CN114774365B - 一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用 - Google Patents

一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用，所述方法利用拟胚体的三维结构为iPSC分化提供良好的分化微环境，在缺氧诱导培养条件下第4天即可开始产生高比例的CD34+细胞，随后通过拟胚体贴壁或者消化再悬浮诱导分化的方式，显著提高了iPSC诱导NK细胞分化的产量，且诱导分化得到的NK细胞在短时间内即可发挥对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤杀伤能力，适合规模化细胞制剂的生产和临床应用。

Description

一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用。
背景技术
造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSC）是成体内极其重要的一类干细胞，尽管其仅占人体血细胞比例不到万分之一，但具备极强的自我更新能力和分化能力，能长期重建机体整个血液***和免疫***，具备各世系血细胞和免疫细胞的分化潜能。造血干细胞是人类最早发现的一种干细胞，也是目前为止研究最多的一种干细胞。近年来，随着造血干细胞移植治疗的开展，对造血干细胞的研究日益深入，临床治疗中，造血干细胞移植广泛应用于血液***疾病以及自身免疫疾病，在其它实体瘤的治疗中，比如淋巴瘤、生殖细胞瘤、乳腺癌、小细胞肺癌，主要应用于常规治疗失败或复发难治以及具有不良预后因素的患者。造血干细胞移植的主要来源有脐带血，骨髓和外周血，但是其中造血干细胞的比例最多1%-5%，因此需通过体外扩增获得足够数量的造血干细胞。
CD34分子属于钙黏蛋白家族，是一种高度糖基化的单次跨膜蛋白，其选择性地表达于人类及其他哺乳动物的造血干细胞（HSC）、造血祖细胞（HPC）和血管内皮细胞（EC）表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失，是原代血细胞和骨髓来源祖细胞（尤其是造血细胞）的典型表面标记。CD34蛋白主要表达于造血干细胞和造血祖细胞中，同时，血管内皮细胞、一部分间充质干细胞表面也表达CD34，CD34在脐带和骨髓中表达强度相对较高。造血干细胞移植主要分为自体和异体造血干细胞移植两种。尽管自体移植具有无移植排斥、无移植物抗宿主病等并发症的优点，但脐血库储存的自体造血干细胞数量供不应求，使其在疾病中的临床应用中受到限制。异体移植虽然远期疗效优于自体移植且复发率低，但是配型效率极低且来源有限，从而限制了其在临床上的应用。
因此，目前本领域迫切需要寻求更为安全、成本较低、来源稳定的造血干细胞资源。人多能干细胞具有分化为几乎所有类型体细胞，包括造血干细胞的能力。人多能干细胞包括人胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和人诱导多能干细胞（Inducedpluripotent stem cells，iPSC）。研究表明，小鼠、猴子和人的人胚胎干细胞在体外都可以被诱导分化为各种血液细胞，但是人胚胎干细胞来源于发育早期的胚胎，存在取材困难、免疫排斥、伦理道德等问题。人诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）可由人体皮肤、血液等体细胞在体外重编程而来，且具有和人胚胎干细胞类似的无限增殖能力，及在体外分化为几乎所有功能细胞，包括造血干细胞的能力。人诱导多能干细胞的这一特性成功地绕开了免疫排斥和伦理性两个最关键的问题，为临床上获得体外来源的造血干细胞进行临床移植应用提供了可能性。
目前已有的诱导人诱导多能干细胞定向CD34+细胞分化的方法较多，例如拟胚体（Embryoid bodies，EB）分化方法、贴壁诱导分化方法等，并且通过不同细胞因子和化合物的组合以达到诱导CD34+造血干细胞的分化，但是目前已有的上述诱导分化方法的主要缺点是获得CD34+细胞时间长，产量低。可见虽然本领域对于从人诱导多能干细胞体外分化为造血祖细胞的过程已经有所了解，但是现有的分化方法仍存在一些明显缺陷，其中包括诱导分化时间长、产量低等问题。因此，本领域迫切需要开发一种高效、快速诱导iPSC分化获得CD34+细胞的方法。
NK细胞对于机体防御和抗肿瘤至关重要，但肿瘤病人体内的NK细胞通常是功能受损的，因此，通过外源输入功能正常或经过基因改造的功能加强的NK细胞对肿瘤细胞进行杀伤，即NK细胞过继治疗，是目前癌症治疗的前沿和热点。NK细胞免疫治疗需要大量的NK细胞，目前NK细胞主要来源有：①自体/异体外周血分离得到的NK细胞(PB-NK)，②自体/异体脐带血分离得到的NK细胞(UCB-NK)，③胚胎干细胞分化/诱导多能干细胞分化得到的NK细胞(hESC-NK/iPSC-NK)，④NK细胞系如NK-92。自体外周血分离得到的NK细胞容易受到病人自身HLA分子的抑制而削弱细胞的杀伤能力，且从病人体内通常难以分离到足够的NK细胞用于临床治疗。异体外周血虽然能够提供大量的NK细胞，但由于捐献者不同，分离得到的NK细胞在数量上和细胞杀伤能力上都存在较大差异。且PB-NK细胞不易基因修饰。UCB-NK不易扩增，且UCB-NK不成熟，杀伤力弱。NK-92细胞系存在多倍体，增殖不可控，具有潜在的致瘤性。而iPSC能够分化得到均一的、基因型明确的、功能与PB-NK相似的NK细胞，消除了PB-NK存在的捐献者差异性，具有重要的临床应用前景。
目前将iPSC分化成NK细胞主要有三种方法：①将iPSC与基质细胞共培养，分化形成造血祖细胞，分离造血祖细胞，将造血祖细胞与基质细胞共培养，分化形成NK细胞。整个分化过程需要47-55天。②将iPSC铺到96孔板中形成EB球，分化形成造血祖细胞，然后将EB球转入24孔板或6孔板中，分化形成NK细胞。整个分化过程需要27-46天。③将iPSC单细胞铺到培养皿中，待iPSC克隆长到合适大小后，加入生长因子刺激细胞分化形成造血祖细胞，分离造血祖细胞，加入生长因子刺激NK细胞分化，得到NK细胞，整个分化过程需要48天。其中，方法①需要将iPSC与动物来源的基质细胞共培养，且在分化过程中需要添加FBS等动物源成分，因而不适用于临床治疗。方法②分化过程操作繁琐且需要添加人血清，不利于大规模制备。方法③虽然分化过程简单，且无血清无动物源成分，符合临床制备条件，但得到的NK细胞杀伤力比PB-NK弱。可见目前iPSC诱导NK细胞的方法普遍存在如下不足：NK细胞获得产量低、分化得到的NK细胞杀伤功能差等。如何克服现有技术存在的上述不足，研究出一种新的具有良好的杀瘤活性的体外NK细胞诱导分化的方法是生物领域亟需解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用，所述方法采用常氧+缺氧的诱导培养方式，在第4天即可开始产生高比例的CD34+细胞，且显著优于常氧+常氧、缺氧+缺氧、缺氧+常氧的培养方式，显著提高了iPSC诱导NK细胞分化的产量，1个iPSC约可获得10000个NK细胞，且获得的NK细胞具有良好的杀伤功能。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种诱导iPSC分化制备获得CD34+细胞的培养基。
进一步，所述培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基和第四阶段培养基；
所述第一阶段培养基为含有ROCK通路抑制剂和聚乙烯醇的E8完全培养基；
所述第二阶段培养基为含有GSK-3β抑制剂的E8完全培养基；
所述第三阶段培养基包括SPM1培养基和SPM2培养基；
所述第四阶段培养基为SPM3培养基；
所述SPM1培养基包括stempro-34完全培养基、DMEM/F12培养基、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、BMP4、VEGF、bFGF；
所述SPM2培养基包括所述SPM1培养基和TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂；
所述SPM3培养基包括stempro-34完全培养基、DMEM/F12培养基、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、bFGF、VEGF、SCF、TPO、FLT-3L。
进一步，所述第一阶段培养基中的ROCK通路抑制剂为Y-27632；
所述第二阶段培养基中的GSK-3β抑制剂为CHIR-99021；
所述第三阶段培养基中的TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂为SB431542；
所述第一阶段培养基中Y-27632的浓度为0.5-20 μM；
所述第一阶段培养基中聚乙烯醇的浓度为2-6 mg/mL；
所述第二阶段培养基中CHIR-99021的浓度为1-20 μM；
所述第三阶段培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、BMP4、VEGF、bFGF、SB431542的浓度分别为（0.1-5）%、（10-100）μg/mL、（0.1-5）×、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（1-10）μM；
所述第四阶段培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、bFGF、VEGF、SCF、TPO、FLT-3L的浓度分别为（0.1-5）%、（10-100）μg/mL、（0.1-5）×、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（1-50）ng/mL。
进一步，所述第一阶段培养基中Y-27632的浓度为10 μM；
所述第一阶段培养基中聚乙烯醇的浓度为4 mg/mL；
所述第二阶段培养基中CHIR-99021的浓度为10 μM；
所述第三阶段培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、BMP4、VEGF、bFGF、SB431542的浓度分别为1%、50 μg/mL、1×、50 ng/mL、50 ng/mL、50 ng/mL、6 μM；
所述第四阶段培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、bFGF、VEGF、SCF、TPO、FLT-3L的浓度分别为1%、50 μg/mL、1×、50 ng/mL、50 ng/mL、50 ng/mL、30 ng/mL、10 ng/mL。
本发明的第二方面提供了一种诱导iPSC分化制备获得NK细胞的培养基。
进一步，所述培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基、第四阶段培养基、第五阶段培养基；
所述第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基、第四阶段培养基为本发明第一方面所述的第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基、第四阶段培养基；
所述第五阶段培养基为SPM-NK培养基；
所述SPM-NK培养基包括stempro-34完全培养基、DMEM/F12培养基、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、SCF、Flt-3L、IL-3、IL-7、IL-15；
所述SPM-NK培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、SCF、Flt-3L、IL-3、IL-7、IL-15的浓度分别为（0.1-5）%、（10-100）μg/mL、（0.1-5）×、（10-50）ng/mL、（1-20）ng/mL、（1-10）ng/mL、（10-50）ng/mL、（1-100）ng/mL。
进一步，所述SPM-NK培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、SCF、Flt-3L、IL-3、IL-7、IL-15的浓度分别为1%、50 μg/mL、1×、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL。
本发明的第三方面提供了一种诱导iPSC分化成CD34+细胞的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1) 第一阶段，Day -1，在常氧条件下，采用本发明第一方面所述的第一阶段培养基对iPSC进行悬浮培养，形成拟胚体；
(2) 第二阶段，Day 0，在缺氧条件下，采用本发明第一方面所述的第二阶段培养基对所述拟胚体进行诱导培养，形成中胚层细胞；
(3) 第三阶段，Day 1- Day 4，在缺氧条件下，采用本发明第一方面所述的第三阶段培养基对所述中胚层细胞进行诱导培养，形成CD34+生血内皮细胞；
(4) 第四阶段，Day 5- Day 12，在常氧条件下，采用本发明第一方面所述的第四阶段培养基对所述CD34+生血内皮细胞进行诱导培养，形成CD34+/CD45+细胞。
进一步，所述第一阶段是iPSC诱导分化形成拟胚体，第二阶段是拟胚体诱导分化形成中胚层细胞，第三阶段是中胚层细胞诱导分化形成CD34+生血内皮细胞，第四阶段是CD34+生血内皮细胞诱导分化形成CD34+/CD45+细胞。
进一步，步骤(1)中所述形成拟胚体包括如下步骤：Day -1，将iPSC消化至单细胞状态，接种细胞，加入第一阶段培养基进行重悬培养，形成拟胚体；
所述接种细胞密度为1×105-2×105/mL；
步骤(3)中所述形成CD34+生血内皮细胞包括如下步骤：
(a) Day 1，将所述中胚层细胞在SPM1培养基中进行诱导培养；
(b) Day 2，将所述SPM1培养基更换为SPM2培养基进行诱导培养；
(c) Day 3，半换液，弃去一半旧的SPM2培养基，加入一半新的SPM2培养基；
(d) Day 4，拟胚体贴壁培养，形成CD34+生血内皮细胞。
进一步，步骤(1)中所述接种细胞密度为1×105/mL；
步骤(1)中所述培养的条件为5% CO2，37℃恒温培养；
步骤(2)中所述培养的条件为5% CO2，90% N2，37℃恒温培养；
步骤(3)中所述培养的条件为5% CO2，90% N2，37℃恒温培养；
步骤(4)中所述培养的条件为5% CO2，37℃恒温培养。
本发明的第四方面提供了一种诱导iPSC分化成NK细胞的方法。
进一步，所述方法包括在本发明第三方面所述的方法基础上进行如下步骤：第五阶段，Day 13- Day 40，在常氧条件下，采用本发明第二方面所述的第五阶段培养基对所述CD34+/CD45+细胞进行诱导培养，形成NK细胞。
进一步，所述第五阶段是诱导CD34+/CD45+细胞分化形成NK细胞。
进一步，所述第五阶段包括如下步骤：
a) Day 13- Day 18，将所述CD34+/CD45+细胞在第五阶段培养基中进行悬浮培养；
b) Day 19- Day 40，将所述第五阶段培养基更换为不含IL-3的第五阶段培养基进行悬浮培养，形成NK细胞；
所述培养的条件为5% CO2，37℃恒温培养。
在本发明的具体实施方案中，本发明利用拟胚体的三维结构为iPSC分化提供良好的分化微环境，采用形成拟胚体的方式，在缺氧诱导培养条件下第4天即可开始产生高比例的CD34+细胞，随后通过拟胚体贴壁或者消化再悬浮诱导分化的方式，显著提高了iPSC诱导NK细胞分化的产量，最终1个iPSC约可获得10000个NK细胞，且获得的NK细胞具有良好的杀伤肿瘤细胞的功能。
本发明的第五方面提供了一种CD34+细胞群体或其衍生物或一种NK细胞群体或其衍生物。
进一步，所述CD34+细胞群体为采用本发明第三方面所述的方法诱导分化得到的，所述NK细胞群体为采用本发明第四方面所述的方法诱导分化得到的；
所述CD34+细胞群体同时表达CD45；
所述CD34+细胞群体衍生物为CD34+细胞群体诱导分化得到的造血细胞系细胞群体；
所述CD34+细胞群体诱导分化得到的造血细胞系细胞群体包括T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞。
本发明的第六方面提供了一种用于治疗和/或预防血液***疾病和/或自身免疫性疾病和/或实体瘤的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第五方面所述的CD34+细胞群体或其衍生物、NK细胞群体或其衍生物；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；
优选地，所述血液***疾病包括慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无巨核细胞性血小板减少症；
优选地，所述自身免疫性疾病包括难治性类风湿关节炎、***性红斑狼疮、多发性硬化、幼年特发性关节炎、***性硬化症、韦格纳肉芽肿、抗磷脂抗体综合症、严重性重症肌无力、克罗恩病、Ⅰ 型糖尿病、重症联合免疫缺陷症；
优选地，所述实体瘤包括乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、鼻咽癌、腹膜后卵黄囊瘤、尤文肉瘤、原始神经外胚层肿瘤、肾母细胞瘤、肝癌、恶性神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤。
进一步，所述药学上可接受的载体和/或辅料在Remington's PharmaceuticalSciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。优选地，所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。优选地，所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂、溶液剂中的至少一种。优选地，所述药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、***速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
进一步，所述药物组合物中的活性成分（本发明第五方面所述的CD34+细胞群体或其衍生物、NK细胞群体或其衍生物）的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。
本发明的第七方面提供了如下任一方面的应用：
(1) 本发明第一方面所述的培养基在诱导iPSC分化制备获得CD34+细胞中的应用；
(2) 本发明第二方面所述的培养基在诱导iPSC分化制备获得NK细胞中的应用；
(3) 本发明第五方面所述的CD34+细胞群体或其衍生物、NK细胞群体或其衍生物在制备治疗和/或预防血液***疾病和/或自身免疫性疾病和/或实体瘤的药物中的应用；
优选地，所述血液***疾病包括慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、重型阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无巨核细胞性血小板减少症；
优选地，所述自身免疫性疾病包括难治性类风湿关节炎、***性红斑狼疮、多发性硬化、幼年特发性关节炎、***性硬化症、韦格纳肉芽肿、抗磷脂抗体综合症、严重性重症肌无力、克罗恩病、Ⅰ 型糖尿病、重症联合免疫缺陷症；
优选地，所述实体瘤包括乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、鼻咽癌、腹膜后卵黄囊瘤、尤文肉瘤、原始神经外胚层肿瘤、肾母细胞瘤、肝癌、恶性神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤。
为了进一步解释本发明，对本发明中涉及到的部分专业术语进行如下解释：
本文中所述的“造血干细胞（HSC）”，是指具有自我更新及分化成更成熟的血细胞的能力的未成熟的血细胞，其中所述的更成熟的血细胞包括粒细胞（例如，前髓细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）、红细胞（例如，网状细胞、红细胞）、凝血细胞（例如，成巨核细胞、产血小板的巨核细胞、血小板）和单核细胞（例如，单核细胞、巨噬细胞）。在本说明书中，HSC被可互换地表述为干细胞。本领域已知该类细胞可能包括或不包括CD34+细胞。CD34+细胞是表达CD34细胞表面标记的未成熟细胞。认为CD34+细胞包括具有上面所定义的干细胞性质的细胞亚群。本领域众所周知，HSC包括多向性干细胞、多能性干细胞（例如，淋巴干细胞）和/或被归为特殊的造血细胞系的干细胞。被归为特殊的造血细胞系的干细胞可以是T细胞系、B细胞系、树突细胞系、朗格汉斯细胞系和/或淋巴组织-特异性的巨噬细胞系中的细胞。此外，HSC还涉及长期HSC（LT-HSC）和短期HSC（ST-HSC）。ST-HSC比LT-HSC的活力更高且增殖性更强。但是，LT-HSC具有不受限制的自我更新（即，其存活贯穿整个成人期），而ST-HSC具有有限的自我更新（即，其仅在有限时期内存活）。这些HSC中的任何一种都可用于本文所述的任何方法中。任选地，因为它们的高增殖性以及因此可迅速增加HSC及其后代的数目，ST-HSC是有用的。造血干细胞任选地得自血液产品。一种血液产品包括得自躯体或含有造血源细胞的躯体器官的产品。该类来源包括未分级的骨髓、脐带、外周血、肝、胸腺、淋巴和脾。上述粗制或未分级的血液产品都可用本领域技术人员已知的方式富集具有造血干细胞特性的细胞。
本文中所述的“拟胚体（EB）”，是指胚状体或聚集体，是指包含分化细胞，部分分化细胞和/或悬浮培养的多能干细胞的均质或异质细胞簇。为了概括体内分化固有的一些线索，本发明使用三维拟胚体作为中间步骤。在细胞聚集开始时，可以启动分化并且细胞可以在有限程度上开始以重现胚胎发育。虽然它们不能形成滋养外胚层组织，但是生物体中存在的几乎所有其他类型的细胞都可以发育。本发明可以进一步促进拟胚体形成后的造血祖细胞分化。
本文中所述的“治疗和/或预防”，是指预防、逆转、缓和、抑制该术语所适用的失调或病症或者这种失调或病症的一种或多种症状的进展，治疗疾病或病状包括改善特定疾病或病状的至少一种症状，即便基础病理生理学不受影响，例如，本文中所使用“治疗和/或预防血液***疾病”包括以下一种或多种：(1) 预防血液***疾病的发生；(2) 抑制血液***疾病的发展；(3) 治愈血液***疾病；(4) 缓解血液***疾病患者的相关症状；(5) 减轻血液***疾病的严重程度；(6) 防止血液***疾病的复发。
本文中所述的“人诱导多能干细胞”，同“诱导多能干细胞”，通常缩写为iPS细胞或iPSC，是指通过引入或接触重编程因子，将非多能细胞（通常是成体体细胞）或终末分化细胞（例如成纤维细胞，造血细胞）人工制备的一种多能干细胞，如肌细胞、神经元、表皮细胞等。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
目前已有的诱导iPSC定向CD34+细胞分化的方法（如：拟胚体分化方法、贴壁诱导分化方法）具有诱导时间长、产量普遍偏低等缺点，相对于上述现有技术而言，本发明提供了一种诱导多能干细胞分化获得CD34+细胞和NK细胞的培养基组合和制备方法，所述培养基组合和制备方法，在缺氧诱导培养条件下第4天即可开始产生高比例的CD34+细胞，随后通过EB贴壁或者消化再悬浮诱导分化的方式，显著提高了iPSC诱导NK细胞分化的产量，且诱导分化得到的NK细胞在短时间内即可发挥对肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤杀伤能力。本发明提供的方法显著克服了现有NK细胞分化技术中存在的NK细胞获得产量低、获得的NK细胞杀伤功能差等问题，适合规模化细胞制剂的生产和临床应用。此外，本发明首次发现在诱导iPSC定向分化为CD34+细胞中，采用常氧+缺氧的诱导培养方式显著优于常氧+常氧、缺氧+缺氧、缺氧+常氧的诱导培养方式，取得了预料不到的技术效果。
附图说明
图1为本发明诱导iPSC分化获得NK细胞的实验流程图；
图2为iPS细胞在4倍光学显微镜下细胞形态结果图；
图3为分化进程中Day 0、Day 4、Day 5、Day 12、Day 26、Day 40细胞在4倍光学显微镜下细胞形态结果图；
图4为分化第40天在20倍光学显微镜下观察NK细胞形态结果图；
图5为分化第4天CD34、CD31和CD235表达情况检测结果图，其中，A图：CD34、CD31，B图：CD34、CD235；
图6为分化第12天CD34和CD45表达情况检测结果图；
图7为分化第26天CD122、CD45和CD56表达情况检测结果图，其中，A图：CD122、CD45，B图：CD122、CD56；
图8为分化第40天CD45、CD56和CD3阳性细胞表达情况检测结果图，其中，A图：CD45、CD56，B图：CD3、CD56；
图9为分化第40天NK细胞相关maker检测结果图，其中，A图：Granzyme B，B图：NKP46；
图10为经诱导分化获得的NK细胞杀伤功能验证实验结果图，其中，A图：LNCap细胞系，B图：K562细胞系；
图11为分化第4天，常氧+缺氧、常氧+常氧、缺氧+常氧、缺氧+缺氧的培养条件下CD34和CD235表达情况检测结果图，其中，A图：常氧+缺氧（拟胚体形成阶段常氧，中胚层和生血内皮形成阶段缺氧），B图：常氧+常氧（拟胚体形成阶段、中胚层和生血内皮形成阶段均为常氧），C图：缺氧+常氧（拟胚体形成阶段、中胚层和生血内皮形成阶段均为缺氧），D图：缺氧+缺氧（拟胚体形成阶段缺氧，中胚层和生血内皮形成阶段缺氧）；
图12为分化第12天，常氧+缺氧、常氧+常氧、缺氧+常氧、缺氧+缺氧培养条件下悬浮细胞CD34和CD45表达情况检测结果图，其中，A图：常氧+缺氧，B图：常氧+常氧，C图：缺氧+常氧，D图：缺氧+缺氧；
图13为分化第40天，常氧+缺氧、常氧+常氧、缺氧+常氧、缺氧+缺氧的培养条件下悬浮细胞CD56和CD45表达情况检测结果图，其中，A图：常氧+缺氧，B图：常氧+常氧，C图：缺氧+常氧，D图：缺氧+缺氧；
图14为分化第12天，不同起始细胞密度条件下CD34和CD43的表达情况的结果图；
图15为分化第4天，流式检测不同bFGF浓度下CD34的表达情况的结果图；
图16为分化第4天，流式检测不同SB431542浓度下CD34的表达情况的结果图，其中，A图：于分化第6天收取细胞流式检测CD34的表达情况的结果图，B图：于分化第12天收取细胞流式检测CD34的表达情况的结果图；
图17为检测脐血来源NK和iNK的标志物表达情况的结果图，其中，A图：流式检测脐血来源NK和iPSC诱导分化来源NK的CD56、CD45和CD3表达情况，B图：流式检测脐血来源NK和iPSC诱导分化来源NK的Granzyme B、CD94、NKP30、NKP44、NKP46、TRAIL表达情况，C图：流式检测脐血来源NK和3个不同分化批次的iPSC诱导分化来源NK的Granzyme B、IFN-γ、CD94、NKG2D、NKP30、NKP44、NKP46、TRAIL表达情况统计结果；
图18为脐血来源NK细胞和本发明制备得到的iNK细胞对肿瘤杀伤能力对比结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的实验过程
1、实验材料
本发明实施例中涉及到的实验材料见表1。
表1 实验材料
实验材料名称 厂家 货号
matrigel Corning 354277
StemPro-34 SFM Thermo 10640-019
StemPro-34 Nutrient Thermo 10641-025
DMEM/F-12 with HEPES Thermo 11330-032
GlutaMAX-I(100X) Gibco 35050061
Insulin-Transferrin-Selenium-X Gibco 51500056
L-抗坏血酸 sigma A92902
BMP4 peprotech 120-05ET
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic(154 a.a.) peprotech AF-100-18B
Animal-Free Recombinant Human VEGF165 peprotech AF-100-20
CHIR99021 StemCellTechnologies 72054
SB431542 abcam ab120163
0.25% Trypsin-EDTA(1X) Thermo 25200072
E8 Basal Medium STEMCELL 05991
E8 25X Supplement STEMCELL 05992
Recombinant Human TPO peprotech 300-18-10
Recombinant Human SCF peprotech 300-07
Animal-Free Recombinant Human Flt3-Ligand peprotech AF-300-19
IL-7 peprotech 200-07
Recombinant Human IL-15 peprotech 200-15
Recombinant Human IL-21 peprotech 200-21
IL-3 peprotech 200-03-10
Human IL-2 peprotech 200-02
2、拟胚体（Embryoid bodies，EB）的形成
(1) iPSC来源于北京呈诺医学科技有限公司，采用本公司在先申请的专利文件（201910110768.7）中记载的方法制备得到，待iPSC生长汇合度达到70%后，吸去上清，加入提前预热的DPBS清洗细胞两次，之后加入预热的Tryple Express消化细胞呈单细胞状态，终止消化离心后去除上清，加入含有10 μM ROCK通路抑制剂Y-27632的E8培养基+含有4mg/mL聚乙烯醇（PVA）的E8完全培养基重悬细胞，进行细胞计数；
(2) 调整细胞密度为1×105-2×105/mL，接种细胞到低吸附六孔板中进行悬浮培养，每孔3 mL培养基，即5-60万细胞每孔，放于5% CO2，37℃恒温培养箱中培养细胞24小时，记为Day -1，形成EB（不同细胞密度的实验结果详见如下实施例4）；
本实施例中，所述ROCK通路抑制剂为0.5-20 μM的Y-27632；可发挥类似功能的小分子物质包括但不限于：Thiazovivin、Fasudil (HA-1077) HCl、GSK429286A、RKI-1447、Azaindole 1。
3、诱导启动拟胚体向中胚层分化
将EB转移到离心管中，20 g离心2 min后去除上清，加入含有10 μM GSK-3β抑制剂CHIR-99021的E8完全培养基，启动中胚层分化，记为Day 0，开始置于5% CO2，90% N2，37℃恒温培养箱中培养细胞24小时；
本实施例中，GSK-3β抑制剂为1-10 μM的CHIR-99021；可发挥类似功能的小分子物质包括但不限于：SB216763、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib、SB415286。
本实施例中，分化诱导基础培养基包括但不限于：E8完全培养基、StemPro-34、Stemline® II、STEMdiff™ APEL™2 Medium。
4、诱导中胚层细胞向CD34+生血内皮细胞（Hematopoietic endothelial cell，HEC）分化
(1) Day 1更换为SPM1培养基，SPM1培养基由50% stempro-34完全培养基、50%DMEM/F12培养基、1% L-谷氨酰胺、50 μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X)、50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF组成，将上述Day 0的EB重悬于SPM1培养基中，并将其置于5% CO2，90% N2，37℃恒温培养箱中培养细胞24小时（不同bFGF浓度的实验结果详见如下实施例5）；
(2) Day 2更换为SPM2培养基，SPM2培养基为在SPM1基础上加入6 μM TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂SB431542，每孔加入3 mL，将上述Day 1的EB重悬于SPM2培养基中，并将其置于5% CO2，90% N2，37℃恒温培养箱中培养细胞24小时（SB431542加入与不加入的对比实验结果详见实施例6）；
(3) Day 3半换液，弃去一半旧的SPM2培养基，加入一半新的SPM2培养基；
(4) Day 4收取部分EB进行流式检测，检测方法见实施例2；
本实施例中，所述TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂为1-6 μM SB431542，可发挥类似功能的小分子物质包括但不限于：Galunisertib (LY2157299)、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388。
5、诱导CD34+生血内皮细胞向CD34+/CD45+造血干细胞（Hematopoietic stemcell，HSC）分化
(1) Day 5将EB转移到Matrigel提前包被的细胞培养皿中，同时更换SMP3培养基，SPM3培养基由50% stempro-34完全培养基、50% DMEM/F12培养基、1% L-谷氨酰胺、50 μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X)、50 ng/mLbFGF、50 ng/mL VEGF、50 ng/mL SCF、30 ng/mLTPO、10 ng/mLFLT-3L组成，置于5% CO2，37℃恒温培养箱中培养细胞至Day 12，期间每3天半换液1次，获得CD34+/CD45+悬浮细胞。
本实施例中，培养皿包被基质包括但不限于：Mtrigel、Geltin、Lamin521或Fibronection。
(2) Day 12收取悬浮细胞进行流式检测，对所述悬浮细胞进行流式检测，检测方法见实施例2。
本实施例中，所述E8培养基可为stem cell公司产品，所述stempro-34、DMEM/F12Medium、TrypLE均可为Thermo公司产品，所述BMP4、Human Recombinant VEGF165 (VEGFA)、Human Recombinant SCF、Human Recombinant Flt-3L、Human Recombinant bFGF、HumanRecombinant TPO均可为peprotech公司产品，所述Y-27632、CHIR99021、SB431542均可为sigma公司产品，所述matrigel均可为康宁公司产品。
6、诱导CD34+/CD45+造血干细胞向NK细胞分化
(1) Day 13将上清收取到50 mL离心管中，250 g离心5 min，去除上清；
(2) 用SPM-NK完全培养基重悬细胞，其SPM-NK培养基由50% stempro-34完全培养、50% DMEM/F12、1% L-谷氨酰胺、50 μg/mL抗坏血酸、1×Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X)、20 ng/mL SCF、10 ng/mL Flt-3L、5 ng/mL IL-3、20ng/mL IL-7、50 ng/mL IL-15，放于5% CO2，37℃恒温培养箱中培养，期间每2天半换液1次；
(3) 分化第19天，将悬浮细胞收集到50 mL离心管中，250 g离心5 min，去除上清，加入新的不含IL-3的SPM-NK培养基重悬细胞，放于5% CO2，37℃恒温培养箱中培养，期间每2天半换液一次；
(4) 分化第26天，将上清转移到新的培养皿中，同时收集部分悬浮细胞流式检测CD45、CD122和CD56的表达情况；
(5) 分化第40天收取悬浮细胞，流式检测CD45、CD56、CD3、NKP46、Granzyme B的表达情况，检测方法见实施案例2；同时收集部分悬浮细胞，进行NK细胞的杀伤实验验证，具体实验方法见实施案例3。
本实施例中，所述E8培养基可为stem cell公司产品，所述stempro-34、DMEM/F12Medium、TrypLE均可为Thermo公司产品，所述BMP4、Human Recombinant VEGF165 (VEGFA)、Human Recombinant SCF、Human Recombinant Flt-3L、Human Recombinant bFGF、HumanRecombinant TPO、IL-3、IL-7、IL-15、IL-21均可为peprotech公司产品，所述Y-27632、CHIR99021、SB431542均可为sigma公司产品，所述matrigel均可为康宁公司产品。
实施例2 拟胚体流式检测和悬浮细胞流式检测
1、拟胚体流式检测
拟胚体流式检测的具体实验步骤如下：
(1) 将拟胚体转移到15 mL离心管中，20 g离心2 min，去除上清；
(2) 加入1 mL DPBS清洗后，20 g离心2min，去除上清；
(3) 加入1 mL 0.25%胰酶，37℃消化5 min，期间每隔2分钟吹打1次；
(4) 加入含有4% FBS的DPBS终止消化，250 g离心5 min，去除上清；
(5) 加入1 mL DPBS清洗细胞1次；
(6) 用100 μL含4% FBS的DPBS重悬细胞；
(7) 加入相应的流式检测抗体，4℃孵育30 min；
(8) 250 g离心去除上清，加入1 mL DPBS清洗细胞3次；
(9) 200 μL DPBS重悬细胞后进行上机检测。
2、悬浮细胞流式检测
悬浮细胞流式检测的具体实验步骤如下：
(1) 将上清转移到15 mL离心管中，250 g离心5 min，去除上清；
(2) 加入1 mL DPBS清洗细胞1次；
(3) 用100 μL含4% FBS的DPBS重悬细胞；
(4) 加入相应的流式检测抗体，4℃孵育30 min；
(5) 250 g离心去除上清，加入1 mL DPBS清洗细胞3次；
(6) 200 μL DPBS重悬细胞后进行上机检测。
3、实验结果
本发明诱导iPSC分化获得NK细胞的实验流程图见图1，iPS细胞在4倍光学显微镜下细胞形态结果图见图2，iPSC汇合度达到70%-80%开始进入分化；分化进程中Day 0、Day4、Day 5、Day 12、Day 26、Day 40细胞在4倍光学显微镜下细胞形态结果图见图3，结果显示，分化开始（Day 0）形成边缘光滑的拟胚体；分化第4天，拟胚体增大且出现明显的腔体；分化第5天，拟胚体周围延展出均一的生血内皮样细胞；分化第12天出现悬浮细胞；分化第26天悬浮细胞数量明显增加，并出现海马状的NK细胞形态细胞；分化第40天出现大量海马状NK形态细胞；分化第40天在20倍光学显微镜下观察NK细胞形态结果图见图4，结果显示，分化第40天悬浮细胞大多呈现NK细胞的海马状形态；分化第4天CD34、CD31和CD235表达情况检测结果图见图5，结果显示，分化第4天获得至少大于5%的CD34阳性细胞和至少5%的CD31阳性细胞，CD235阴性细胞比例不超过30%；分化第12天CD34和CD45表达情况检测结果图见图6，结果显示，分化第12天获得至少5%的CD34和CD45双阳性细胞；分化第26天CD122、CD45和CD56表达情况检测结果图见图7，结果显示，分化第26天获得至少5%的CD45和CD122阳性细胞，至少获得2%的CD56阳性细胞；分化第40天CD45和CD56阳性细胞表达情况检测结果图见图8，结果显示，分化第40天获得至少5%的CD45和CD56双阳性细胞，CD3阳性细胞不超过30%；分化第40天NK细胞相关maker检测结果图见图9，结果显示，分化第40天NKP46阳性细胞比例至少5%，Granzyme B阳性细胞比例至少5%。
实施例3 经诱导分化获得的NK细胞杀伤功能验证
1、实验方法
(1) 收集靶标肿瘤细胞和NK细胞，分别进行细胞计数。所述靶标肿瘤细胞包括人***癌LNCap细胞和人慢性髓系白血病K562细胞（LNCap细胞购自于Procell公司，K562购自于北纳生物科技有限公司）；
(2) 将NK细胞和肿瘤细胞按照0:1、0.5:1、1:1、2:1、4:1的靶标比接种到96孔板中，同时设置空白对照孔和相应的NK细胞单独培养孔，放于5% CO2，37℃恒温培养箱中培养；
(3) 3小时后每孔加入15 μL Alamar Blue，放于5% CO2，37℃恒温培养箱中培养；
(4) 分别在3小时和6小时后进行酶标仪检测。
2、实验结果
NK细胞杀伤功能验证实验结果图见图10，结果显示，杀伤6小时后，LNCap和K562细胞存活率随着E:T比例的增加而降低，表明了采用本发明所述的方法制备得到的NK细胞在短时间内即可发挥对肿瘤细胞的杀伤作用，且具有较强的肿瘤杀伤能力。
实施例4 不同实验条件对诱导iPSC分化得到CD34+细胞和NK细胞的影响
1、拟胚体（Embryoid bodies，EB）的形成
(1) iPSC（来源于北京呈诺医学科技有限公司）生长汇合度达到70%后，吸去上清，加入提前预热的DPBS清洗细胞两次，之后加入预热的Tryple Express消化细胞呈单细胞状态，终止消化离心后去除上清，加入含有10 μM ROCK通路抑制剂Y-27632的E8培养基+含有4mg/mL聚乙烯醇（PVA）的E8完全培养基重悬细胞，进行细胞计数；
(2) 调整细胞密度为1.5×103-2×104/mL，接种细胞到低吸附六孔板中进行悬浮培养，每孔3 mL培养基，即5-60万细胞每孔，其中A和B培养板放于5% CO2（常氧条件），37℃恒温培养箱中培养细胞24小时，另外C和D培养条件将培养板放于5% CO2，90% N2（缺氧条件），37℃恒温培养箱中培养细胞24小时，记为Day -1，形成EB；
本实施例中，所述ROCK通路抑制剂为0.5-20 μM的Y-27632；可发挥类似功能的小分子物质包括但不限于：Thiazovivin、Fasudil (HA-1077) HCl、GSK429286A、RKI-1447、Azaindole1。
2、诱导启动拟胚体向中胚层分化
分别将4个低吸附6孔板的EB转移到离心管中，20 g离心2 min后去除上清，加入含有10 μM GSK-3β抑制剂CHIR-99021的E8完全培养基，启动中胚层分化，记为Day 0，A和D培养板开始置于5% CO2，90% N2（缺氧条件），37℃恒温培养箱中培养细胞24小时。B和C培养板开始置于5% CO2（常氧条件），37℃恒温培养箱中培养24小时；
本实施例中，GSK-3β抑制剂为1-10 μM的CHIR-99021；可发挥类似功能的小分子物质包括但不限于：SB216763、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib、SB415286。
本实施例中，分化诱导基础培养基包括但不限于：E8完全培养基、StemPro-34、Stemline® II、STEMdiff™ APEL™2 Medium。
3、诱导中胚层细胞向CD34+生血内皮细胞（Hematopoietic endothelial cell，HEC）分化
(1) Day 1更换为SPM1培养基，SPM1培养基由50% stempro-34完全培养基、50%DMEM/F12培养基、1% L-谷氨酰胺、50 μg/mL抗坏血酸、1× Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)、50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF、50 ng/mL bFGF组成，将上述Day 0的EB重悬于SPM1培养基中，并将A和D培养板开始置于5% CO2，90% N2（缺氧条件），37℃恒温培养箱中培养细胞24小时。B和C培养板开始置于5% CO2（常氧条件），37℃恒温培养箱中培养24小时；
(2) Day 2更换为SPM2培养基，SPM2培养基为在SPM1基础上加入6 μM TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂SB431542，每孔加入3 mL，将上述Day 1的EB重悬于SPM2培养基中，并将A和D培养板开始置于5% CO2，90% N2（缺氧条件），37℃恒温培养箱中培养细胞24小时。B和C培养板开始置于5% CO2（常氧条件），37℃恒温培养箱中培养24小时；
(3) Day 3半换液，弃去一半旧的SPM2培养基，加入一半新的SPM2培养基；
(4) Day 4收取部分EB进行流式检测，检测方法见实施例2；
其中，A培养板：常氧（Day -1）+缺氧（Day 0- Day 4），B培养板：常氧（Day -1）+常氧（Day 0- Day 4），C培养板：缺氧（Day -1）+常氧（Day 0- Day 4），D培养板：缺氧（Day -1）+缺氧（Day 0- Day 4）。
本实施例中，所述TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂为1-6 μM SB431542，可发挥类似功能的小分子物质包括但不限于：Galunisertib (LY2157299)、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388。
剩余分化步骤同实施例1。并于分化第4天、第12天、第40天流式检测不同培养条件下的CD34+/CD235-细胞比例。
4、实验结果
不同实验条件下分化第4天的检测结果如图11A-11D所示，结果显示，分化第4天，常氧+缺氧的培养条件下的CD34+/CD235-细胞比例最高；不同实验条件下分化第12天的检测结果如图12A-12D所示，结果显示，分化第12天，常氧+缺氧的培养条件下的悬浮细胞CD34+/CD45+细胞比例最高；不同实验条件下分化第40天的结果如图13A-13D所示，结果显示，分化第40天，常氧+缺氧的培养条件下悬浮细胞CD56+/CD45+细胞比例最高。上述结果表明了常氧+缺氧的培养条件显著优于常氧+常氧、缺氧+缺氧、缺氧+常氧的培养条件。
实施例5 不同细胞密度对诱导iPSC分化得到CD34+细胞的影响
1、实验方法
在实施例1中的“2、拟胚体的形成”第(2)步骤中设置不同的细胞密度：1×105、2×105、4×105、6×105/mL，其余步骤同实施例1。
于分化第12天，流式检测不同起始细胞密度条件下CD34和CD43的表达情况。
2、实验结果
结果如图14所示，结果显示，随着细胞密度的增加，分化第14天，CD34和CD43双阳细胞比例逐渐降低，其中，1×105/mL细胞密度形成拟胚体的分化效率最高，因此，优选细胞密度范围为1×105-2×105/mL，最优选为1×105/mL。
实施例6 不同bFGF浓度对诱导iPSC分化得到CD34+细胞的影响
1、实验方法
在实施例1的“4、诱导中胚层细胞向CD34+生血内皮细胞（Hematopoieticendothelial cell，HEC）分化”阶段第(1)步的SPM1培养基中，设置不同的bFGF浓度：0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、100 ng/mL。其余步骤同实施例1。并于分化第4天收取细胞，流式检测CD34+的细胞比例。
2、实验结果
结果如图15所示，结果显示，在bFGF浓度低于50 ng/mL时，CD34+细胞比例随着bFGF浓度增加而增加。bFGF浓度达到75 ng/mL和100 ng/mL时，CD34+细胞比例随着bFGF浓度增加而减，因此，bFGF的浓度优选为25-75 ng/mL，最优选为50 ng/mL。
实施例7 不同TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂浓度对诱导iPSC分化得到CD34+细胞的影响
1、实验方法
在实施例1的“4、诱导中胚层细胞向CD34+生血内皮细胞（Hematopoieticendothelial cell，HEC）分化”阶段第(2)步的SPM2培养基中，设置不同的SB431542浓度：0mM和6 mM。其余步骤同实施例1。并于分化第6天和第12天收取细胞，流式检测CD34的表达情况。
2、实验结果
结果如图16所示，结果显示，与不加入TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7抑制剂SB431542相比，Day 2加入SB431542后，能够显著提高分化第6天和12天的CD34+细胞比例。
实施例8 本发明得到的iNK和脐血来源NK的标志物表达情况对比
1、实验方法
分离收取脐带血来源的NK细胞和本发明分化第40天得到的iNK细胞，分别流式检测CD45、CD56、CD3、CD94、NKp30、NKp44、NKp46、TRAIL、Granzyme B的表达情况。
2、实验结果
结果如图17A-17C所示，结果显示，脐血来源NK和分化获得iNK的CD45和CD56表达比例分别为96%和99%，脐血来源NK约有5%的CD3+细胞，而iNK约有1.5%的CD3+细胞；脐血来源NK和iNK均表达Granzyme B、CD94、NKP30、NKP44、NKP46、TRAIL且细胞比例差异不大，可见iNK的标志物检测结果达到脐血NK的水平，且CD45和CD56表达比例高达99%高于脐血来源NK的96%。
实施例9 本发明得到的iNK和脐血来源NK（CB NK）的肿瘤杀伤能力对比
1、实验方法
首先将人***癌LNCap-GFP细胞（购自于Procell公司）进行贴壁，96孔板每孔1万细胞，随后分别取脐血来源的NK细胞和本发明制备得到的iNK细胞，按照0、0.5、1、2、4、8不同的效靶比加入效应NK细胞，每个效靶比进行3次重复检测，将培养板放到incucyte监测仪器中对GFP信号进行检测，得到CB NK和iNK的杀伤曲线。
2、实验结果
结果如图18所示，结果显示，CB NK和本发明制备得到的iNK在效靶比1：1及大于1：1时，对靶细胞的杀伤效果一致，在效靶比为0.5时，本发明制备得到的iNK比CB NK的肿瘤杀伤能力更强，表明了本发明制备得到的iNK对靶细胞的杀伤能力与脐血来源NK一致甚至更强。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (15)

1.一种诱导iPSC分化制备获得CD34+细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基和第四阶段培养基；
所述第一阶段培养基为含有ROCK通路抑制剂和聚乙烯醇的E8完全培养基；
所述第二阶段培养基为含有GSK-3β抑制剂的E8完全培养基；
所述第三阶段培养基包括SPM1培养基和SPM2培养基；
所述第四阶段培养基为SPM3培养基；
所述SPM1培养基包括stempro-34完全培养基、DMEM/F12培养基、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、BMP4、VEGF、bFGF；
所述SPM2培养基包括所述SPM1培养基和TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂；
所述SPM3培养基包括stempro-34完全培养基、DMEM/F12培养基、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、bFGF、VEGF、SCF、TPO、FLT-3L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述第一阶段培养基中的ROCK通路抑制剂为Y-27632；
所述第二阶段培养基中的GSK-3β抑制剂为CHIR-99021；
所述第三阶段培养基中的TGF-β I型受体ALK5，ALK4和ALK7的抑制剂为SB431542；
所述第一阶段培养基中Y-27632的浓度为0.5-20 μM；
所述第一阶段培养基中聚乙烯醇的浓度为2-6 mg/mL；
所述第二阶段培养基中CHIR-99021的浓度为1-20 μM；
所述第三阶段培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、BMP4、VEGF、bFGF、SB431542的浓度分别为（0.1-5）%、（10-100）μg/mL、（0.1-5）×、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（1-10）μM；
所述第四阶段培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、bFGF、VEGF、SCF、TPO、FLT-3L的浓度分别为（0.1-5）%、（10-100）μg/mL、（0.1-5）×、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（10-100）ng/mL、（1-50）ng/mL。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述第一阶段培养基中Y-27632的浓度为10 μM；
所述第一阶段培养基中聚乙烯醇的浓度为4 mg/mL；
所述第二阶段培养基中CHIR-99021的浓度为10 μM；
所述第三阶段培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、BMP4、VEGF、bFGF、SB431542的浓度分别为1%、50 μg/mL、1×、50 ng/mL、50 ng/mL、50 ng/mL、6 μM；
所述第四阶段培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、bFGF、VEGF、SCF、TPO、FLT-3L的浓度分别为1%、50 μg/mL、1×、50 ng/mL、50 ng/mL、50 ng/mL、30 ng/mL、10 ng/mL。
4.一种诱导iPSC分化制备获得NK细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基、第四阶段培养基、第五阶段培养基；
所述第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基、第四阶段培养基为权利要求1-3中任一项所述的第一阶段培养基、第二阶段培养基、第三阶段培养基、第四阶段培养基；
所述第五阶段培养基为SPM-NK培养基；
所述SPM-NK培养基包括stempro-34完全培养基、DMEM/F12培养基、L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、SCF、Flt-3L、IL-3、IL-7、IL-15；
所述SPM-NK培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、SCF、Flt-3L、IL-3、IL-7、IL-15的浓度分别为（0.1-5）%、（10-100）μg/mL、（0.1-5）×、（10-50）ng/mL、（1-20）ng/mL、（1-10）ng/mL、（10-50）ng/mL、（1-100）ng/mL。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述SPM-NK培养基中L-谷氨酰胺、抗坏血酸、ITS-X、SCF、Flt-3L、IL-3、IL-7、IL-15的浓度分别为1%、50 μg/mL、1×、20 ng/mL、10ng/mL、5 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL。
6.一种诱导iPSC分化成CD34+细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 第一阶段，Day -1，在常氧条件下，采用权利要求1-3中任一项所述的第一阶段培养基对iPSC进行悬浮培养，形成拟胚体；
(2) 第二阶段，Day 0，在缺氧条件下，采用权利要求1-3中任一项所述的第二阶段培养基对所述拟胚体进行诱导培养，形成中胚层细胞；
(3) 第三阶段，Day 1- Day 4，在缺氧条件下，采用权利要求1-3中任一项所述的第三阶段培养基对所述中胚层细胞进行诱导培养，形成CD34+生血内皮细胞；
(4) 第四阶段，Day 5- Day 12，在常氧条件下，采用权利要求1-3中任一项所述的第四阶段培养基对所述CD34+生血内皮细胞进行诱导培养，形成CD34+/CD45+细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述形成拟胚体包括如下步骤：Day -1，将iPSC消化至单细胞状态，接种细胞，加入第一阶段培养基进行重悬培养，形成拟胚体；
所述接种细胞密度为1×105-2×105/mL；
步骤(3)中所述形成CD34+生血内皮细胞包括如下步骤：
(a) Day 1，将所述中胚层细胞在SPM1培养基中进行诱导培养；
(b) Day 2，将所述SPM1培养基更换为SPM2培养基进行诱导培养；
(c) Day 3，半换液，弃去一半旧的SPM2培养基，加入一半新的SPM2培养基；
(d) Day 4，拟胚体贴壁培养，形成CD34+生血内皮细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述接种细胞密度为1×105/mL；
步骤(1)中所述培养的条件为5% CO2，37℃恒温培养；
步骤(2)中所述培养的条件为5% CO2，90% N2，37℃恒温培养；
步骤(3)中所述培养的条件为5% CO2，90% N2，37℃恒温培养；
步骤(4)中所述培养的条件为5% CO2，37℃恒温培养。
9.一种诱导iPSC分化成NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括在权利要求6-8中任一项所述的方法基础上进行如下步骤：第五阶段，Day 13-Day 40，在常氧条件下，采用权利要求4中所述的第五阶段培养基对所述CD34+/CD45+细胞进行诱导培养，形成NK细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第五阶段包括如下步骤：
a) Day 13-Day 18，将所述CD34+/CD45+细胞在第五阶段培养基中进行悬浮培养；
b) Day 19-Day 40，将所述第五阶段培养基更换为不含IL-3的第五阶段培养基进行悬浮培养，形成NK细胞；
所述培养的条件为5% CO2，37℃恒温培养。
11.一种CD34+细胞群体或其衍生物或一种NK细胞群体或其衍生物，其特征在于，所述CD34+细胞群体为采用权利要求6-8中任一项所述的方法诱导分化得到的，所述NK细胞群体为采用权利要求9所述的方法诱导分化得到的；
所述CD34+细胞群体同时表达CD45；
所述CD34+细胞群体衍生物为CD34+细胞群体诱导分化得到的造血细胞系细胞群体；
所述CD34+细胞群体诱导分化得到的造血细胞系细胞群体包括T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞。
12.一种用于治疗和/或预防血液***疾病和/或自身免疫性疾病和/或实体瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求11所述的CD34+细胞群体或其衍生物、NK细胞群体或其衍生物。
13.权利要求1-3中任一项所述的培养基在诱导iPSC分化制备获得CD34+细胞中的应用。
14.权利要求4所述的培养基在诱导iPSC分化制备获得NK细胞中的应用。
15.权利要求11所述的CD34+细胞群体或其衍生物、NK细胞群体或其衍生物在制备治疗和/或预防血液***疾病和/或自身免疫性疾病和/或实体瘤的药物中的应用。
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