WO2010087594A2 - 시디９３ 또는 이의 가용성 단편의 용도 - Google Patents

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    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Definitions

  • CD93 Human CD93 (CD93) (C1qRp, AA4.1 (mouse)) is a type 1 transmembrane glycoprotein located on chromosome 20, p11.21 (Malhotra, R. et al., 1993. Immunology 78: 341-348 Nepomuceno, RR et al., 1997. Immunity 6: 119-129; Steinberger, P. et al., 2002. Biol . 71: 133-140). The protein has been reported to be involved in cell-cell interactions and phagocytosis in B cell development (Petrenko, O. et al., 1999. Immunity 10: 691-700; Norsworthy, PJ et al. , 2004. J.
  • CD93 consists of a total of 652 amino acids and contains a leader sequence, a c-type carbohydrate-cognitive domain, five EGF-like domains, a mucin domain, a membrane transmembrane domain, and an intracellular domain of 47 amino acids.
  • CD93 is also expressed in myeloid lineage, hematopoietic stem cells, NK cells, platelets, microglia and endothelial cells (Nepomuceno, RR et al., 1997). Immunity 6: 119; Nepomuceno, RR et al., 1998. J. Immunol. 160: 1929; Danet GH et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 10441-5; Lovik G. et al., J. Immunol 2000; 30: 3355-62; Fonseca MI et al., J Leukoc Biol 2001; 70: 793-800; Webster, SD et al., 2000. J. Leukocyte Biol.
  • CD93 is not expressed in tissue macrophage but is expressed in vascular endothelial cells (Petrenko, O. et al., 1999. Immunity 10: 691; Dean, YD et al., J. Immunol. 31: 1370; Fonseca, MI et al., 2001. J. Leukocyte Biol. 70: 793.).
  • the potential of CD93 to be involved in C1q-mediated enhancement of phagocytosis in phagocytosis in the results with anti-CD93 antibodies has been raised as a potential receptor for C1q.
  • CD93-related polymorphs are useful for the diagnosis of type 1 diabetes and lupus erythematosus.
  • WO 2008/082519 discloses that CD93-related polymorphs are useful for the diagnosis of type 1 diabetes and lupus erythematosus.
  • WO 2008/082519 discloses that CD93-related polymorphs are useful for the diagnosis of type 1 diabetes and lupus erythematosus.
  • the present inventors have studied the association with inflammation of CD93 or soluble fragments thereof, and by confirming that the soluble fragment of CD93 has excellent anti-inflammatory efficacy, and that CD93 or soluble fragments thereof are overexpressed in an inflammation inducing substance or inflammatory environment, Soluble fragment of CD93 can be used as an active ingredient of an anti-inflammatory composition, and the present invention was completed by revealing that CD93 or a soluble fragment thereof can be used as a marker for diagnosing an inflammatory disease.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing inflammatory disease using CD93 or a soluble fragment thereof, and a method for diagnosing inflammatory disease using the same.
  • the present invention provides an anti-inflammatory composition as an active ingredient specific antibody to the CD93 water-soluble fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides an anti-inflammatory composition
  • an anti-inflammatory composition comprising at least one selected from the group consisting of siRNA, shRNA and shRNA expression vectors capable of inhibiting the expression of the CD93 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 as an active ingredient. .
  • the present invention also provides a method of treating inflammation comprising administering the composition to an individual suffering from inflammation.
  • the present invention also provides a method for preventing inflammation, comprising administering the composition to a subject.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing inflammatory diseases comprising an antibody or aptamer specifically binding to CD93 or a soluble fragment thereof.
  • the present invention provides a method for diagnosing an inflammatory disease using the kit for diagnosing an inflammatory disease.
  • the present invention can provide an anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising an antibody against a soluble fragment of CD93 as an active ingredient, it can be usefully used for the prevention or treatment of inflammatory diseases using the composition.
  • the present invention can provide the use of CD93 or a soluble fragment thereof as a diagnostic marker for inflammatory diseases, and can be usefully used for monitoring or diagnosing inflammatory diseases using the markers.
  • FIG. 1 is a diagram showing the amino acid sequence of the full-length CD93 protein (Fig. 1A) and the amino acid sequence of the sCD93 protein (Fig. 1B).
  • Figure 2 is an electrophoresis picture after the expression and purification of sCD93_Fc in HEK293E cells. Where N is the protein in the unreduced state and R is the protein in the reduced state.
  • 3 to 6 show the effect of sCD93 protein to induce differentiation of THP-1 cells into macrophages.
  • Figure 3 is a photograph showing the degree of attachment of THP-1 cells to the dish surface.
  • FIG. 5 is a photograph showing the degree of differentiation of THP-1 cells into macrophages.
  • 6 is a graph showing the expression level of macrophage differentiation markers.
  • Figure 7 is an electrophoresis picture of phospho-Erk 1/2, phospho-p38 and total p38 quantified by Western blot.
  • FIG. 8 is an electrophoresis photograph of phospho-Erk 1/2 quantified with time after sCD93 protein treatment.
  • Figure 9 shows the results of measuring the expression level of TNF- ⁇ and IL-6 after sCD93 protein treatment at the RNA level.
  • 11 is a result of measuring the expression level of IL-12, CXCL12, SPHK-1 and CLEC4A at the protein level after sCD93 protein treatment.
  • Figure 13 is an electrophoresis picture showing the effect of sCD93 protein on the expression of matrix metalloprotein protease (MMP).
  • MMP matrix metalloprotein protease
  • FIG. 14 is a photograph showing the induction effect of phagocytosis of sCD93 protein.
  • 15 is a FACS analysis graph showing the induction effect of phagocytosis of sCD93 protein.
  • 16 is a graph showing the effect of inhibiting TNF- ⁇ production of CD93 protein antibody.
  • 17 is a graph showing the inhibitory effect of siRNA's production of TNF-a and IL-6 on CD93 gene.
  • FIG. 18 is a graph showing the results of analyzing CD93 expression on the cell surface by FACS after treatment with LPS, TNF-a or PMA to THP-1 cells, which are human monocytes.
  • 20 is a graph showing the results of quantitative measurement of CD93 mRNA expression on the surface of cells after treatment with LPS or PMA on THP-1 cells by RT-PCR.
  • 21 is a graph showing the results of analysis of mouse CD93 expression by FACS in peritoneal macrophages after injection of PBS, thioglycolate, and LPS into mice.
  • FIG. 22 shows the results of Western blot expression of PBMCs and peritoneal macrophages after injection of PBS, thioglycolate, and LPS into mice.
  • Fig. 23 is a graph showing the results of measuring the amount of mouse CD93 soluble fragments by sandwich ELISA method in serum and peritoneal fluid after injection of PBS, thioglycolate, and LPS into mice.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of staining the synovial tissue obtained from rheumatoid arthritis patients (RA) and degenerative arthritis patients (OA) with CD93 antibody and analyzed the expression pattern by immunohistochemistry.
  • FIG. 25 shows the results of measuring the amount of CD93 soluble fragment in synovial fluid obtained from rheumatoid arthritis patients (RA) and degenerative arthritis patients (OA) by sandwich ELISA.
  • the present invention provides an anti-inflammatory composition
  • an antibody specific for sCD93 which is a CD93 soluble fragment, as an active ingredient.
  • the present invention also provides the use of a specific antibody against sCD93, a CD93 soluble fragment, in the manufacture of an anti-inflammatory composition.
  • THP-1 cells which are human-derived monocytes
  • the present inventors mediated the activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) to differentiate THP-1 cells into macrophages and phagocytosis.
  • inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • MAPK is known to be activated by inflammation-inducing substances such as bacterial lipid polysaccharides to promote the secretion of inflammatory cytokines, and MMP is known to promote its secretion in the process of inducing an inflammatory response.
  • the present inventors focus on the inflammatory response inducing effect of sCD93, and when the antibody is treated with THP-1 cells, the cytokine TNF-a, which is known to be produced primarily by activated monocytes or macrophages, is reduced. It could also be confirmed.
  • the present invention is provided based on these experimental results, and the anti-inflammatory pharmaceutical composition of the present invention is characterized in that it contains an antibody specific for sCD93 as an active ingredient.
  • anti-inflammatory is meant to include the prevention, amelioration, treatment, and delayed onset of inflammation or inflammatory disease.
  • inflammatory disease may be defined as any condition specified as a local or systemic biological defense response to external physical or chemical stimuli or infection of an external infectious agent such as bacteria, fungi, viruses, and various allergens. This response activates various inflammatory mediators and enzymes associated with immune cells (eg iNOS, COX-2, etc.), secretion of inflammatory mediators (eg NO, TNF- ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ , PGE 2) . ), Accompanied by a series of complex physiological reactions such as fluid infiltration, cell migration, tissue destruction, etc., and are manifested externally by symptoms such as erythema, pain, edema, fever, deterioration or loss of certain functions of the body.
  • immune cells eg iNOS, COX-2, etc.
  • secretion of inflammatory mediators eg NO, TNF- ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ , PGE 2 .
  • Accompanied by a series of complex physiological reactions such as fluid infiltration, cell
  • the inflammatory disease may be acute, chronic, ulcerative, allergic or necrotic, so as long as any disease is included in the definition of an inflammatory disease as above, whether it is acute, chronic, ulcerative, allergic or Irrespective of necrosis
  • the inflammatory diseases include asthma, allergic and non-allergic rhinitis, chronic and acute rhinitis, chronic and acute gastritis or enteritis, ulcerative gastritis, acute and chronic nephritis, acute and chronic hepatitis, chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary fibrosis Irritable bowel syndrome, inflammatory pain, migraine, headache, back pain, fibromyalgia, fascia disease, viral infection (eg, type C infection), bacterial infection, fungal infection, burn, wound by surgical or dental surgery, pro Prostaglandin E excess syndrome, atherosclerosis, gout, arthritis, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, Hodgkin's disease, pancre
  • active ingredient alone refers to a component that can exhibit the desired activity, or itself can exhibit activity with a pharmaceutically acceptable carrier and the like without activity.
  • pharmaceutically acceptable The meaning of "pharmaceutically acceptable” will be described below.
  • telomere binding refers to the case where an antibody forms an antigen-antibody conjugate with its target protein, sCD93, and does not substantially form such a conjugate with other proteins. "Substantially” herein means that a low but nonspecific conjugate can be formed. The meaning of the "specific binding” may be expressed in other words that the binding is determined by a specific structure of the protein, that is, the epitope which is the determining site of the antigen.
  • epitope refers to an amino acid region (antigen determinant) of a part having antigenic or immunogenicity in sCD93 which is a target protein. Epitopes will typically include at least 10 amino acids. Such epitopes can be identified by known epitope analysis methods known in the art, such as phage display, reverse immunogenetics, and the like.
  • antibody is meant to include all forms of the specific binding to the target protein sCD93.
  • monoclonal antibodies polyclonal antibodies, multispecific antibodies (ie, antibodies having binding specificities for two or more antigens or two or more epitopes, eg bispecific antibodies, etc.), humanized antibodies, human antibodies.
  • fragments of antibodies, recombinant antibodies, and chemically modified antibodies that possess the ability to specifically bind to the target protein sCD93 are included.
  • the humanized antibody refers to an antibody in which the complementarity determining region (CDR) of human immunoglobulin is replaced with CDRs of non-human species such as mice, rabbits, rats, and primates, and minimizes immune rejection reactions.
  • CDR complementarity determining region
  • the human antibody refers to an antibody obtained by introducing a human immunoglobulin gene into an animal such as a mouse which has destroyed a gene capable of producing endogenous immunoglobulin and immunizing a specific antigen with the animal.
  • a human immunoglobulin gene obtained by introducing a human immunoglobulin gene into an animal such as a mouse which has destroyed a gene capable of producing endogenous immunoglobulin and immunizing a specific antigen with the animal.
  • Specific examples are described in Jakobovits et al., Proc, Natl. Acad, Sci. USA, 90: 2551 (1993), Jakobovits et al., Nature , 362: 255-258 (1993), Bruggermann et al., Year in Immuno. , 7: 33 (1993), Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio. , 222: 581-597 (19
  • fragments of the antibody include Fab, F (ab '), F (ab') 2 , scFv (an antibody in which the Fv of the heavy or light chain is linked with a suitable linker), Fv fragment, Fab / c (one Fab and a complete Fc).
  • Antibody linear antibody (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995)), genes for antibody fragments, fragments obtained by treating the antibody with a protein cleavage enzyme such as papain, pepsin As described below, it is meant to include antibody fragments obtained by introduction and expression into host cells by genetic recombination methods.
  • the globulin type of the antibody is not particularly limited as long as it specifically binds to sCD93, which is a target protein.
  • the globulin type may be any one of IgG, IgM, IgA, IgE, IgY, and IgD.
  • Polyclonal antibodies are target proteins for birds (e.g. chickens), mammals (e.g. rabbits, goats, horses, sheep, mice, non-human primates (monkeys, chimpanzees, gorillas, etc.). It can be prepared by immunizing sCD93. Usually, 6 to 60 days after the last immunization date, the antibody titer is measured by enzyme immunoassay (EIA and ELISA), radioimmunoassay (RIA), and the like. Antibodies can be purified from the blood of an immunized animal using methods known or conventional in the art, such as ion exchange chromatography, affinity-chromatography and the like.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies specific for the target protein sCD93.
  • a method for producing such hybridoma cell lines for example, an animal (eg, a mouse) is immunized with a target protein sCD93, splenocytes are taken from the immunized animal, and the spleen cells are fused to a myeloma cell line, Therefore, the method of generating a hybridoma cell and identifying the hybridoma cell line which produces the target monoclonal antibody is mentioned. Isolation or recovery of monoclonal antibodies from such cell lines is possible by known or conventional art.
  • sCD93 a target protein as an immunogen
  • mammals such as rats, mice, rabbits, monkeys, goats, and non-human primates (monkeys, chimpanzees, gorillas).
  • Single doses of an immunogen may be appropriately determined by one skilled in the art within the scope of their usual capacity, taking into account the type of immune animal, the route of administration, and the like. Typically, it will be about 50-200 ⁇ g per animal.
  • Administration can usually be carried out by diluting or suspending an immunogen in an appropriate amount of PBS (phospate-buffered saline), physiological saline, or the like, and mixing and emulsifying the usual adjuvant, followed by subcutaneous and intraperitoneal injection.
  • PBS phospate-buffered saline
  • physiological saline or the like
  • mixing and emulsifying the usual adjuvant followed by subcutaneous and intraperitoneal injection.
  • Such administration will take place 2 to 10 times, preferably 3 to 4 times, at intervals of days to weeks after the initial administration, preferably at intervals of 1 to 4 weeks.
  • the antibody titer was measured in the serum of the immunized animal by the ELISA method or the like. When the antibody titer reached the plateau, the immunogen was finally administered intravenously or intraperitoneally. After 5 days antibody producing cells are harvested.
  • the antibody producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the
  • hybridoma cell line producing monoclonal antibodies specific for the administered immunogen, that is, the target protein of the present invention, sCD93.
  • Such hybridomas can be produced and identified by known or conventional techniques in the art. Normally, antibody-producing cells, preferably spleen cells, are harvested from immunized animals, the splenocytes are fused to myeloma cell lines to produce hybridoma cells, and hybridomas that produce monoclonal antibodies that bind to immunogens. You will go through the steps of identifying cell lines. Myeloma cell lines used for fusion with antibody-producing cells can be cell lines derived from animals such as mice, which are commercially available.
  • Preferred myeloma cell lines are derived from immune and allogeneic animals, have drug selectivity for antibiotics, etc., and survive in HAT selection medium containing hypoxanthine, aminoputerine and thymine without being fused with spleen cells. It is desirable to have a property that cannot survive and can survive only in the state of fusion with spleen cells.
  • Specific examples of the myeloma cell line include P3X63 (ATCC TIB9), which is a HGPRT (hypoxantine guanine phosporibosyl-transferase) deficient cell line derived from BALB / c mice.
  • a cell fusion promoter polyethylene glycol and the like having an average molecular weight of 1500 to 4000 daltons may be used at a concentration of about 10 to 80%.
  • an adjuvant such as dimethyl sulfoxide may be used in combination to increase the fusion efficiency.
  • it can also be fused using a commercially available cell fusion device.
  • the desired hybridomas should be selected.
  • the cell suspension is appropriately diluted with fetal calf serum-containing RPMI-1640 medium or the like, and then, the microtiter plate is divided into about 2 million cells per well, selection medium is added to each well, and then appropriately exchanged with the same selection medium. Incubate while supplying fresh medium. Incubation temperature is 20-40 degreeC normally.
  • the myeloma cell line is an HGPRT-deficient or thymidine kinase-deficient line
  • selective hybridization of only the antibody-producing cells and myeloma cell line can be performed by using a selection medium (HAT medium) containing hypoxanthine, aminopretin or thymidine.
  • hybridomas can be cultured and expanded. Then, cells grown about 14 days after the start of the culture in the selection medium can be obtained as hybridomas. The presence of the antibody of interest is then screened in the supernatant culture of the propagated hybridomas. Screening of such hybridomas can be done according to known or conventional techniques in the art. Such techniques include, for example, enzyme immunoassay (EIA: Enzyme Immuno Assay and ELISA), radioimmunoassay, and the like. Cloning of fusion cells can be accomplished by a limiting dilution method or the like.
  • the cloned hybridomas may be cultured in animal cell culture media such as 10% fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, DMEM medium, and serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). . Incubation period is about 2 to 10 days. Monoclonal antibodies can be obtained from their upper cultures.
  • animal cell culture media such as 10% fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, DMEM medium, and serum-free medium under normal culture conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 concentration).
  • Incubation period is about 2 to 10 days.
  • Monoclonal antibodies can be obtained from their upper cultures.
  • Monoclonal antibodies can be recovered using techniques known or conventional in the art. As such a known or conventional technique in the art, methods such as ammonium sulfate salting method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, or a combination thereof are mentioned.
  • mRNA encoding the variable region (V region) of the antibody of the present invention is obtained from a hybridoma producing the antibody of the present invention.
  • Obtaining such mRNA is known or conventional in the art, such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry., Vol 18, 5294-5299, 1979), AGPC method (Chomczynski, P. et. al., Anal. Biochem., 162, 156-159) and the like to obtain total RNA and from the total mRNA to obtain the desired mRNA using the mRNA Purification Kit (Pharmacia) and the like.
  • mRNA may be obtained directly by using the QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • cDNA of the antibody variable region is synthesized using reverse transcriptase. If necessary, RACE PCR may be applied to cDNA synthesis or amplification.
  • the cDNA encoding the variable region thus obtained is inserted into an expression vector containing DNA encoding the constant region (C region) of the antibody.
  • expression vectors may include regulatory sequences such as promoters, enhancers, replication initiation points, polyadenylation signals, ribosomal binding sites, and the like, as described below in connection with a method for recombinant DNA production of sCD93, a target protein of the present invention.
  • Expression of the antibody gene may be recombined with the DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or the light chain (L chain) into an expression vector, respectively, to co-transform host cells, or the single expression of DNA encoding the heavy and light chains.
  • the host cell may be transformed by inserting it into a vector (WO 94/11523).
  • sCD93 the target protein of the present invention as an immunogen used to obtain the antibody of the present invention
  • a cDNA of sCD93, the target protein of the present invention is prepared and inserted into the expression vector, the expression vector is transformed into prokaryotic or eukaryotic host cells, and the transformed host cell is cultured in a suitable medium. Or from the culture or cells.
  • the cDNA can be produced within the range of ordinary skill of those skilled in the art based on the gene sequence provided by a gene / protein database such as GenBank or the like.
  • a DNA synthesis apparatus using the phosphoramidite method or the like, an RT-PCR method, a hybridization method for obtaining a desired cDNA from a cDNA library, and the like can be used. You can also amplify.
  • the expression vectors are biotechnology companies such as Novagen, Takarashujo, Qiagen, Stratagene, Promega, Roche Diagnositics. Commercially available from, Inc., Invitrogen, Genetics Institute.
  • Such expression vector facilitates regulatory elements other than DNA encoding sCD93, the target protein of the present invention, for example, promoters, enhancers, polyadenylation signals, ribosomes, binding sites, replication initiation points, terminators, selection markers, isolation or purification. Labeled peptide sequences (eg, nucleotide sequences encoding histidine repeat sequences) and the like.
  • Host cells include prokaryotic cells such as bacteria (e.g., Escherichia coli, Bacillus subtilis), and yeast (e.g. Saccharomyces cerevisiae ), insect cells (e.g. Sf cells), mammalian cells (e.g. For example, eukaryotic cells such as COS, CHO, and BHK can be used.
  • prokaryotic cells such as bacteria (e.g., Escherichia coli, Bacillus subtilis), and yeast (e.g. Saccharomyces cerevisiae ), insect cells (e.g. Sf cells), mammalian cells (e.g.
  • eukaryotic cells such as COS, CHO, and BHK can be used.
  • Purification of the target protein of the present invention from the host cell or its culture includes ultrafiltration, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography (when labeled peptide is bound), HPLC, hydrophobic chromatography, isoelectric point chromatography, and the like. Method or a combination thereof may be used.
  • a fragment thereof a fragment of sCD93 or a full-length protein (CD93 itself) may be used. This is because an antibody obtained by using a fragment or full-length protein may also possess the ability to specifically bind to the target protein of the present invention.
  • the present invention also provides an anti-inflammatory composition comprising at least one selected from the group consisting of siRNA, shRNA and shRNA expression vector capable of inhibiting the expression of the CD93 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a use of at least one selected from the group consisting of siRNA, shRNA and shRNA expression vectors capable of inhibiting the expression of the CD93 gene in the production of anti-inflammatory compositions.
  • the present inventors confirmed that when the siRNA for the CD93 gene was treated with THP-1, the expression of inflammatory cytokines TNF-a and IL-6 was increased when LPS (lipopolysaccharide) treatment, which is an inflammation-inducing substance, was reduced.
  • LPS lipopolysaccharide
  • RNAi small interfering RNA
  • shRNA short haripin RNA
  • RISC RNA induced gene sciencing complex
  • RNAi are involved in helicases and endonucleases, which release the double-stranded RNA of the siRNA, and the antisense binds to the mRNA of the target gene, which is bound by an endonuclease Degradation (Cell 101, 25-33, 2000; Science 296, 1265-1269, 2002; J. Biol. Chem. 2003 Feb 28: 278 (9): 7108-18).
  • siRNA refers to a double stranded RNA having 10 to 40 base pairs, preferably 15 to 30 base pairs, more preferably at least 10 to 40 base pairs capable of inducing RNAi phenomena relative to the RNA of the target gene. Double stranded RAN with 20 to 22 base pairs. Such siRNA may have a blunt end or an overhang end, and with an overhang end it is possible at both the 3 'end and the 5 end. Preferably it is a case where the 3 'end protrudes. The number of bases of the protruding ends may be 1 to 5, preferably 2 to 3 bases.
  • shRNA refers to a double stranded RNA of hairpin structure having a loop region of 2 to 10 bases. Bases of such loop regions can be used known in the art (Proc. Natl. Acad. Sci. US A 99 (8): 5515-5520, 2002; Nature Biotechnology 20: 505-508, 2002; Nature Biotechnology 20 : 500-505, 2002; Nat Cell Biol. 5: 489-490, 2003; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (9): 6047-6052, 2002). Since the double stranded portion of the shRNA can be configured in the same manner as the siRNA, the description regarding the siRNA can be applied as it is.
  • an expression vector of shRNA means a vector capable of expressing shRNA in a cell by including a coding sequence of shRNA.
  • the shRNA coding sequence is composed of a spacer sequence constituting a loop region and a partial sequence of the CD93 gene and a sequence complementary to some sequences of the CD93 gene.
  • the shRNA coding sequence may be RNA or DNA depending on the expression vector to be used. And operably linked to regulatory sequences of the expression vector (e.g., promoter, polyaninated signal, etc.).
  • the expression vector may be an expression vector derived from a plasmid or a lentiviral vector. Expression vectors derived from plasmids include biotechnology such as Promega (Cat Nos.
  • Genscript (Cat.Nos. SD1201, SD1202, SD1207).
  • Commercially available from the company can be purchased or used in-house, and the disclosure of WO2004 / 065549 can be referred to the use of lentivirus vectors.
  • composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the antibody to the sCD93, siRNA, shRNA and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the antibody to the sCD93, siRNA, shRNA and the like.
  • “Pharmaceutically acceptable” means here that the subject of application (prescription) does not have more toxicity (adequately low toxicity) to which the subject of application (prescription) is applicable without inhibiting the activity of the active ingredient.
  • examples of such carriers include water, saline, dextrose, glycerol, ethanol, polyalcohols (eg mannitol, sorbitol), sodium chloride and the like.
  • compositions of the present invention may also include preservatives, antioxidants, wetting agents, emulsifiers, buffers, nonionic surfactants, and the like, to extend their shelf life or preserve their effectiveness. Suitable as such preservatives, antioxidants, wetting agents and the like are known in the art.
  • compositions of the present invention may be formulated in a variety of forms, such as, but not limited to, liquid solutions, suspensions, syrups, tablets, pills, and the like.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally to a mammal, including humans, usually by intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular injection as in biopharmaceuticals containing the antibody as an active ingredient. It may be administered but is not limited thereto.
  • the dosage of the composition of the present invention will be determined by a medical professional according to the flow rate of the active ingredient of the composition, the severity of the disease, the weight of the patient, the form of the drug, the route of administration, and the duration of administration, usually 0.01 ⁇ g / kg per day. It may be determined within the range of to 100 mg / kg, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a marker for diagnosing inflammatory disease containing CD93 or a soluble fragment thereof as an active ingredient.
  • the CD93 preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 33, but is not limited thereto.
  • the CD93 soluble fragment is an extracellular portion (ectodomain) released after the cell culture of the CD93 protein, which is a transmembrane protein, preferably about 95 kDa, but is not limited thereto.
  • CD93 The expression of CD93 according to the present invention is increased by LPS and TNF-a in THP-1 cells, which are human monocytes, but not much by PMA treatment.
  • the amount of CD93 soluble fragment is all increased by LPS, TNF-a, PMA treatment.
  • mouse CD93 expression in macrophages in peritoneal cells is most increased by LPS treatment, and similarly by thioglycolate treatment.
  • the amount of CD93 soluble fragment in serum is not significantly changed by LPS or thioglycolate, but the amount of CD93 soluble fragment in peritoneal fluid is significantly increased by LPS or thioglycolate treatment.
  • CD93 expression was significantly higher in synovial tissue obtained from rheumatoid arthritis patients than in synovial tissue obtained from patients with degenerative arthritis, and the amount of CD93 soluble fragment in synovial fluid obtained from rheumatoid arthritis patients was significantly higher than that of degenerative arthritis patients. appear.
  • the CD93 or soluble fragment thereof according to the present invention increases CD93 expression and increases the amount of CD93 soluble fragment by or in an inflammatory environment. Therefore, the CD93 or soluble fragment thereof according to the present invention can be usefully used as a diagnostic marker of inflammatory disease.
  • the inflammatory diseases include asthma, allergic and non-allergic rhinitis, chronic and acute rhinitis, chronic and acute gastritis or enteritis, ulcerative gastritis, acute and chronic nephritis, acute and chronic hepatitis, chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary fibrosis, irritability Bowel Syndrome, Inflammatory Pain, Migraine, Headache, Back Pain, Fibromyalgia, Fascia Disease, Viral Infection, Bacterial Infection, Fungal Infection, Burn, Surgical or Dental Surgery, Prostaglandin E Over Syndrome, Atherosclerosis Sclerosis, gout, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, Hodgkin's disease, pancreatitis, conjunctivitis, iris, peritonitis, uveitis, dermatitis, eczema, multiple sclerosis, and the like.
  • the present invention also provides an inflammatory disease diagnostic kit comprising an antibody or aptamer specifically binding to CD93 or a soluble fragment thereof.
  • the present invention also provides the use of an antibody or aptamer specifically binding to CD93 or a soluble fragment thereof for the preparation of an inflammatory disease diagnostic kit.
  • the inflammatory disease diagnostic kit can be easily prepared by a manufacturing method commonly used in the art using the CD93 of the present invention or a soluble fragment marker thereof.
  • the aptamer is a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) that has a stable tertiary structure in itself and is characterized by high affinity and specificity for binding to a target molecule.
  • the inflammatory disease diagnostic kit includes an antibody that specifically binds CD93 or a soluble fragment thereof, a secondary antibody conjugate conjugated with a label that is developed by reaction with a substrate, a solution of a chromogenic substrate that will develop a color reaction with the label, It may include a washing solution and a solution for stopping the enzyme reaction.
  • the present invention also provides a method of diagnosing an inflammatory disease using the CD93 of the present invention or a soluble fragment marker thereof.
  • the method is preferably performed by the following steps, but not limited to:
  • the biological sample is preferably one or more selected from the group consisting of tissues, cells, blood, serum, peritoneal fluid, synovial fluid, saliva, urine and feces, but is not limited thereto.
  • the label of the secondary antibody conjugate is preferably a conventional coloring agent that undergoes a color reaction, and includes horseradish peroxidase (HRP), basic alkaline phosphatase, colloid gold, and FITC (poly L).
  • HRP horseradish peroxidase
  • FITC poly L
  • -lysine-fluorescein isothiocyanate fluorescent materials such as rhodamine-B-isothiocyanate (RITC)
  • dyes may be used.
  • the chromogenic substrate solution is preferably used according to the label, TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) and the like can be used.
  • the color development substrate is more preferably provided in a dissolved state in a buffer solution (0.1M NaOAc, pH 5.5).
  • the wash preferably comprises phosphate buffer, NaCl and Tween 20, more preferably a buffer consisting of 0.02 M phosphate buffer, 0.13 M NaCl, and 0.05% Tween 20 (PBST).
  • the washing solution is preferably washed three to six times by reacting the secondary antibody with the antigen-antibody conjugate and then adding an appropriate amount to the fixed body.
  • sulfuric acid solution may be used as the reaction terminating solution.
  • the present invention can detect CD93 or soluble fragment thereof through an antigen-antibody binding reaction using an antibody that specifically binds CD93 or a soluble fragment thereof in a biological sample, thereby predicting the diagnosis or prognosis of an inflammatory disease early.
  • the biological sample includes, but is not limited to, tissue, cells, blood, serum, peritoneal fluid, synovial fluid, saliva, urine or feces.
  • CD93 or a soluble fragment thereof in a biological sample is subjected to electrophoresis on SDS-PAGE, fractionated and transferred to a fixture, followed by immobilization of the antibody to specifically bind to the immobilized CD93 or a soluble fragment thereof. Is performed and the expression level of CD93 or a soluble fragment thereof is measured. In other words, high expression levels of CD93 or soluble fragments thereof in a biological sample are predicted to have or be likely to have an inflammatory disease.
  • a nitrocellulose membrane a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF), a 96-well plate synthesized with polyvinyl or polystyrene resin, glass slide glass, or the like may be used.
  • PVDF polyvinylidene difluoride membrane
  • the antigen-antibody binding reaction is conventional enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), sandwich ELISA, Northern blot, Western blot, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, fluorescence immunoassay It can be measured using a method such as, enzyme substrate coloration, antigen-antibody aggregation, surface plasmon resonance (SPR), biochip (DNA, RNA), electrophoresis, PCR, RT-PCR.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • sandwich ELISA Western blot
  • Western blot Western blot
  • immunoprecipitation immunohistochemical staining
  • fluorescence immunoassay It can be measured using a method such as, enzyme substrate coloration, antigen-antibody aggregation, surface plasmon resonance (SPR), biochip (DNA, RNA), electrophoresis, PCR, RT-PCR.
  • pMEP4 (Invitrogen, USA) was used as a template with a forward primer (5'-gt agatct gcaggaaaggacaagc-3 '; SEQ ID NO: 27) and a reverse primer (5'-cg agatct ggttgacttccctaatgt-3'; SEQ ID NO: 28) using the PCR reaction under the conditions of 95 °C 30 seconds, 60 °C 30 seconds, 72 °C 1 minutes, 30 cycles, the 2187 bp PCR product using a PCR purification kit (Promega, USA) Purified.
  • a forward primer 5'-gt agatct gcaggaaaggacaagc-3 '; SEQ ID NO: 27
  • a reverse primer 5'-cg agatct ggttgacttccctaatgt-3'; SEQ ID NO: 28
  • the PCR product was then cleaved with Bgl II enzyme (Invitrogen, USA), and the cleavage product was purified again.
  • the purified cleavage fragment was inserted into a linearized vector using Bgl II enzyme (Invitrogen, USA) at the Bgl II recognition site on the CMV promoter of pcDNA3.1 (Invitrogen, USA), and then transformed into E. coli. Transformants were obtained (pcDNA3.1-oriP). After extracting the plasmid from the transformant in a conventional manner, it was confirmed whether oriP was properly inserted through sequencing.
  • a pLCN-MoH vector (Korean Patent No. 450266) was used as a template, 'Bam HI-SfiI-human immunoglobulin.
  • Fc N-terminal sequence 'forward primer (5'-cgg gat cc g gcc gtg ggg gcc gac aaa a ct cac aca tgc c-3': SEQ ID NO: 29) and 'XbaI-stop codon-human immunoglobulin Fc C- PCR reaction was performed using a reverse primer (5'-cgagtc tca ttt acc cgg aga cag gga-3 ': SEQ ID NO: 30) consisting of a terminal sequence' (94 ° C., 4 min, 95 ° C., 30 sec, 60 ° C., 30 sec., 72 ° C., 1 min, repeated 30 times, followed by 72 ° C., 10 min).
  • PCR products were then purified using the PCR Purification Kit (Promega, USA).
  • the purified PCR product was digested with restriction enzymes BamH I and Xba I and then inserted into the oriP prepared pcDNA3.1 vector (pcDNA3.1-oriP), which was also digested with BamH I and Xba I, pcDNA3.1-oriP-Fc was prepared.
  • E. coli (DH5a) was transformed with the recombinant plasmid prepared as described above, the transformant was isolated, and a plasmid was obtained to confirm that the polynucleotide encoding the Fc was correctly inserted. This completes the pYW600.
  • HEK293E cells In order to express / purify sCD93_Fc in animal cells, HEK293E cells, an expression vector capable of expressing sCD93_Fc was prepared.
  • a CD93 plasmid (Kugi, HMU003993, Kugi No. IRAT-49-A06) was used as a template, and 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCACGGGAGCTGACACGGAGGC-3 '(SEQ ID NO: 31) was used as a forward primer. 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGTCCACACAGTCCAGCTGAC-3 '(SEQ ID NO: 32) was used as the reverse primer.
  • PCR reaction conditions of CD93 are as follows. After the treatment for 2 minutes at 94 °C for the initial denaturation process, 30 seconds at 94 °C, 30 seconds at 55 °C, 30 times repeated for 1 minute at 72 °C, was extended for 10 minutes at 72 °C. PCR products were digested with Sfi I, followed by CMV IE Enhancer / Promoter and Leader sequence, followed by the CD93 gene, followed by 6X His tag, Fc, Myc, and 8X His tag. The pYK-602 vector was inserted into the pYK-CD93_Fc vector.
  • sCD93_Fc 20 ⁇ g of the prepared pCD93_Fc and 40 ⁇ g of Polyethylenimine (PEI, Polysciences) were mixed and introduced into HEK293E cells previously grown in 150 mm dish. Cultures were collected and filtered every 2 days for a total of 8 days, and then purified using Protein A sepharose (Amersham). The purified sample was quantified with PIERCE (Coomassie protein assay reagent) and placed on an SDS-PAGE gel to confirm its size (FIG. 2). In the reduced state (R), sCD93_Fc was about 70 kDa and in the non-reduced state (N), it was about 140 ⁇ 150 kDa.
  • PIERCE Concentrassie protein assay reagent
  • THP-1 cells which are human acute monocytic leukemia cells, differentiate into macrophage through adherence, spreading, and maturation by chemicals such as PMA.
  • sCD93 induced the differentiation of THP-1 cells into macrophages.
  • THP-1 cells purchased from ATCC
  • PBS, Fc (5 ⁇ g / ml) and normal human IgG (hIgG, 5 ⁇ g / ml) were added to each negative control group, and PMA (Sigma, 0.1 ⁇ g / ml) was treated to the positive control group.
  • the experimental group was treated with sCD93_Fc 5, 1, 0.2, 0.04 ⁇ g / ml concentration. After treatment, the cells were placed in a culture chamber at 37 ° C. for 30 minutes and then taken out again, and the non-attached cells were removed by tapping so that the adhered cells did not fall off.
  • FIG. 3 After washing twice more with PBS, pictures were taken with an optical microscope (Leika) (FIG. 3). The number was calculated using a hematocytometer (Marienfeld, Germany) as a culture supernatant containing non-stick cells. The remaining number minus the non-stick cell count was expressed as a percentage. THP-1 cells did not adhere to the negative control group, but in the experimental group treated with sCD93_Fc, it was observed that the degree of adhesion (%) was increased (FIG. 4).
  • THP-1 cells which are monocyte cells according to the differentiation of THP-1 cells, actually differentiate into macrophages, CD14, a known macrophage and dendritic cell, and neutrophil differentiation marker
  • Real-time PCR was performed to measure RNA expression levels of CD1a and CD64.
  • THP-1 cells were treated with PBS (-) and hIgG 5 ⁇ g / ml as negative controls, and positive controls were treated with 0.1 ⁇ g / ml PMA.
  • the experimental group was treated with 5 ⁇ g / ml of sCD93_Fc and after 24 hours, LPS was treated to determine the sensitivity by LPS.
  • RNA was isolated and purified (Qiagen RNA miniprep kiT). CDNA was synthesized by reverse transcription (iScript cDNA synthesis kit, Bio-Rad) of 1 ⁇ g of purified RNA. Quantitative-PCR was performed on the cDNA using the primers of Table 1 below, iG SYBR Green supermix (Bio-Rad) and CFX-96 Real-time system (Bio-Rad).
  • THP-1 cells were differentiated into macrophages by sCD93 treatment, and the RNA level of CD14, a differentiation marker, was further increased by LPS treatment (FIG. 6).
  • THP-1 cells were treated with PBS (-), Fc 5 ⁇ g / ml and hIgG 5 ⁇ g / ml as negative controls, and the positive control treated with 0.1 ⁇ g / ml PMA.
  • the experimental group treated sCD93_Fc at 5, 1, 0.2, 0.04 ⁇ g / ml concentration.
  • the resultant was placed in 37 culture chambers for 30 minutes and then taken out again. After dissolution with lysis buffer, western blot was performed.
  • As the primary antibody cell siganaling
  • phospho-Erk 1/2 Cell signaling
  • phospho-p38 Cell signaling
  • total-p38 Cell signaling
  • THP-1 cells were treated with PBS (-) and hIgG 5 / ml as negative controls, positive controls were treated with 0.1 ⁇ g / ml PMA, and experimental groups were treated with sCD93_Fc.
  • LPS was treated to determine susceptibility by LPS.
  • RNA was isolated and purified (Qiagen RNA miniprep kiT). CDNA was synthesized by reverse transcription of purified RNA 1 (iScript cDNA synthesis kit, Bio-Rad).
  • Quantitative-PCR was performed on the cDNA using the primer sequences shown in Table 2 below, iG SYBR Green supermix (Bio-Rad) and CFX-96 Real-time system (Bio-Rad).
  • the sCD93_Fc treatment slightly increased pro-inflammatory cytokine TNF-a, IL-1b, IL-6 at the RNA level, and significantly increased by further treatment with LPS (FIGS. 9 to 11).
  • TNF-a in inflammatory cytokines was measured at the protein level according to the differentiation of THP-1 cells and the change of MAPK signal.
  • THP-1 cells were treated with PBS (-), hIgG 5 ⁇ g / ml as a negative control group, and 0.1 ⁇ g / ml PMA as a positive control group, and sCD93_Fc as an experimental group.
  • LPS was treated to determine susceptibility by LPS.
  • the amount of TNF-a in the culture supernatant was measured using a Quantikine TNF-a assay kit (R & D system).
  • the amount of TNF-a was slightly increased.
  • TNF-a was measured relatively higher than the experimental group treated with LPS only. This shows that THS-1 cells were differentiated into macrophages by sCD93_Fcdp to increase susceptibility to TLR signal (FIG. 12).
  • THP-1 cells were treated with 5 ⁇ g / ml of hIgG as a negative control, and the positive control was treated with 0.1 ⁇ g / ml of PMA.
  • sCD93_Fc was treated at 5, 1, 0.2 ⁇ g / ml concentration.
  • the expression changes of MMP-9 (92kDa) and MMP-2 (72kDa) contained in the culture supernatant were observed using Gelatin Zymography assay.
  • phagocytosis was measured using bacteria expressing mRFP (E. coli).
  • E. coli bacteria expressing mRFP
  • THP-1 cells were treated with 5 ⁇ g / ml of sCD93_Fc and incubated for 3 days, and then E. coli transformed with previously grown RFP (red fluorescent protein) expression vectors were put into THP-1 cells differentiated.
  • RFP red fluorescent protein
  • THP-1 cells were treated with PBS (-) and hIgG 5 ⁇ g / ml as negative controls, and 0.1 ⁇ g / ml PMA as positive controls, and sCD93_Fc 5 ⁇ g / ml and the anti-CD93 polyclonal antibody as experimental groups. 10 ⁇ g / ml of polyclonal antibody (R & D system) was treated. After 24 hours, LPS was treated for susceptibility by 1 ⁇ g / ml of LPS. After 24 hours after LPS treatment, the amount of TNF-a contained in the culture supernatant was measured using a Quantikine TNF-a assay kit (R & D system).
  • the amount of TNF-a was slightly increased in the experimental group treated with sCD93_Fc only, and the TNF-a was measured in the experimental group treated with sCD93_Fc and LPS relatively higher than the experimental group treated with LPS only.
  • the anti-CD93 antibody treatment was found to inhibit the increase of TNF-a by more than 50 ⁇ 60%.
  • the siRNA inhibition of CD93 in THP-1 cells was tested by real-time PCR for the amount of cytokine change when knocking down CD93.
  • THP-1 cells 2 ⁇ 10 5 (medium: 10% FBS (Hyclone) + RPMI1640 (Hyclone)) were placed in 24 wells, followed by Lipofectamin RNAiMax (Invitrogen) 1 ul and CD93 siRNA (siCD93). (Bioneer) 10 pmole was mixed and left for 10 minutes, and then transfected into pre-loaded THP-1 cells. Negative control siRNA (Bioneer) was used as a negative control and full-length CD93 (CD93_Full) gene (Kugi distribution, hMU003993, Kugi No. IRAT-49-A06) was used as a positive control. Transfection. After storage in a CO 2 incubator for 12 hours, LPS was treated, and then further incubated for an additional 24 hours. Thereafter, real-time PCR was performed on TNF-a and IL-6 in the same manner as described in Examples 2 and 3.
  • the amount of both proinflammatory cytokines was decreased by siCD93 treatment, and the amount increased by LPS was also decreased.
  • the CD93_Full treatment group overexpressing CD93 increased the amount of TNF-a or IL-6 and showed a further increase by LPS treatment (FIG. 17).
  • Example 8 CD93 expression and amount of CD93 soluble fragments in THP-1 cells, which are human monocytes in vitro )
  • CD93 expression in human monocytes, THP-1 cells, and the amount of CD93 soluble fragments in culture supernatants were measured.
  • THP-1 cells contain 10% fetal calf serum, penicillin G (100 IU / ml), streptomycin (100 ⁇ g / ml), L-glutamine (2 mM), HEPES (10 mM), sodium pyruvate (1.0 mM). Cultured in 37 cell culture in RPMI 1640 medium. Cultured THP-1 cells were treated with PBS, LPS (1.0 ⁇ g / ml), TNF-a (0.5 ⁇ g / ml) or PMA (0.1 ⁇ g / ml) for 24 hours and fixed with 4% paraformaldehyde for 20 minutes. It was. Washed once with PBS, blocked for 30 minutes using 3% NGS (normal goat serum) and then washed again three times.
  • the goat anti-human CD93 antibody (R & D systems) was cooled and reacted for 1 hour. After washing three times with PBS again, and cold-cooled for 1 hour with anti-goat IgG-FITC antibody and stained. As a control group, each experimental group was separately stained with anti-CD14-FITC antibody. Each stained cell was analyzed using a flow cytometer (EPICS Elite (Coulter)).
  • the cell surface expression of CD93 in THP-1 cells was increased by LPS and TNF-a, but not significantly by PMA treatment (FIG. 18).
  • the expression of the cell surface of CD14 used as a control was all reduced by LPS, TNF-a, PMA treatment, which is considered to be due to fragmentation of CD14. Fragmentation of CD14 is known to be an important mechanism in down-modulation of monocyte-macrophage activation (Schutt, C. 1999. Cd14. Int. J. Biochem. Cell Biol. 31: 545. 23. Le ... -Barillec, K., M. Si-Tahar, V. Balloy, and M. Chignard 1999.
  • THP-1 cells include 10% fetal calf serum, penicillin G (100 IU / ml), streptomycin (100 /), L-glutamine (2 mM), HEPES (10 mM), sodium pyruvate (1.0 mM) Cultured in 37 cell culture in RPMI 1640 medium. Cultured THP-1 cells were treated with PBS, LPS (1.0 ⁇ g / ml), TNF-a (0.5 ⁇ g / ml) or PMA (0.1 ⁇ g / ml) for 24 hours, followed by lysate and culture supernatant. Got. The sample was boiled for 5 minutes and then stored frozen. Samples were loaded onto 8% SDS-PAGE gels and then electrophoresed.
  • the gel was transferred back to the nitrocellulose membrane and blocked with 4% skim milk. Thereafter, goat anti-CD93 antibody (R & D systems) was diluted to 0.5 ⁇ g / ml and reacted at room temperature for 1 hour. After washing three times with PBST, the anti-goat IgG-HRP antibody (Santa cruz) was 0.5 ⁇ g / ml and reacted at room temperature for 1 hour. Anti- ⁇ actin (Santa cruz) and anti-goat IgG-HRP (Santa cruz) were used as internal controls. The ECL kit (ECL Plus, Amersham, USA) was then processed according to the manufacturer's method.
  • CD93 As a result, as shown in FIG. 19, self-expression of CD93 molecules was increased by LPS and TNF-a treatment, but not by PMA treatment, similar to FACS results. However, the amount of CD93 soluble fragment was all increased by LPS, TNF-a, PMA treatment (FIG. 19).
  • the expression of CD93 itself increases, especially considering that the amount of CD93 soluble fragment also increases. It is contemplated that CD93, or a soluble fragment thereof, may be utilized as a diagnostic marker for inflammatory diseases.
  • THP-1 cells were cultured in 6-well plates and treated with PBS, LPS (1.0 ⁇ g / ml, InvivoGen) and PMA (0.1 ⁇ g / ml, Sigma), respectively.
  • RNA was identified 24 hours after treatment using the RNA Identification Kit (Qiagen).
  • reverse transcriptase Bio-Rad
  • dNTP dNTP
  • the CFX96 system Bio-Rad was used for real-time PCR analysis. Initial denaturation at 95 ° C. for 3 minutes, followed by annealing at 95 ° C. for 15 seconds, and elongation at 60 ° C. for 1 minute at 40-45 cycles was performed.
  • Primer sets were as follows (CD93: forward primer CTC TGG GGC TAC TGG TCT ATC (SEQ ID NO: 34), reverse primer TGT CGG ACT GTA CTG GTT CTC (SEQ ID NO: 35)); GAPDH: forward primer CAT GTT CGT CAT GGG TGT GAA (SEQ ID NO: 36), reverse primer GGA CTG TGG TCA TGA GTC CTT (SEQ ID NO: 37)].
  • CD93 expression in THP-1 cells was significantly increased by LPS and PMA treatment (FIG. 20).
  • CD93 expression in mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and peritoneal cells after injection of peritonitis or an inflammation-inducing substance (thioglycollate or LPS) in mice Aspects and the amount of CD93 soluble fragment in serum and peritoneal lavage fluid (PLF) were measured.
  • 6-week-old balb / C mice were injected with 1 ml of PBS, 4% thioglycolate or 0.1 mg / ml of LPS and maintained for 3 days. Three days later, blood was collected from mice using heparin-coated glass capillary tubes via retro-orbital vein and centrifuged to obtain serum and PBMC cells. Immediately, mice were sacrificed to obtain peritoneal fluid (PLF) and peritoneal cells (mostly intraperitoneal macrophages) from the intraperitoneal cavity. In order to remove red blood cells contained in each cell, 10 ml of red blood cell lysing buffer (Sigma) was reacted twice at 37 ° C. for 10 minutes to completely remove red blood cells.
  • PPF peritoneal fluid
  • peritoneal cells mostly intraperitoneal macrophages
  • Example ⁇ 8-1> fluorescent dyeing was carried out in the same manner as described above in Example ⁇ 8-1>.
  • antibodies both anti-mouse CD93 antibodies (R & D systems) and anti-sheep IgG-FITC (Santa Cruz) were used.
  • double staining was performed using a CD11b antibody (BD sciences), a differentiation marker.
  • mouse CD93 expression in macrophages among peritoneal cells showed the greatest increase by LPS treatment and similarly increased by thioglycolate treatment (FIG. 21). Therefore, it can be seen that macrophages present in PBMCs were transferred to the peritoneum by treatment with thioglycolate and LPS in mice.
  • the sandwich ELISA method was used to determine the CD93 soluble fragment in serum and peritoneal fluid (PLF). The amount was measured.
  • the amount of CD93 soluble fragment in serum was not significantly changed by LPS or thioglycolate.
  • the amount of CD93 soluble fragment in peritoneal fluid was significantly increased by LPS or thioglycolate treatment (FIG. 23). Therefore, it is thought that the CD93 soluble fragment may be utilized as a diagnostic marker of inflammatory disease.
  • Synoviium tissue from three patients with rheumatoid-arthritis (RA) and two patients with osteo-arthritis (OA) was fixed overnight with 4% paraformaldehyde. Subsequently, cleavage was performed by dehydration with alcohol and embedding with paraffin. It was then reacted with methanolic H 2 O 2 to eliminate the intrinsic peroxidase activity. It was also blocked for 2 hours with 3% NGS (normal goat serum) to eliminate nonspecific reactions. The tissues were then reacted with goat anti-human CD93 antibody (R & D), biotinylated anti-chlorine IgG, streptavidin-peroxidase complex (Vector, Peterboredgh, UK) for 1 hour each. The stained tissues were counter stained with hematoxylin again and observed with an Olympus microscope (Tokyo, Japan).
  • CD93 expression was significantly higher in synovial tissue obtained from rheumatoid arthritis patients than in synovial tissue obtained from degenerative arthritis patients (FIG. 24).
  • the expression of CD93 molecules was significantly higher in synovial lining, sublining, and perivascular region where lymphocyte infiltration occurs.
  • the amount of CD93 soluble fragment in synovial fluid obtained from 8 patients with rheumatoid arthritis and 8 patients with degenerative arthritis was measured using a sandwich ELISA method.
  • rat anti-human CD93 antibody R & D systems
  • PBST 93-well Bekcon Plates
  • SF synovial fluid
  • the cells were left for 1 hour with 1 ⁇ g / ml goat anti-human CD93 antibody (R & D systems), followed by 1 ⁇ g / ml anti-goat IgG-HRP antibody (Santa cruz) for 1 hour. Reacted. After washing three times with PBST again, the color was developed using OPD (Sigma), and the OD value was measured using a spectrophotometer. The measured values were each quantified using a standard curve.
  • the CD93 molecule or soluble fragment thereof may be utilized as a diagnostic marker for inflammatory diseases.
  • the present invention can be usefully used to develop therapeutics and diagnostic kits for various inflammatory diseases.

Abstract

본 발명은 CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항염증성 조성물, CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용한 염증성 질환 진단 방법, 및 염증성 질환 진단 키트에 관한 것이다.

Description

시디９３ 또는 이의 가용성 단편의 용도
시디93(CD93) 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항염증성 조성물, 염증성 질환 진단 방법, 및 염증성 질환 진단 키트에 관한 것이다.
인간 시디93(CD93)(C1qRp, AA4.1(mouse))은 염색체 20번, p11.21에 위치한 타입 1 막 통과 당단백질이다(Malhotra, R.et al., 1993. Immunology 78: 341-348; Nepomuceno, R. R. et al., 1997. Immunity 6: 119-129; Steinberger, P. et al., 2002. Biol. 71: 133-140). 상기 단백질은 B 세포 발달에 있어서 세포-세포간 상호작용과 식세포작용(phagocytosis)에 관련되어진 것으로 보고되어 있다(Petrenko, O. et al., 1999. Immunity 10: 691-700; Norsworthy, P. J. et al., 2004. J. Immunol. 172: 3406-3414; Nepomuceno, R. R. et al., 1997. Immunity 6: 119-129; McGreal, E. P. et al., 2002. J. Immunol. 168: 5222-5232).
CD93은 총 652개 아미노산으로 구성되어지며, 리더서열, c-타입 탄수화물-인지 도메인, 5개의 EGF-유사 도메인, 뮤신 도메인, 하나의 막 통과 도메인, 47개 아미노산의 세포내 도메인을 포함하고 있다(Nepomuceno R. R. et al., 1997. Immunity 6:119-129; Park, M. et al., 2003. J. Cell Physiol. 196: 512-522; Nepomuceno, R. R. et al., J. Immunol. 162:3583). 또한, CD93은 골수계(myeloid lineage), 조혈모세포(hematopoietic stem cell), NK 세포, 혈소판, 소교세포 (microglia) 및 혈관내피세포(endothelial cell) 등에서 발현되어 진다(Nepomuceno, R. R. et al., 1997. Immunity 6:119; Nepomuceno, R. R. et al., 1998. J. Immunol. 160:1929; Danet G. H. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:10441-5; Lovik G. et al., J Immunol 2000; 30:3355-62; Fonseca M. I. et al., J Leukoc Biol 2001; 70:793-800; Webster, S. D. et al., 2000. J. Leukocyte Biol. 67:109). 또 다른 연구결과에서는 CD93이 대식세포(tissue macrophage)에서는 발현되지 않으나, 혈관내피(vascular endothelial) 세포에서는 많이 발현된다고 보고되어 있다(Petrenko, O. et al., 1999. Immunity 10:691; Dean, Y. D. et al., J. Immunol. 31:1370; Fonseca, M. I. et al., 2001. J. Leukocyte Biol. 70:793.). CD93은 원래 항-CD93 항체를 이용한 결과에서 식세포작용의 C1q-매개 증강(C1q-mediated enhancement of phagocytosis)에 관여한다고 하여 C1q에 대한 수용체로서의 가능성이 제기되어 왔다. 그러나 연이은 실험에서 C1q와 직접 결합하지 않는 것으로 여러 그룹에서 보고되었다(Nepomuceno, R. R. et al. 1999. J. Immunol. 162:3583; McGreal, E. P. et al., 2002. J. Immunol. 168:5222; Steinberger, P. et al., 2002. J. Leukocyte Biol. 71:133).
CD93 녹-아웃 마우스 실험에서는 CD93의 부재에 의해 사멸세포의 제거 기능에 문제가 생기는 것으로 밝혀졌고, 시험관내(in vitro) 실험에서는 그런 기능 이상이 보여지지 않는 상반된 결과가 도출되었다(Guan, E. et al., 1994. J. Immunol. 152: 4005-4016; Norsworthy, P. J. et al., 2004. J. Immunol. 172: 3406-3414; Norsworthy, P. J. et al., 2004. J. Immunol. 172: 3406-3414). 이러한 식세포작용 기능은 면역반응에서 초기에 중요한 역할을 담당하고 있으며, 세포사멸된 세포들의 제거에 중요한 역할을 하고 있다(Brown, E. J. (1995) Phagocytosis. Bioessays 17, 109-117).
이런 기능들에 대한 실마리를 푸는 최근 연구 결과에서, CD93이 TNF-a, LPS 등의 초기 염증단계(pro-inflammatory state)에서 세포외 부분(ectodomain)이 잘려지는 단편화(shedding)가 일어난다는 보고가 있었다(Park, M. et al., 2003. J. Cell Physiol. 196: 512-522.; Suzanne S. Bohlson et al., 2005. J. immunol. 175: 1239-1247). 또한, CD93과 같은 계열 세포인 U937 세포에서 PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate) 처리에 의해 단편화가 일어나 가용성 단편으로 잘려진다는 보고도 있었다(Ikewaki N., Tamauchi H., and Inoko H. 2007. Decrease in CD93 expression in a human monocyte-like cell line (U937) treated with various apoptosis-inducing chemical substances. Microbiol. Immunol., 51(12):1189-1200). 아울러, 국제공개특허 WO 2008/082519호에는 CD93-관련 다형체가 제 1형 당뇨병과 홍반성 낭창의 진단에 유용하다고 기재되어 있다. 그러나, CD93을 염증성 질환 치료 또는 진단에 사용한 보고는 없다.
이에, 본 발명자들은 CD93 또는 이의 가용성 단편의 염증과 관련성을 연구한 결과, CD93의 가용성 단편이 우수한 항염증 효능을 가지며, CD93 또는 이의 가용성 단편이 염증 유도 물질 또는 염증성 환경에서 과발현되는 것을 확인함으로써, CD93의 가용성 단편은 항염증성 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있으며, CD93 또는 이의 가용성 단편은 염증성 질환 진단용 마커로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 CD93의 가용성 단편을 이용한 항염증성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 CD93 또는 이의 가용성 단편을 이용한 염증성 질환 진단용 키트, 및 이를 이용한 염증성 질환 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CD93 수용성 단편에 대한 특이적인 항체를 유효성분으로 항염증성 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 CD93 유전자의 발현을 억제할 수 있는, siRNA, shRNA 및 shRNA의 발현벡터로부터 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 염증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증의 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 염증성 질환 진단용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 염증성 질환 진단용 키트를 이용하여 염증성 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 CD93의 가용성 단편에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 항염증성 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물을 이용하여 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 CD93 또는 이의 가용성 단편을 염증성 질환의 진단 마커로의 용도를 제공할 수 있으며, 상기 마커를 이용하여 염증성 질환의 모니터링 또는 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 전장의 CD93 단백질의 아미노산 서열(도 1A)과 sCD93 단백질의 아미노산 서열(도 1B)을 나타낸 그림이다.
도 2는 HEK293E 세포에서 sCD93_Fc를 발현 및 정제한 후의 전기영동 사진이다. 여기서 N은 환원되지 아니한 상태의 단백질이고, R은 환원된 상태의 단백질이다.
도 3 내지 도 6은 sCD93 단백질의 THP-1 세포의 대식세포로의 분화 유도 효과를 보여주는 결과이다.
도 3은 THP-1 세포가 디쉬(dish) 표면에 부착된 정도를 보여주는 사진이다.
도 4는 THP-1 세포의 부착율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 THP-1 세포가 대식세포로 분화한 정도를 보여주는 사진이다.
도 6은 대식세포 분화 표지의 발현 정도를 보여주는 그래프이다.
도 7 내지 도 11은 sCD93 단백질의 MAPK 신호 활성화 효과를 보여주는 결과이다.
도 7은 phospho-Erk 1/2, phospho-p38 및 전체 p38을 웨스턴 블럿으로 정량화한 전기영동 사진이다.
도 8은 phospho-Erk 1/2이 sCD93 단백질 처리 후의 시간에 따라 정량화한 전기영동 사진이다.
도 9는 sCD93 단백질 처리 후 TNF-α 및 IL-6의 발현량을 RNA 수준에서 측정한 결과이다.
도 10은 sCD93 단백질 처리 후 IL-1β 및 iNOS의 발현량을 단백질 수준에서 측정한 결과이다.
도 11은 sCD93 단백질 처리 후 IL-12, CXCL12, SPHK-1 및 CLEC4A의 발현량을 단백질 수준에서 측정한 결과이다.
도 12는 sCD93 단백질 처리 후 TNF-α의 발현량을 단백질 수준에서 측정한 결과이다.
도 13은 sCD93 단백질이 기질금속단백질프로테아제(MMP)의 발현에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 14는 sCD93 단백질의 식세포 작용의 유도 효과를 보여주는 사진이다.
도 15는 sCD93 단백질의 식세포 작용의 유도 효과를 보여주는 FACS 분석 그래프이다.
도 16는 CD93 단백질 항체의 TNF-α 생성 저해 효과를 보여주는 그래프이다.
도 17은 CD93 유전자에 대한 siRNA의 TNF-a 및 IL-6의 생성 저해 효과를 보여주는 그래프이다.
도 18은 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포에 LPS, TNF-a 또는 PMA를 처리한 후, 세포 표면에서의 CD93 발현 양상을 FACS로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 THP-1 세포에 LPS, TNF-a 또는 PMA를 처리한 후, 세포 표면에서의 CD93 발현 양상과 이의 가용성 단편을 웨스턴 블롯으로 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.
도 20은 THP-1 세포에 LPS 또는 PMA를 처리한 후, 세포 표면에서의 CD93 mRNA 발현을 RT-PCR로 측정하여 정량한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 마우스에 PBS, 티오글리콜레이트, LPS를 주사한 후, 마우스 CD93의 발현 양상을 복막 대식세포에서 FACS로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 마우스에 PBS, 티오글리콜레이트, LPS를 주사한 후, 마우스 CD93의 발현 양상을 PBMC와 복막 대식세포에서 웨스턴 블롯으로 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.
도 23은 마우스에 PBS, 티오글리콜레이트, LPS를 주사한 후, 마우스 CD93 가용성 단편의 양을 혈청과 복막액에서 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24은 류마티스성 관절염 환자(RA)와 퇴행성 관절염 환자(OA)로부터 얻은 활막 조직을 CD93 항체로 염색하여 그 발현 양상을 면역조직화학 방법으로 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 25는 류마티스성 관절염 환자(RA)와 퇴행성 관절염 환자(OA)로부터 얻은 활막액에 존재하는 CD93 가용성 단편의 양을 샌드위치 ELISA 방법으로 측정한 결과를 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 CD93 수용성 단편인 sCD93에 대한 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CD93 수용성 단편인 sCD93에 대한 특이적인 항체를 항염증성 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명자들은 sCD93을 인간 유래 단구 세포인 THP-1 세포에 처리하였을 때, 미토젠-활성화 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinases, MAPK)의 활성화가 매개되어 THP-1 세포가 마크로파지로 분화하고 식세포 작용이 유도되며, 또 TNF-α, IL-1β, IL-6 등의 염증성 사이토카인의 분비가 증가하고, 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 분비가 촉진되는 등 염증 반응이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
상기에서 MAPK는 세균성 지질 다당류 등 염증 유발 물질에 의하여 활성화되어 염증성 사이토카인의 분비 등을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, MMP는 염증 반응이 유도되는 과정에서 그 분비가 촉진되는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 이러한 sCD93의 염증 반응 유도 효과에 착안하여, 그것의 항체를 THP-1 세포에 처리하였을 때 활성화된 단핵세포나 대식세포에 의해 일차적으로 생성되는 것으로 알려진 사이토카인인 TNF-a가 감소하는 것도 확인할 수 있었다.
본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 항염증성 약학적 조성물은 sCD93에 대한 특이적인 항체를 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
본 명세서에서, "sCD93"은 전장의 CD93 단백질에서 떨어져 나온 CD93 단백질의 수용성 단편을 의미하며 그것의 아미노산 서열과 염기서열은 <도 1B> 및 <서열번호 1 및 2>에 개시되어 있다. 본 명세서에서 표적 단백질은 특별히 다른 언급이 없는 한 sCD93을 의미한다. 전장의 CD93 단백질의 서열은 <도 1A> 및 <서열번호 3>에 개시되어 있으며, 상기 단백질 유전자의 염기서열은 <서열번호 4>에 개시되어 있다.
본 명세서에서, "항염증성"의 의미는 염증이나 염증성 질환의 예방, 개선, 치료, 및 발병 지연을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리 또는 화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.
본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 약학적으로 허용되는 담체 등과 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다. 상기 "약학적으로 허용되는"의 의미에 대해서는 아래에서 설명될 것이다.
본 명세서에서, "특이적 결합"의 의미는 항체가 그 표적 단백질인 sCD93과 항원-항체 결합체를 형성하고, 다른 단백질과는 실질적으로 그러한 결합체를 형성하지 않는 경우를 의미한다. 여기서 "실질적으로"란 정도는 낮지만 비특이적인 결합체는 형성될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 "특이적 결합"의 의미는 달리 표현할 경우 그 결합이 단백질의 특정 구조 즉 항원의 결정 부위인 에피토프에 의해서 결정되는 결합이라고 표현될 수도 있다.
본 명세서에서, "에피토프"란, 표적 단백질인 sCD93에서 항원성 또는 면역원성을 갖는 부분의 아미노산 영역(항원 결정기)을 가리킨다. 에피토프는 통상 적어도 적어도 10개 아미노산을 포함할 것이다. 이러한 에피토프는 당업계의 공지럭鰥逾 에피토프 해석법 예컨대, 파지 제시(phage display)법, 역면역유전학(reverse immunogenetics) 등에 의해서 동정될 수 있다.
본 명세서에서, "항체"는 표적 단백질인 sCD93에 특이적으로 결합하는 것이면 모든 형태의 것을 포함하는 의미이다. 따라서 모노클로날항체, 폴리클로날항체, 다중특이적 항체(즉 두 개 이상의 항원 또는 두 개 이상의 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체로서 예컨대 이특이적 항체 등을 말함), 인간화 항체, 인간 항체를 포함하는 것 이외에, 표적 단백질인 sCD93에에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 단편, 재조합 항체, 화학적으로 수식된 항체를 포함한다.
상기 인간화 항체는 인간 면역글로불린의 상보성 결정 영역(CDR)이 마우스, 토끼, 쥐, 영장류 등 비인간 종의 CDR로 대체된 항체로서 면역 거부 반응을 최소화한 항체를 말하는데, 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상세한 것은 문헌 [Riechmann L. et al., Nature, 332; 323-327, 1988], 문헌[Nakatani T. et al., Protein Engineering, 7; 435-443, 1994], 문헌[Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986)], 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)] 등을 참조할 수 있다.
상기 인간 항체는 내인성 면역글로불린을 생산할 수 있는 유전자를 파괴시킨 마우스 등의 동물에 인간 면역글로불린 유전자를 도입시키고, 그 동물에 특정 항원을 면역시켜 얻어지는 항체를 말한다. 구체적인 것은 문헌[Jakobovits et al., Proc, Natl. Acad, Sci. USA, 90: 2551 (1993)], 문헌[Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993)], 문헌[Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)], 문헌[Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio., 222: 581-597 (1991)] 등을 참조할 수 있다.
상기 항체의 단편의 예로서는 Fab, F(ab'), F(ab')2, scFv(중쇄나 경쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 항체), Fv 단편, Fab/c(1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 항체), 선형 항체(Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)), 항체를 단백질 절단 효소 예컨대, 파파인, 펩신으로 처리하여 얻어진 항체 단편, 단편에 대한 유전자를 후술하는 바와 같이 유전자 재조합 방법으로 숙주세포에 도입 및 발현시켜 얻어지는 항체 단편을 포함하는 의미이다. 상기 항체의 글로불린 유형도 표적 단백질인 sCD93에에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 한정되지 않는데, 그 글로불린 유형은 IgG, IgM, IgA, IgE, IgY 및 IgD 중 어느 하나일 수 있다.
한편, 폴리클로날 항체는, 조류(예를 들면, 닭 등), 포유 동물(예를 들면, 토끼, 염소, 말, 양, 쥐, 비인간 영장류(원숭이, 침팬지, 고릴라) 등)에 표적 단백질인 sCD93을 면역시킴으로써 제조할 수 있다. 통상 최종 면역일부터 6 내지 60일 후에 효소 면역 측정법(EIA 및 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA) 등으로 항체가를 측정하고, 최대 항체가를 나타낼 때에 채혈하는 과정을 밟게 될 것이다. 항체는 면역된 동물의 혈액으로부터 당업계의 공지 또는 관용된 방법, 예컨대 이온교환크로마토그래피, 친화도-크로마토그래피 등의 방법을 사용하여 정제할 수 있다.
모노클로날 항체는 표적 단백질인 sCD93에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 의해서 얻어질 수 있다. 이러한 하이브리도마 세포주를 생산하기 위한 방법으로서, 예컨대 동물(예컨대, 마우스)을 표적 단백질인 sCD93로 면역시키고, 그 면역시킨 동물로부터 비장 세포를 채취하고, 그 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시키고, 그에 따라 하이브리도마 세포를 생성하고, 그리고 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 동정하는 방법을 들 수 있다. 그러한 세포주로부터 모노클로날 항체의 분리 또는 회수는 당업계의 공지 또는 관용에 의해서 가능하다.
이러한 모노클로날 항체의 제조에 대해서 보다 자세히 설명하면 아래와 같다.
먼저, 모노클로날 항체를 얻기 위해서는 면역원인 표적 단백질인 sCD93를 포유동물, 예를 들면 랫드, 마우스, 토끼, 원숭이, 염소, 비인간 영장류(원숭이, 침팬지, 고릴라) 등에 투여할 필요가 있다. 면역원의 1회 투여량은 당업자가 면역 동물의 종류, 투여 경로 등을 고려하여 그의 통상의 능력 범위 내에서 적절하게 결정할 수 있다. 통상은 동물 1 마리당 약 50 내지 200 ㎍일 것이다. 투여는 통상 면역원을 PBS(phospate-buffered saline)나 생리 식염수 등으로 적당량 희석 또는 현탁시키고, 통상의 어쥬번트를 혼합하고 유화한 후에 피하, 복강 내에 주입함으로써 행해질 수 있다. 이러한 투여는 처음의 투여 후 수일에서 수주 간 간격으로, 바람직하게는 1 내지 4주간 간격으로 2 내지 10회, 바람직하게는 3 내지 4회에 걸쳐 이루어질 것이다. 면역원의 투여를 계속하면서 ELISA 방법 등에 의해서 면역 동물의 혈청 중 항체가를 측정하여 항체가가 정점(plateau)에 도달했을 때는, 최종적으로 면역원을 정맥 내 또는 복강 내에 투여하고, 그 최종 투여일로부터 2 내지 5일 후에 항체 생산 세포를 채취한다. 항체 생산 세포로는 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 비장 세포 또는 림프절 세포가 바람직하다.
항체 생산 세포를 채취한 후에는 투여된 면역원 즉 본 발명의 표적 단백질인 sCD93에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이러한 하이브리도마는 당업계의 공지 또는 관용의 기술에 의해서 생산하고 동정하는 것이 가능하다. 통상은 항체 생산 세포, 바람직하게는 비장 세포를 면역된 동물로부터 채취하고, 그 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시켜 하이브리도마 세포를 제조하며, 면역원에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 동정하는 단계를 거치게 될 것이다. 항체 생산 세포와 융합되는데 사용되는 골수종 세포주는 마우스 등의 동물로부터 유래한 세포주를 사용할 수 있는데, 이러한 세포주는 상업적으로 입수 가능하다. 바람직한 골수종 세포주는 면역 동물과 동종계의 동물에서 유래하고, 항생제 등에 대한 약제 선택성을 지니며, 비장 세포와 융합되지 아니한 상태로는 히포크산틴, 아미노푸테린 및 티민을 포함하는 HAT 선택 배지에서 생존할 수 없고 비장 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 특성을 지니는 것이 바람직하다. 골수종 세포주의 구체적인 예로서는 BALB/c 마우스 유래의 HGPRT(hypoxantine guanine phosporibosyl-transferase) 결손 세포주인 P3X63(ATCC TIB9) 등을 들 수 있다.
항체 생산 세포인 비장 세포와 골수종 세포주의 융합은 혈청을 포함하지 않는 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물 세포 배양용 배지 중에서 항체 생산 세포와 골수종 세포주를 적정한 비율(약 1:1 내지 20:1의 비율)로 혼합하고, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 수행함으로써 이루어지게 된다. 세포 융합 촉진제로서 평균 분자량 1500 내지 4000 달톤의 폴리에틸렌글리콜 등을 약 10 내지 80 %의 농도로 사용할 수 있다. 또한, 경우에 따라서는 융합 효율을 높이기 위해서, 디메틸술폭시드 등의 보조제를 병용할 수도 있다. 또한, 시판되고 있는 세포 융합 장치를 이용하여 융합시킬 수도 있다.
세포 융합 처리 후, 목적으로 하는 하이브리도마를 선별하여야 한다. 통상 세포 현탁액을 우태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등으로 적당히 희석한 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 세포를 웰당 200만개 정도로 분주하고, 각 웰에 선택 배지를 첨가하고, 이후 동일한 선택 배지로 적절히 교환하여 줌으로써 신선한 배지를 공급하며 배양한다. 배양 온도는 통상 20 내지 40℃이다. 골수종 세포주가 HGPRT 결손주 또는 티미딘 키나제 결손주인 경우에는 히포크산틴, 아미노프레틴 또는 티미딘을 포함하는 선택 배지(HAT 배지)를 이용함으로써, 항체 생산 세포와 골수종 세포주의 하이브리도마만을 선택적으로 배양하고 증식시킬 수 있다. 그러면 선택 배지에서 배양 개시 후 약 14일 전후에서 생육되는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다. 이어서, 증식된 하이브리도마의 상등 배양물에서 목적으로 하는 항체의 존재 여부를 스크리닝한다. 이러한 하이브리도마의 스크리닝은 당업계의 공지 또는 관용의 기술에 따라 이루어질 수 있다. 그러한 기술로서 예컨대, 효소 면역 측정법(EIA: Enzyme Immuno Assay 및 ELISA), 방사 면역 측정법 등을 들 수 있다. 융합 세포의 클로닝은 한계 희석법(limiting dilution method) 등에 의해 이루어질 수 있다.
클로닝된 하이브리도마는 10% 우태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, DMEM 배지, 무혈청 배지 등 동물 세포 배양 배지에서 통상의 배양 조건(예를 들면, 37℃, 5 % CO2 농도)에서 배양하면 된다. 배양 기간은 2 내지 10일 정도이다. 모노클로날 항체는 그 상등 배양물로부터 수득할 수 있다.
모노클로날 항체는 당업계의 공지 또는 관용의 기술을 사용하여 회수할 수 있다. 그러한 당업계의 공지 또는 관용의 기술로서는 황산암모늄 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법 또는 이들을 조합한 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 생산에는 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 삽입시키고 이를 적당한 숙주세포에 도입 및 발현시켜 수득하는 유전자 재조합 기술을 이용할 수도 있다(Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990).
구체적으로 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 본 발명의 항체의 가변 영역(V 영역)을 암호화하는 mRNA을 수득한다. 이런 mRNA의 수득은 당업계의 공지 또는 관용의 방법, 예를 들어 구아니딘 초원심분리법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry., Vol 18, 5294-5299, 1979), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162, 156-159) 등을 사용하여 전체 RNA를 수득하고 그 전체 mRNA로부터 mRNA Purification Kit(Pharmacia 사) 등을 사용하여 목적하는 mRNA를 수득함으로써 이루어진다. 대안적으로는 QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제품)을 이용함으로써, mRNA를 직접 수득할 수도 있다.
수득된 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 가변 영역의 cDNA를 합성한다. 필요하다면 cDNA 합성 또는 증폭에 RACE PCR 방법 등을 적용할 수도 있다. 이렇게 얻어진 가변 영역을 암호화하는 cDNA를 항체의 불변 영역(C 영역)을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현 벡터에 삽입한다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 표적 단백질인 sCD93의 DNA 재조합 생산 방법과 관련하여 후술하는 바와 같이 프로모터, 인핸서, 복제 개시점, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위 등 조절서열을 포함할 수 있다. 이 발현벡터가 숙주 세포에 형질전환되면 항체의 생산이 가능하게 된다. 항체 유전자의 발현은 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 암호화하는 DNA를 각각 발현벡터에 재조합하여 숙주세포를 동시 형질전환시켜도 무방하며, 또는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA를 단일의 발현벡터에 삽입하여 숙주세포를 형질전환시켜도 무방하다(WO 94/11523호 공보).
한편, 본 발명의 항체를 얻기 위하여 사용한 면역원으로서의 본 발명의 표적 단백질인 sCD93 당 업계의 공지 또는 관용의 DNA 재조합 기술에 의하여 얻을 수 있다. 통상적으로는, 본 발명의 표적 단백질인 sCD93의 cDNA를 제작하고 그 cDNA를 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 형질전환시키고 그 형질전환된 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양하고, 그 배양액 또는 세포로부터 얻게 될 것이다. 상기 cDNA는 GenBank 등의 유전자/단백질 테이터베이스가 제공하는 유전자 서열 또는 본 명세서가 제공하는 서열에 기초하여 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 제작 가능하다.
이러한 cDNA의 제조에는 포스포아미다이트법 등을 이용하는 DNA 합성 장치, RT-PCR 법, cDNA 라이브러리로부터 목적하는 cDNA를 얻기 위한 혼성화 방법 등이 사용될 수 있고, 필요에 따라서는 PCR 방법 등에 의해서 목적하는 cDNA를 증폭할 수도 있다.
상기에서 발현벡터는 생명공학 회사 예컨대 노바겐(Novagen) 사, 다까라슈죠 사, 키아겐(Qiagen)사, 스트라타진(Stratagene) 사, 프로메가(Promega) 사, 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnositics) 사, 인비트로겐(Invitrogen) 사, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)사 등으로부터 상업적으로 입수 가능하다.
이러한 발현 벡터에는 본 발명의 표적 단백질인 sCD93을 코딩하는 DNA 이외에 조절 엘리멘트, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜, 결합 부위, 복제 개시점, 터미네이터, 선택 마커, 단리 또는 정제를 용이하게 하기 위한 표지 펩티드 서열(예컨대 히스티딘 반복 서열을 암호화하는 염기서열) 등이 포함될 수 있다.
숙주 세포는 세균 등의 원핵 세포(예를 들면 대장균, 고초균), 및 효모(예를 들면 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)), 곤충 세포(예를 들면 Sf 세포), 포유 동물 세포(예를 들면 COS, CHO, BHK) 등의 진핵 세포를 사용할 수 있다.
숙주 세포 또는 그 배양물로부터 본 발명의 표적 단백질의 정제에는 한외 여과, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피(표지 펩티드가 결합된 경우), HPLC, 소수성 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피 등의 방법이나 이들을 조합하는 방법이 사용될 수 있다.
DNA 재조합 기술에 의한 본 발명의 표적 단백질의 생산에 대해서는 본 명세서의 기재 내용 이외에 "Samrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US(1989)", "Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Jon Willey & Sons, US(1993)" 및 "Sambrook, J. & Russel, D. 저, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 7.42 내지 7.45, 제2권 8.9 내지 8.17" 등의 문헌을 참조할 수 있다. 이 문헌들은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 항체를 생산하기 위한 면역원으로서의 본 발명의 표적 단백질은 그 단편(sCD93의 단편)이나 전장의 단백질(CD93 자체)이 사용될 수도 있다. 단편이나 전장의 단백질을 사용하여 얻어지는 항체도 본 발명의 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 가능성이 있기 때문이다.
또한, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 CD93 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA, shRNA 및 shRNA의 발현벡터로부터 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 것을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 CD93 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA, shRNA 및 shRNA의 발현벡터로부터 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 것을 항염증성 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명자들은 CD93 유전자에 대한 siRNA를 THP-1에 처리하였을 때, 염증 유발 물질인 LPS(lipopolysaccharide) 처리시 증가하는 염증성 사이토카인 TNF-a 및 IL-6 발현량을 감소시킴을 확인하였다.
특정 유전자에 대한 짧은 이중 가닥의 RNA인 siRNA(small interfering RNA)나 shRNA(short haripin RNA)가 세포 내로 도입될 경우 리보뉴클레아제인 다이서(dicer)에 의해 프로세싱되어 RISC(RNA induced gene sciencing complex)에 결합함으로써 RNAi를 유도하는 것으로 알려져 있다(Nature 391, 806-811, 1998; Genes Dev. 15, 485-490, 2001; Nature 411, 494-498, 2001; Science 287, 2494-2497, 2000; Cell 101, 25-33, 2000). 이러한 RNAi에는 헬리카제와 엔도뉴클레아제가 관여하는데, 헬리카제에 의해 siRNA의 이중 가닥의 RNA가 풀려지고 이 중 안티센스는 표적 유전자의 mRNA에 결합하는데, 이 결합된 부위는 엔도뉴클레아제에 의해서 가수분해되게 된다(Cell 101, 25-33, 2000; Science 296, 1265-1269, 2002; J. Biol. Chem. 2003 Feb 28:278(9):7108-18).
본 명세서에서, "siRNA"는 그 표적 유전자의 RNA에 대해서 RNAi 현상을 유도할 수 있는 10 내지 40 염기쌍을 갖는 이중 가닥 RNA, 바람직하게는 15 내지 30의 염기쌍을 갖는 이중 가닥 RNA, 더 바람직하게는 20 내지 22 염기쌍을 갖는 이중 가닥의 RAN를 의미한다. 이러한 siRNA는 블런드(blunt) 말단을 갖거나 돌출(overhang) 말단을 가질 수 있으며, 돌출 말단을 가질 경우 그것은 3'말단과 '5말단 모두에서 가능하다. 바람직하게는 3'말단이 돌출된 경우이다. 돌출된 말단의 염기수는 1 내지 5, 바람직하게는 2 내지 3 염기일 수 있다.
본 명세서에서, "shRNA"는 2 내지 10 염기의 루프(loop) 영역을 갖는 헤어핀 구조의 이중 가닥 RNA를 말한다. 이러한 루프 영역의 염기는 당업계에 공지된 것들을 사용할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. US A 99(8): 5515-5520, 2002; Nature Biotechnology 20: 505-508, 2002; Nature Biotechnology 20 : 500-505, 2002; Nat Cell Biol. 5:489-490, 2003; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002). shRNA의 이중 가닥 부분은 상기 siRNA와 동일하게 구성할 수 있으므로 siRNA와 관련한 설명이 그대로 적용될 수 있다.
본 명세서에서, "shRNA의 발현벡터"는 shRNA의 코딩 서열을 포함함으로써 세포 내에서 shRNA를 발현시킬 수 있는 벡터를 의미한다. 상기 shRNA 코딩 서열은 CD93 유전자의 일부 서열과 루프 영역을 구성하는 스페이서(spacer) 서열 및 그 CD93 유전자의 일부 서열에 상보적인 서열로 구성되는데, shRNA 코딩 서열은 사용될 발현벡터에 따라 RNA이거나 DNA일 수 있으며 발현벡터의 조절 서열(예컨대 프로모터, 폴리아네닐화 시그널 등)에 작동 가능하게 연결되게 된다. 발현벡터는 플라스미드 유래의 발현벡터이거나 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 플라스미드 유래 발현벡터는 프로메가(Promega) 사(Cat Nos. C8750, C8760, C8770, C8780, C8790, C7800 등), 진스크립트(Genscript) 사((Cat.Nos. SD1201, SD1202, SD1207) 등 생명공학회사에서 시판하는 것을 구입하여 사용하거나 자체 제작하여 사용할 수 있다. 렌티바이러스 벡터의 이용에 대해서 국제특허 제WO2004/065549호의 개시 내용을 참조할 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 sCD93에 대한 항체나 siRNA, shRNA 등을 포함하는 외에 통상적으로 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 여기서 "제약상 허용되는"는 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다. 이러한 담체의 예로는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 폴리알콜(예, 만니톨, 솔비톨), 염화나트륨 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 그 저장 수명을 연장하거나 유효성을 보존하기 위하여 보존제, 항산화제, 습윤제, 유화제, 완충제, 비이온계 계면활성제 등을 포함할 수도 있다. 이러한 보존제, 항산화제, 습윤제 등으로서 적당한 것은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태로 제형화될 수 있는데, 예컨대 액상 용액, 현탁액, 시럽, 정제, 환제 등으로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 통상은 항체를 유효성분으로 포함하는 바이오의약품과 마찬가지로 정맥내, 피하, 복강내, 근육내 주사에 의하여 투여될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물의 투여량은 상기 조성물의 유효성분의 유량, 질병의 중증 정도, 환자의 체중, 약물 형태, 투여 경로, 투여 기간에 따라 의학적 전문인에 의해 결정될 것인데, 통상은 1일 0.01 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 범위 내에서 결정될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 CD93 또는 이의 가용성 단편을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 진단용 마커를 제공한다.
상기 CD93는 서열번호 33으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 CD93 가용성 단편은 막 통과 단백질인 CD93 단백질이 세포배양 후 방출된 세포외 부분(ectodomain)으로서, 95kDa 정도의 단편인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 CD93의 발현이 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포에서 LPS, TNF-a에 의해 증가하고, PMA 처리에 의해서는 별로 증가하지 않는다. 그러나, CD93 가용성 단편의 양은 LPS, TNF-a, PMA 처리에 의해 모두 증가한다. 또한, 마우스에 PBS, 티오글리콜레이트, LPS를 주사한 후, 복막세포 중 대식세포에서의 마우스 CD93 발현은 LPS 처리에 의해 가장 많이 증가하며, 티오글리콜레이트 처리에 의해서도 유사하게 증가한다. 또한, 혈청 내 CD93 가용성 단편의 양은 LPS나 티오글리콜레이트에 의해 크게 변화되지 않으나, 복막액 내의 CD93 가용성 단편의 양은 LPS나 티오글리콜레이트 처리에 의해 현저히 증가한다.
또한, 퇴행성 관절염 환자로부터 얻은 활막 조직보다 류마티스성 관절염 환자로부터 얻은 활막 조직에서 CD93의 발현이 현저히 높게 나타나며, 류마티스성 관절염 환자로부터 얻은 활막액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양이 퇴행성 관절염 환자군 보다 현저히 높게 나타난다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 CD93 또는 이의 가용성 단편은 염증 유도 물질에 의한 또는 염증성 환경에서 CD93 발현이 증가하고 CD93 가용성 단편의 양이 증가한다. 따라서, 본 발명에 따른 CD93 또는 이의 가용성 단편은 염증성 질환의 진단 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 염증성 질환은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 퇴행성 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 복막염, 포도막염, 피부염, 습진, 다발성 경화증 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 염증성 질환 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 염증성 질환 진단용 키트의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
상기 염증성 질환 진단 키트는, 본 발명의 CD93 또는 이의 가용성 단편 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 상기 앱타머는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다.
상기 염증성 질환 진단 키트는 CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 CD93 또는 이의 가용성 단편 마커를 이용하여 염증성 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 생물학적 시료 및 대조군의 단백질을 고정체에 코팅시키는 단계,
2) 상기 고정체에 염증성 질환 진단용 마커인 CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계,
3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합 반응물을 2차 항체 접합체의 표지체 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및
4) 생물학적 시료와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계.
상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 복막액, 활막액, 타액, 소변 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 2차 항체 접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein), 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 발색 기질 용액은 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충용액(0.1M NaOAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02M 인산염 완충용액, 0.13M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3회 내지 6회 세척하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 반응 정지용액은 황산 용액이 사용될 수 있다.
본 발명은 생물학적 시료에서 CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 CD93 또는 이의 가용성 단편을 검출하여, 염증성 질환의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 복막액, 활막액, 타액, 소변 또는 대변을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 생물학적 시료 내 CD93 또는 이의 가용성 단편을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분획하고 고정체로 옮겨 고정시킨 후, 고정된 CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행하고, CD93 또는 이의 가용성 단편의 발현 수준을 측정한다. 즉, 생물학적 시료에서 CD93 또는 이의 가용성 단편의 발현 수준이 높으면, 염증성 질환을 갖는 것으로 진단하거나 염증성 질환의 가능성을 가질 것으로 예측하는 것이다.
상기 방법에 있어서, 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막 (polyvinylidene difluoride membrane), 폴리비닐 수지 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 ELISA법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR (surface plasmon resonance), 바이오칩(DNA, RNA), 전기영동법, PCR, RT-PCR 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다.
그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> sCD93 단백질의 준비
<1-1> pYW600의 제작
<1-1-1> oriP의 삽입
우선, oriP를 클로닝하기 위해, pMEP4(Invitrogen, USA)를 주형으로 정방향 프라이머(5'-gtagatctgcaggaaaaggacaagc-3'; 서열번호 27) 및 역방향 프라이머(5'-cgagatctggttgacttccctaatgt-3'; 서열번호 28)를 이용하여 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 30 사이클의 조건으로 PCR 반응을 수행한 후, 2187 bp 크기의 PCR 산물을 PCR 정제 키트(Promega, USA)를 이용하여 정제하였다. 그런 다음, 상기 PCR 산물을 BglII 효소(Invitrogen, USA)로 절단한 뒤, 절단 산물을 다시 정제하였다. 상기 정제된 절단 단편을 pcDNA3.1(Invitrogen, USA)의 CMV 프로모터 상부에 존재하는 BglII 인식부위에 BglII 효소(Invitrogen, USA)를 이용하여 선형화한 벡터에 삽입한 후, 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 수득하였다(pcDNA3.1-oriP). 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 통상의 방법으로 추출한 후, 염기서열 분석을 통해 oriP가 제대로 삽입되었는지 확인하였다.
<1-1-2> 인간 항체 Fc를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입
상기에서 제조한 oriP가 삽입된 pcDNA3.1 벡터에 인간 항체 Fc를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해, pLCN-MoH 벡터(대한민국 등록특허 제450266호)를 주형으로,'Bam HI-SfiI-human immunoglobulin Fc N-terminal sequence'로 구성된 정방향 프라이머(5'-cgg gat cc g gcc gtg ggg gcc gac aaa a ct cac aca tgc c-3': 서열번호 29)와 'XbaI-stop codon-human immunoglobulin Fc C-terminal sequence'로 구성된 역방향 프라이머(5'-cgagtc tca ttt acc cgg aga cag gga-3': 서열번호 30)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다(94℃, 4분 처리 후, 95℃, 30초, 60℃, 30초, 72℃, 1분 과정을 30회 반복한 후 72℃, 10분간 연장).
이어, PCR 산물을 PCR 정제 키트(Promega, USA)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 PCR 산물을 제한효소 BamHI 및 XbaI으로 절단한 후, 역시 BamHI 및 XbaI으로 절단한 상기에서 제조한 oriP가 삽입된 pcDNA3.1 벡터(pcDNA3.1-oriP)에 삽입하여, pcDNA3.1-oriP-Fc를 제조하였다. 이후, 상기와 같이 제조된 재조합 플라스미드로 대장균(DH5a)을 형질전환시키고, 형질전환체를 분리한 다음, 플라스미드를 수득하여, Fc를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제대로 삽입되었는지 확인하였다. 이로써 pYW600이 완성되었다.
<1-1-3> sCD93_Fc의 발현 정제
sCD93_Fc을 동물세포인 HEK293E 세포에서 발현/정제하기 위하여 sCD93_Fc를 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작하였다.
인간 IgG1 Fc 단편을 포함하고 있는 자체 제작된 상기 pYW600을 SfiI 으로 절단한 다음, PCR을 통해 얻어진 CD93 단편을 SfiI 으로 절단한후 삽입하였다. CD93 단편을 증폭하기 위하여 CD93 플라스미드(plasmid)(Kugi 분양, hMU003993,Kugi No. IRAT-49-A06)를 주형(template)으로 이용하였고, 정방향 프라이머로 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCACGGGAGCTGACACGGAGGC-3'(서열번호 31)를, 역방향 프라이머로 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGTCCACACAGTCCAGCTGAC-3'(서열번호 32)를 사용하였다. CD93 PCR시 주형은 100ng을, 각각의 프라이머는 10 pmol, Pfu DNA 폴리머라아제(polymerase)(2.5 unit/ul) 0.5 ul, 전체 50 ul를 반응하였다. CD93의 PCR 반응 조건은 다음과 같다. 초기 변성 과정으로 94℃에서 2분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분간 30회 반복하였고, 72℃에서 10분간 연장반응을 수행하였다. PCR 산물은 SfiI으로 절단시켜 CMV I.E 인행서/프로모터(Enhancer/Promoter)와 리더 서열(Leader sequence)이 앞에 있고 CD93 유전자가 들어간 후, 6X His tag, Fc, Myc, 8X His tag이 순차적으로 만들어지는 pYK 602 벡터로 삽입하여 pYK-CD93_Fc 벡터를 만들었다.
상기 제작된 pCD93_Fc 20 ㎍과 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine)(PEI, Polysciences) 40 ㎍을 섞어 150 mm 디시(dish)에 미리 키워둔 HEK293E 세포에 도입하였다. 배양액을 총 8일동안 2일 마다 수거하여 필터링한 다음 단백질 A 세파로즈(Protein A sepharose)(Amersham)를 이용하여 정제하였다. 정제한 시료를 PIERCE(Coomassie protein assay reagent)로 정량하여 SDS-PAGE 겔(gel)에 걸어 그 사이즈를 확인하였다(도 2). 환원된 상태(Reduced; R)에서 sCD93_Fc는 70 kDa 정도였고 환원되지 않은 상태(Non-reduced; N)에서는 140 ~ 150 kDa 정도였다.
<실시예 2> sCD93 단백질의 THP-1 세포의 대식세포로의 분화 유도 효과 실험
사람 유래의 급성 단핵구성 백혈병(Acute monocytic leukemia) 세포인 THP-1 세포는 PMA 등의 화학물질에 의하여 부착(adherence), 퍼짐(spreading), 성숙 과정을 거치며 대식세포(macrophage)로 분화한다. 본 실험에서는 sCD93이 THP-1 세포의 대식세포로의 분화 유도 효과를 실험하였다.
먼저 5x103 THP-1 세포(ATCC로부터 구입)를 96 웰 플레이트(well plate)에 옮겼다. 각각의 음성대조군에 PBS, Fc(5 ㎍/ml), 전상 인간(normal human) IgG(hIgG, 5 ㎍/ml)를 첨가하고, 양성대조군에는 PMA(Sigma, 0.1 ㎍/ml)를 처리하였으며, 실험군에는 sCD93_Fc 5, 1, 0.2, 0.04 ㎍/ml 농도로 처리하였다. 처리후 30분간 37℃ 배양실에 놓아둔 다음 다시 꺼내어, 붙은 세포가 떨어지지 않게 tapping으로 붙지 않은 세포들을 제거하였다. PBS로 2번 더 세척한 다음 광학현미경(Leika)으로 사진을 찍었다(도 3). 붙지 않은 세포들이 담겨진 배양상등액으로 헤마토사이토미터(hematocytometer)(Marienfeld,Germany)를 이용, 그 숫자를 계산하였다. 처음 넣어준 세포수에서 붙지않은 세포수를 뺀 나머지를 백분율로 나타내었다. THP-1 세포는 음성대조군에서는 붙지 않으나 sCD93_Fc를 처리한 실험군에서는 농도-의존적으로 부착 정도(%)가 높아짐을 관찰할 수 있었다(도 4).
그 다음으로 상기와 동일한 방식으로 THP-1 세포에서 sCD93_Fc의 분화(differenciation) 효과를 알아보았다. 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5 ㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1 ㎍/ml을 처리하였다. 실험군에는 sCD93_Fc를 5 ㎍/ml 농도로 처리하여 각각을 3일동안 배양하여 광학현미경으로 사진을 촬영하였다. 음성대조군은 분화하지 않았으며, sCD93_Fc를 넣어준 THP-1 세포는 PMA와 유사하게 macrophage-like 세포로 분화하였다(도 5).
이러한 THP-1 세포의 분화에 따른 단핵구(monocyte) 세포인 THP-1 세포가 실제로 대식세포(macrophage)로 분화하는지를 알아보기 위해, 이미 알려진 대식세포 및 수지상세포, 그리고 호중구(neutrophil) 분화 마커인 CD14, CD1a 및 CD64의 RNA 발현량을 측정하기 위해 실시간 PCR을 수행하였다. THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5 ㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1 ㎍/ml을 처리하였다. 또한 실험군으로는 sCD93_Fc 5 ㎍/ml을 처리하고 24시간이 경과한후 LPS에 의한 감수성을 알아보기 위해 LPS를 처리하였다. 처리후 다시 24시간이 경과한 후, RNA를 분리정제하였다(Qiagen RNA miniprep kiT). 정제된 RNA 1 ㎍을 역전사(reverse transcription)(iScript cDNA synthesis kit, Bio-Rad)하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA에 대해 아래 <표 1>의 프라이머, iG SYBR Green supermix(Bio-Rad) 및 CFX-96 Real-time system(Bio-Rad)을 이용 정량-PCR을 수행하였다.
그 결과, sCD93처리에 의해 THP-1 세포가 대식세포로 분화함을 알 수 있었고, LPS 처리에 의해 분화 마커인 CD14의 RNA 수준이 더욱 높아짐을 알수 있었다(도 6).
표 1 프라이머 서열
분화 마커 정방향 역방향
CD14-New GCCTAGACCTCAGCCACAACTC (서열번호 5) CCAGCCCAGCGAACGACAG(서열번호 6)
CD64-New GGGTCAGCGTGTTCCAAGAGG(서열번호 7) GCACCTGTATTCACCACTGTCATTG(서열번호 8)
CD1a-New ACT CAT ACC TGG GAC AGC AAT(서열번호 9) CTG CAA TTC ATG GGC GTA TCT(서열번호 10)
<실시예 3> sCD93 단백질의 미토젠-활성화 단백질 키나제(MAPK)의 활성 유도 효과 실험
이러한 THP-1 세포의 분화가 분자적으로 어떻게 일어나는지를 알아보기 위해, MAPK(mitogen-activated protein kinases) 신호경로(signaling pathway)를 중심으로 알아보았다.
구체적으로, THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), Fc 5 ㎍/ml, hIgG 5 ㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1 ㎍/ml을 처리하였다. 실험군은 sCD93_Fc를 5, 1, 0.2, 0.04 ㎍/ml 농도로 처리하였다. 처리후 30분간 37 배양실에 놓아둔다음 다시 꺼내어, 용해 완충용액(lysis buffer)으로 용해 시킨 후, 웨스턴블랏(westernblot)을 실시하였다. 1차 항체(Cell siganaling)로 phospho-Erk 1/2(Cell signaling)와 phospho-p38(Cell Signaling) 그리고 정량을 위해 total-p38(Cell signaling)을 각각 블롯팅하였다. phospho-Erk 1/2와 phospho-p38의 양이 sCD93_Fc 처리에 의해 농도-의존적으로 증가함을 알 수 있었다(도 7).
또한 시간적 변화에 따른 phospho-Erk 1/2 양을 관찰하기 위해, 상기와 동일한 방법으로 sCD93_Fc 5 ㎍/ml 을 0, 10, 30, 60, 180 분간 각각 처리하여 웨스턴블랏을 실시하였다. 양성대조군으로 PMA 0.1 ㎍/ml 과 LPS 1 ㎍/ml을 각각 동일한 방법으로 처리하여 웨스턴블랏을 실시하였다. sCD93_Fc 처리에 의해 10분 경과후부터 phospho-Erk 1/2 양이 증가하기 시작하여 30분에서 가장 많이 증가하였고 60min부터 약간 감소하는 경향을 보여주었다(도 8).
이러한 THP-1 세포의 분화와 MAPK 신호의 변화에 따른 사이토카인의 변화를 알아보기 위해, 여러 가지 잘 알려진 전구염증(pro-inflammatory) 사이토카인들의 발현 변화를 RNA 수준에서 알아보았다. THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1 ㎍/ml을 처리하였고, 또한 실험군으로는 sCD93_Fc을 처리하였다. 24시간이 경과한 후, LPS에 의한 감수성을 알아보기 위해 LPS를 처리하였다. LPS 처리후 다시 24시간이 경과한 후, RNA를 분리정제하였다(Qiagen RNA miniprep kiT). 정제된 RNA 1을 reverse transcription (iScript cDNA synthesis kit, Bio-Rad) 하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA에 대해 아래 <표 2>의 프라이머 서열, iG SYBR Green supermix(Bio-Rad)와 CFX-96 Real-time system(Bio-Rad)을 이용하여 정량-PCR을 수행하였다. sCD93_Fc 처리에 의해 pro-inflammatory cytokine 인 TNF-a, IL-1b, IL-6 등이 RNA 수준에서 약간 증가하였고, LPS를 추가 처리함으로써 현저히 더 증가함을 알 수 있었다(도 9 내지 도 11).
표 2 프라이머 서열
사이토카인 정방향 역방향
IL-6 TGG CTG AAA AAG ATG GAT GCT(서열번호 11) TCT GGC TTG TTC CTC ACT ACT(서열번호 12)
IL-12 TGT ACC AGG TGG AGT TCA AGA(서열번호 13) GGA GGA TTT TTG TGG CAC AGT(서열번호 14)
iNOS ATC TTG CCT GGG GTC CAT TAT(서열번호 15) CCT GGC CAG ATG TTC CTC TAT(서열번호 16)
CXCL11 CCT GGG GTA AAA GCA GTG AAA(서열번호 17) TTG CTT GCT TCG ATT TGG GAT(서열번호 18)
CLEC4A TTG GCA AGA CAG TGA GAA GGA(서열번호 19) AAT GTC GCT GAC CTT CTG GAT(서열번호 20)
SPHK-1 CTG TAG GAA GAG TGG GTT CCA(서열번호 21) GTG CCA GGA CTA GCA CAA AG(서열번호 22)
IL-1β ACA GCT GGA GAG TGT AGA TCC(서열번호 23) TTT TCT GCT TGA GAG GTG CTG(서열번호 24)
TNF-α TAG CCC ATG TTG TAG CAA ACC(서열번호 25) AGA GGA CCT GGG AGT AGA TGA(서열번호 26)
다음으로 이러한 THP-1 세포의 분화와 MAPK 신호의 변화에 따라 염증성 사이토카인 중 TNF-a의 발현이 어떻게 변화하는지를 단백질 수준에서 측정하였다.
구체적으로, THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5 ㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1 ㎍/ml을 처리하였고, 또한 실험군으로는 sCD93_Fc을 처리하였다. 24시간이 경과한 후, LPS에 의한 감수성을 알아보기 위해 LPS를 처리하였다. LPS 처리후 다시 24시간이 경과한 후, Quantikine TNF-a assay kit (R&D system)을 이용하여 배양상등액에 포함된 TNF-a 양을 측정하였다. sCD93_Fc만 처리한 실험군에서 TNF-a의 양이 조금 증가하였으며, sCD93_Fc와 LPS를 처리한 실험군에서는 LPS만 처리한 실험군에 비해 비교적 높게 TNF-a가 측정됨을 알수 있었다. 이는 sCD93_Fcdp에 의해 THP-1 세포가 대식세포로 분화하여 TLR 신호에 대한 감수성(susceptibility)이 증가되었음을 보여주는 것이다(도 12).
<실시예 4> sCD93 단백질의 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현 유도 효과 실험
그 다음으로 sCD93_Fc 처리에 의한 THP-1 세포의 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)발현에 대한 영향을 알아보았다. THP-1 세포에 음성대조군으로 hIgG 5 ㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1 ㎍/ml을 처리하였다. 실험군으로는 sCD93_Fc 를 5, 1, 0.2 ㎍/ml 농도로 처리하였다. 처리한 후 24시간이 경과한 후, 젤라틴 지모그라피 분석(Gelatin Zymography assay)법을 이용하여 배양상등액에 포함된 MMP-9(92kDa)과 MMP-2(72kDa)의 발현 변화를 관찰하였다. 젤라틴(Gelatin)(Sigma) 최종 농도가 2 mg/ml이 되도록 8% SDS-PAGE 겔을 만든 다음 24시간 동안 배양한 상등액을 걸어 컴파시 블루(Coomassie blue)로 염색한 다음, 탈염색(destaining) 용액으로 약하게 탈색한 후, 겔을 사진촬영하였다.
그 결과, MMP-9의 양이 sCD93_Fc 처리에 의해 농도-의존적으로 증가함을 알 수 있었다(도 13).
<실시예 5> sCD93 단백질의 식세포작용 유도 효과 실험
이러한 THP-1 세포의 대식세포 유사(macrophage-like) 세포로의 분화에 따른 식세포작용(phagocytosis) 효과를 알아보기 위해, mRFP를 발현하고 있는 박테리아(E. coli)를 이용하여 식세포작용을 측정하였다. THP-1 세포에 sCD93_Fc 5 ㎍/ml를 처리하고 3일간 배양한 후, 미리 키워놓은 RFP(적색 형광 단백질) 발현 벡터로 형질전환된 E. coli를 분화한 THP-1 세포에 넣어주었다. 다시, 12시간이 경과한 후 형광현미경으로 박테리아가 분화한 THP-1 세포에 의해 식세포작용된 것을 확인하였으며(도 14), 이 세포들을 세포 분리 완충용액(cell dissociation buffer)(EDTA 완충용액)으로 분리하여 FACS(Coolter) 분석을 실시하였다(도 15).
그 결과, sCD93_Fc 처리에 의해 분화된 세포들의 식세포작용이 음성대조군 hIgG 처리에 의한 것 보다 훨씬 증가하여 형광이 나타남을 알 수 있었다.
<실시예 6> CD93 단백질 항체의 TNF-a 생성 저해 효과 실험
이러한 sCD93_Fc의 염증 효과와 대식세포 분화 효과에 대해 이에 대한 항체의 항염증제로서의 개발 가능성을 알아보기 위해, CD93에 대한 항체 처리에 의해 이러한 효과들이 억제되는지 알아보았다(도 16). THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5 ㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1 ㎍/ml을 처리하였고, 또한 실험군으로는 sCD93_Fc 5 ㎍/ml와 항-CD93 다클론 항체(polyclonal antibody)(R&D system) 10 ㎍/ml을 처리하였다. 24시간이 경과한 후, LPS 1 ㎍/ml에 의한 감수성을 알아보기 위해 LPS를 처리하였다. LPS 처리후 다시 24시간이 경과한후, Quantikine TNF-a assay kit (R&D system)을 이용하여 배양상등액에 포함된 TNF-a 양을 측정하였다.
그 결과, sCD93_Fc만 처리한 실험군에서 TNF-a의 양이 조금 증가하였으며, sCD93_Fc와 LPS를 처리한 실험군에서는 LPS만 처리한 실험군에 비해 비교적 높게 TNF-a가 측정됨을 알 수 있었다. 그러나 항-CD93 항체 처리에 의해 이러한 TNF-a의 증가가 50 ~ 60% 이상 저해됨을 알 수 있었다.
<실시예 7> siRNA를 이용한 다양한 전구염증(pro-inflammatory) 사이토카인 발현 변화 실험
THP-1 cell에서 CD93에 대한 siRNA 저해기법을 이용 CD93을 녹다운(knockdown)시켰을 때의 여러 가지 사이토카인들의 변화량을 실시간 PCR을 이용하여 실험하였다.
먼저, THP-1 cell 2 x 105 (배지: 10% FBS(Hyclone사) + RPMI1640 (Hyclone사))을 24 웰(well)에 넣어둔 다음, Lipofectamin RNAiMax (Invitrogen) 1 ul와 CD93 siRNA (siCD93)(Bioneer사) 10 pmole을 섞은 다음, 10분간 방치한 후 미리 넣어둔 THP-1 세포에 형질감염(transfection)시켰다. 음성대조군으로는 Negative control siRNA (Bioneer사) 를 사용하였고, 양성대조군으로는 전장(full-length) CD93 (CD93_Full) 유전자(Kugi 분양, hMU003993,Kugi No. IRAT-49-A06)를 이용하여 동일한 방법으로 형질감염시켰다. 12시간 동안 CO2 인큐베이터(incubator)에 보관한후, LPS를 처리하였으며, 이후 추가로 24시간을 더 배양하였다. 이후, 실시예 2와 3에서 설명한 바와 같은 방법으로 TNF-a와 IL-6에 대해 실시간 PCR을 수행하였다.
그 결과, siCD93 처리에 의해 두 전구염증 사이토카인의 양이 줄어 들었으며, LPS에 의해 증가된 양또한 감소하였다. 이와는 반대로, CD93을 과발현한 CD93_Full 처리군은 오히려 TNF-a나 IL-6의 양을 증가시켰으며, LPS 처리에 의해 더욱더 증가하는 양상을 보여주었다(도 17).
<실시예 8> 사람 단핵구 세포인 THP-1 세포에서의 CD93 발현 및 CD93 가용성 단편의 양 측정 실험( in vitro )
여러 가지 염증 유도 물질에 의한 또는 염증성 환경에서의 CD93 발현과 이의 단편화 양상을 알아보기 위하여, 인간 단핵구 세포인 THP-1 세포에서의 CD93 발현과 배양 상등액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양을 측정하였다.
<8-1> 사람 단핵구 세포인 THP-1 세포에서의 CD93 발현 양상: FACS 실험
THP-1 세포는 10% 우태아 혈청, 페니실린 G(100 IU/㎖), 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖), L-글루타민(2 mM), HEPES(10 mM), 피루빈산나트륨(1.0 mM)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37 세포배양기에서 배양하였다. 배양된 THP-1 세포를 PBS, LPS(1.0 ㎍/㎖), TNF-a(0.5 ㎍/㎖) 또는 PMA(0.1 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하고, 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정하였다. PBS로 1회 세척하고 3% NGS(normal goat serum)를 이용하여 30분간 차단한 후 다시 3회 세척하였다. 여기에 염소 항-인간 CD93 항체(R&D systems)를 1시간 동안 차갑게 냉각하여 반응시켰다. PBS로 다시 3회 세척한 후, 항-염소 IgG-FITC 항체로 1시간 동안 차갑게 냉각하여 형광염색하였다. 대조군으로는 각각의 실험군에 대해 항-CD14-FITC 항체로 따로 형광염색하였다. 각각 염색한 세포를 유세포 분석기(EPICS Elite (Coulter))를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, THP-1 세포에서 CD93의 세포 표면 발현이 LPS, TNF-a에 의해 증가하였고, PMA 처리에 의해서는 별로 증가하지 않았다(도 18). 또한, 대조군으로 사용한 CD14의 세포 표면의 발현은 LPS, TNF-a, PMA 처리에 의해 모두 감소하였는데, 이는 CD14의 단편화에 의한 것으로 고려된다. CD14의 단편화는 단핵구-대식세포 활성화를 하향-조절(down-modulation)하는데 있어서 중요한 메커니즘으로 알려져 있다(Schutt, C. 1999. Cd14. Int. J. Biochem. Cell Biol. 31:545. 23. Le-Barillec, K., M. Si-Tahar, V. Balloy, and M. Chignard. 1999. Proteolysis of monocyte CD14 by human leukocyte elastase inhibits lipopolysaccharide-mediated cell activation. J. Clin. Invest. 103:1039. Bazil, V., and J. L. Strominger. 1991. Shedding as a mechanism of down-modulation of CD14 on stimulated human monocytes. J. Immunol. 147:1567). 지금까지의 여러 연구 결과에 따르면, 콜라게나제, 뉴트로필 엘라스타제(neutrophil elastase)와 카텝신 G 등이 세포 표면의 CD14 분자를 단편화시킴이 보고되어져 있다(Bryniarski, K., K. Maresz, M. Szczepanik, M. Ptak, and W. Ptak. 2003. Modulation of macrophage activity by proteolytic enzymes. Differential regulation of IL-6 and reactive oxygen intermediates (ROIs) synthesis as a possible homeostatic mechanism in the control of inflammation. Inflammation 27:333. Le-Barillec, K., M. Si-Tahar, V. Balloy, and M. Chignard. 1999. Proteolysis of monocyte CD14 by human leukocyte elastase inhibits lipopolysaccharide-mediated cell activation. J. Clin. Invest. 103:1039. Coyne, C. P., T. Howell III, H. Smodlaka, C. Willetto, B. W. Fenwick, and E. Chenney. 2002. Alterations in membrane-associated CD14 expression and the simultaneous liberation of soluble CD14 fragment in adherent macrophages mediated by a leukocyte carboxyl/aspartate protease. J. Endotoxin. Res. 8:273.).
<8-2> 웨스턴 블롯 실험
THP-1 세포는 10% 우태아 혈청, 페니실린 G(100 IU/㎖), 스트렙토마이신 (100/), L-글루타민(2mM), HEPES(10mM), 피루빈산나트륨(1.0mM)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37 세포배양기에서 배양하였다. 배양된 THP-1 세포를 PBS, LPS(1.0 ㎍/㎖), TNF-a(0.5 ㎍/㎖) 또는 PMA(0.1 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리한 후, 용해물(lysate)과 배양 상등액을 얻었다. 5분간 시료를 끓인 후, 냉동 보관하였다. 시료를 8% SDS-PAGE 겔에 로딩한 후, 전기영동하였다. 겔을 다시 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 4% 탈지우유로 차단하였다. 이후, 염소 항-CD93 항체(R&D systems)를 0.5 ㎍/㎖로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 또한 PBST로 3회 세척한 후, 항-염소 IgG-HRP 항체(Santa cruz)를 0.5 ㎍/㎖로 하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 내부 대조군으로 항-β 액틴(Santa cruz)과 항-염소 IgG-HRP(Santa cruz)를 이용하였다. 이후 ECL 키트(ECL Plus, Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하였다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, CD93 분자의 자체 발현은 FACS 결과와 동일하게 LPS, TNF-a 처리에 의해 증가하였으나, PMA 처리에 의해서는 증가하지 않았다. 그러나, CD93 가용성 단편의 양은 LPS, TNF-a, PMA 처리에 의해 모두 증가하였다(도 19). 상기 결과에 의해, 염증성 환경 혹은 염증 유도 물질에 의해 THP-1 세포와 Jukat 세포에서의 발현증가라는 측면에서 보면, CD93 자체의 발현도 증가하고, 특히 CD93 가용성 단편의 양 또한 증가한다는 점을 고려하면, CD93 또는 이의 가용성 단편이 염증성 질환의 진단 마커로서의 활용이 가능할 것으로 고려된다.
<8-3> RT-PCR 실험
THP-1 세포를 6 웰 플레이트에 배양한 후, 각각 PBS, LPS(1.0 ㎍/㎖, InvivoGen), PMA(0.1 ㎍/㎖, Sigma)를 처리하였다. 처리 24시간 후 RNA 동정 키트 (Qiagen)를 이용하여 RNA를 동정하였다. 역전사를 위해 역전사효소(Bio-Rad)와 dNTP를 혼합하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 각각의 cDNA를 얻었다. real-time PCR 분석을 위해 CFX96 system(Bio-Rad)이 이용되었다. 95℃에서 3분 동안 초기 변성하고, 이어서 95℃에서 15초 동안 어닐링, 60℃에서 1분 동안 신장화를 40 ~ 45 주기로 하여 PCR을 수행하였다. 형광 측정은 각 어닐링 단계에서 기록되며, 데이터들은 각 단계마다 자동으로 저장되었다. 구체적으로는, 2 ㎕의 cDNA 주형과 CD93 프라이머를 23의 iQ SYBR Supermix(Bio-Rad)와 혼합하여 반응시켰다. 모든 반응은 2번 반복하였다. 상대적 mRNA 발현을 측정하기 위하여 평균 Ct(average threshold cycle) 값을 기준값으로 하였다. 모든 Ct 값의 기준은 GAPDH를 이용하여 표준화하였다. 프라이머 세트는 다음과 같다[CD93: 정방향 프라이머 CTC TGG GGC TAC TGG TCT ATC(서열번호: 34), 역방향 프라이머 TGT CGG ACT GTA CTG GTT CTC(서열번호: 35); GAPDH: 정방향 프라이머 CAT GTT CGT CAT GGG TGT GAA(서열번호: 36), 역방향 프라이머 GGA CTG TGG TCA TGA GTC CTT(서열번호: 37)].
그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, THP-1 세포에서의 CD93 발현은 LPS와 PMA 처리에 의해 유의하게 증가하였다(도 20).
<실시예 9> 마우스 말초혈액단핵세포와 복막세포에서의 CD93 발현 양상 및 혈청과 복막액에서의 CD93 가용성 단편의 양 측정 실험( in vivo )
상기 시험관내(in vitro) 실험에서의 CD93 발현 양상에 대해 생체내(in vivo) 실험에서도 같은 발현 양상과 단편화 현상이 일어나는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 즉, 마우스에 복막염을 일으키거나 염증 유발 물질[티오글리콜레이트 (thioglycollate) 또는 LPS]을 주사한 후, 마우스 말초혈액단핵세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)와 복막세포(peritoneal cell)에서의 CD93 발현 양상, 및 혈청(serum)과 복막액(peritoneal lavage fluid, PLF)에서의 CD93 가용성 단편의 양을 측정하였다.
<9-1> 마우스 말초혈액단핵세포와 복막세포에서의 CD93 발현 양상 : FACS 실험
6주령 balb/C 마우스에 1 ㎖의 PBS, 4% 티오글리콜레이트 또는 0.1 ㎎/㎖의 LPS를 주사한 다음, 3일 동안 유지하였다. 3일 후, 마우스로부터 후안와정맥 (retro-orbital vein)을 통해 헤파린-코팅된 유리 모세관 튜브를 이용하여 혈액을 채혈하고 원심분리하여 혈청과 PBMC 세포를 얻었다. 곧바로 마우스를 희생시켜, 복강내로부터 복막액(PLF)과 복막세포(대부분 복강내 대식세포)를 얻었다. 각각의 세포들에 포함된 적혈구를 제거하기 위하여, 10 ㎖의 적혈구 용해용액(red blood cell lysing buffer, Sigma)을 37℃에서 10분간 두 번 반응시켜 완전히 적혈구를 제거하였다. 그 다음 상기 실시예 <8-1>에서 전술한 것과 동일한 방법으로 형광염색하였다. 다만, 항체의 경우 양 항-마우스 CD93 항체(R&D systems)와 항-양 IgG-FITC(Santa Cruz)를 사용하였다. 또한 대식세포 분화 정도를 알아보기 위하여, 분화마커인 CD11b 항체(BD sciences)를 이용하여 이중 염색을 하였다.
그, 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, 복막세포 중 대식세포에서의 마우스 CD93 발현은 LPS 처리에 의해 가장 많은 증가를 보였고, 티오글리콜레이트 처리에 의해서도 유사하게 증가하였다(도 21). 따라서, 마우스에 티오글리콜레이트와 LPS 처리에 의해 PBMC에 존재하던 대식세포들이 복막으로 옮겨간 것을 알 수 있다.
<9-2> 웨스턴 블롯 실험
상기 <9-1>에서 사용하고 남은 절반의 세포를 용해시킨 후, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 마우스 CD93을 검출하기 위해 양 항-마우스 CD93 항체(R&D systems)와 항-양 IgG-HRP(Santa Cruz)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 <8-2>의 방법과 동일하게 하여 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. 또한 대식세포 분화 정도를 알아보기 위하여, 분화마커인 CD11b 항체(BD sciences)를 이용하여 이중염색을 하였다. 내부 대조군으로 항-β 액틴(Santa cruz)과 항-염소 IgG-HRP(Santa cruz)를 이용하였다. 이후 ECL 키트(ECL Plus , Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하였다.
그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 상기 FACS 결과와 동일하게 마우스에 티오글리콜레이트와 LPS 처리에 의해 복막세포에서 CD93 분자의 발현이 현저히 증가하였다(도 22).
<9-3> CD93 가용성 단편의 양 측정: 샌드위치 ELISA 실험
FACS와 웨스턴블롯 실험에 의해 CD93 분자 자체의 양이 증가되었음을 관찰한 후, CD93 가용성 단편은 어떻게 변화되는지를 확인하기 위하여, 샌드위치 ELISA 방법을 이용하여 혈청과 복막액(PLF)에서의 CD93 가용성 단편의 양을 측정하였다.
먼저, 93-웰 휄콘 플레이트(Becton Dickinson)에 100 ng/well의 랫트 항-마우스 CD93 항체(R&D systems)를 밤새도록 코팅하였다. PBST로 3회 세척한 후, 3% 탈지우유로 상온에서 30분간 차단하였다. 다시 PBST로 3회 세척한 후, 모아둔 각각의 마우스 혈청과 복막액을 100 ㎕씩 로딩한 후 2시간 동안 방치하였다. 정량을 위한 표준 물질로는 마우스 CD93 가용성 단편이 사용되었다. 다시 3회 세척한 후, 1 ㎍/㎖의 양 항-마우스 CD93 항체(R&D systems)로 1시간 방치하였으며, 곧이어 1 ㎍/㎖의 항-양 IgG-HRP 항체(Santa cruz)로 다시 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 다시 3회 세척한 후, OPD(Sigma)를 이용하여 발색한 후, 분광광도계(VERSAmax tunable microplate reader, Molecular Devices)를 이용하여 OD값을 측정하였다. 측정한 값은 각각 표준곡선을 이용하여 절대 정량을 실시하였다.
그 결과, 도 23에 나타난 바와 같이, 혈청 내 CD93 가용성 단편의 양은 LPS나 티오글리콜레이트에 의해 크게 변화되지 않았다. 그러나, 복막액 내의 CD93 가용성 단편의 양은 LPS나 티오글리콜레이트 처리에 의해 현저히 증가하였다(도 23). 따라서, CD93 가용성 단편은 염증성 질환의 진단 마커로서의 활용이 가능할 것으로 생각된다.
<실시예 10> 활막조직 내에서의 CD93 발현 및 활막액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양 측정
<10-1> 활막 조직 내에서의 CD93 발현: 면역조직화학(immunohistochemistry) 방법
3명의 류마티스성 관절염(rheumatoid-arthritis, RA) 환자와 2명의 퇴행성 관절염(osteo-arthritis, OA) 환자로부터 얻은 활막(synovium) 조직을 4% 파라포름알데히드로 밤새도록 고정하였다. 이후, 알콜로 탈수시키고 파라핀으로 임베딩 (embedding)하여 절단을 실시하였다. 이후 내재된 퍼옥시다제 활성을 없애기 위해 methanolic H2O2로 반응시켰다. 또한 비특이적 반응을 없애기 위해 3% NGS(normal goat serum)로 2시간 차단하였다. 이후 조직을 염소 항-인간 CD93 항체(R&D)와 비오티닐화된 항-염소 IgG, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체(Vector, Peterboredgh, UK)를 차례로 각 1시간씩 반응시켰다. 염색된 조직은 다시 헤마톡실린으로 대조염색(counter staining)하여, 올림푸스 현미경(Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, 퇴행성 관절염 환자로부터 얻은 활막 조직보다 류마티스성 관절염 환자로부터 얻은 활막 조직에서 CD93의 발현이 현저히 높게 나타났다(도 24). 특히, 림프구의 침윤이 일어나는 윤활막(synovial lining), sublining, 및 혈관주위 부분(perivascular region)에서 CD93 분자의 발현이 현저히 높게 나타났다.
<10-2> 활막액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양 측정: 샌드위치 ELISA 방법
8명의 류마티스성 관절염 환자와 8명의 퇴행성 관절염 환자로부터 얻은 활막액(synovial fluid) 내에서의 CD93 가용성 단편의 양을 샌드위치 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다.
먼저, 93-웰 휄콘 플레이트(Becton Dickinson)에 100 ng/well의 랫트 항-인간 CD93 항체(R&D systems)를 밤새도록 코팅하였다. PBST로 3회 세척한 후, 3% 탈지우유로 상온에서 30분간 차단하였다. 다시 PBST로 3회 세척한 후, 모아둔 각각의 류마티스성 관절염 환자와 8명의 퇴행성 관절염 환자의 활막액(SF)을 100 ㎕씩 로딩한 후 2시간 동안 방치하였다. 정량을 위한 표준 물질로는 인간 가용성 CD93이 사용되었다. 다시 3회 세척한 후, 1 ㎍/㎖의 염소 항-인간 CD93 항체(R&D systems)로 1시간 방치하였으며, 곧이어 1 ㎍/㎖의 항-염소 IgG-HRP 항체(Santa cruz)로 다시 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 다시 3회 세척한 후, OPD(Sigma)를 이용하여 발색하고, 분광광도계를 이용하여 OD값을 측정하였다. 측정한 값은 각각 표준곡선을 이용하여 절대 정량을 실시하였다.
그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이, 류마티스성 관절염 환자로부터 얻은 활막액 내에서의 CD93 가용성 단편의 양이 퇴행성 관절염 환자군 보다 현저히 높음을 확인하였다(도 25).
따라서, CD93 분자 또는 이의 가용성 단편은 염증성 질환의 진단 마커로서의 활용이 가능할 것으로 고려된다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 다양한 염증성 질환의 치료제 및 진단 키트를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (20)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CD93 수용성 단편에 대한 특이적인 항체를 유효성분으로 항염증성 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날항체, 폴리클로날항체, 다중특이적 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 단편, 재조합 항체 및 화학적으로 수식된 항체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 항체의 단편은 Fab, F(ab')2, scFv, Fv, Fab/c, 항체를 단백질 절단 효소로 절단시켜 얻어진 항체 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 항체인 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는
    1) 포유동물에, sCD93 단백질, 그 단편 및 전장의 CD93 단백질로 구성된 군에서 선택된 면역원을 면역시키고 항체 생산 세포를 채취하는 단계;
    2) 상기 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하는 단계; 및,
    3) 상기 하이브리도마로부터 상기 모로클로날 항체를 얻는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 폴리클로날 항체는
    1) 포유동물에, sCD93 단백질, 그 단편 및 전장의 CD93 단백질로 구성된 군에서 선택된 면역원을 면역시키는 단계; 및
    2) 면역된 포유동물로부터 채취한 혈액으로부터 sCD93 단백질에 특이적인 항체를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항염증성 조성물.
  7. 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 CD93 유전자의 발현을 억제할 수 있는, siRNA, shRNA 및 shRNA의 발현벡터로부터 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물.
  8. 제 1항 또는 제 7항 중 어느 한 항의 조성물을 염증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 치료 방법.
  9. 제 1항 또는 제 7항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 예방 방법.
  10. 제 1항의 항체, 또는 제 7항의 siRNA, shRNA 및 shRNA의 발현벡터로부터 구성된 군에서 선택된 어느 하나를 항염증성 조성물의 제조에 이용하는 용도.
  11. CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 염증성 질환 진단용 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 가용성 단편은 CD93 단백질이 세포배양 후 방출된 세포외 부분(ectodomain)으로서 95kDa인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단용 키트.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 퇴행성 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 복막염, 포도막염, 피부염, 습진 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단용 키트.
  14. 1) 생물학적 시료 및 대조군의 단백질을 고정체에 코팅시키는 단계;
    2) 상기 고정체에 서열번호 33으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계;
    3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합 반응물을 2차 항체 접합체의 표지체 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계;
    4) 생물학적 시료와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계; 및
    5) 생물학적 시료 내 CD93 또는 이의 가용성 단편의 발현 수준이 대조군 보다 높으면 염증성 질환을 가지거나 가질 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 진단 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 복막액, 활막액, 타액, 소변 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 고정체는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막 (polyvinylidene difluoride membrane), 폴리비닐 수지 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드글라스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 방법.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 항원-항체 결합반응은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 ELISA법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR(surface plasmon resonance), 바이오칩(DNA, RNA), 전기영동법, PCR 및 RT-PCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 방법.
  18. 제 14항에 있어서, 상기 2차 항체 접합체의 표지체는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 및 색소(dye)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 방법.
  19. 제 14항에 있어서, 상기 발색 기질 용액은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], 및 OPD(o-phenylenediamine)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 진단 방법.
  20. CD93 또는 이의 가용성 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 염증성 질환 진단용 키트의 제조에 이용하는 용도.
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