC，所述培养基包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子。在其它实施方式中，包括将永久HE细胞分化为前-HSC的方法进一步包括通过使前-HSC细胞接触培养基将前-HSC分化为iMPP，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，且培养基不含或基本上不含ROCK抑制剂。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。
在从多能干细胞来源的永久HE细胞产生多能干细胞来源的专能祖细胞(iMPP)的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为iMPP，所述培养基包含BMP激活剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子以及可选的ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-HSC，所述培养基包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子。在其它实施方式中，包括将永久HE细胞分化为前-HSC的方法进一步包括通过使前-HSC细胞接触培养基将前-HSC分化为iMPP，所述培养基包含BMP激活剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，且培养基不含或基本上不含ROCK抑制剂。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。
5.得到多能干细胞来源的T祖细胞(ipro-T)或T细胞—iCD34平台和iT平台
本发明的一个方面提供了使用优化的多阶段过程来产生多能干细胞来源的T祖细胞(ipro-T)或多能干细胞来源的T细胞的方法。一般，该方法始于多能干细胞，从中分化和扩增中胚层细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。中胚层然后被分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞。具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞随后被分化为永久造血内皮，其同时在培养基中扩增。然后永久HE细胞被分化为前-proT，然后分化为T祖细胞(pro-T)，其在相同培养基中可被连续分化为T细胞。可替代的，本发明提供了产生多能干细胞来源的T祖细胞(ipro-T)或T细胞的方法，包括将接种的多能干细胞分化为中胚层，将中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，然后将具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化为iHE，其然后被分化为T祖细胞或T细胞。本发明进一步提供了产生多能干细胞来源的T祖细胞(ipro-T)或T细胞的方法，其包括将多能干细胞来源的中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，其然后被分化为iHE，其然后被分化为ipro-T或T细胞。可替代的，本发明提供了产生多能干细胞来源的T祖细胞或T细胞的方法，其括将具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞分化为iHE，其然后被分化为ipro-T或T细胞。进一步的，本发明提供了产生多能干细胞来源的T祖细胞(ipro-T)或T细胞的方法，其包括将多能干细胞来源的iHE分化为ipro-T或T细胞。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。本文公开的方法利用优化的iCD34培养平台，其不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施方式中，Notch因子包括但不限于Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。
在从多能干细胞产生多能干细胞来源的T祖细胞(ipro-T)或T细胞(iT)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使细胞接触培养基将接种的多能干细胞分化为中胚层，所述培养基包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；(2)通过使细胞接触培养基将中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂、Wnt途径激活剂和bFGF；(3)通过使细胞接触培养基将具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化为永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子和(4)通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为ipro-T或iT，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L和IL7以及可选的一种或多种选自下述的因子：VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使细胞接触培养基来接种和扩增多能干细胞，所述培养基包含MEKi、GSKi和ROCKi。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-proT，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、VEGF和bFGF。在其它实施方式中，包括将永久HE细胞分化为前-proT的方法进一步包括通过使前-proT细胞接触培养基将前-proT分化为ipro-T或iT，所述培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，且培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，上述方法包括具有一种或多种Notch因子的多能干细胞来源的pro-T。在一些实施方式中，Notch因子为Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3或DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使接种的多能干细胞、中胚层和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632或thiazovivin。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。
在从多能干细胞来源的中胚层产生多能干细胞来源的T祖细胞(ipro-T)或T细胞的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使细胞接触培养基将中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF；(2)通过使细胞接触培养基将具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化为永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及(3)通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为ipro-T或iT，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L和IL7以及可选的一种或多种选自下述的因子：VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-proT，所述培养基包含ROCK抑制剂一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、VEGF和bFGF。在其它实施方式中，包括将永久HE细胞分化为前-pro-T的方法进一步包括通过使前-proT细胞接触培养基将前-proT分化为ipro-T或iT，所述培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子且培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，上述方法包括具有一种或多种Notch因子的多能干细胞来源的pro-T。在一些实施方式中，Notch因子为Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3或DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使中胚层和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632或thiazovivin。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。
在从具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞产生多能干细胞来源的T祖细胞(ipro-T)或T细胞(iT)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使细胞接触培养基将具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化为永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及(2)通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为ipro-T或iT，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L和IL7以及可选的一种或多种选自下述的因子：VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-proT，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、VEGF和bFGF。在其它实施方式中，该包括将永久HE细胞分化为前-pro-T的方法进一步包括通过使前-proT细胞接触培养基将前-iproT分化为ipro-T或iT，所述培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子且培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，上述方法包括具有一种或多种Notch因子的多能干细胞来源的pro-T。在一些实施方式中，Notch因子为Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3或DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632或thiazovivin。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。
在从多能干细胞来源的HE细胞产生多能干细胞来源的T祖细胞(ipro-T)或T细胞(iT)的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使永久HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为ipro-T或T，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L和IL7以及可选的一种或多种选自下述的因子：VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-proT，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7、VEGF和bFGF。在其它实施方式中，该包括将永久HE细胞分化为前-pro-T的方法进一步包括通过使前-proT细胞接触培养基将前-iproT分化为pro-T或iT，所述培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子且培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，上述方法包括具有一种或多种Notch因子的多能干细胞来源的pro-T。在一些实施方式中，Notch因子为Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3或DLL-4。在一些实施方式中，DLL-1和DLL-4可作为可溶性肽、微珠缀合肽、表面缀合肽或细胞呈递肽被引入。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使多能干细胞来源的HE细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632或thiazovivin。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。
6.获得多能干细胞来源的NK祖细胞(ipro-NK)或NK细胞—iCD34平台和iNK平台
本发明的一个方面提供了使用优化的多阶段过程来产生多能干细胞来源的NK祖细胞(ipro-NK)或NK细胞(iNK)的方法。一般，该方法始于多能干细胞，其在一些实施方式中被接种。多能干细胞发育为中胚层细胞，后者进行扩增并随后分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞。然后从具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮。HE细胞能够被分化为前-proNK，然后分化为NK祖细胞(pro-NK)，其能够在同一培养基中继续被分化为NK细胞。可替代的，本发明提供了产生多能干细胞来源的NK祖细胞(ipro-NK)或NK细胞的方法，其包括将接种的多能干细胞分化为中胚层，将中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，然后将具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化为iHE，其然后分化为NK祖细胞。本发明进一步提供了产生多能干细胞来源的NK祖细胞(ipro-NK)或NK细胞的方法，其包括将多能干细胞来源的中胚层分化为具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，然后具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞被分化为iHE，其然后被分化为ipro-NK或iNK。可替代的，本发明提供了产生多能干细胞来源的NK祖细胞或iNK的方法，包括将具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞分化为iHE，其然后被分化为ipro-NK或iNK。进一步，本发明提供了产生多能干细胞来源的NK祖细胞(ipro-NK)或NK细胞的方法，包括将多能干细胞来源的iHE分化为ipro-NK或iNK。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，用于获得NK祖细胞的培养平台包括通过使pro-NK细胞接触一种或多种用于刺激NK生长、发育和成熟的人工抗原来得到NK细胞，其中人工抗原以微珠缀合、质膜颗粒和/或抗原呈递细胞的形式引入。本文公开的方法利用优化的iCD34培养平台，其不含或基本上不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在从接种的iPSC产生多能干细胞来源的NK祖细胞(ipro-NK)或NK细胞(iNK)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使细胞接触培养基从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞，所述培养基包含BMP激活剂，以及可选的bFGF；(2)通过使中胚层细胞接触培养基在中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF；(3)通过使细胞接触培养基从具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化和扩增永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及(4)通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为ipro-NK或iNK，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15以及可选的一种或多种选自下述的因子：VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-iproNK，所述培养基包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL3、IL7、IL15、VEGF和bFGF。在其它实施方式中，该包括将永久HE细胞分化为前-proNK的方法进一步包括通过使前-proNK细胞接触培养基将前-proNK分化为pro-iNK或iNK，所述培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子且该培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，用于获得NK祖细胞的培养平台包括通过使pro-NK细胞接触一种或多种用于刺激NK生长、发育和成熟的人工抗原来得到NK细胞，其中人工抗原以微珠缀合、质膜颗粒和/或抗原呈递细胞的形式引入。在一个实施方式中，上述方法进一步包括通过使多能细胞接触培养基接种和扩增初始多能细胞，所述培养基包含MEKi、GSKi和ROCKi。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使接种的iPSC，中胚层和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632或thiazovivin。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。
在从多能干细胞来源的中胚层产生多能干细胞来源的NK祖细胞(ipro-NK)或NK细胞(iNK)的方法的一个实施方式中，该方法包括(1)通过使中胚层接触培养基来分化中胚层，所述培养基包含BMP激活剂，Wnt途径激活剂和bFGF以获得具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞；(2)通过使细胞接触培养基来分化具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，以获得永久HE细胞；以及(3)通过使HE细胞接触培养基来分化永久HE细胞，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15以及可选的一种或多种选自下述的因子：VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂，以获得ipro-NK或iNK。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-proNK，所述培养基包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL3、IL7、IL15、VEGF和bFGF。在其它实施方式中，该包括将永久HE细胞分化为前-proNK的方法进一步包括通过使前-proNK细胞接触培养基将前-proNK分化为ipro-NK或iNK，所述培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子且该培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，用于获得NK祖细胞的培养平台包括通过使pro-NK细胞接触一种或多种用于刺激NK生长、发育和成熟的人工抗原来得到NK细胞，其中人工抗原以微珠缀合、质膜颗粒和/或抗原呈递细胞的形式引入。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使中胚层和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632或thiazovivin。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。
在从具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞产生多能干细胞来源的NK祖细胞(ipro-NK)或NK细胞(iNK)的方法的一个实施方式中，该方法包括：(1)通过使具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞接触培养基来分化和扩增永久HE细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及(2)通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为ipro-NK或iNK，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15以及可选的一种或多种选自下述的因子：VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括通过使HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为前-ipro-NK，所述培养基包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL3、IL7、IL15、VEGF和bFGF。在其它实施方式中，该包括将永久HE细胞分化为前-pro-NK的方法进一步包括通过使前-proNK细胞接触培养基将前-proNK分化为ipro-NK或iNK，所述培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子且该培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，用于获得NK祖细胞的培养平台包括通过使pro-NK细胞接触一种或多种用于刺激NK生长、发育和成熟的人工抗原来得到NK细胞，其中人工抗原以微珠缀合、质膜颗粒和/或抗原呈递细胞的形式引入。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使接种的多能干细胞，中胚层和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632或thiazovivin。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。
在从多能干细胞来源的HE细胞产生多能干细胞来源的NK祖细胞(ipro-NK)或NK细胞(iNK)的方法的一个实施方式中，该方法包括通过使永久HE细胞接触培养基将永久HE细胞分化为ipro-NK或iNK，所述培养基包含一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15以及可选的一种或多种选自下述的因子：VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一些实施方式中，上述方法进一步包括将永久HE细胞分化为前-iproNK通过使HE细胞接触培养基，所述培养基包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自下述的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL3、IL7、IL15、VEGF和bFGF。在其它实施方式中，该包括将永久HE细胞分化为前-ipro-NK的方法进一步包括通过使前-proNK细胞接触培养基将前-proNK分化为ipro-NK或iNK，所述培养基包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子且该培养基不含或基本上不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施方式中，用于获得NK祖细胞的培养平台包括通过使ipro-NK细胞接触一种或多种用于刺激NK生长、发育和成熟的人工抗原来得到NK细胞，其中人工抗原以微珠缀合、质膜颗粒和/或抗原呈递细胞的形式引入。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使接种的多能干细胞，中胚层和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于约2％至约10％的低氧张力下。在一些实施方式中，从上述方法获得的iHE细胞表达CD34。在一些实施方式中，上述方法进一步包括使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4分选获得的iHE细胞。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。在一些实施方式中，上述方法中的BMP激活剂是BMP4。在一些实施方式中，Wnt途径激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y27632或thiazovivin。在一些实施方式中，上述方法中的培养基不含或基本上不含TGFβ受体抑制剂。
在上述教导下，本文考虑的培养平台提供的优点之一是培养、传代和解离单个多能细胞而没有用于多能干细胞分化的EB形成的增强的活力和存活率。在一些实施方式中，多能干细胞是iPSC。在一些实施例中，iPSC是初始iPSC。将细胞解离成单细胞，例如成为单细胞悬浮液，可以通过酶或机械方式完成。本领域已知的允许将细胞解离成单细胞的任何酶剂可用于本发明的方法中。在一个实施方式中，解离剂选自胰蛋白酶/EDTA、TrypLE-Select、胶原酶IV和分散酶。根据本文所考虑的方法，螯合剂如EDTA、Accutase或AccuMax也可单独使用或与酶剂组合用于解离细胞。解离剂可以溶解在不含钙和镁的PBS中以促进解离成单细胞。为了增强解离过程中和解离后细胞的存活，在一些实施方式中，加入存活促进物质，例如一种或多种生长因子、参与细胞死亡和细胞凋亡的细胞途径抑制剂或条件培养基。在一个实施方式中，存活促进物质是ROCK抑制剂，包括但不限于thiazovivin。
细胞培养和培养基收集技术概述于Hu等，Curr.Opin.Biotechnol.8:148，1997；K.Kitano，Biotechnology 17:73，1991；Curr.Opin.Biotechnol.2:375，1991；Birch等，Bioprocess Technol.19:251，1990；“Teratocarcinomas and embryonic stem cells:Apractical approach”(E.J.Robertson编，IRL Press Ltd.1987)；“Guide to Techniquesin Mouse Development”(P.M.Wasserman等编，Academic Press 1993)；“Embryonic StemCell Differentiation in vitro”(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225:900，1993)；“Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application toHuman Biology and Gene Therapy”(P.D.Rathjen等，al.，1993)。干细胞分化概述于Robertson，Meth.Cell Biol.75:173，1997；和Pedersen，Reprod.Fertil.Dev.10:31，1998。
在本发明中，在方法的各个阶段提供用于富集具有特定表征的细胞群的策略。在一个实施方式中，从细胞群富集多能干细胞的方法包括通过解离群体中的细胞并重新悬浮细胞来制备单细胞悬液。解离的细胞可以重新悬浮在用于维持细胞或进行细胞分选的任何合适的溶液或培养基中。在具体实施方式中，多能单细胞悬浮液含有GSK3抑制剂、MEK抑制剂和Rock抑制剂，并且缺少TFGβ抑制剂。在某些实施方式中，GSK3抑制剂是CHIR99021，MEK抑制剂是PD0325901和/或Rock抑制剂是thiazovivin。
在特定实施方式中，将细胞群分选为阳性选择多能细胞，和/或使群中去除非重编程或非多能细胞，从而获得富含多能细胞的细胞群体。在一个实施方式中，制备单细胞悬浮液，然后制备单细胞用于分选，例如通过使用例如适当的抗体对多能性的标记进行染色。可以通过任何合适的分选细胞的方法，例如通过磁珠或流式细胞术(FACS)分选来分选细胞。
可以基于一种或多种多能性标志物或指示细胞分化的标志物来分选细胞，包括但不限于，SSEA3/4、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、KLF4、SSEA1(小鼠)、CD30、SSEA5、CD90和/或CD50的表达。在多个实施方式中，基于至少一个、至少两个、至少三个或至少四个多能性或分化标志物来分选细胞。在某些实施方式中，基于SSEA4的表达来分选细胞，在某些具体实施方式中基于SSEA4组合TRA1-81和/或TRA1-60的表达。在某些实施方式中，基于SSEA4、TRA1-81或TRA1-60和/或CD30的表达分选细胞。在一个实施方式中，基于SSEA4、TRA1-81和CD30分选细胞。在另一实施方式中，基于SSEA4、TRA1-60和CD30分选细胞。在某些实施方式中，细胞分选使用一种或多种分化表面标志物，包括但不限于CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46和CD7和多能标志物例如SSEA4，TRA1-81和/或CD30。
在一些实施方式中，进行重编程的细胞群或多能细胞群被去除了分化细胞。在一个实施方式中，可以去除诱导重编程的多能细胞或细胞群中具有分化细胞的一个或多个细胞表面标志物的细胞。分化细胞的细胞表面标志物的说明性实例包括但不限于CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46和CD7。在具体实施方式中，CD13被用作分化细胞的表面标记。
在其它实施方式中，诱导细胞群分化为期望的谱系，并且去除多能细胞以获得富集的分化细胞或分化细胞群体。在一些实施方式中，分化细胞群体包含已被诱导分化成特定谱系的细胞群，例如ESCs或iPSC。在一些实施方式中，可以使用上述阴性细胞分选技术(“淘选”)在细胞群中去除多能细胞，例如根据基于多能性标记的磁珠或FAC分选群体中的细胞。在一些实施方式中，使用多能性标志物通过FAC对包含分化细胞的细胞群进行分选，并且获得去除表达多能性标志物的细胞级分。在其它实施方式中，基于分化标志物，例如谱系特异性标志物(包括但不限于CD13，CD26，CD34，CD45，CD31，CD46和CD7)，通过FAC对细胞群进行分选，以获得去除多能性标志物的级分。在本发明的一些具体实施方式中，CD13被用作分化细胞的表面标志物。
D.由本文提供的方法和平台产生的细胞群和细胞系
在一些实施方式中，重编程后培养的细胞被诱导分化至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20、22、24、26、28、30、32、35、40、42或45天，或期间的任何天数。在一些实施方式中，重编程后培养的细胞被诱导约1-42天、2-40天、2-35天、2-20天、2-10天、4-30天、约4-24天、约6-22天或约8-约12天。在一些实施方式中，细胞是多能干细胞，包括iPSC。在一些实施方式中，iPSC是初始iPSC。在一个实施方式中，富集提供了一种用于在相对短的时间获得克隆多能干细胞来源的分化细胞集落的方法，从而在各阶段改进产生多能干细胞来源的分化的细胞的效率。在一个实施方式中，富集提供了一种用于得到表达CD34的HE细胞、表达CD34的HSC细胞、T或NK祖细胞和T或NK细胞的方法，从而改进产生每个细胞群的效率。富集可以包括分选细胞群，以鉴定和获得表达能指示分化阶段/细胞类型的特异性特征标志物的细胞。在一些实施方式中，分选使用CD34、CD43、CD73和/或CXCR4。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性和CD43阴性。在一些实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性和CD73阴性。在一些其他实施方式中，分选使用CD34阳性、CD43阴性、CD73阴性和CXCR4阴性。附加的富集方法包括去除表达代表不期望的细胞类型的标志物的细胞，以获得富集的期望细胞类型的群。
从而，本发明的一个方面提供了包含一种或多种下述细胞群、细胞系或克隆细胞的组合物：(i)多能干细胞来源的CD34+HE细胞(iCD34)，其中iCD34细胞能够分化为专能祖细胞且其中iCD34细胞是CD34+CD43-；(ii)多能干细胞来源的永久造血内皮(iHE)，其中iHE细胞系或克隆细胞是CD34+；(iii)多能干细胞来源的永久HSC(iHSC)，其中iHSC是CD34+CD45+并适于长期移植；(iv)多能干细胞来源的专能祖细胞(iMPP)，其中iMPP细胞是CD34+CD45+；(v)多能干细胞来源的T祖细胞(iproT)，其中T祖细胞是CD34+CD7+；(vi)多能干细胞来源的T细胞(iTC)，其中T细胞是CD4+或CD8+；(vii)多能干细胞来源的NK祖细胞(iproNK)，其中NK祖细胞是CD56+CD3-；以及(viii)多能干细胞来源的NK细胞(iNK)，其中NK细胞是CD56+CD57+CD16+。在一些实施方式中，上述组合物、细胞群、细胞系或克隆细胞适于低温保存。在一些实施方式中，组合物、细胞群、细胞系或克隆细胞适于室温保存条件下保存多于12小时、24小时、36小时、48小时，但不长于3天、4天、5天、6天或一周。
本发明的另一方面提供了一种混合物，包含一种或多种多能干细胞来源的(i)CD34+HE细胞(iCD34)，以及一种或多种选自下述的培养基：iMPP-A，iTC-A1，iTC-A2，iTC-B1，iTC-B2，iNK-A1，iNK-A2，iNK-B1和iNK-B2；(ii)永久造血内皮(iHE)，以及一种或多种选自下述的培养基：iMPP-A，iTC-A1，iTC-A2，iTC-B1，iTC-B2，iNK-A1，iNK-A2，iNK-B1和iNK-B2；(iii)永久HSC，以及一种或多种选自下述的培养基：iMPP-A，iTC-A1，iTC-A2，iTC-B1，iTC-B2，iNK-A1，iNK-A2，iNK-B1和iNK-B2；(iv)专能祖细胞(iMPP)和iMPP-A；(v)T祖细胞(iproT)，以及一种或多种选自下述的培养基：iTC-A1，iTC-A2，iTC-B1和iTC-B2；(vi)T细胞(iTC)和iTC-B1或iTC-B2；(vii)NK祖细胞(iproNK)，以及一种或多种选自下述的培养基：iNK-A1，iNK-A2，iNK-B1和iNK-B2；和/或(viii)NK细胞(iNK)和iNK-B1或iNK-B2；(ix)HSC(iHSC)和iHSC-A，iHSC-B和iHSC-C；其中
a.iHSC-A包含Wnt途径激活剂和BMP激活剂；
b.iHSC-B包含Wnt途径激活剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂；
c.iHSC-C包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子。在一些实施方式中，该组合物不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂；
d.iTC-A1包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种选自Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4的Notch途径激活剂；在一些实施方式中，该组合物不含VEGF和/或IL15；
e.iTC-B1包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3和IL6的生长因子和细胞因子，以及一种或多种选自Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3和DLL-4的Notch途径激活剂；(iHSC平台)；在一些实施方式中，该组合物不含BMP激活剂；
f.iNK-A1包含BMP激活剂，一种或多种选自SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；
g.iNK-B1包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6和IL15的生长因子和细胞因子；
h.iCD34-C包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及不含TGFβ受体/ALK抑制剂；
i.iMPP-A包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；
j.iTC-A2包含ROCK抑制剂；以及一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子；
k.iTC-B2包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子；其中该组合物不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；
l.iNK-A2包含BMP激活剂、ROCK抑制剂、VEGF和bFGF，以及一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7、IL15的生长因子和细胞因子；以及
m.iNK-B2包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7和IL15的生长因子和细胞因子。
实施例
下述实施例以说明方式而非限定方式提供。
实施例1-hiPSC产生和维持
在存在含有ROCK、MEK、GSK3途径和TGFβ受体抑制剂的重编程培养基(Valamehr等，Sci Rep.2002；2：213)中，使用包括OCT4/SOX2/LargeT、OCT4/SOX2或OCT4/SOX2/NANOG/LargeT在内的各种因子组合诱导包括成纤维细胞和血细胞在内的体细胞向多能状态重新编程。诱导后14天，将重编程群转至含有ROCK、GSK3和MEK途径抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)的维持培养基(Valamehr等，Stem Cell Reports，2014，2(3)：366-381)。将细胞无限期地保留在维持介质中。
诱导后约三周，将重编程群分选到96孔板的各个孔中。选择克隆进行表征，选择代表初始hiPSC的完全重编程克隆进行分化研究(Valamehr等，Stem Cell Reports 2014，2(3)：366-381)。为了确定维持期间和分化后的未分化细胞百分比，进行流式细胞分析，以分析SSEA4、TRA181和CD30的共表面表达。
实施例2-使用iHSC培养平台的造血分化
为了启动向造血细胞谱系的分化，将初始hiPSC作为单层接种在维持培养基中并允许扩张直到达到约25％的融合。此时，通过将培养基切换为iHSC-A(参见图1)开始造血分化。如图1所示，培养物随后在分化开始后48小时切换为iHSC-B，随后在分化开始后的第4-5天切换为iHSC-C。附着的培养物在培养基变化期间保持贴壁并且不受干扰。
在分化过程早期，通过谱系标志物CD57、NESTIN、SOX17和BRACHYURY监测直接分化。图3示出了朝向中胚层谱系并远离外胚层谱系的直接分化改变。通过随后的分化阶段，将hiPSC形态给予由圆形细胞组成的分化群体，其是与造血细胞簇(图4A)相似的形态，缺失了hiPSC相关表面标志物(图4B)，并出现了如Brachyury、CD34、CXCR4和CD45的表面标记(图4C和4D)。在第9天(这个时间点可以延长，最优至第14天)，将细胞解离成单细胞并分析CD34和CD45的表面表达(图5A-5C)。单细胞解离通常由Accutase辅助并通过40μm筛网过滤以收集单细胞。使用FACS Aria或MACS富集，收集CD34阳性或CD34和CD45阳性细胞进行进一步的处理和测试。
实施例3-使用iHSC培养平台分化后的体外表征和试验
为了确定分化的永久造血干细胞的可扩展性和维持性，将CD34分选或富集的群体转移至悬浮培养，并补充Stemspan造血干细胞培养基(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)、1x CC110补充物(StemCell Technologies)、10ng/mL bFGF和5μMThiazovivin或10μM 27632ROCK抑制剂(用于培养的最初几天以提高存活)。每隔一天给培养物加入新鲜培养基，并用移液器吸取以破坏由***的CD34阳性分选细胞产生的聚集体。在培养数周后，通过表面标志物表达和活细胞数量来评估和成规模的悬浮培养物。如图8所示，CD34分选群体在培养物中保持22天，CD34群体的损失最小。为了提高悬浮培养的活力，加入了ROCK途径的小分子抑制剂。图7说明在存在ROCK抑制的情况下单细胞解离传代后细胞的存活和增殖。图6A-6C示出了应用于单层和EB培养物的图1中描述的分化方法的改进，并且与EB介导的分化相比，较高百分比的CD34细胞显示以单层形式存在。
实施例4-使用iHSC培养平台分化后的体内重建
为了显示得到的永久造血干细胞的体内功能性和移植潜能，使用FACS Aria分选或使用MACS微珠富集了来自上述hiPSC分化过程的CD34阳性细胞。通过台盼蓝染色确定活性对收集的细胞进行计数。将大约30,000活性CD34阳性细胞重悬于HBSS并通过眶后注射引入NSG小鼠。移植研究前将NSG小鼠以300rad半致死辐射24小时。此外，未分选的分化的群(多达250,000)以及人外周血也被引入NSG小鼠作为对照。每两周对小鼠放血并使用人特异性标志物包括CD45、CD11b、CD19和CD3评价人血贡献(blood contribution)。图9A显示了移植的CD34阳性细胞的12周重建，如专一表达人CD45标志物的细胞的存在所示。该数据还显示了移植细胞产生骨髓和淋巴群的多谱系能力。图9B显示了在T和B细胞存在下CD34+细胞的18周重建。
实施例5-使用iHSC培养平台分化后的小分子调节
为了评价hiPSC来源的CD34阳性永久造血干细胞应答药理学调节的能力，用已知调节剂处理CD34分选或富集的细胞。在37℃下孵育过夜后，用流式细胞术评价了CD34阳性细胞的药理学应答，包括表面PDL1表达的上调。与载体对照相比，显著更多的处理的CD34细胞显示了PDL1表面蛋白的上调以及在总的群体中增加的表达(见图11)，其是使用所公开的方法从初始hiPSC获得的CD34阳性细胞的免疫调节潜能的指标。
实施例6-使用iHSC培养平台进行分化后特定造血谱系的继续分化
分选或富集的CD34阳性细胞沿着造血谱系进一步分化为各种特定细胞类型，包括T细胞和NK细胞。具体到T细胞，富集后，将CD34阳性细胞转移到不含饲养细胞的悬浮培养或含有OP9基质细胞或基质胶包覆表面的贴壁培养。无论环境(setting)如何，对培养物补充含有可溶性DLL1和DLL4的iTC-A1(图1)。大约10天后，将培养环境置换为iTC-B1以完成T细胞成熟。大约30-40天(原始诱导分化后)，评估T细胞的组成，包括CD3，CD7，TCRαβ，CD4和CD8的表面表达。图10示出了得到的CD34阳性细胞产生通过来自CD7群体的CD4和CD8的表达所定义的不同T细胞群体的体外分化能力。
具体到NK细胞，CD34阳性细胞用包括IL15、iNK-A1培养基的分化培养基处理大约10天(图2)，并切换到iNK-B1培养基(图2)另外的10-20天(参见图10中的CD56阳性群)。培养以悬浮形式进行。
本文描述的多阶段分化平台示出了使用顺序分化方法从多种干、祖细胞或转分化细胞(包括多能干细胞)中得到永久造血干细胞的过程。得到的CD34阳性造血干细胞可以保留在悬浮培养物中用于扩增(scaling)，并产生多系造血细胞类型，包括造血干细胞，T细胞和NK细胞。此外，得到的CD34阳性永久造血干细胞显示通过上调免疫调节表面蛋白PDL1来响应药理学调节(图11)。此外，当植入时，得到的CD34阳性细胞能够在体内重建包括骨髓和淋巴群体(图9)。来自各种群体(包括多能干细胞)的永久造血干细胞是患者特异性治疗和再生医学应用的理想候选者。
实施例7–使用iCD34培养平台的造血分化和具有移植潜能的HE群体的鉴定
对上述iHSC平台进一步优化用于造血谱系细胞分化。为了启动向造血谱系的分化，将hiPSC作为单层在第0天(D0)在维持培养基中接种，并使其贴壁并扩增约24小时。此时，除去维持培养基，并在D1替换为不含维持因子的基础培养基。通过将培养基切换到iCD34-A(参见图12)，在D2左右开始造血分化。如图12所示，在D3对培养基补充生长因子bFGF，并随后转换到iCD34-B培养基进行分化。将单层维持直到D5-D6左右，此时其被解离成单细胞，并在iCD34-C培养基中以低密度单层接种直到在D10左右分化。从D2左右的开始造血分化直至分化的D10左右维持低氧张力(2-10％O2)。
在培养过程中，通过将单层解离成单细胞并分析CD34和任选的CD43，CD45，CXCR4和CD73等表面标志物的表达来监测向造血谱系的直接分化(图15A)。在分化的约D8，通过细胞表面表达特征CD34+观察到代表HE的细胞群的出现。在CD34+细胞中也观察到CD43-CXCR4-CD73-。CD34+群体保持直到D10左右(图15A)。在D10(可将时间点缩短至约D9或延长至约D12)，将细胞解离成单细胞，并使用BD FACS Aria通过FACS分选CD34+HE群体用于进一步分析和功能评估。作为造血输出能力的一个例子，对于单个iPSC的每个输入产生463个总CD34+细胞(图15A)和41个CD34+CD43-CXCR4-CD73-细胞(图15A)，至少2.5％向永久HE细胞的转化率。
为了显示hiPSC来源的iHE的移植潜能，如上所述，在iMPP试验中分选和培养第10天的CD34+细胞7天。在总共培养17天后(iCD34 10天，加iMPP 7天)，通过眶后注射将约40万个细胞注入NSG。将200,000脐带血CD34+细胞注射到单独的小鼠中作为对照。图33显示了通过在小鼠的外周血中表达人CD45标记的细胞的存在所示的移植的CD34阳性细胞的5周重建。
实施例8–通过小分子、细胞因子和铺板密度调节优化HE生成
为了优化约10天的分化后来自hiPSC的HE的有效产生，检查了几个参数。通过在matrigelTM涂覆的6孔培养皿上将hiPSC的量从7.5x104/孔铺增加至1.5x105/孔来评估分化的D0时单层的最佳铺板密度，然后在约D10分析CD34+HE群的产生。图16A显示增加细胞铺板密度增加了CD34+细胞的总百分比，但降低了CXCR4-CD73-HE亚群。尽管有这种减少，但是在单层分化10天后，hiPSC向HE的最高转化率是在1.5×10 5/孔下测试的最高铺板密度(图15C)。
从分化的约D2至约D6通过用浓度从0ng/ml至30ng/ml的增加的BMP4浓度处理培养物来评估在造血分化初期阶段BMP4调节浓度对HE产生的影响。通过检测CD34+HE群体评估D10中HE的产生。图16B显示，从D2增加到D6的BMP4浓度增加使D10的HE群体低于阈值BMP4浓度，表明最佳浓度为约3ng/mL。
Wnt途径激活剂CHIR99021负责诱导hiPSC的永久造血程序。在约D3.75至约D6通过用浓度增加的CHIR处理培养物评估了在造血分化方案的诱导期期间CHIR调节的作用。图16C显示，在增加CHIR99021的浓度时，增加CD34+细胞的总百分比，其降低HE亚群的百分比，最佳CHIR99021浓度约为1μM。
在直接分化方案的D6，单层培养物解离成单细胞，并作为单层进行再铺板以进一步分化为HE。如图16D所示，D6时的铺板密度显示影响HE的产生，其中从1.5x105至7.4x104的细胞浓度降低增加了HE群体的百分比。
之前用于直接分化的方案要求在产生HE期间添加IGF1和EPO细胞因子。图16E示出了IGF1和EPO的添加降低了在D10左右观察到的HE的百分比，并且去除这些因子导致分化方法的改善。
实施例9–通过Notch依赖性造血和MPP分化测定HE的造血潜能
为了证明hiPSC来源的永久群体的造血潜能，使用FACS分选HE细胞，并评估其经历内皮细胞向造血细胞的转换以产生CD45+造血祖细胞的能力，如图12中的专能祖细胞试验(iMPP)中所述。将约30,000个CD34+HE细胞在悬浮液中作为聚集体在iMPP-A培养基中过夜培养，然后以单层铺板，并进一步培养6-8天。图17A示出了出现圆形造血细胞的单层培养物中的表型改变，流式细胞术染色鉴定了6-8天培养期间CD45+的存在。
为了评估在直接分化方案的D10产生的HE群体是否代表永久HE，在7-9天的iMPP试验期间，用Notch途径抑制剂γ分泌酶抑制剂(γSI)处理CD34+HE分选的细胞。每2天将新鲜的γSI加入到iMPP-A培养基中。大约8天后，通过流式细胞术评估单层培养物中出现的CD45+造血细胞。与载体对照相比，在经γSI处理的培养物中观察到显著较少的CD45+细胞，显示依赖于Notch信号途径和存在永久HE(图17B)。
实施例10–通过操作氧条件优化HE和iMPP生成
为了评估氧环境是否影响永久HE和iMPP造血祖细胞的产生，如图12所示，在正常氧(21％O2)或缺氧(5％O2)条件下分化hiPSC。在分化的D10附近，通过流式细胞术计数并评估单层中存在的CD34+HE群体。如图18A所示，在缺氧条件下分化导致产生的CD34+HE量的增加。为了证实在缺氧条件下产生的HE保留产生CD45+造血祖细胞的潜能，通过FACS从正常氧和缺氧分化条件分离CD34+细胞，并通过iMPP试验进行评估。在两种条件下生成的HE具有相当的iMPP潜能，表明在缺氧条件下的造血分化增加了永久HE的输出(图18B)。
实施例11–第8天分化培养物和HE的冷冻保存
在直接分化方案的约10天，将全部培养物解离以评估其在补充有10％DMSO的第8天培养基中在冷冻保存后维持造血潜能的能力。将解冻的细胞重新悬浮，然后在流式分析之前，如图12所述在iMPP-A培养基中继续培养7天。如图19A所示，冷冻保存的D10细胞在冷冻/融化过程中存活，并且具有与通过CD45+细胞存在可见的未冷冻对照相当的造血潜能。
评估分选的CD34+细胞在冷冻保存后维持造血潜能的能力。分离在缺氧条件下产生的D10 iCD34，并如图12所述直接铺在iMPP试验中或在iMPP-A培养基中冷冻保存7天，然后解冻并铺板于iMPP试验中。如图19B所示，冷冻保存的HE在冷冻/融化过程中存活，并且能够保持由CD45+细胞存在所观察到的造血潜能，尽管与未冷冻的对照相比效率降低(图19B顶部图)。冷冻保存的iCD34还以更高密度(200,000个细胞/孔)铺板，这似乎增加CD45+细胞的产量(图19D)。
实施例12–过夜装运后第8天分化培养物的恢复
将来自6孔板的第6天分化培养物以200,000个细胞/***接种密度传代到T25培养瓶中，然后在第8天用培养基完全填充，并在聚苯乙烯泡沫箱中保存过夜以评估直接运送新鲜细胞而不需要冷冻保存的可行性。最初保存在37℃水浴中的冷包装也加入到泡沫塑料盒中，以便尽可能长地保持37℃的温度。在37℃培养箱中的对照烧瓶旁边测试两种培养基组合物：在第8天步骤(图12)中使用的浓度为30％的细胞因子和成形素的烧瓶以及浓度为100％的烧瓶。在第9天，将烧瓶从盒中取出，用10mL第8天培养基替换培养基，并将新瓶盖放置在烧瓶上，并在第10天处理进行流式分析之前恢复以获得CD34+HE群体的存在。如图20所示，HE的总体输出在所有条件之间是可比较的，表明新鲜过夜运送第8天培养物作为输送HE细胞的有效手段的可行性。
实施例13-使用表达DLL4的基质细胞进行HE向成熟T和NK淋巴谱系的继续分化
分选的CD34+HE细胞进一步分化为T和NK淋巴谱系。具体到T细胞，在分选后，在含有BMP4，SCF，Flt3L和IL7的iTC-A无血清分化培养基中的低附着组织培养板上将HE细胞作为聚集体培养16小时(图13)。16小时后，将聚集的细胞转移到含有表达DLL4的基质细胞的贴壁iTC-B分化培养基中，所述iTC-B分化培养基含有SCF，Flt3L和IL7。5天后，维持iTC-B培养基完成T细胞分化。在培养约10天后(HE分离后)，通过细胞表面标志物CD34和CD7的共表达评估培养物产生的T祖细胞。在进一步分化约15-20天后，这些CD34+CD7+ T祖细胞产生不同的成熟T细胞群，如CD4和CD8的表达所示。图21描绘了通过分析共培养物中产生的CD45+CD56-群体，第10天HE群体的体外分化能力引起早期T细胞祖细胞和成熟T细胞亚群。图26描绘了通过分析大约30天培养后(HE分离后)在共培养物中产生的CD45+CD56-群体，得到的第10天HE群体产生成熟T细胞亚群的体外分化能力。
具体到NK细胞，在分选时，将HE细胞作为聚集体在含有BMP4，SCF，IL3，IL15，Flt3L和IL7的iNK-A无血清分化培养基中的低附着组织培养板上培养16小时(图14)。16小时后，将聚集细胞转移至含有SCF，IL3，IL15，Flt3L和IL7的iNK-B分化培养基中的含有表达DLL4的基质细胞的贴壁培养物。5天后，维持iNK-B培养基以完成NK细胞分化。大约10-15天的培养后(HE分离后)，评估培养物产生的NK祖细胞，然后是另外的10-15天培养后成熟的NK亚群。CD56和CD161(NKR-P1A)是在早期NK细胞发育中表达的第一个细胞表面标志物，随后在后期成熟的NK细胞亚群上表达CD16，KIR，CD8和NKG2D(CD314)。图22描绘了通过分析共培养物中产生的CD45+群体得到的第10天HE群体产生早期NK细胞祖细胞和成熟NK细胞亚群的体外分化能力。增强NK祖细胞成熟的另一种方法是在悬浮培养物中与饲养细胞共同培养。将第20天的iNK细胞从DLL4基质细胞培养物转移到含有SCF，IL15，FLT3L和IL7的iNK-B培养基中的基于饲养的悬浮培养物中培养另外12天。图27描述了通过分析在基质和基于饲养的共培养物中产生的CD45+群体与外周血来源物相比，第10天HE群体使用饲养悬液培养物产生成熟NK细胞亚群的体外分化能力。将HiPSC来源的CD34+细胞向NK细胞谱系分化20天，然后置于悬浮培养物中进一步成熟。成熟的NK谱系标志物鉴定如CD56，CD122，NKp30，CD94，CD16，NKG2D和KIR所定义的成熟NK细胞的存在。
实施例14-单层hiPSC造血分化平台允许高度规模化的扩增策略
将hiPSC作为单层接种，并在限定的无血清和无饲养培养中向造血细胞分化，如图12-14所述，并与在造血分化开始之前在聚集体中形成拟胚体的hiPSC进行比较(Kennedy等人，Cell Reports 2012：1722-1735)。两个培养环境均使用100,000个hiPSC作为初始起始数。在造血分化过程中，常规进行细胞计数和表型评估，以显示每个***的扩增潜能。如图23所示，在分化的第6天，在单层培养物中检测到显著数量的CD34阳性细胞——超过2百万个CD34+细胞，而EB形式检测不到CD34阳性细胞。在分化的第8天，单层形式产生了大约240万个细胞，而在EB形式中，尽管使用大致相同数量的iPSC作为起始材料，但仅检测到约100,000个CD34阳性细胞，差异约为24倍。此外，作为评估时间，单层形式仅产生CD34+CD43-细胞，表明为永久造血，EB形式产生多数CD34+CD43+细胞，表明为原始造血(Kennedy等，2012)。图24进一步说明了本文公开的用于生产成品iNK和iT细胞的单层hiPSC造血分化平台的规模化扩增。本文提供的多能细胞克隆扩增平台确保了例如从单个多能细胞克隆至约100万小瓶的治疗剂量的成品规模化，其每个都具有不少于106个具备治疗功能的NK或T细胞。所公开的克隆扩增进一步提供广泛的均质性，从而确保产品一致性，质量控制和质量保证。在一些实施方式中，单多能细胞克隆被遗传工程化。
实施例15–iCD34+细胞的免疫调节性质
为了确定hiPSC来源的CD34阳性细胞(iCD34)的免疫调节能力，将CD34分选的细胞与活化的外周血来源的表达CD3的T细胞在iMPP-A培养基中共培养。在37℃下孵育5天后，将共培养物与计数珠混合，并通过流式细胞试验来确定每个样品中的绝对细胞数。图25描述了通过与仅含有CD3+ T细胞的培养物比较观察到的hiPSC来源的CD34+细胞的免疫调节潜能，与hiPSC来源的CD34+细胞共培养的CD3+ T细胞具有降低的细胞存活，而培养物中CD34+细胞的总量不受影响。
实施例16-通过细胞因子释放和脱粒表征细胞因子诱导的激活来测定iNK细胞功能
为了显示hiPSC来源的成熟iNK细胞的功能，将第20天(HE分离后)的iNK细胞转移到含有SCF、IL15、IL7和Flt3L的iNK-B培养基中基于饲养的悬浮培养另外10天。经10天的额外培养后，用IL12和IL18刺激iNK细胞来诱导iNK细胞活化。iCD34来源的iNK以与外周血NK细胞相似的方式响应细胞因子刺激和分泌的促炎细胞因子。图28显示了与使用相同的基质和饲养悬液共培养物产生的脐带血来源的NK细胞和外周血来源的NK细胞相比，CD107A(代表脱粒的细胞表面标记)的表达和基于CD45+CD56+设门方法的干扰素γ胞内染色所显示的iNK细胞的活化。
实施例17-用于产生T和NK细胞的无基质分化培养物的建立
上述T和NK淋巴分化平台被进一步优化以用于使用无基质分化平台产生脐带血来源的和hiPSC来源的iT和iNK祖细胞。
具体到NK细胞，将富集的脐带血CD34+细胞接种在含有DLL4蛋白或对照蛋白的培养板上含有SCF、Flt3L、IL3、IL15和IL7的iNK-A无血清分化培养基中。5天后，维持iNK-B培养基以完成NK细胞分化。培养约10-15天后，评估培养物产生的NK祖细胞和不存在骨髓细胞。CD56、CD7和CD161是在NK细胞发育过程中表达的第一细胞表面标志物。CD11b和CD14是在骨髓细胞亚群上表达的细胞表面标志物。图29描述了脐带血CD34+细胞向NK细胞的无基质分化。结果显示，与基于基质的培养和无基质对照培养相比，板结合的DLL4支持CD56+CD7+CD161+NK细胞祖细胞的更快速和有效的分化，并且脐带血CD34+细胞具有在表达DLL4的无基质的分化平台中以与常规基于基质的分化平台中使用CD45+设门方法的类似的方式(在表型方面)产生早期NK祖细胞(pro-NK)的体外分化能力。早期NK谱系标志物鉴定由CD56、CD7和CD161定义的proNK细胞的存在以及髓系标志物CD11b和CD14的缺失。
为了显示hiPSC来源的HE细胞在无基质分化平台中产生iNK祖细胞的能力，将第10天的CD34+iHE分选的细胞在含有DLL4蛋白或对照蛋白的培养物中的iNK-A2培养基中培养。然后将hiPSC来源的CD34+细胞向NK细胞谱系分化20天，然后置于悬浮培养中进一步成熟。图30示出了hiPSC来源的iHE产生iNK祖细胞的能力，如使用CD45+设门方法的CD56，CD161和CD94的表达所示。板结合的DLL4支持CD56+CD7+CD161+NK祖细胞分化而不是CD11b+骨髓细胞的分化。5天后，维持iNK-B2培养基完成NK细胞分化。在基于饲养的悬浮培养物中hiPSC来源的iNK细胞的成熟导致使用CD45+设门方法的表型类似于外周血NK细胞的成熟NK细胞。成熟的NK谱系标志物鉴定如CD56、CD122、NKp30、CD94、CD16、NKG2D和KIR所定义的成熟NK细胞的存在。
具体到T细胞，来自脐带血的富集的CD34+细胞在含有DLL4蛋白或对照蛋白的培养物中的iT-A2培养基中接种。5天后，维持iT-B2培养基用于产生T祖细胞(proT)。在培养约10-15天后，通过细胞表面标志物CD34和CD7的共表达来评价培养物产生T祖细胞。图31描绘了使用CD45+设门方法的CD34+脐带血细胞在表达DLL4的无基质分化平台中产生T祖细胞的能力。来自脐带血CD34阳性细胞的proT细胞的无基质分化平台显示出比使用CD45+CD56设门方法的常规基于基质的分化平台更快速。早期T谱系标记鉴定由CD34、CD5和CD7定义的proT细胞的存在。
为了显示hiPSC来源的HE细胞在无基质平台中产生iT细胞的能力，将第10天CD34+iHE分选的细胞在含有DLL4蛋白或对照蛋白的培养物中的iT-A2培养基中培养。图32示出了由CD45和CD7的表达所示的hiPSC来源的iHE产生iT祖细胞的能力。
本领域技术人员将容易地理解，本文描述的方法、组合物和产品是示例性实施方式的代表，并不意图限制本发明的范围。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的本公开内容进行各种替换和修改。
本说明书中提到的所有专利和出版物都指示本公开所属领域的技术人员的水平。通过引用将所有专利和出版物并入本文，其程度如同每个单独的出版物被具体地和单独地指出通过引用并入。
在本文中说明性地描述的本公开内容可以适当地在没有本文未具体公开的任何元素或限制的情况下实践。因此，例如，在本文中，任何术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”可以用其他两个术语中的任何一个来代替。已经使用的术语和表达被用作说明而不是限制的术语，并且不意图使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应认识到在所要求保护的本公开的范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解，虽然本公开已经由优选实施例和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变化，并且将这些修改和变化视为在所附权利要求限定的本发明的范围内。

Claims (13)

1.一种用于引导多能干细胞向造血细胞系分化的方法，包含：
(i)使多能干细胞接触包含BMP途径激活剂以及可选的bFGF的第一组合物，以获得中胚层细胞；
(ii)使中胚层细胞接触包含BMP途径激活剂、bFGF和WNT途径激活剂的第二组合物，以获得具有永久造血内皮(HE)潜能的中胚层细胞；以及
(iii)使具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含bFGF和ROCK抑制剂的第三组合物，以获得永久HE细胞；
其中所述永久HE细胞能够提供造血细胞系，其包括造血干和祖细胞(HSC)；
其中中胚层细胞和具有永久HE潜能得中胚层细胞在步骤(i)和(ii)中获得，而不形成拟胚体；以及
其中所述多能干细胞向造血细胞系的分化不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中该造血细胞系包括造血干和祖细胞(HSC)、造血专能祖细胞(MPP)、前-T祖细胞、前-NK祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞或B细胞。
3.如权利要求1所述的方法，进一步包括：
(i)使多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物，以接种和扩增细胞；或
(ii)使多能干细胞、中胚层细胞和/或具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞处于2％至10％的低氧张力下。
4.如权利要求1所述的方法，进一步包括：
(i)使永久HE细胞接触包含BMP激活剂，以及可选的ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以获得造血专能祖细胞(MPP)；或
(ii)使永久HE细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子；以及可选的ROCK抑制剂的组合物，以获得前-T祖细胞、T祖细胞和/或T细胞；或
(iii)使永久HE细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL7和IL15的生长因子和细胞因子以及可选的一种或多种BMP激活剂、ROCK抑制剂、VEGF和bFGF的组合物，以获得前-NK祖细胞、NK祖细胞和/或NK细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中
(i)多能干细胞向造血细胞系的分化处于无饲养条件下；或
(ii)多能干细胞向造血细胞系的分化处于无基质条件下；或
(iii)多能干细胞包括诱导性多能干细胞(iPSC)，可选地其中iPSC是初始iPSC；或
(iv)WNT途径激活剂是GSK3抑制剂，可选地其中GSK3抑制剂是CHIR99021；或
(v)BMP途径激活剂是BMP4。
6.如权利要求1所述的方法，其中ROCK抑制剂是：(i)Thiazovivin，或(ii)Y-27632。
7.如权利要求1所述的方法，包括：
使多能干细胞来源的前-T祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子的组合物，以获得多能干细胞来源的T祖细胞或T细胞，其中组合物不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；
其中多能干细胞来源的前-T祖细胞通过使永久造血内皮接触包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子的组合物产生，以允许细胞分化和扩增。
8.如权利要求7所述的方法，其中：
(a)所述方法进一步包括
使所述多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物以接种和扩增多能干细胞，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；或
(b)其中产生多能干细胞来源的T细胞系(i)不产生拟胚体；(ii)于单层培养下进行；(iii)于无饲养条件下进行；或(iv)于无基质条件下进行；或
(c)其中多能干细胞是iPSC或初始iPSC。
9.如权利要求1所述的方法，进一步包括：
使多能干细胞来源的前-NK祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子的组合物，以获得多能干细胞来源的NK祖细胞或NK细胞，其中组合物不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；
其中多能干细胞来源的前-NK祖细胞获得自使永久造血内皮接触包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子的组合物，以允许细胞分化和扩增。
10.如权利要求9所述的方法，其中
(a)所述方法进一步包括：(i)使所述多能干细胞、所述中胚层细胞、所述具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞、和/或所述永久造血内皮处于2％至10％的低氧张力下；或(ii)使所述多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物，以接种和扩增细胞，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；或
(b)其中产生多能干细胞来源的NK细胞系(i)不产生拟胚体，(ii)在单层培养下进行；(iii)于无饲养条件下进行；或(iv)于无基质条件下进行；或
(c)其中多能干细胞是iPSC或初始iPSC。
11.如权利要求1所述的方法，进一步包括：
使多能干细胞来源的前-HSC接触包含BMP激活剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以获得多能干细胞来源的专能祖细胞，其中组合物不含ROCK抑制剂；
其中多能干细胞来源的前-HSC获得自使永久造血内皮接触包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以允许细胞分化和扩增。
12.如权利要求11所述的方法，其中
(a)所述方法进一步包括如下一个或两个：(i)使所述多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物，以接种和扩增多能干细胞，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；(ii)使所述多能干细胞、所述中胚层细胞、所述具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞和/或所述永久造血内皮处于2％至10％的低氧张力下；或
(b)其中多能干细胞来源的专能造血谱系祖细胞(i)不产生拟胚体，
(ii)进行单层培养，(iii)处于无饲养条件下，或(iv)处于无基质条件下；或
(c)其中多能干细胞是iPSC或初始iPSC。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中：
(i)所述永久HE细胞包含CD34+永久造血内皮(iCD34 HE)，其中iCD34细胞能够分化为专能祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、T细胞和NK细胞且其中iCD34细胞是CD34+CD43-；
(ii)所述永久HE细胞是CD34+；
(iii)所述HSC是CD34+CD45+；
(iv)专能祖细胞(iMPP)是CD34+CD45+；
(v)T祖细胞是CD34+CD7+；
(vi)T细胞是CD4+或CD8+；
(vii)NK祖细胞是CD56+CD7+CD161+；和
(viii)NK细胞是CD56+CD57+CD16+CD94-。
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