JP2019103521A - 造血細胞分化を誘導するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年1月26日に出願された米国仮出願番号第62/107,517号および2015年11月4日に出願された米国仮出願番号第62/251,016号に基づく優先権を主張しており、これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
本発明は一般に、多能性幹細胞から、全ての造血系の細胞を製造するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、ヒト人工(induced)多能性幹細胞を含む多能性幹細胞から、全ての造血系の細胞を製造するための、改善された培養プラットフォームに関する。
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)技術は、がんを含む、多数の血液悪性腫瘍および非血液悪性腫瘍の処置のための治療において実行可能な造血細胞の、高度に有望であり潜在的に無際限の供給源を代表する。造血細胞治療の同種供給源としての、hiPSCおよび遺伝子操作hiPSC技術の有望性を推し進めるためには、造血幹細胞および前駆細胞(HSC)のみでなく、T細胞、B細胞、NKT細胞、およびNKリンパ系細胞、およびこれらの前駆細胞の多様なサブセットを含む免疫エフェクター集団も、効率的かつ再現可能に発生させることが可能なことが不可欠である。
in vitroにおける、hiPSCの、二次HEへの指向性分化について記載している研究の数は、限定されている。治療を目的とするhiPSCの活用における主要な障害は、多能性を維持し、そして分化を誘導するために、マウス由来の間質細胞またはヒト由来の間質細胞と共に、組成未知の血清含有培地の存在下で、このような細胞をまず同時培養することの要請であった。加えて、既存のプロトコールはまた、外胚葉細胞、中胚葉細胞、および内胚葉細胞を含む多様な分化細胞を含む、異質性の細胞凝集物である胚葉体(EB)を形成するように、iPSCを培養することからなる戦略も採用している。これらの手順は、例えば、クランプを形成するようにスピンするか、細胞をウェル内で沈殿および凝集させるか、または懸濁培養物中の受動的凝集およびクランプ形成を可能とすることにより、多能性細胞を凝集させることを要請する。形成されたEBは、ある特定の持続期間にわたり、分化下に維持し、典型的には、適正な分化を可能とするように、7〜10日間にわたり、培養系を誘導し、次いで、EBを、さらなる成熟のために、接着培養へと移すか、または後続の分化ステップへと進むために、細胞型の選択のため単一細胞へと解離させる(Kennedyら、Cell Reports、2012年、1722〜1735頁;Knorrら、Stem Cells Translational Medicine、2013年、2巻:274〜283頁)。例えば、Kennedyらは、iPSCの分化のためにEBを発生させることについて教示しており、多能性細胞を、コラゲナーゼおよびトリプシンで処理して、小型の凝集物を形成するように、細胞のスクレーピングを可能とし、次いで、これを培養して、EBが形成された。EBの形成は、多能性幹細胞の分化を容易とすることが示されているが、凝集物および後続のEBを形成することの要請は労働集約的なものであり、この工程における細胞数の増大は最小限であり、三次元的EB凝集物中の細胞内容物の、培地因子への曝露は、一貫せず、不均等であり、これにより、分化段階が可変的な、異質性の細胞産物をもたらし、効率的で合理的となるために要請される、製造工程のスケーラビリティーおよび再現性は大きく損なわれる。
本発明は一般に、幹細胞を培養し、造血細胞運命へと分化させるための、細胞培養条件、培地、培養プラットフォーム、および方法に関する。
CD43− CXCR4− CD73−である。
本発明の特定の態様では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
多能性幹細胞の分化を、造血系細胞へと方向付けるための方法であって、(i)前記多能性幹細胞を、BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含む組成物と接触させて、中胚葉細胞を得るステップと;(ii)前記中胚葉細胞を、BMP経路活性化因子と、bFGFと、WNT経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮(HE)のポテンシャルを有する中胚葉細胞を得るステップとを含み、二次造血性内皮(HE)のポテンシャルを有する前記中胚葉細胞が、造血幹細胞および前駆細胞(HSC)、造血複能性前駆細胞(MPP)、プレT細胞の前駆細胞、プレNK細胞の前駆細胞、T細胞の前駆細胞、NK細胞の前駆細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、またはB細胞を含む造血系細胞を提供することが可能であり;中胚葉細胞および二次HEのポテンシャルを有する中胚葉細胞が、ステップ(i)および(ii)において、胚葉体を形成せずに得られる方法。
(項目2)
二次HEのポテンシャルを有する前記中胚葉細胞を、bFGFとROCK阻害剤とを含む組成物と接触させて、二次HE細胞を得るステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記二次HE細胞を、BMP活性化因子と、任意選択で、ROCK阻害剤と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、造血複能性前駆細胞(MPP)を得るステップをさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記二次HE細胞を、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインと;任意選択で、BMP活性化因子、ROCK阻害剤、VEGF、およびbFGFのうちの1または複数とを含む組成物と接触させて、プレT細胞前駆体、T細胞前駆体、および/またはT細胞を得るステップをさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記二次HE細胞を、SCF、Flt3L、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインと、任意選択で、BMP活性化因子、ROCK阻害剤、VEGF、およびbFGFのうちの1または複数とを含む組成物と接触させて、プレNK細胞前駆体、NK細胞前駆体、および/またはNK細胞を得るステップをさらに含む、項目2に記載の方法。
(項目6)
前記多能性幹細胞を、MEK阻害剤と、GSK3阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記多能性幹細胞、前記中胚葉細胞、および/または二次造血性内皮のポテンシャルを有する前記中胚葉細胞を、約2%〜約10%の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記多能性幹細胞の、造血系細胞への分化が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記多能性幹細胞の、造血系細胞への分化が、フィーダーフリー条件下である、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記多能性幹細胞の、造血系細胞への分化が、間質フリー条件下にある、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)を含む、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記WNT経路活性化因子が、GSK3阻害剤である、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記GSK3阻害剤が、CHIR99021である、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記BMP経路活性化因子が、BMP4である、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記ROCK阻害剤が、チアゾビビンまたはY−27632である、項目2に記載の方法。
(項目17)
前記ROCK阻害剤が、Y−27632である、項目2に記載の方法。
(項目18)
多能性幹細胞の分化を、造血系の細胞へと方向付けるための方法であって、
(i)多能性幹細胞を、GSK3阻害剤と、BMP活性化因子とを含む組成物と接触させて、中胚葉細胞を得るステップと;
(ii)前記中胚葉細胞を、GSK3阻害剤と、BMP活性化因子と、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含む組成物と接触させて、造血性内皮を得るステップと;
(iii)前記造血性内皮を、VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF、およびTPOからなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインと;BMP活性化因子とを含む組成物と接触させて、二次HSCを得るステップであって、前記組成物が、任意選択で、Wnt経路活性化因子と、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含まないステップと
を含む方法。
(項目19)
(iv)二次HSCを、SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;BMP活性化因子と、1もしくは複数のNotch経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、T細胞前駆体を得るステップと、任意選択で、
(v)T細胞前駆体を、SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;1もしくは複数のNotch経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、T細胞を得るステップと
をさらに含むか、または
(vi)二次HSCを、SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;BMP活性化因子とを含む組成物と接触させて、NK細胞前駆体を得るステップと;任意選択で、
(vii)NK細胞前駆体を、SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物と接触させて、NK細胞を得るステップであって、前記組成物が、BMP活性化因子を含まないステップと
をさらに含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記二次HSCが、CD34+ CD45+である、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記二次HSCが、長期にわたる生着に適する、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記T細胞前駆体が、CD34+ CD7+である、項目19に記載の方法。
(項目23)
前記NK細胞前駆体が、CD56+ CD7+ CD161+である、項目19に記載の方法。
(項目24)
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、胚葉体の発生を欠く、項目18に記載の方法。
(項目25)
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、単層培養下である、項目18に記載の方法。
(項目26)
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、フィーダーフリー条件下である、項目18に記載の方法。
(項目27)
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、間質フリー条件下である、項目18に記載の方法。
(項目28)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目18に記載の方法。
(項目29)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目28に記載の方法。
(項目30)
多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させるための方法であって、前記方法が、
(I)多能性幹細胞由来のT細胞前駆体を、SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;1もしくは複数のNotch経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、T細胞を得るステップであって;前記組成物が、BMP活性化因子を含まないステップ
を含み;
前記多能性幹細胞由来のT細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次HSCを、BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;1もしくは複数のNotch経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られ;
前記多能性幹細胞由来の二次HSCが、多能性幹細胞由来の造血性内皮を、BMP活性化因子と;VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF、およびTPOからなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、任意選択で、Wnt経路活性化因子と、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含まず;
前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、GSK3阻害剤と、BMP活性化因子と、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られ;
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、GSK3阻害剤、BMP活性化因子を含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られるか;または前記方法が、
(II)多能性幹細胞由来のプレT細胞前駆体を、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物
と接触させて、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体もしくはT細胞を得るステップであって、前記組成物が、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1もしくは複数を含まないステップ
を含み;
前記多能性幹細胞由来のプレT細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ;
前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、二次HEのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ;前記組成物が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;
二次HEのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られる、
方法。
(項目31)
多能性幹細胞を、MEK阻害剤と、GSK3阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップ
をさらに含み、前記組成物が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない、項目30に記載の方法。
(項目32)
多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させることが、胚葉体の発生を欠く、項目30に記載の方法。
(項目33)
多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させることが、単層培養下である、項目30に記載の方法。
(項目34)
多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させることが、フィーダーフリー条件下である、項目30に記載の方法。
(項目35)
多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させることが、間質フリー条件下である、項目30に記載の方法。
(項目36)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目30に記載の方法。
(項目37)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目36に記載の方法。
(項目38)
多能性幹細胞由来のNK系統細胞を発生させるための方法であって、前記方法が、
(I)多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体を、SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来のNK細胞を得るステップであって、前記組成物が、BMP活性化因子を含まないステップ
を含み;
前記多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次HSCを、BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ;
前記多能性幹細胞由来の二次HSCが、多能性幹細胞由来の造血性内皮を、BMP活性化因子と、VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF、およびTPOからなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、Wnt経路活性化因子と、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含まず;
前記多能性幹細胞由来の造血性内皮が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、GSK3阻害剤と、BMP活性化因子と、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の分化を誘発して、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ;
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、GSK3阻害剤、BMP活性化因子を含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られるか;
または前記方法が、
(II)多能性幹細胞由来のプレNK細胞前駆体を、SCF、Flt3L、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体もしくはNK細胞を得るステップであって、前記組成物が、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1もしくは複数を含まないステップ
を含み;
前記多能性幹細胞由来のプレNK細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ;
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、二次HEのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;
二次HEのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られる、
方法。
(項目39)
播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞、および/または二次造血性内皮を、約2%〜約10%の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
多能性幹細胞を、MEK阻害剤と、GSK3阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記細胞を播種し、拡大するステップをさらに含み、前記組成物が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない、項目38に記載の方法。
(項目41)
多能性幹細胞由来のNK系統細胞を発生させることが、胚葉体の発生を欠く、項目38に記載の方法。
(項目42)
多能性幹細胞由来のNK系統細胞を発生させることが、単層培養下である、項目38に記載の方法。
(項目43)
多能性幹細胞由来のNK系統細胞を発生させることが、フィーダーフリー条件下である、項目38に記載の方法。
(項目44)
多能性幹細胞由来のNK系統細胞を発生させることが、間質フリー条件下である、項目38に記載の方法。
(項目45)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目38に記載の方法。
(項目46)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目45に記載の方法。
(項目47)
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための方法であって、
二次HEのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を得るステップであって、前記組成物が、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まないステップを含み;
二次HEのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られる、
方法。
(項目48)
多能性幹細胞を、MEK阻害剤と、GSK3阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップ
をさらに含み、前記組成物が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない、項目47に記載の方法。
(項目49)
播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞、および/または二次造血性内皮を、約2%〜約10%の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目47および48に記載の方法。
(項目50)
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、胚葉体の発生を欠く、項目47に記載の方法。
(項目51)
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、単層培養下である、項目47に記載の方法。
(項目52)
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、フィーダーフリー条件下である、項目47に記載の方法。
(項目53)
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、間質フリー条件下である、項目47に記載の方法。
(項目54)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目47に記載の方法。
(項目55)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目54に記載の方法。
(項目56)
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体を発生させるための方法であって、
多能性幹細胞由来のpre−HSCを、BMP活性化因子と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の複能性前駆体を得るステップであって、前記組成物が、ROCK阻害剤を含まないステップを含み;
前記多能性幹細胞由来のpre−HSCが、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ;
前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、二次HEのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;
二次HEのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られる、
方法。
(項目57)
多能性幹細胞を、MEK阻害剤と、GSK3阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップ
をさらに含み、前記組成物が、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない、項目56に記載の方法。
(項目58)
播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞、および/または二次造血性内皮を、約2%〜約10%の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目56および57に記載の方法。
(項目59)
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、胚葉体の発生を欠く、項目58に記載の方法。
(項目60)
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、単層培養下にある、項目58に記載の方法。
(項目61)
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、フィーダーフリー条件下にある、項目58に記載の方法。
(項目62)
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、間質フリー条件下にある、項目58に記載の方法。
(項目63)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目58に記載の方法。
(項目64)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目63に記載の方法。
(項目65)
項目1から64に記載の方法を使用して発生させる細胞集団、細胞株、またはクローン細胞のうちの1または複数を含む組成物を使用して、造血系の自己再生、再構成、または生着を促進する方法であって、前記細胞集団、細胞株、またはクローン細胞が、
(i)多能性幹細胞由来のCD34+二次造血性内皮(iCD34 HE)であって、前記iCD34細胞が、複能性前駆細胞、T細胞前駆体、NK細胞前駆体、T細胞、およびNK細胞へと分化する能力を有し、前記iCD34細胞がCD34+ CD43−である、CD34+二次造血性内皮;
(ii)多能性幹細胞由来の二次造血性内皮(iHE)であって、前記iHE細胞株またはクローン細胞がCD34+である、二次造血性内皮;
(iii)多能性幹細胞由来の二次HSCであって、前記iHSCが、CD34+ CD45+である二次HSC;
(iv)多能性幹細胞由来の複能性前駆細胞であって、前記iMPP細胞が、CD34+ CD45+である、複能性前駆細胞;
(v)多能性幹細胞由来のT細胞前駆体であって、CD34+ CD7+であるT細胞前駆体;
(vi)多能性幹細胞由来のT細胞であって、CD4+またはCD8+であるT細胞;
(vii)多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体であって、CD56+ CD7+ CD161+であるNK細胞前駆体;ならびに
(viii)多能性幹細胞由来のNK細胞であって、CD56+ CD57+ CD16+ CD94−であるNK細胞
から選択される、
方法。
(項目66)
多能性幹細胞由来の造血系細胞を得るための培養プラットフォームであって、
I:
(i)BMP活性化因子と、VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF、およびTPOからなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、Wnt経路活性化因子と、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含まず、多能性幹細胞由来の二次HSCを、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(ii)GSK3阻害剤と、BMP活性化因子と、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;および
(iii)GSK3阻害剤、BMP活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
またはII:
(i)ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(ii)BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含み、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地;ならびに
(iii)BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地
を含む培養プラットフォーム。
(項目67)
群IIが、
(iv)MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む、
項目66に記載の培養プラットフォーム。
(項目68)
I:
(i)SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;1もしくは複数のNotch経路活性化因子とを含み;BMP活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のT細胞へと分化させるのに適する培養培地、または
(ii)BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;1もしくは複数のNotch経路活性化因子とを含み、多能性幹細胞由来の二次HSCを、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させるのに適するか、
あるいはII:
(i)SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレT細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体もしくはT細胞へと分化させるのに適する培養培地;または
(ii)BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のプレT細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させるのに適する、
項目66に記載の培養プラットフォーム。
(項目69)
I:
(i)SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、BMP活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のNK細胞へと分化させるのに適する培養培地;または
(ii)BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次HSCを、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のNK系統細胞を発生させるのに適するか、
あるいはII:
(i)SCF、Flt3L、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレNK細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体もしくはNK細胞へと分化させるのに適する培地;または
(ii)BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレNK細胞前駆体へと分化させるのに適する培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のNK系統細胞を発生させるのに適する、
項目66に記載の培養プラットフォーム。
(項目70)
群(II)が、
(i)BMP活性化因子と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ROCK阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のpre−HSCを、多能性幹細胞由来の複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地;または
(ii)BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のpre−HSCへと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み;
前記培養培地が、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるのに適する、項目66に記載の培養プラットフォーム。
(項目71)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目66に記載の培養プラットフォーム。
(項目72)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目71に記載の培養プラットフォーム。
(項目73)
多能性幹細胞由来の造血細胞を得、かつ拡大するための組成物であって、
I:
(i)BMP活性化因子と、VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF、およびTPOからなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、任意選択で、Wnt経路活性化因子と、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次HSCを、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮から得るのに適する培養培地;
(ii)GSK3阻害剤と、BMP活性化因子と、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤と;多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地;ならびに
(iii)GSK3阻害剤、BMP活性化因子と;iPSCとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から得るのに適する培養培地;
またはII:
(i)ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤と;二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地;
(ii)BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤と;多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地;ならびに
(iii)BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFと;多能性幹細胞とを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から得るのに適する培養培地
のうちの1または複数を含む組成物。
(項目74)
群(II)が、
(vi)MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤と;多能性幹細胞とを含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地
をさらに含む、項目73に記載の組成物。
(項目75)
I:
(i)SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;1もしくは複数のNotch経路活性化因子と;多能性幹細胞由来のT細胞前駆体とを含み;BMP活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のT細胞へと分化させるのに適する培養培地、または
(ii)BMP活性化因子と;SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;1もしくは複数のNotch経路活性化因子と;多能性幹細胞由来の二次HSCとを含み、多能性幹細胞由来の二次HSCを、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体へと分化させるのに適し、多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させるのに適する培養培地
をさらに含み、
あるいはII:
(i)SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1もしくは複数と;多能性幹細胞由来のプレT細胞前駆体とを含まず、多能性幹細胞由来のプレT細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体もしくはT細胞へと分化させるのに適する培養培地、または
(ii)BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のプレT細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させるのに適する、
項目73に記載の組成物。
(項目76)
I:
(i)SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体とを含み、BMP活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のNK細胞へと分化させるのに適する培養培地;または
(ii)BMP活性化因子;SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;多能性幹細胞由来の二次HSCとを含み、多能性幹細胞由来の二次HSCを、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のNK系統細胞を発生させるのに適するか、
あるいはII:
(i)SCF、Flt3L、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1もしくは複数と;多能性幹細胞由来のプレNK細胞前駆体とを含まず、多能性幹細胞由来のプレNK細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体もしくはNK細胞へと分化させるのに適する培地;または
(ii)BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレNK細胞前駆体へと分化させるのに適する培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のNK系統細胞を発生させるのに適する、
項目73に記載の組成物。
(項目77)
群(II)が、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための、1または複数の培地をさらに含み、前記培地が、
(i)BMP活性化因子と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ROCK阻害剤と;多能性幹細胞由来のpre−HSCとを含まず、多能性幹細胞由来のpre−HSCを、多能性幹細胞由来の複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地;ならびに/または
(ii)BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のpre−HSCへと分化させるのに適する培養培地
を含む、項目73に記載の組成物。
(項目78)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目73に記載の培養プラットフォーム。
(項目79)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目78に記載の培養プラットフォーム。
(項目80)
多能性幹細胞由来のT系統細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、
I:
(i)GSK3阻害剤、BMP活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(ii)GSK3阻害剤と、BMP活性化因子と、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(iii)BMP活性化因子と、VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF、およびTPOからなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、Wnt経路活性化因子と、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含まず、多能性幹細胞由来の二次HSCを、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;ならびに
(iv)BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、1もしくは複数のNotch経路活性化因子とを含み、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体を、多能性幹細胞由来の二次HSCから分化させるのに適する培養培地;ならびに、任意選択で、
(iii)SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと;1もしくは複数のNotch経路活性化因子とを含み;BMP活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のT細胞を、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体から分化させるのに適する培養培地;
またはII:
(i)BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(ii)BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含み、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の二次HEのポテンシャルを得るのに適する培養培地;
(iii)ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の造血性内皮のポテンシャルを伴う前記中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(iv)BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のプレT細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地;ならびに
(v)SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレT細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体もしくはT細胞へと分化させるのに適する培養培地を含むプラットフォーム。
(項目81)
群(II)が、
(vi)MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含み、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地
をさらに含む、項目80に記載の培養プラットフォーム。
(項目82)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目80に記載の培養プラットフォーム。
(項目83)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目82に記載の培養プラットフォーム。
(項目84)
多能性幹細胞由来のNK細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、
I:
(i)GSK3阻害剤、BMP活性化因子を含み、多能性幹細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞へと分化させるのに適する培養培地;
(ii)GSK3阻害剤と、BMP活性化因子と、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮へと分化させるのに適する培養培地;
(iii)BMP活性化因子と、VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF、およびTPOからなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;任意選択で、Wnt経路活性化因子と、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の二次HSCへと分化させるのに適する培養培地;ならびに
(iv)BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;多能性幹細胞由来の二次HSCを、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地;ならびに、任意選択で、
(iv)SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、BMP活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のNK細胞へと分化させるのに適する培養培地;
またはII:
(i)BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(ii)BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含み、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地;
(iii)ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から分化させるのに適する培養培地;
(iv)BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレNK細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地;ならびに
(v)SCF、Flt3L、IL3、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレNK細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体もしくはNK細胞へと分化させるのに適する培養培地
を含むプラットフォーム。
(項目85)
群(II)が、
(vi)MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む、
項目84に記載の培養プラットフォーム。
(項目86)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目84に記載の培養プラットフォーム。
(項目87)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目86に記載の培養プラットフォーム。
(項目88)
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための培養プラットフォームであって、
(i)BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(ii)BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含み、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地;ならびに
(iii)ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の前記中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地
を含む培養プラットフォーム。
(項目89)
(iv)MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む、
項目88に記載の培養プラットフォーム。
(項目90)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目88に記載の培養プラットフォーム。
(項目91)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目90に記載の培養プラットフォーム。
(項目92)
複能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための培養プラットフォームであって、
(i)BMP活性化因子と、任意選択で、bFGFとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(ii)BMP活性化因子と、bFGFと、GSK3阻害剤とを含み、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地;
(iii)ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地;
(iv)BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のpre−HSCへと分化させるのに適する培養培地;ならびに
(v)BMP活性化因子と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ROCK阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のpre−HSCを、多能性幹細胞由来の複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地
を含む培養プラットフォーム。
(項目93)
(vi)MEK阻害剤、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含み、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地
をさらに含む、項目92に記載の培養プラットフォーム。
(項目94)
前記多能性幹細胞が、iPSCである、項目92に記載の培養プラットフォーム。
(項目95)
前記iPSCが、ナイーブiPSCである、項目94に記載の培養プラットフォーム。
(項目96)
(a)任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まない培養培地;ならびに
(b)項目4から7に記載の培養プラットフォームから発生させる、1または複数の細胞集団:
(i)多能性幹細胞由来のCD34+二次造血性内皮(iCD34 HE)であって、前記iCD34細胞が、複能性前駆細胞、T細胞前駆体、NK細胞前駆体、T細胞、およびNK細胞へと分化する能力を有し、CD34+ CD43−である、CD34+二次造血性内皮;
(ii)多能性幹細胞由来の二次造血性内皮(iHE)であって、前記iHE細胞がCD34+である、二次造血性内皮;
(iii)多能性幹細胞由来の二次HSCであって、前記iHSCが、CD34+ CD45+である、二次HSC;
(iv)多能性幹細胞由来の複能性前駆細胞であって、前記iMPP細胞が、CD34+ CD45+である、複能性前駆細胞;
(v)多能性幹細胞由来のT細胞前駆体であって、CD34+ CD7+であるT細胞前駆体;
(vi)多能性幹細胞由来のT細胞であって、CD4+またはCD8+であるT細胞;
(vii)多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体であって、CD56+ CD7+ CD161+であるNK細胞前駆体;ならびに
(viii)多能性幹細胞由来のNK細胞であって、CD56+ CD57+ CD16+ CD94−であるNK細胞
を含む組成物。
(項目97)
(i)CD34+ HE細胞(iCD34)、ならびにiCD34−C、iMPP−A、iTC−A1、iTC−A2、iTC−B1、iTC−B2、iNK−A1、iNK−A2、iNK−B1、およびiNK−B2から選択される、1または複数の培養培地;
(ii)二次造血性内皮(iHE)、ならびにiCD34−C、iMPP−A、iTC−A1、iTC−A2、iTC−B1、iTC−B2、iNK−A1、iNK−A2、iNK−B1、およびiNK−B2から選択される、1または複数の培養培地;
(iii)二次HSC、ならびにiMPP−A、iTC−A1、iTC−A2、iTC−B1、iTC−B2、iNK−A1、iNK−A2、iNK−B1、およびiNK−B2から選択される、1または複数の培養培地;
(iv)複能性前駆細胞(iMPP)およびiMPP−A;
(v)T細胞前駆体(iproT)、ならびにiTC−A1、iTC−A2、iTC−B1、およびiTC−B2から選択される、1または複数の培養培地;
(vi)T細胞(iTC)、およびiTC−B1またはiTC−B2;
(vii)NK細胞前駆体(iproNK)、ならびにiNK−A1、iNK−A2、iNK−B1、およびiNK−B2から選択される、1または複数の培養培地;ならびに
(viii)NK細胞(iNK)と、iNK−B1またはiNK−B2
(ix)HSC(iHSC)、ならびにiHSC−A、iHSC−B、およびiHSC−C
からなる群から選択される、多能性幹細胞由来の造血細胞と、1または複数の培養培地とを含む組成物であって;
iHSC−Aが、Wnt経路活性化因子およびBMP活性化因子を含み;
iHSC−Bが、Wnt経路活性化因子と、BMP活性化因子と、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含み;
iHSC−Cが、BMP活性化因子と、VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF、およびTPOからなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
iTC−A1が、BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインと、Jag1、Jag2、DLL−1、DLL−3、およびDLL−4からなる群から選択される、1または複数のNotch経路活性化因子とを含み;
iTC−B1が、SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインと、Jag1、Jag2、DLL−1、DLL−3、およびDLL−4からなる群から選択される、1または複数のNotch経路活性化因子とを含み;(iHSCプラットフォーム);
iNK−A1が、BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
iNK−B1が、SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインを含み;
iCD34−Cが、ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
iMPP−Aが、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
iTC−A2が、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、およびbFGFと;SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
iTC−B2が、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインを含み;
iNK−A2が、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、およびbFGFと、SCF、Flt3L、IL7、IL15からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
iNK−B2が、SCF、Flt3L、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインを含む、
組成物。
(項目98)
iHSC−Cが、Wnt経路活性化因子と、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含まず;iTC−A1が、VEGFおよび/もしくはIL15を含まず;iCD34−Cが、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;iTC−B1が、BMP活性化因子を含まず;かつ/またはiTC−B2が、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1もしくは複数を含まない、項目97に記載の組成物。
本発明は一般に、幹細胞を、二次造血細胞運命へと分化させるための方法および組成物に関する。より特定すると、本発明は、発生の種々の段階において、二次造血性内皮から、完全に分化した造血細胞であって、T細胞、B細胞、NKT細胞、およびNK細胞を含む造血細胞にわたる範囲の二次造血表現型を呈するように、iPSCまたはiPSC由来の細胞を誘導しうる、多段階分化プラットフォームを提供する。すなわち、本発明は、細胞が、二次造血運命、例えば、CD34+二次造血幹細胞を、より呈しやすくなるようにするための方法および組成物を提供する。代替的に、本発明の方法および組成物は、EBまたは凝集物の形成を回避することにより、二次造血性内皮(HE)を、ナイーブiPSCから、スケーラブルな様式で発生させる。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。下記では、本発明の目的で、以下の用語について規定する。本明細書では、「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」という冠詞を、その冠詞の文法的目的語のうちの1つまたは1つを超える(すなわち、少なくとも1つ)を指すのに用いる。例として述べると、「ある要素」とは、1つの要素または1つを超える要素を意味する。
本発明は一般に、ナイーブ多能性細胞を、中胚葉細胞、二次造血性内皮、二次造血幹もしくは二次造血前駆細胞、CD34+細胞、複能性前駆体(MPP)(好中球前駆体を含む骨髄性細胞へと分化することが可能である)、T細胞前駆体、NK細胞前駆体を含む、非多能性細胞または部分的に分化した細胞;あるいは、例えば、T細胞、B細胞、NKT細胞、またはNK細胞など、完全に分化した最終造血細胞へと分化させる多段階工程に関する。本発明はまた、開示される方法で使用される組成物;および開示される方法を使用して発生させた細胞集団、細胞株、またはクローン細胞にも関する。
多能性細胞を培養するための既存の方法は、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞であらかじめ馴化され、ウシ胎仔血清を含有する培地に大きく依存するが、このような環境は、臨床使用および治療における使用のための細胞を作製するのに適さない場合がある。例えば、動物成分への曝露は、免疫拒絶の重大な危険性、および識別されていない病原体を、処置される患者へと伝染させる重大な危険性を提示する可能性があり、動物レトロウイルスを潜在的に再活性化させうるため、このような異種夾雑環境で培養された細胞は一般に、ヒトへの細胞移植に適さないと考えられる。本明細書で想定されるフィーダーフリー環境など、動物フリーの培養培地を使用する培養系は、臨床的グレードの細胞株、特に、hESC、hiPSC、および多能性幹細胞由来のHSC、T細胞株、B細胞株、NKT細胞株、またはNK細胞株の製造を容易とする。
TGFβ受容体(例えば、ALK5)阻害剤は、TGFβ受容体(例えば、ALK5)に対する抗体、これらのドミナントネガティブの変異体、およびこれらの発現を抑制するアンチセンス核酸を含みうる。例示的なTGFβ受容体/ALK阻害剤は、SB431542(例えば、Inmanら、Molecular Pharmacology、62巻(1号):65〜74頁(2002年)を参照されたい);3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミドとしてもまた公知のA−83−01(例えば、Tojoら、Cancer Science、96巻(11号):791〜800頁(2005年)を参照されたい;例えば、Toicris Bioscienceから市販されている);2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン;Wnt3a/BIO(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Daltonら、WO2008/094597を参照されたい);GW788388(−{4−[3−(ピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル]ピリジン−2−イル}−N−(テトラヒドロ−2H−ピラン−4−イル)ベンズアミド)(例えば、Gellibertら、Journal of Medicinal Chemistry、49巻(7号):2210〜2221頁(2006年)を参照されたい);SM16(例えば、Suzukiら、Cancer Research、67巻(5号):2351〜2359頁(2007年)を参照されたい);IN−1130(3−((5−(6−メチルピリジン−2−イル)−4−(キノキサリン−6−イル)−1H−イミダゾール−2−イル)メチル)ベンズアミド)(例えば、Kimら、Xenobiotica、38巻(3号):325〜339頁(2008年)を参照されたい);GW6604(2−フェニル−4−(3−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾール−4−イル)ピリジン)(例えば、de Gouvilleら、Drug News Perspective、19巻(2号):85〜90頁(2006年)を参照されたい);SB−505124(2−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジン塩酸塩)(例えば、DaCostaら、Molecular Pharmacology、65巻(3号):744〜752頁(2004年)を参照されたい);およびピリミジン誘導体(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Stieflら、WO2008/006583において列挙されているピリミジン誘導体を参照されたい)を含むがこれらに限定されない。さらに、「ALK5阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包摂することを意図しないが、「ALK5阻害剤」は、例えば、SB−431542(例えば、Inmanら、J. Mol. Pharmacol.、62巻(1号):65〜74頁(2002年)を参照されたい)など、ALK5に加えて、ALK4および/またはALK7も阻害する阻害剤を包摂することを理解されたい。本発明の範囲を限定することを意図せずに述べると、ALK5阻害剤は、間葉から上皮への転換/移行(MET)過程に影響を与えることが考えられる。TGFβ/アクチビン経路は、上皮から間葉への移行(EMT)の駆動因子である。従って、TGFβ/アクチビン経路を阻害することにより、MET(すなわち、再プログラム化)過程を促進することができる。
本明細書で使用される「Wntシグナル促進剤」、「Wnt経路活性化因子」、「Wnt経路活性化剤」、または「Wnt経路アゴニスト」という用語は、Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt14、Wnt15、およびWnt16のうちの1または複数のアゴニストを含むがこれらに限定されない、Wntシグナル伝達経路のアゴニストを指す。Wnt経路アゴニストはさらに、以下のポリペプチドまたはそれらの断片:Dkkポリペプチド、Crescentポリペプチド、Cerberusポリペプチド、Axinポリペプチド、Frzbポリペプチド、T細胞因子ポリペプチド、またはドミナントネガティブのDisheveledポリペプチドのうちの1または複数を含むがこれらに限定されない。
GSK3阻害剤は、本明細書で想定される組成物における使用に適する、特異的な例示的Wnt経路アゴニストであり、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子を含みうるがこれらに限定されない。本明細書で想定されるGSK3阻害剤は、GSK3α/βの発現および/またはGSK3α/βの活性を減殺しうる。本明細書で想定されるGSK3阻害剤の例示的な例は、GSK3をターゲティングする抗GSK3抗体、ドミナントネガティブのGSK3変異体、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。
本明細書で想定される組成物における使用に適するERK/MEK阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子を含むがこれらに限定されない。本明細書で想定されるERK/MEK阻害剤は、MEKもしくはERKの発現および/またはMEKもしくはERKの活性を減殺しうる。本明細書で想定されるMEK/ERK阻害剤の例示的な例は、MEKまたはERKをターゲティングする抗MEK抗体または抗ERK抗体、ドミナントネガティブのMEK変異体またはERK変異体、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。
Rho関連キナーゼ(ROCK)とは、Rhoキナーゼ(その3つのアイソフォーム(RhoA、RhoB、およびRhoC)が存在する)の下流のエフェクターとして働くセリン/トレオニンキナーゼである。本明細書で想定される組成物における使用に適するROCK阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子を含むがこれらに限定されない。本明細書で想定されるROCK阻害剤は、ROCKの発現および/またはROCKの活性を減殺しうる。本明細書で想定されるROCK阻害剤の例示的な例は、ROCKをターゲティングする抗ROCK抗体、ドミナントネガティブのROCK変異体、siRNA、shRNA、miRNA、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。
I.iHSCプラットフォーム
本発明の一態様は、中胚葉細胞を、iPSCを含む多能性幹細胞から得るための培養培地を提供する。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。一実施形態では、培養培地は、Wnt経路活性化因子およびBMP活性化因子を含む。一実施形態では、培養培地は、Wnt経路活性化因子と、BMP活性化因子を含むiHSC基礎培地とを含む。一実施形態では、培養培地中のWnt経路活性化因子は、GSK3阻害剤である。一実施形態では、GSK3阻害剤は、CHIR99021である。一実施形態では、BMP活性化因子は、BMP4である。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および/またはサイトカインを、表1に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Vitronectinではなく、Matrigel(商標)を使用する場合、完全に組成既知である。
本発明のさらなる態様は、多能性幹細胞を使用して二次造血性内皮を得るための培養プラットフォームを提供する。本明細書で使用される二次造血性内皮とは、二次造血へと方向付けられた造血性細胞集団であって、二次HSC、造血複能性前駆体(MPP)、T細胞前駆体、NK細胞前駆体、成熟T細胞および/またはNK細胞を含むがこれらに限定されない、全ての造血細胞を発生させる能力を伴う造血細胞集団である。
本発明は、1または複数の培養培地を含む多段階培養プラットフォームを使用して、多能性幹細胞由来の二次造血細胞を発生させる方法を提供する。方法は、フィーダーフリー条件に適する。方法はまた、単層培養にも適し、従って、当技術分野で公知の方法と比較して、多能性幹細胞を分化させるために、EBの形成または凝集中間体を要請しない。提供される方法により、複能性前駆細胞(iMPP)、ナチュラルキラー細胞前駆体(ipro−NK)、T細胞前駆体(ipro−T)、成熟NK細胞(iNK)、およびT細胞(iT)へとさらに分化させることが可能な、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮(iHE)、二次HSC(iHSC)、CD34+ HE(iCD34)を発生し、同時に、これらを拡大する。本発明のさらなる態様はまた、多能性幹細胞由来のCD34+細胞、HE、HSC、および/またはMPPから分化させた骨髄性細胞を発生させる方法も提供する。
1.iHSCを、多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉、またはHEから分化させ、拡大すること(iHSCプラットフォーム)
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、二次HSC(iHSC)を発生し、拡大する方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させる第1段階で始まり、次いで、第2段階で、中胚葉細胞を、造血性内皮(HE)へと分化させ、拡大する。第3段階では、HE細胞を、二次HSC(iHSC)へと分化させ、これを同時にまた、拡大もする。本発明はまた、二次HSC(iHSC)を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、HEへと分化させ、拡大することと、HEを、iHSCへと分化させることとを含む方法も提供する。代替的に、本発明は、二次HSC(iHSC)を発生し、拡大する方法であって、多能性幹細胞由来のHEを、iHSCへと分化させることを含む方法を提供する。上記の方法についての一部の実施形態では、多能性幹細胞は、iPSCを含む。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、二次造血性内皮を発生し、拡大する方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させる第1段階で始まり、次いで、第2段階で、中胚葉細胞を、拡大し、造血性内皮へと分化させる。出発多能性細胞は、基底状態の人工多能性幹細胞またはナイーブ人工多能性幹細胞および胚性幹細胞を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、発生させ、拡大される造血性内皮は、二次造血性内皮である。一部の実施形態では、発生させる二次造血性内皮は、CD34陽性である。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させることにより、造血性内皮を発生し、拡大する方法を提供する。
本発明の一態様は、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。出発多能性細胞は、基底状態の人工多能性幹細胞またはナイーブ人工多能性幹細胞および胚性幹細胞を含むがこれらに限定されない。
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、T細胞前駆体を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させ、中胚葉細胞を拡大する第1段階で始まり、次いで、第2段階で、造血性内皮を、分化させ、拡大する。第3段階では、HE細胞を、二次HSC(iHSC)へと分化させ、iHSCを拡大する。第4段階では、iHSCを、T細胞前駆体へと分化させる。本発明はまた、T細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、HEへと分化させること、次いで、HEを、iHSCへと分化させること、次いで、iHSCを、T細胞前駆体へと分化させることを含む方法も提供する。本発明は、T細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のHEを、iHSCへと分化させること、次いで、iHSCを、T細胞前駆体へと分化させることを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、T細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のiHSCを、T細胞前駆体へと分化させることを含む方法を提供する。
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、NK細胞前駆体を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大する第1段階で始まり、次いで、第2段階で、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させると、HE細胞が拡大する。第3段階では、HE細胞を、二次HSCへと分化させると、二次HSCが拡大する。第4段階では、iHSCを、NK細胞前駆体へと分化させる。本発明はまた、NK細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、HEへと分化させ、次いで、HEを、iHSCへと分化させ、次いで、iHSCを、NK細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法も提供する。本発明は、NK細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のHEを、iHSCへと分化させ、次いで、iHSCを、NK細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、NK細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のiHSCを、NK細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法を提供する。
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、NK細胞を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大する第1段階で始まり、次いで、第2段階で、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させると、HE細胞が拡大する。第3段階では、HE細胞を、二次HSC(iHSC)へと分化させると、HSCが拡大する。第4段階では、iHSCを、NK細胞前駆体(ipro−NK)へと分化させる。第5段階では、iHSCを、NK細胞へと分化させる。本発明はまた、NK細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、HEへと分化させ、HEを、iHSCへと分化させ、iHSCを、NK細胞前駆体へと分化させ、次いで、NK細胞前駆体を、NK細胞へと分化させるステップを含む方法も提供する。本発明は、NK細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のHEを、iHSCへと分化させ、iHSCを、NK細胞前駆体へと分化させ、NK細胞前駆体を、NK細胞へと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、NK細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のiHSCを、NK細胞前駆体へと分化させ、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体を、NK細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、NK細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体を、NK細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。
1.二次iHEを導出し、拡大すること(iCD34プラットフォーム)
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、二次造血性内皮(iHE)を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種し、拡大する第1段階で始まる。次いで、この段階で、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大する。次いで、拡大された中胚葉集団を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉集団へと分化させ、次いで、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大する。代替的に、本発明は、二次造血性内皮(iHE)を発生させる方法であって、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大し;次いで、二次造血性内皮(iHE)を、中胚葉細胞から、分化させ、拡大するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、iPSCである。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。本発明は、二次造血性内皮(iHE)を発生し、拡大する方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を分化させ、拡大し、二次iHEのポテンシャルを有する中胚葉細胞を得、次いで、これらを、iHEへと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、二次造血性内皮を発生し、拡大する方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、iHEへと分化させるステップを含む方法を提供する。本明細書で開示される方法は、EBの形成を伴わない、最適化された単層iCD34培養プラットフォームであって、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種する第1段階で始まる。次いで、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと発生させる。第3段階では、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと、さらに分化させる。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を発生させる方法であって、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと分化させるステップを含む方法と、中胚葉を、二次造血性ポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させる方法とを提供する。本発明は、二次HEのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を発生させる方法をさらに提供するが、方法は、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、iPSCである。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。本明細書で開示される方法は、最適化されたiCD34培養プラットフォームであって、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来の中胚葉を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種する第1段階で始まり、次いで、第2段階で、播種された細胞を、中胚葉へと分化させる。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、iPSCである。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。本明細書で開示される方法は、最適化されたiCD34培養プラットフォームであって、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来の複能性前駆体(iMPP)を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種する第1段階で始まる。播種された細胞を拡大し、中胚葉細胞へと分化させる。中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと拡大し、分化させ、その後、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させる。HE細胞を、pre−HSCへと拡大し、分化させ、次いで、好中球前駆体を含む骨髄性細胞へと分化することが可能な、複能性前駆体へと拡大し、分化させる。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来の複能性前駆体(iMPP)を発生させる方法であって、播種された多能性細胞を、中胚葉へと分化させ、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、中胚葉細胞を、二次iHEへと分化させ、次いで、これらを、iMPPへと分化させるステップを含む方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞由来のiMPPを発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、中胚葉細胞を、二次iHEへと分化させ、次いで、これらを、iMPPへと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のiMPPを発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、二次iHEへと分化させ、次いで、これらを、iMPPへと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、多能性幹細胞由来のiMPPを発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のiHEを、iMPPへと分化させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、iPSCである。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。本明細書で開示される方法は、EBの形成を伴わない、最適化された単層iCD34培養プラットフォームであって、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体(ipro−T)または多能性幹細胞由来のT細胞を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、中胚葉細胞を、分化させ、拡大する多能性幹細胞で始まる。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、iPSCである。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。次いで、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させる。その後、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させ、同時に、培地中で、これらを拡大する。次いで、二次HE細胞を、pre−proTへと分化させ、次いで、T細胞前駆体(pro−T)へと分化させ、同じ培地中で、これらを、引き続き、T細胞へと分化させることができる。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体(ipro−T)またはT細胞を発生させる方法であって、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと分化させ、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、iHEへと分化させ、次いで、これらを、T細胞前駆体またはT細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体(ipro−T)またはT細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、これらを、iHEへと分化させ、次いで、これらを、ipro−TまたはT細胞へと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体またはT細胞を発生させる方法であって、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、iHEへと分化させ、次いで、これらを、ipro−TまたはT細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、多能性幹細胞由来のT細胞前駆体(ipro−T)またはT細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のiHEを、ipro−TまたはT細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、iPSCである。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。本明細書で開示される方法は、最適化されたiCD34培養プラットフォームであって、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。一部の実施形態では、Jag1、Jag2、DLL−1、DLL−3、およびDLL−4を含むがこれらに限定されないNotch因子を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体(ipro−NK)またはNK細胞(iNK)を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、一部の実施形態では、播種される、多能性幹細胞で始まる。多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと発生させ、これらを拡大し、その後、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させる。次いで、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大する。HE細胞は、pre−proNKへと分化させ、次いで、NK細胞前駆体(pro−NK)へと分化させることが可能であり、同じ培地中で、これらを、引き続き、NK細胞へと分化させることができる。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体(ipro−NK)またはNK細胞を発生させる方法であって、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと分化させ、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、iHEへと分化させ、次いで、これらを、NK細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体(ipro−NK)またはNK細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、iHEへと分化させ、次いで、これらを、ipro−NKまたはiNKへと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体またはiNKを発生させる方法であって、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、iHEへと分化させ、次いで、これらを、ipro−NKまたはiNKへと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、多能性幹細胞由来のNK細胞前駆体(ipro−NK)またはNK細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のiHEを、ipro−NKまたはiNKへと分化させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、iPSCである。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。一部の実施形態では、NK細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、pro−NK細胞を、NKの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および/または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの1または複数と接触させることにより、NK細胞を導出するステップを含む。本明細書で開示される方法は、最適化されたiCD34培養プラットフォームであって、TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
一部の実施形態では、再プログラム化の後で培養した細胞を、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20、22、24、26、28、30、32、35、40、42、もしくは45日間、またはこれらの間の任意の日数にわたり、分化するように誘導する。一部の実施形態では、再プログラム化の後で培養した細胞を、約1〜42日間、2〜40日間、2〜35日間、2〜20日間、2〜10日間、4〜30日間、約4〜24日間、約6〜22日間、または約8〜約12日間にわたり誘導する。一部の実施形態では、細胞は、iPSCを含む多能性幹細胞である。一部の実施形態では、iPSCは、ナイーブiPSCである。一実施形態では、濃縮は、クローン多能性幹細胞由来の分化細胞コロニーを、比較的短時間で得、これにより、多様な段階にある、多能性幹細胞由来の分化細胞を発生させる効率を改善するための方法をもたらす。一実施形態では、濃縮は、CD34を発現するHE細胞、CD34を発現するHSC細胞、T細胞前駆体またはNK細胞前駆体、およびT細胞またはNK細胞を導出し、これにより、細胞集団の各々を発生させる効率を改善するための方法をもたらす。濃縮は、分化段階/細胞型を示す特異的な特徴的マーカーを発現する細胞を識別し、得るように、細胞の集団をソートすることを含みうる。一部の実施形態では、ソートすることは、CD34、CD43、CD73、および/またはCXCR4を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、CD34陽性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、CD34陽性およびCD43陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、CD34陽性、CD43陰性、およびCD73陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートすることは、CD34陽性、CD43陰性、CD73陰性、およびCXCR4陰性を使用する。さらなる濃縮法は、所望されない細胞型を表すマーカーを発現する細胞の枯渇であって、所望される細胞型の、濃縮された集団を得る枯渇を含む。
a.iHSC−Aが、Wnt経路活性化因子およびBMP活性化因子を含み;
b.iHSC−Bが、Wnt経路活性化因子と、BMP活性化因子と、任意選択で、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含み;
c.iHSC−Cが、BMP活性化因子と、VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF、およびTPOからなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む。一部の実施形態では、組成物が、Wnt経路活性化因子と、TGFβ受容体/ALK阻害剤とを含まず;
d.iTC−A1が、BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、IL7、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインと、Jag1、Jag2、DLL−1、DLL−3、およびDLL−4からなる群から選択される、1または複数のNotch経路活性化因子とを含み;一部の実施形態では、組成物が、VEGFおよび/またはIL15を含まず;
e.iTC−B1が、SCF、Flt3L、IL7、IGF、IL2、IL3、およびIL6からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインと、Jag1、Jag2、DLL−1、DLL−3、およびDLL−4からなる群から選択される、1または複数のNotch経路活性化因子とを含み(iHSCプラットフォーム);一部の実施形態では、組成物が、BMP活性化因子を含まず;
f.iNK−A1が、BMP活性化因子と、SCF、Flt3L、VEGF、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
g.iNK−B1が、SCF、Flt3L、IGF、IL7、IL2、IL3、IL6、およびIL15からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインを含み;
h.iCD34−Cが、ROCK阻害剤と、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;TGFβ受容体/ALK阻害剤を含まず;
i.iMPP−Aが、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、およびIL11からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
j.iTC−A2が、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、およびbFGFと;SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
k.iTC−B2が、SCF、Flt3L、およびIL7からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインを含み;組成物が、VEGF、bFGF、BMP活性化因子、およびROCK阻害剤のうちの1または複数を含まず;
l.iNK−A2が、BMP活性化因子と、ROCK阻害剤と、VEGF、およびbFGFと、SCF、Flt3L、IL7、IL15からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み;
m.iNK−B2が、SCF、Flt3L、IL7、およびIL15からなる群から選択される、1または複数の増殖因子およびサイトカインを含む
混合物を提供する。
hiPSCの発生および維持
OCT4/SOX2/LargeT、OCT4/SOX2、またはOCT4/SOX2/NANOG/LargeTを含む多様な因子の組合せを、ROCK経路阻害剤、MEK経路阻害剤、GSK3経路阻害剤、およびTGFβ受容体阻害剤を含有する再プログラム化培地(Valamehrら、Sci Rep.、2012年、2巻:213頁)の存在下で使用して、線維芽細胞および血液細胞を含む体細胞を、多能性状態へと再プログラム化するように誘導した。誘導の14日後、再プログラム化集団を、ROCK経路阻害剤、GSK3経路阻害剤、およびMEK経路阻害剤、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、および白血病阻害因子(LIF)を含有する維持培地(Valamehrら、Stem Cell Reports、2014年、2巻(3号):366〜381頁)へと切り換えた。細胞を、無制限に、維持培地中で保った。
iHSC培養プラットフォームを使用する造血分化
造血系統細胞への分化を誘発するために、ナイーブhiPSCを、維持培地中単層として播種し、およそ25%のコンフルエンシーに達するまで拡大させた。この時点で、培養培地を、iHSC−Aへと切り換えることにより、造血分化を誘発した(図1を参照されたい)。図1に例示される通り、その後、分化の誘発の48時間後に、培養物を、iHSC−Bへと切り換えるのに続き、分化の誘発の4〜5日目に、iHSC−Cへと切り換えた。付着培養物は、接着させたまま維持し、培地交換の間に撹乱しなかった。
iHSC培養プラットフォームを使用する分化に続く、in vitroにおける特徴付けおよび試験
分化させた二次造血幹細胞の拡大可能性およびそれが維持されるかを決定するため、CD34でソートまたは濃縮された集団を、Stemspan造血幹細胞培養培地(StemCell Technologies、Vancouver、Canada)、1×CC110サプリメント(StemCell Technologies)、10ng/mLのbFGF、および5μMのチアゾビビンまたは10μMの27632 ROCK阻害剤を補充した(最初の数日間、生存を改善するために培養中に)懸濁培養物へと移した。培養に、新鮮培地を、隔日でフィードし、ピペッティングして、CD34陽性でソートされた細胞の***から生じる凝集物をバラバラにした。数週間培養した後、スケーリングされた懸濁培養を、表面マーカーの発現および生細胞数によって評価および測定した。図8で裏付けられる通り、CD34ソート集団は、CD34集団の喪失を最小限として、培養で22日間にわたり維持された。懸濁培養物の生存率を改善するために、ROCK経路の低分子阻害剤を添加した。図7は、ROCK阻害の存在下における、単一細胞解離物の継代培養後の細胞の生存および増殖を示す。図6A〜6Cは、図1に記載される分化法の改善であって、単層培養およびEB培養の両方へと適用された改善を示すが、単層フォーマットでは、EBにより介在される分化と比較して、より高パーセントのCD34細胞が存在することが示された。
iHSC培養プラットフォームを使用する分化に続く、in vivoにおける再構成
導出された二次造血幹細胞の、in vivoにおける機能性および生着のポテンシャルを示すために、上記で記載したhiPSC分化工程から導出されたCD34陽性細胞を、FACS Ariaを使用してソートするか、またはMACSビーズを使用して濃縮した。回収された細胞を、トリパンブルー染色によりカウントして、生存率を決定した。およそ30,000個のCD34陽性生細胞を、HBSS中に再懸濁させ、眼窩後注射を介して、NSGマウスへと導入した。NSGマウスは、生着研究の前に、致死線量未満の300radで、24時間にわたり照射した。加えて、ソートされていない分化集団(最大で250,000個)のほか、ヒト末梢血もまた、対照として、NSGマウスへと導入した。2週間ごとに、マウスから採血し、CD45、CD11b、CD19、およびCD3を含むヒト特異的マーカーを使用して、ヒト血液の寄与について評価した。図9Aは、ヒトCD45マーカーをもっぱら発現する細胞の存在と共に見られる通り、生着したCD34陽性細胞の、12週間にわたる再構成を裏付ける。データはまた、骨髄系集団およびリンパ系集団の両方を発生させる、生着細胞の多系統能も示す。図9Bは、T細胞およびB細胞の両方を伴う、CD34+細胞の、18週間にわたる再構成を裏付ける。
iHSC培養プラットフォームを使用する分化に続く、低分子モジュレーション
薬理学的モジュレーションに応答する、hiPSC由来のCD34陽性二次造血幹細胞の能力について評価するため、CD34でソートまたは濃縮された細胞を、公知のモジュレーターで処理した。37℃で一晩にわたるインキュベーションの後、CD34陽性細胞を、表面PDL1発現の上方調節を含む薬理学的応答についてフローサイトメトリーにより評価した。媒体対照と比較して、優により多く処理されたCD34細胞は、開示される方法を使用して、ナイーブhiPSCから導出されたCD34陽性細胞の、免疫調節潜在力の指標である、集団全般の全発現の増大に加えて、PDL1表面タンパク質の上方調節(図11を参照されたい)を裏付けた。
iHSC培養プラットフォームを使用する分化に続く、特異的造血系への分化の継続
ソートまたは濃縮されたCD34陽性細胞を、造血系へと、T細胞およびNK細胞を含む、多様な特異的細胞型に向かってさらに分化させた。T細胞に特異的なCD34陽性細胞を濃縮して、フィーダー細胞を含有しない懸濁培養物またはOP9間質細胞を含有する接着培養物またはマトリゲルコーティングされた表面へと移した。設定に関わりなく、培養物に、可溶性DLL1およびDLL4を含有するiTC−A1を補充した(図1)。およそ10日後、培養の設定を、iTC−B1へと切り換えて、T細胞の成熟を完了させた。およそ30〜40日後(当初の分化誘導後)、細胞集団を、CD3、CD7、TCRαβ、CD4、およびCD8の表面発現を含むT細胞の組成について評価した。図10は、in vitroにおける、導出されたCD34陽性細胞の分化能力であって、CD7集団からの、CD4およびCD8の発現により規定される、別個のT細胞の集団を発生させる分化能力を示す。
iCD34培養プラットフォームを使用する造血分化、および生着のポテンシャルを有するHE集団の識別
上記のiHSCプラットフォームを、造血系細胞の分化のためにさらに最適化した。造血系への分化を誘発するため、hiPSCを、0日目(D0)に、維持培地中の単層として播種し、約24時間にわたり、接着および拡大を可能とした。1日目であるこの時点で、維持培地を除去し、維持因子を伴わない基礎培地に置きかえた。培養培地を、iCD34−Aへと切り換えることにより、約2日目に、造血分化を誘発した(図12を参照されたい)。図12に例示される通り、3日目に、培養培地に増殖因子であるbFGFを補充し、その後、分化のために、iCD34−B培地へと切り換えた。それらを単一細胞へと解離させる時点である約5日目〜6日目まで、単層を維持し、約10日目における分化まで、iCD34−C培地中の、低密度の単層として播種した。約2日目における造血分化の開始から、分化の約10日目まで、低酸素圧(2〜10%のO2)を維持した。
低分子、サイトカイン、およびプレーティング密度のモジュレーションによる、HE発生の最適化
約10日間にわたる分化の後における、HEの、hiPSCからの効率的な発生を最適化するため、いくつかのパラメータについて検討した。分化の0日目における、単層の最適なプレーティング密度を、matrigel(商標)でコーティングした6ウェル培養ディッシュ上にhiPSCをプレーティングし、ウェル1つ当たり7.5×104個からウェル1つ当たり1.5×105個へと量を増大させ、次いで、約10日目に、CD34+ HE集団の発生を解析することにより評価した。図16Aは、細胞のプレーティング密度を増大させると、CD34+細胞の全百分率は増大するが、CXCR4− CD73− HE亜集団は減少することを裏付ける。この減少にも拘らず、10日間にわたる単層分化の後における、hiPSCの、HEへの転換率は、ウェル1つ当たり1.5×105個の最高被験プレーティング密度のときに最高であった(図15C)。
Notch依存性の造血およびMPPの分化による、HEの造血ポテンシャルの決定
hiPSC由来の二次集団の造血ポテンシャルを裏付けるため、FACSを使用して、HE細胞をソートし、図12の複能性前駆体アッセイ(iMPP)で記載される通り、CD45+造血前駆体を発生させる、内皮から造血への移行を経るそれらの能力について評価した。およそ30,000個のCD34+ HE細胞を、懸濁液中の凝集物として、iMPP−A培地中で、一晩にわたり培養し、次いで、単層としてプレーティングし、6〜8日間にわたり、さらに培養した。図17Aは、丸い造血細胞の出現を伴う、単層培養物中の表現型の変化、およびフローサイトメトリー染色により、6〜8日間の培養期間にわたってCD45+の存在が識別されることを示す。
酸素条件の操作を介する、HEおよびiMPPの発生の最適化
酸素環境が、二次HEおよびiMPP造血前駆体の発生に影響を与えるのかどうかについて評価するため、hiPSCを、図12で記載されている通り、正常酸素(21%のO2)条件下または低酸素(5%のO2)条件下で分化させた。分化の約10日目に、単層を、フローサイトメトリーにより、CD34+ HE集団の存在について、カウントし、評価した。図18Aに見られる通り、低酸素条件下の分化は、発生するCD34+ HEの量の増大を結果としてもたらした。低酸素条件下で発生させたHEが、CD45+造血前駆体を発生させるポテンシャルを保持していたことを確認するために、正常酸素条件および低酸素分化条件によるCD34+細胞を、FACSにより単離し、iMPPアッセイにより評価した。いずれの条件下で発生させたHEも、同等のiMPPポテンシャルを有することから、低酸素条件下の造血分化は、二次HEのアウトプットを増大させることが指し示される(図18B)。
8日目の分化培養物およびHEの低温保存
直接的分化プロトコールの約10日目において、全培養物を、解離させて、10%のDMSOを補充した8日目の培地中の低温保存後において、造血ポテンシャルを維持するそれらの能力について評価した。融解させた細胞を、再懸濁させ、その後、図12で記載されている通り、iMPP−A培地中で、7日間にわたり培養してから、フロー解析にかけた。図19Aに見られる通り、低温保存された10日目の細胞は、凍結/融解工程後も生存し、CD45+細胞の存在により見られる通り、非凍結対照と同等の造血ポテンシャルを有していた。
一晩にわたる出荷後における、8日目の分化培養物の回復
6ウェルプレートによる6日目の分化培養物を、フラスコ1つ当たり細胞200,000個の播種密度で、T25培養フラスコへと継代培養し、次いで、8日目に培地で完全に満たし、発泡スチロール製の箱の中で一晩にわたり保って、新鮮な細胞を、低温保存の必要なしに、直接出荷することの実施可能性について評価した。可能な限りにわたり37℃の温度を保持するために、当初に37℃の水浴中で保たれた保冷パックもまた、発泡スチロール製の箱に添付した。2つの培地組成物:8日目のステップで活用される、30%の濃度のサイトカインおよびモルフォゲンを伴うフラスコ(図12)と、100%の濃度のサイトカインおよびモルフォゲンを伴うフラスコとについて、37℃のインキュベーター内で保たれた対照フラスコと共に調べた。9日目に、これらのフラスコを箱から取り出し、フラスコに新たなキャップを取り付けると共に、培地を、8日目の培地10mLで置きかえ、回復させてから、CD34+ HE集団の存在についての、10日目のフロー解析のために処理した。図20に見られる通り、HEの全般的なアウトプットは、全ての条件間で同等であったことから、8日目の培養物の新鮮なままでの一晩にわたる出荷の、HE細胞を送達するための有効な手段としての実施可能性が裏付けられる。
DLL4を発現する間質細胞を使用する、HEの、成熟Tリンパ系および成熟NKリンパ系への分化の継続
ソートされたCD34+ HE細胞を、Tリンパ系およびNKリンパ系へとさらに分化させた。T細胞に特異的なHE細胞をソートして、低付着型組織培養物プレート上で、BMP4、SCF、Flt3L、およびIL7を含有するiTC−A無血清分化培地(図13)中の凝集物として、16時間にわたり培養した。16時間後、凝集した細胞を、SCF、Flt3L、およびIL7を含有するiTC−B分化培地に、DLL4を発現する間質細胞を含有する接着培養に移した。5日後、iTC−B培地を維持して、T細胞の分化を完了させた。培養のおよそ10日後(HEの単離後)、細胞表面マーカーであるCD34およびCD7の同時発現により、培養物を、T細胞前駆体の発生について評価した。およそ15〜20日間にわたるさらなる分化の後で、これらのCD34+ CD7+ T細胞前駆体は、CD4およびCD8の発現により見られる通り、成熟T細胞の別個の集団を発生した。図21は、同時培養物中で発生したCD45+ CD56−集団についての解析により、in vitroにおける、10日目のHE集団の分化能力であって、早期T細胞前駆体および成熟T細胞サブセットを発生させる分化能力について示す。図26は、培養のおよそ30日後(HEの単離後)、同時培養物中で発生したCD45+ CD56−集団についての解析により、in vitroにおける、10日目のHE集団の分化能力であって、成熟T細胞サブセットを発生させる分化能力について示す。
高度にスケーラブルな拡大戦略を可能とする、単層hiPSC造血分化プラットフォーム
hiPSCを、図12〜14で記載される、組成既知、無血清で、フィーダーフリーの培養物中の単層として播種し、造血細胞へと分化させ、凝集下にあるhiPSC状態であって、造血分化の誘発の前に胚葉体を形成するhiPSCセットアップ(Kennedyら、Cell Reports、2012年、1722〜1735頁)と比較した。いずれの培養物セットも、初期出発数として、100,000個のhiPSCを使用した。造血分化工程において、細胞カウントおよび表現型の評価を慣用的に行って、各系の拡大ポテンシャルを裏付けた。図23で示される通り、分化の6日目までに、単層培養物では、顕著な数のCD34陽性細胞(CD34陽性細胞が検出されなかったEBフォーマットと対比して、200万個超のCD34+細胞)が検出された。分化の8日目に、単層フォーマットは、およそ240万個の細胞を発生させたが、EBフォーマットでは、CD34陽性細胞の検出は、およそ100,000個に過ぎず、出発材料としてのiPSCがほぼ同数であるにも拘らず、およそ24倍の差が見られた。加えて、評価時に、単層フォーマットからは、二次造血を示唆するCD34+ CD43−細胞のみが作製されたのに対し、EBフォーマットからは、一次造血を示唆するCD34+ CD43+が大半の細胞が作製された(Kennedyら、2012年)。図24は、オフザシェルフのiNK細胞およびiT細胞を産生するための、本明細書で開示される、単層hiPSC造血分化プラットフォームのスケーラブルな拡大をさらに示す。本明細書で提示される多能性細胞クローン拡大プラットフォームは、例えば、1個の多能性細胞クローンから、各々が治療的に機能的な、106個を下回らないNK細胞またはT細胞を有する、治療用量のバイアル約100万本への、オフザシェルフ用のスケーラビリティーを確保する。開示されるクローン拡大は、広範な均質性をさらにもたらし、従って、製品の一貫性、品質管理、および品質保証を確保する。一部の実施形態では、1個の多能性細胞クローンは、遺伝子操作される。
iCD34+細胞の免疫調節特性
hiPSC由来のCD34陽性細胞(iCD34)の免疫調節能力を決定するため、CD34でソートされた細胞を、iMPP−A培地中で、末梢血由来の、CD3を発現する活性化T細胞と共に同時培養した。37℃で5日間にわたるインキュベーションの後、同時培養物を、カウンティングビーズと混合し、フローサイトメトリーを介してアッセイして、各試料中の細胞の絶対数を決定した。図25は、CD3+ T細胞単独を含有する培養物との比較により見られる、hiPSC由来のCD34+細胞の免疫調節ポテンシャルについて示すが、hiPSC由来のCD34+細胞と共に同時培養されたCD3+ T細胞が、細胞の生存を低減したのに対し、培養物中のCD34+細胞の総数は、影響を受けなかった。
サイトカインの放出および脱顆粒により見られる、サイトカイン誘導性活性化による、iNK細胞機能の決定
hiPSC由来の成熟iNK細胞の機能性を裏付けるため、20日目(HEの単離後)に、iNK細胞を、SCF、IL15、IL7、およびFlt3Lを含有するiNK−B培地に、さらに10日の間、フィーダーベースの懸濁培養物へと移した。10日間にわたるさらなる培養の後、iNK細胞を、IL12およびIL18で刺激して、iNK細胞の活性化を誘導した。iCD34由来のiNKは、末梢血NK細胞と同様の様式で、サイトカインの刺激に応答し、炎症促進性サイトカインを分泌した。図28は、CD107A(脱顆粒を表す細胞表面マーカー)の発現、およびCD45+ CD56+ゲーティング戦略に基づく、インターフェロンガンマについての細胞内染色により見られる、iNK細胞の活性化であって、同じ間質およびフィーダー懸濁液による同時培養物と、末梢血由来のNK細胞とを使用して発生させた、臍帯血由来のNK細胞と比較した活性化について示す。
T細胞およびNK細胞を発生させるための間質フリーの分化培養物の確立
間質フリーの分化プラットフォームを使用して、臍帯血由来のiT前駆体およびiNK前駆体、ならびにhiPSC由来のiT前駆体およびiNK前駆体を発生させるためにさらに、上記のTリンパ系およびNKリンパ系の分化プラットフォームを最適化した。
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