WO2017164257A1 - 血球分化能の高い中胚葉誘導方法 - Google Patents

血球分化能の高い中胚葉誘導方法 Download PDF

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浩之 江藤
大 遠藤
幸敬 伊東
淳一 福永
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国立大学法人京都大学
株式会社メガカリオン
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for inducing mesoderm, particularly a method for inducing mesoderm having high blood cell differentiation ability from human pluripotent stem cells, and a method for producing megakaryocytes and platelets using the same.
  • platelets When treating blood-related diseases or performing surgical treatment, blood cells that are used for treatment are required.
  • platelets platelet precursors (proplatelets), which are essential for blood coagulation (hemostasis), and megakaryocytes, which are cells that produce platelets, are cells with particularly high needs.
  • platelets are in great demand for leukemia, bone marrow transplantation, anticancer treatment, etc., and the need for a stable supply is high.
  • Pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are used as a source for artificially producing blood cells such as platelets.
  • Pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are used as a source for artificially producing blood cells such as platelets.
  • various reports on the differentiation lineage and mechanism from pluripotent stem cells to hematopoietic mesoderm have been found, and no conclusion has been obtained so far (Non-patent Document 1).
  • BMP4 or CHIR plays an important role in the differentiation of human pluripotent stem cells into blood precursor mesoderm, and have completed the present invention.
  • a method for inducing mesoderm comprising a step of contacting pluripotent stem cells with bone morphogenetic protein (BMP4) or CHIR for 3 days or more.
  • BMP4 bone morphogenetic protein
  • CHIR bone morphogenetic protein
  • [6] A method for producing a culture containing megakaryocytes or megakaryocyte progenitor cells, wherein the mesoderm induced by the method according to any one of [1] to [5] is induced to differentiate into megakaryocyte cells Including a method.
  • [7] A method for producing platelets from megakaryocytes produced by the method according to [6].
  • [8] A platelet preparation containing platelets produced by the method according to [7].
  • [9] A method in which the platelet produced by the method according to [7] is transplanted or transfused into a subject.
  • the novel differentiation-inducing method of the present invention using BMP4 or CHIR not only differentiation from pluripotent stem cells to mesoderm can be induced with higher efficiency but also differentiation induction into blood cell groups. Can be promoted.
  • the present invention further enables high-efficiency differentiation induction of not only megakaryocytes and platelets but also various blood cells including hematopoietic stem cells.
  • FIG. 2A is a diagram showing a surface antigen expression pattern of a blood cell differentiation system obtained by co-culture of C3H10T1 / 2 cells and KhES3 in a time series.
  • FIG. 2B shows the appearance pattern of the CD56 + APJ + cell population in the initial step.
  • FIG. 2C shows the appearance pattern of the CD34 + cell population at the mid-step.
  • FIG. 2D shows the appearance pattern of CD43 + cells at the late step.
  • FIG. 2A is a diagram showing a surface antigen expression pattern of a blood cell differentiation system obtained by co-culture of C3H10T1 / 2 cells and KhES3 in a time series.
  • FIG. 2B shows the appearance pattern of the CD56 + APJ + cell population in the initial step.
  • FIG. 2C shows the appearance pattern of the CD34 + cell population at the mid-step.
  • FIG. 2D shows the appearance pattern of CD43 + cells at the late step.
  • FIG. 3A shows the FACS plot on the 4th day from the start of differentiation.
  • FIG. 3C shows a FACS plot on the 10th day from the start of differentiation.
  • FIG. 4A shows a schematic of an experiment in which three important signal factors were identified by intervention in the initial step.
  • FIG. 4B shows the appearance pattern of day4 CD56 + APJ + cells under the condition where each factor was added.
  • FIG. 4D shows the result of comparing the effect of NOGGIN (BMP antagonist) with the control group. The results are shown as mean values and standard deviations.
  • FIG. 4F is a diagram showing that there is a difference in the influence of each signal, and that the TGF ⁇ signal has the strongest influence. The degree of influence is expressed by the size of the arrow.
  • FIG. 5A shows a schematic of the experiment showing that improved differentiation was obtained by two factors in the metaphase step. Each factor was added to the middle stage of Day 4-7, and the appearance rate of blood cells on day 10 was analyzed.
  • FIG. 5C shows the result of comparing the effect of adding SB431542 with that of the DMSO group. The addition of SB431542 significantly improved the appearance efficiency of day10 blood cells.
  • FIG. 6A shows a schematic of the experiment showing that intervention at the mid-step resulted in a dramatic improvement in blood cell differentiation efficiency. In order to use the number of blood cells finally obtained as an index, it was necessary to match the initial seeding number under each condition. Therefore, differentiation started in a single cell state.
  • FIG. 6B shows a result of bFGF and SB431542 having a synergistic effect, achieving an increase in the number of blood cells produced by about 40 times compared with the previous report.
  • FIG. 6C shows FACS plots for all differentiated cells induced by Conventional vs. proved method. In the conventional method, most differentiated cells were negative for CD43, but the proportion of CD43 + cells increased by the improved method. Data for KhES3 are shown.
  • FIG. 7A shows an outline of an experiment in which stable hemocyte differentiation could be achieved by purifying mesoderm. At day 4, only CD56 + APJ + mesoderm cells were sorted and seeded on a new feeder. The culture was continued, and blood cells on day 14 were analyzed.
  • FIG. 7C shows the result of confirming the appearance of spherical cells appearing in colonies on day14.
  • FIG. 7D shows the appearance ratio of CD56 + APJ + cells on day 4. The results were displayed as dots, and the average value and standard deviation were shown. There is more than 10% variation between trials.
  • FIG. 7E shows the appearance ratio of CD43 + blood cells on Day 14. The results were displayed as dots, and the average value and standard deviation were shown. 20-60% of all cells were differentiated into blood cells, and a highly efficient differentiation system could be constructed.
  • FIG. 8A shows the results of finding that there are a plurality of conditions capable of inducing blood cell progenitor mesoderm cells by performing an initial step in a serum-free feeder system. The signal factors required at each step are illustrated.
  • FIG. 8A shows the results of finding that there are a plurality of conditions capable of inducing blood cell progenitor mesoderm cells by performing an initial step in a serum-free feeder system. The signal factors required at each step are illustrated.
  • FIG. 8B illustrates the outline of the experiment. Differentiation on Day0-4 was performed with a combination of Matrigel and three signal factors, cells were sorted on day4 and seeded on a new Matrigel-coated plate, culture continued, all cells analyzed on day14, and blood cell differentiation efficiency Evaluated. Each factor was used at Activin A 50 ng / ml, BMP4 50 ng / ml, and CHIR99021-3 ⁇ M.
  • FIG. 8C shows the appearance pattern of CD56 + APJ + cells in each condition on day4.
  • FIG. 8D is a bar graph showing the appearance ratio of CD56 + APJ + cells under each condition. Appearance was observed under all conditions, and AC and ABC induced mesoderm cells most efficiently.
  • FIG. 8C shows the appearance pattern of CD56 + APJ + cells in each condition on day4.
  • FIG. 8D is a bar graph showing the appearance ratio of CD56 + APJ + cells under each condition. Appearance was observed under all conditions, and AC and
  • FIG. 8E shows the appearance pattern of CD43 + cells on Day 14.
  • FIG. 8G shows the appearance pattern of vascular endothelial cells (KDR + VE-Cadherin + cells) on day 14.
  • FIG. 9A shows a schematic of an experiment showing that blocking one signal did not affect blood cell differentiation.
  • antagonist DKK1 100 ⁇ ng / mL
  • inhibitor XAV939 2.5 ⁇ M
  • NOGGIN 125
  • FIG. 9B shows FACS plots on the 4th and 14th days from the start of differentiation under ABD conditions
  • FIG. 9C shows FACS plots on the 4th and 14th days from the start of differentiation under ABX conditions.
  • FIG. 10A shows the results of finding differences between the conditions by gene expression pattern analysis. Perform gene expression analysis of Day4 CD56 + APJ + cells induced by Day0 hPSC and AB, AC, ABC conditions, compare Day4 cells and hPSC of each condition, extract genes that were Fold change> 2, and clustering analysis Went.
  • FIG. 10B shows a Venn ’s diagram composed of genes that were Fold change> 2, comparing Day4 CD56 + APJ + cells and hPSC under each condition.
  • FIG. 10C shows a Venn ’s diagram composed of gene groups in which Day4 CD56 + APJ + cells were compared between each condition and Fold change> 2. The GO analysis was performed on the gene group in which variation was observed between AB, AC and ABC. TOP-10 terms are shown in the table. Changes in gene groups related to tissues other than blood cells and blood vessels were confirmed.
  • FIG. 10D is a comparative analysis by inducing Day14 CD43 + cells under AB and AC conditions. The GO analysis of the gene group which fluctuated to AB predominance was performed. TOP-10 terms are shown in the table. Changes in immune related genes were confirmed.
  • FIG. 10C shows a Venn ’s diagram composed of gene groups in which Day4 CD56 + APJ + cells were compared between each condition and Fold change> 2. The GO analysis was performed on the gene group in which variation was observed between AB, AC and ABC. TOP-10 terms are shown in the table. Changes in gene groups related to tissues other than blood cells and blood vessels were confirmed.
  • FIG. 10D
  • FIG. 11A shows an outline of an experiment using KhES3 and showing that there was no difference in the ability of induced blood cells between AB and AC conditions.
  • the mesoderm induced under two conditions in the initial step was differentiated into blood cells, and the obtained blood cells were used for each assay.
  • G Granulocyte colony
  • M Macrophage colony
  • GM Granulocyte + Macrophage colony
  • E Erythroid colony
  • Mix E + G or E + M or E + GM.
  • FIG. 11C illustrates the results of erythroblast differentiation.
  • FIG. 11F illustrates the results of megakaryocyte differentiation.
  • FIG. 11G illustrates the results of T cell differentiation.
  • CD2 + CD7 + cell population could be confirmed under either condition (G), and all CD2 + CD7 + cells (red dots) were CD4 + CD8 + (H).
  • I differentiation efficiency
  • FIG. 11H illustrates the results of T cell differentiation.
  • CD2 + CD7 + cell population could be confirmed under either condition (G), and all CD2 + CD7 + cells (red dots) were CD4 + CD8 + (H).
  • FIG. 11I illustrates the results of T cell differentiation.
  • CD2 + CD7 + cell population could be confirmed under either condition (G), and all CD2 + CD7 + cells (red dots) were CD4 + CD8 + (H).
  • There was no significant difference in their differentiation efficiency (I) (n 3, paired t test).
  • the summary of the experimental result of an Example is illustrated. In the presence of ActivinA, when either BMP4 or canonical WNT signal entered, it differentiated into hemocyte progenitor mesoderm and then differentiated into hemocytes with high efficiency (in the presence of VEGF, bFGF, SB431542).
  • FIG. 13 shows the results of comparing the appearance patterns of day4 CD56 + APJ + cells under the conditions where activin A alone, activin A and BMP4, or activin A and CHIR were added.
  • FIG. 14 shows an image related to the definition of mesoderm.
  • the method for producing mesoderm cells according to the present invention includes a step of contacting pluripotent stem cells with BMP4 or CHIR for 3 days.
  • meoderm or “mesoderm cell” means a CD56 positive and APJ positive cell.
  • the mesoderm induced by the present invention is a cell with high blood cell differentiation ability among CD56-positive and APJ-positive cells (FIG. 14).
  • a pluripotent stem cell is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into all cells present in a living body and also has a proliferative ability, and includes, for example, an embryonic stem (ES) cells (JA Thomson et al. (1998), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848; JA Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55: 254-259; JA Thomson and VS Marshall (1998), Curr. Top. Dev.
  • ES embryonic stem
  • the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.
  • pluripotent stem cells are induced to differentiate into mesodermal cells.
  • BMP4 or CHIR is brought into contact with pluripotent stem cells by adding it to a medium or the like for culturing pluripotent stem cells.
  • GSK-3 ⁇ inhibitors for example, 3F8, A 1070722, AR-A 014418, BIO, BIO-acetoxime, 10Z-Hymenialdisine, Indirubin-3'-oxime, Kenpaullone, L803, L803-mts, MeBIO, NSC 693868, SB 216763, SB 415286, TC-G 24, TCS 2002, TCS 21311, TWS 119, etc.
  • the medium may contain other components such as components necessary for inducing differentiation into mesodermal cells, such as activin A.
  • the culture conditions are preferably serum-free conditions and / or feeder-free conditions.
  • the contact period is preferably 3 days or longer, for example, 3 to 5 days, particularly 3 to 4 days.
  • the mesodermal cells obtained through the above contact step are CD56 positive and APJ positive.
  • CD56 and APJ are independently reported as markers of mesoderm (Evseenko, D. et al. P Natl Acad Sci Usa 107, 13742-13747 (2010); Vodyanik, M. A. et al. Cell stem Cell 7, 718-729 (2010); Yu, Q. C. et al. Blood 119, 6243-6254 (2012)).
  • CD56 is an adhesion factor also known as NCAM
  • APJ is a functional molecule reported as a receptor (APLNR) such as an Apelin molecule.
  • CD56-positive and APJ-positive cells further include Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Transforming Growth Factor (beta); It may be contacted with a TGF ⁇ ) inhibitor.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • bFGF Basic Fibroblast Growth Factor
  • TGF ⁇ Transforming Growth Factor
  • the method for producing a culture containing megakaryocytes or megakaryocyte progenitor cells includes a step of inducing differentiation from mesodermal cells produced by the above method to megakaryocytes.
  • the medium used in the present invention is not particularly limited, but a medium used for culturing animal cells can be prepared as a basal medium.
  • basal media include IMDM medium, MediumMedi199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer Life's medium, Neurosal's medium And a mixed medium thereof.
  • the medium may contain serum or may be serum-free.
  • the medium can be, for example, albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, small molecules
  • One or more substances such as compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, cytokines and the like may also be included.
  • Cytokines are proteins that promote blood cell differentiation, and examples include VEGF, TPO, SCF, and the like.
  • a preferable medium in the present invention is an IMDM medium containing serum, insulin, transferrin, serine, thiolglycerol, ascorbic acid, and TPO.
  • it further contains SCF.
  • a drug-responsive promoter such as Tet-on (registered trademark) or Tet-off (registered trademark) system
  • a corresponding drug such as tetracycline or It is desirable to include doxycycline in the medium.
  • the culture conditions are not particularly limited. For example, in the presence of TPO (10 to 200 ng / mL, preferably about 50 to 100 ng / mL), TPO (10 to 200 ng / mL, preferably about 50 to 100 ng / mL) And SCF (10 to 200 ng / mL, preferably about 50 ng / mL), or TPO (10 to 200 ng / mL, preferably about 50 to 100 ng / mL) and SCF (10 to 200 ng / mL, preferably May be cultured in the presence of Heparin (about 10 to 100 U / mL, preferably about 25 U / ml).
  • the culture temperature is a temperature that does not damage the cells, for example, preferably 35.0 ° C to 42.0 ° C, more preferably 36.0 ° C to 40.0 ° C, and even more preferably 37.0 ° C to 39.0 ° C.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of megakaryocytes or megakaryocyte progenitor cells.
  • the proportion of megakaryocyte cells in the culture can be determined by analyzing cell surface markers that are specifically expressed in megakaryocytes using flow cytometry, for example, total cells contained in the culture Among them, megakaryocytes or megakaryocyte progenitor cells, particularly megakaryocytes, may be cultured so that the ratio is 50% or more, for example, 60%, 70%, 80%, 90% or more.
  • the number of days is not particularly limited as long as a desired megakaryocyte progenitor cell can be obtained.
  • it is preferably 3 days or more, more preferably 6 days or more, and even more preferably 9 days or more.
  • it may be 12 days or more, 18 days or more, 24 days or more, 30 days or more, 42 days or more, 48 days or more, 54 days or more, 60 days or more.
  • drugs that can be used include puromycin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, erythromycin, tetracycline, hygromycin, ampicillin, zeocin, blasticidin S, or histidinol. Is mentioned.
  • one embodiment of the method for producing megakaryocytes of the present invention further includes (a) a substance that inhibits the expression or function of the p53 gene product, (b) an actomyosin complex function inhibitor, (c) a ROCK inhibitor, and (d) The medium may further contain an HDAC inhibitor.
  • the amount of megakaryocyte production can be increased by forcibly expressing an exogenous gene such as an oncogene such as c-MYC or the like or a polycomb gene as described in WO2011 / 034073.
  • the production method of the present invention may further include a step of culturing megakaryocytes or megakaryocyte progenitor cells after stopping forced expression.
  • a method of stopping forced expression for example, when forced expression is performed using a drug-responsive vector, it may be achieved by not contacting the corresponding drug with the cell.
  • the above-mentioned vector containing LoxP it may be achieved by introducing Cre recombinase into the cell.
  • a transient expression vector and RNA or protein introduction are used, the contact with the vector or the like may be stopped.
  • the medium used in this step can be performed using the same medium as described above.
  • the conditions for culturing after the forced expression is stopped are not particularly limited. For example, 35.0 ° C to 42.0 ° C is preferable, 36.0 ° C to 40.0 ° C is more preferable, and 37.0 ° C to 39.0 ° C is even more preferable.
  • the culture period after the forced expression is stopped can be appropriately determined while monitoring the number of cells, particularly the number of megakaryocytes, but at least 2 days after the forced expression is stopped. Some are preferred, for example, 2 to 14 days.
  • the culture period is more preferably 3 to 12 days, still more preferably 4 to 10 days. During the culture period, it is desirable to perform medium replacement or passage as appropriate.
  • the megakaryocytes obtained by the present invention can efficiently produce functional platelets by being sufficiently matured.
  • maturation of megakaryocytes means that megakaryocytes are sufficiently polynucleated and can produce functional platelets.
  • Megakaryocyte maturation can also be confirmed by, for example, increased expression of megakaryocyte maturation-related genes such as GATA1, p45 NF-E2, and beta1-tubulin, formation of proplatelets, and intracellular multinucleation.
  • the platelets have already been confirmed to have high thrombus formation ability in in vivo and in vitro.
  • megakaryocytes and / or megakaryocyte progenitor cells can produce functional platelets even after thawing after cryopreservation.
  • the megakaryocyte cell line created in the present invention can be distributed in a cryopreserved state.
  • the method for producing platelets according to the present invention is characterized by using the culture produced by the above production method.
  • the method for producing platelets according to the present invention comprises culturing megakaryocytes, megakaryocyte progenitor cells and / or megakaryocyte cell lines obtained by the above-described method, and collecting platelets from the culture. Process.
  • the culture conditions are not limited. For example, in the presence of TPO (10 to 200 ng / mL, preferably about 50 to 100 ng / mL), or TPO (10 to 200 ng / mL, preferably 50 to 100 ng / mL). Degree), SCF (10 to 200 ng / mL, preferably about 50 ng / mL) and Heparin (10 to 100 U / mL, preferably about 25 U / ml) may be cultured.
  • TPO 10 to 200 ng / mL, preferably about 50 to 100 ng / mL
  • TPO 10 to 200 ng / mL, preferably 50 to 100 ng / mL
  • Heparin 10 to 100 U / mL, preferably about 25 U / ml
  • the culture period is desirably at least 3 days, but is not particularly limited as long as the function of the produced platelets is maintained.
  • the culture period is 3 to 14 days.
  • the culture period is preferably 4 to 12 days, more preferably 5 to 10 days.
  • the culture temperature is not particularly limited and is, for example, 35.0 ° C to 42.0 ° C.
  • the culture temperature is preferably 36.0 ° C to 40 ° C, more preferably 37.0 ° C to 39.0 ° C.
  • the step of culturing megakaryocytes may be performed under serum-free and / or feeder cell-free conditions.
  • the method is carried out by culturing megakaryocytes produced according to the method of the present invention in a medium containing TPO.
  • conditioned medium is not particularly limited and can be produced by a person skilled in the art according to a known method.
  • the conditioned medium can be obtained by appropriately culturing feeder cells and removing the feeder cells from the culture with a filter.
  • a ROCK inhibitor and / or an actomyosin complex function inhibitor is added to the medium.
  • a ROCK inhibitor and an actomyosin complex function inhibitor the same thing as what was used by the manufacturing method of the multinucleated megakaryocyte mentioned above can be used.
  • the ROCK inhibitor include Y27632, fasudil hydrochloride, H1152 dihydrochloride and the like.
  • the actomyosin complex function inhibitor is, for example, a myosin ATPase activity inhibitor or a myosin light chain kinase inhibitor. Examples include blebbistatin, ML-7, and ML-9.
  • a ROCK inhibitor or an actomyosin complex function inhibitor may be added alone, or a ROCK inhibitor and an actomyosin complex function inhibitor may be added in combination.
  • the ROCK inhibitor and / or the actomyosin complex function inhibitor may be added at 0.1 ⁇ M to 30.0 ⁇ M, for example.
  • the concentration of the inhibitor is preferably 0.5 ⁇ M to 25.0 ⁇ M, more preferably 1.0 ⁇ M to 20.0 ⁇ M, and even more preferably 5.0 ⁇ M to 15.0 ⁇ M.
  • the culture period in which the ROCK inhibitor and / or the actomyosin complex function inhibitor is added can be, for example, 1 day to 15 days.
  • the culture period is preferably 3 to 13 days, more preferably 5 to 11 days, and even more preferably 6, 7, 8, 9, and 10 days.
  • Platelets can be isolated from the medium by methods known to those skilled in the art. Platelets obtained by the present invention are highly safe platelets that do not express foreign genes.
  • the megakaryocyte obtained in the present invention is not particularly limited, but, for example, an exogenous apoptosis inhibitor gene and an oncogene may be expressed. In this case, in the platelet production process, the expression of the exogenous gene is suppressed.
  • the platelets obtained in the present invention can be administered to patients as a preparation.
  • platelets obtained by the method of the present invention are, for example, human plasma, infusion solution, citrate-containing physiological saline, a solution containing glucose-added acetate Ringer solution, PAS (platelet additive solution) (Gulliksson, H. et al., Transfusion, 32: 435-440, (1992)), etc.
  • the storage period is about 14 days immediately after formulation. Preferably 10 days. More preferably, it is 8 days. As storage conditions, it is desirable to store with shaking and stirring at room temperature (20-24 ° C).
  • the platelet transplantation or transfusion method according to the present invention includes a step of transplanting or transfusion of platelets produced by the above method to a subject.
  • Platelets produced according to the method of the present invention can be transfused in the same manner as platelets prepared by conventional methods, and those skilled in the art can appropriately administer them to a subject.
  • the term “subject” refers to a mammal (eg, cow, pig, camel, llama, horse, goat, rabbit, sheep, hamster, guinea pig, cat, refers to any vertebrate, including dogs, rats and mice, non-human primates (eg monkeys such as cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees) and humans. Depending on the embodiment, the subject may be a human or non-human animal.
  • a mammal eg, cow, pig, camel, llama, horse, goat, rabbit, sheep, hamster, guinea pig, cat
  • any vertebrate including dogs, rats and mice, non-human primates (eg monkeys such as cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees) and humans.
  • the subject may be a human or non-human animal.
  • Gelatin-coated 60 mm dish, 2 mL / dish, and 100 mm dish, 4 mL / dish gelatin solution were added, the dish was shaken so that it was distributed over the whole, and incubated at 37 ° C. for 1 hour or more to coat.
  • Matrigel- coated 6-well plate, 60 mm dish and pipettes were pre-cooled to 4 ° C. While cooling the 50-fold diluted Matrigel solution stored at 4 ° C., it was added at 2 mL / well for a 6-well plate and 3 mL / dish for a 60 mm dish, and incubated at 37 ° C. for 1 hour or longer to coat.
  • Mouse fetal fibroblasts were established using fetuses of ICR mouse E12.5. The mouse on day 12 of gestation was euthanized, the uterus was aseptically removed, and the fetus was manually separated from the placenta. The head and abdomen were manually removed, and then fined with a scissors. 0.05% Trypsin EDTA (1 mL / animal) was added and placed in a flask for cell culture, and the mixture was stirred at 300 rpm with a magnetic stirrer bar at room temperature for 20 minutes to separate the cells.
  • Trypsin EDTA (1 mL / animal
  • the reaction was stopped by adding 2 volumes of MEF medium, transferred to a 50 mL centrifuge tube, centrifuged at 400 g for 10 minutes, and the supernatant was removed.
  • the pellet was suspended in 10 mL of DMEM + 10% FBS + L-glutamine medium per mouse, the cells for 1 mouse were seeded in one 100 mm dish, and incubated at 10% CO2, 37.0 ° C ( day0). On day 1, the medium was completely changed. On day 2, the cells were detached and collected using 0.05% Trypsin EDTA, and subcultured and expanded in a calculation of 1.2 sheets of 150 mm dish from 100 sheets of 100 mm dish. Cells were collected on day 4 and stored frozen at ⁇ 80 ° C. using a TC protector at 4 ⁇ 10 6 cells / tube.
  • MEF When MEF was used for iPS cell culture, it was performed as follows. The frozen tubes were thawed and seeded on one 100 mm dish. The day after thawing, 1 mg / mL MMC solution was added at a final concentration of 10 mg / mL and incubated at 37 ° C. for 2 hours to inactivate cell division. The cells were collected with 0.05% Trypsin EDTA, and 3 ⁇ 10 5 cells were seeded in a 60 mm dish previously coated with gelatin, and used on the next day and thereafter.
  • C3H10T1 / 2 cells were diluted to maintain from 1 to 8-10 cells when subconfluent and maintained. The passage was performed every 3-4 days, and the medium was changed every other day.
  • MMC solution When used, 1 mg / mL MMC solution was added to a sub-confluent cell dish to a final concentration of 10 mg / mL, and incubated at 37 ° C. for 2 hours to inactivate cell division. Cells were collected with 0.05% Trypsin EDTA, and 8 ⁇ 10 5 cells were seeded in a 100 mm dish pre-gelatin coated and used on the next day and thereafter.
  • OP9-DL1 cells were diluted and maintained to pass from 1 to 8-10 cells when subconfluent. The passage was performed every 3-4 days, and the medium was changed every other day. When used, the cells were seeded on a gelatin-coated 6-well plate, continued to culture, and used to be confluent.
  • the KSR medium was used as the maintenance culture medium using hPSC MEF .
  • the medium was changed every day during the culture. Passaging was performed using TK solution. After removing the culture supernatant by aspiration, TK solution was added at 1 mL / dish and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Aspirate the supernatant and add 3-4 mL of KSR medium. The colonies were detached to some extent from the bottom surface by tapping. The colonies were crushed to some extent by pipetting with Pipetteman (p1000), and the required amount was seeded on a dish seeded with new MEF. The medium was changed the day after the passage, and thereafter the medium was changed every day.
  • StemFit medium was used as the maintenance culture medium using hPSC matrigel .
  • the medium was changed every other day.
  • TrypLE select was added at 1 mL / dish and reacted at 37 ° C. for 3 minutes, and pipetted with a p1000 pipetman and collected in a 15 mL centrifuge tube.
  • the reaction was stopped with MEF medium, the supernatant was removed by centrifugation, 1-2 mL of StemFit was added and suspended, and the cells were counted.
  • the cells were subcultured in 3 ⁇ 10 4 ⁇ 1 ⁇ 10 5 cells / 60 mm dish, and Y27632 was added to the medium at 10 mM in order to prevent cell death.
  • the medium was replaced with StemFit medium the day after the passage, and thereafter the medium was replaced every other day.
  • Human ES cells that had been maintained in the blood cell differentiation method MEF using C3H10T1 / 2 from hPSC were detached from the bottom of the dish in the same manner as at the time of passage, and the inactivated C3H10T1 / 2 prepared the day before. The seeds were sown. Since it was not possible to count the number of cells, it was approximated to be 5 x 10 4 -2 x 10 5 cells / 10cm dish.
  • the medium used was a blood cell differentiation medium supplemented with VEGF to a final concentration of 20 ng / mL. If necessary, the cells were collected in a single cell using 0.05% Trypsin EDTA, the number of cells was counted, added to Y27632 10 mM, and differentiated as a single cell.
  • the culture supernatant was removed, washed twice with PBS, 0.25% Trypsin EDTA was added at 2 mL / dish and incubated at 37 ° C for 5 minutes.
  • the cells were made into a single cell by pipetting with a pipetteman (p1000) and collected in a 15 mL centrifuge tube. The reaction was stopped by adding a blood cell differentiation medium, the supernatant was removed after centrifugation, and the suspension was suspended in the necessary medium for analysis.
  • Serum-free feeder-derived hPSCs from hPSCs were collected in a single cell and recovered from hPSCs maintained in Matrigel differentiation method , and seeded in a Matrigel-coated 60 mm dish. did.
  • For the medium add ActivinA 50 ng / mL, BMP4 50 ng / mL, CHIR99021 3 mM, NOGGIN 125 ng / mL, DKK-1 100 ng / mL, XAV939 2.5 mM to CDM or StemFit medium as needed. The medium was changed with the same composition. Y27632 10 mM was added only to Day 0-2 to suppress cell death.
  • the cells were collected on Day 4. After washing twice with PBS, TrypLE select was added at 1 mL / dish and allowed to react at 37 ° C for 3 minutes. The cells were detached by pipetting with a pipetman (p1000) and collected in a 15-mL centrifuge tube. The reaction was stopped by adding a blood cell differentiation medium, centrifuged, and after removing the supernatant, the cells were suspended in the blood cell differentiation medium and counted. The cells were differentiated into blood cells using the following two methods.
  • VEGF 50 ng / mL, bFGF 50 ng / mL, and heparin 10 units / mL were added to the medium. Thereafter, the medium was changed with the same composition on days 10 and 12. On Day 14, all cells in the plate were pipetted and collected through a 40 mm cell strainer into a 50 mL centrifuge tube. After centrifugation, the supernatant was removed, suspended in a blood cell differentiation medium, and the number of cells was counted.
  • the medium was replaced with a blood cell differentiation medium supplemented with VEGF 50 ng / ml, bFGF 50 ng / ml, and heparin 10 units / ml.
  • the supernatant is collected in a 15 mL centrifuge tube, washed twice with PBS, collected in the same centrifuge tube, added with TrypLE select 1 mL / well, reacted at 37 ° C for 5 minutes, and Pipetman (p1000 ), And the cells were detached from the bottom surface and collected in the same centrifuge tube as a single cell. After centrifugation, the supernatant was removed, suspended in a blood cell differentiation medium, and used for subsequent analysis.
  • Differentiation induction into each blood cell type was performed using the blood cells of day 14 induced by the megakaryocyte, erythroblast, and T cell differentiation induction method from the obtained blood cells.
  • For megakaryocyte induction cells were seeded at 1x10 5 cells / well on a 6-well plate seeded with C3H10T1 / 2 cells.
  • the medium was a blood cell differentiation medium, and SCF 50 ng / mL and TPO 50 ng / mL were added. After culturing for 7 days, it was collected and analyzed by flow cytometry.
  • erythroblast induction seeded with 1x10 5 cells / well of blood cells on a 6-well plate seeded with C3H10T1 / 2 cells.
  • the medium was a blood cell differentiation medium, and SCF 50 ng / mL and EPO 3 units / mL were added. After culturing for 7 days, it was collected and analyzed by flow cytometry.
  • T cell induction blood cells were seeded at 1x10 5-6 cells / well in a 6-well plate seeded with OP9-DL1 cells and confluent.
  • the medium used was an OP9 medium, and SCF 10 ng / mL + FLT3 ligand 5 ng / mL + IL-7 5 ng / mL was added.
  • the cells were collected after 14 days of culture and analyzed by flow cytometry.
  • Colony-forming ability assay Colony-forming ability was measured using induced day 14 blood cells. Methocult H4434 classic 4 mL was mixed with 5 blood cells 5x10 4 -1x10, seeded in a 60 mm dish, cultured for 14 days in a 37 ° C 5% CO2 environment, and the formed colonies were observed under a microscope. .
  • a necessary amount of cells in a state of a flow cytometry single cell was prepared, and a fluorescently labeled antibody was used in combination according to the number of cells as necessary. After the required amount of antibody was added, the reaction was allowed to incubate at 4 ° C. for 30 minutes or more. Thereafter, it was diluted with SM, centrifuged, the supernatant was removed, and suspended in the required amount of SMPI for analysis. At the time of analysis, when hPSC-derived cells and feeder cells were mixed, they were separated by FSC, SSC gate, and GFP expressed in hPSC.
  • reaction solution was prepared as follows using Roche MasterMix and Universal probe. 2xMasterMix 10 mL / sample Probe (10 mM) 0.4 mL / sample Fwd Primer (10 mM) 0.4 mL / sample Rev Primer (10 mM) 0.4 mL / sample Template cDNA 1 mL / sample H 2 O 7.8 mL / sample Total 20 mL / sample
  • reaction and data acquisition were performed using StepOnePlus.
  • the reaction program is as follows. 1 st step (1 cycle) 95 °C 10 minutes 2 nd step (40 cycle) 95 °C 10 seconds 60 °C 30 seconds
  • Gene expression array analysis GeneChip manufactured by Affymetrix was used. GeneSpring 13.0 was used for the analysis. Sample RNA was analyzed using GeneChip (registered trademark) WT PLUS Reagent Kit. Samples were prepared according to the instructions for use. Gene Ontology analysis was performed using DAVID.
  • a new cell population was confirmed on day 3 from the start of co-culture. This cell population could be characterized with CD56 + APJ +.
  • CD34 + cells known as blood cell vascular progenitor cell markers, appeared, and the proportion of cell populations increased from day 6,7.
  • the appearance of CD43 + cells known as an early blood cell marker was observed after Day 8. This increased the cell population after Day12.
  • CD56 + APJ + cells first appeared on day 0-4, CD34 + on day 5-7, and CD43 + cells on day 8 and later. This time axis was very stable and could be confirmed with good reproducibility.
  • the differentiation process consists of four cell states and three steps in between. That is, hPSC, CD56 + APJ + cell, CD34 + cell, and CD43 + cell.
  • the steps between these are called the initial step (day 0-4), mid-term step (day 4-7), and late step (day 7-).
  • NANOG and OCT3 / 4 which are markers of pluripotent stem cells, are highly expressed only in hPSC, and TB (BRACHYURY) and APJ, which are characteristic genes of mesoderm, are only found in CD56 + APJ + cells identified on day 4 It was revealed that ETV2 and KDR, which are important in blood cell vascular progenitor cells, were high only in the CD34 + cells identified on day 7.
  • RUNX1 which is known as an essential gene essential for blood cell development, increased after the day4 CD56 + APJ + cell population and further increased in the day7 CD34 + cells.
  • each cell population identified in the differentiation process is consistent with each stage (mesoderm, blood cell progenitor cells, blood cells) observed in the development process, and the differentiation process uses surface markers. It turned out that it can trace.
  • RUNX1-positive day4 CD56 + APJ + cells were strongly suggested to be blood cell producing mesoderm.
  • FIG. 4B shows the appearance of CD56 + APJ + cells on day 4 of KhES3 differentiation start by addition of each factor in FACS-plot.
  • NOGGIN a physiological antagonist of BMP
  • Nodal / ActivinA / TGF ⁇ signal three different signals as developmentally identified mesodermal inducers, Nodal / ActivinA / TGF ⁇ signal, BMP signal, and canonical WNT signal, are induced to differentiate from hPSC to mesoderm process. Had an impact on the process. Although there was a difference in intensity, Nodal / ActivinA / TGF ⁇ was an essential factor, but BMP4 and canonical WNT signals were involved in mesoderm induction, but their effects were limited.
  • FIG. 4F schematically shows the result. The size of the arrow represents the influence of the signal.
  • the improvement of the blood cell differentiation efficiency was improved by the improvement of the medium step.
  • the appearance rate of CD43 + cells on day 10 was as low as less than 1% (FIGS. 3C and D).
  • the low induction efficiency to blood cells is inconvenient for evaluating the blood cell producing ability of mesoderm. Specifically, it is impossible to exclude the possibility that both cells with high blood cell production ability and cells with low blood cell production ability are evaluated as being low due to poor efficiency of becoming blood cells.
  • BFGF has been reported as an essential molecule for inducing Hemangioblast. BFGF is essential for the induction of BL-CFC. Therefore, bFGF was added to this system, and heparin having a stabilizing action of bFGF was also added to enhance the effect. The results are shown in FIG. 5B. The addition of bFGF and heparin increased blood cell production efficiency at day 10.
  • FIG. 7B The result is shown in FIG. 7B.
  • CD56 + APJ + cells were found to produce blood cells more efficiently than CD56-APJ- cells.
  • FIG. 7C it was confirmed that spherical cells appeared in the form of colonies from the sorted cells. Cells with blood cell markers were observed by FCM.
  • FIG. 7E The ratio of CD43 + cells in all differentiated cells is shown in FIG. 7E. From 20% of the total, it was revealed that about 60% were differentiated into blood cells. From the above, although blood cells were produced from the CD56 + APJ + cell population, it was demonstrated that other cell populations are unnecessary for the production, and that this method can induce blood cell differentiation with high efficiency. .
  • FIG. 8A There is a mesoderm stage in the pathway from pluripotent stem cells to blood cells, there are three factors that are considered necessary for the induction of mesoderm, and a system that can evaluate the ability of mesoderm to produce blood cells has been established. It has been shown. By combining these, preparations were made to examine the path from the target pluripotent stem cell to blood cells, particularly how the mesoderm that is the source of blood cells arises from the pluripotent stem cells.
  • Feeder cells and serum are useful for cell survival and differentiation, but are disadvantageous in that they are unknown factors. Therefore, in order to know what signals are important for the process up to the initial mesoderm, it was examined whether or not differentiation was possible in a serum-free feeder environment only at the initial step. An outline of the experiment is shown in FIG. 8B. As a result of differentiation using a serum-free medium and Matrigel, it was confirmed that the efficiency of blood cell differentiation under these conditions was high, and the subsequent experiments were performed under serum-free and feeder conditions. After the middle phase, serum-free conditions were attempted, but the efficiency was significantly reduced, so that the serum still gave the conditions to be used to evaluate blood cell production ability.
  • CD56 + APJ + cells were confirmed under all conditions, and it was considered that differentiation into mesoderm was achieved. The results are shown in FIG. 8C. Differences were observed in the induction ratio under each condition, and CD56 + APJ + cells were efficiently induced in the order of AB ⁇ AC ⁇ ABC. The result is shown in FIG. 8D.
  • vascular endothelial cell markers were also confirmed on day 14. The results are shown in FIGS. There was no significant difference between the conditions.
  • ActivinA, BMP4, and WNT are supposed to induce the expression of each other, so antagonists and inhibitors were added to AB and AC, respectively, to show that there was really no interference.
  • ActivinA + BMP4 + XAV939 (AB with canonicalABWNT inhibition added)
  • ActivinA + BMP4 + DKK-1 (AB added with WNT signal inhibition)
  • ActivinAAB + CHIR99021 + NOGGIN AC inhibited BMP4 signal
  • FIG. 10 shows the results of recovering RNA from the differentiated cells and analyzing the gene expression array.
  • FIG. 10A shows the result of clustering analysis using genes that fluctuated between hPSC and day4 AB, AC, ABC. Compared with Day0 hPSC, Day4 AB, AC, ABC showed very similar expression pattern.
  • FIG. 10B shows a Venn diagram in which the common part between each comparison is analyzed.
  • day4 cells showed decreased expression of genes related to pluripotency, and at the same time, increased expression of genes characteristic of mesodermal system, Increased expression of epithelial-mesenchymal transition (EMT) related genes was confirmed. Therefore, it was found that day4 CD56 + APJ + cells induced under AB, AC, ABC conditions had typical mesodermal cell characteristics.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • the group that is considered to be involved in blood cell differentiation is a group that varies in common between AB vs. ABC and AC vs. ABC but not between AB vs. AC.
  • Gene Ontology (GO) analysis was performed. Indicates Top10 GO term. A group of genes related to the musculoskeletal system and nervous system were identified in terms of vascular relations. It was suggested that an increase in the number of genes not related to blood cell differentiation under ABC conditions was the cause of the loss of blood cell differentiation potential.
  • FIG. 10D A plot of the gene expression pattern is shown in FIG. 10D. Most of the genes are within Fold change ⁇ 2 and are considered to have very similar properties. However, some genes were highly expressed in AB conditions compared to AC, and GO analysis of this gene group suggested that it was related to the immune system. These results suggested that the blood cells between AB and AC showed very similar gene expression patterns, but there was a possibility that there was a difference in ability with respect to differentiation into the immune system.
  • Figure 11A shows the outline of the experiment. Further differentiation was carried out using Day 14 blood cells derived from the obtained mesoderm as the AB or AC conditions of Day 0-4.
  • FIG. 11B shows the results of colony forming ability. Blood cells induced under the two conditions had the ability to form multiple types of colonies, and there was no significant difference in type or number of colonies.
  • CD41a-CD235 + cells were erythroblasts under erythroid differentiation conditions, and CD41a + CD42b + cells were megakaryocytes under megakaryocyte differentiation conditions.
  • CD2 + CD7 + cells were used as T cells.
  • CD4 and CD8 were analyzed at the same time, all CD2 + CD7 + cells were CD4 + CD8 +.
  • Epiblasts which are considered to be equivalent to pluripotent stem cells in mouse development, must interact with three humoral factor signals: TGF ⁇ signal, BMP signal, and canonical WNT signal when becoming mesoderm.
  • TGF ⁇ signal TGF ⁇ signal
  • BMP signal BMP signal
  • canonical WNT signal canonical WNT signal
  • TGF ⁇ signal inhibition shows a strong mesoderm differentiation inhibitory effect
  • BMP signal inhibition and canonical WNT signal inhibition have limited effects.
  • ActivinA + BMP4 or ActivinA + CHIR99021 canonical WNT signal
  • the signal input on day 0-4 was not affected until day 7 or later, that is, there was a time difference. Therefore, in order to explain the state of a certain cell, it is necessary to know the developmental lineage of the cell, that is, the history of cell fate decisions about where it came from and what signal it received. Suggest that there is. It is not always enough to know the current environment of the cell. Such information may be stored in the cell as a state other than the genome (epigenome information).
  • VEGF and bFGF are known as factors that promote the proliferation of vascular endothelial cells.
  • Hemangioblast is a concept proposed from the observation of chicken embryos and is defined as a common progenitor cell of blood cells and blood vessels. In the ES cell system, it is called Blast colony forming cell (BL-CFC).
  • BL-CFC Blast colony forming cell
  • BFGF is essential for the induction of BL-CFC.
  • bFGF is said to induce the expression of VEGFR2 (Murakami, M. et al. The Journal of clinical investigation 121, 2668-2678 (2011)).
  • TGF ⁇ data was consistent with previous literature ( Figure 3C) (Evseenko, D. et al. P Natl Acad Sci Usa 107, 13742-13747 (2010); Wang, C. et al Cell Res 22, 194-207 (2012)).
  • Figure 3C There is a report that TGF ⁇ signal suppresses blood cell production when ALK5 is mediated, while blood cell production is enhanced when ALK1 is mediated, and Endoglin is involved in this (Zhang, L. et al Blood 118, 88-97 (2011)). Since SB431542 showed an ALK5 inhibitory effect, it was considered that the suppression of blood cell production was released.
  • Blood cell differentiation could be achieved without feeder cells under conditions that increased the efficiency of blood cell differentiation as much as possible. As a result, it was finally possible to use it as a system that can evaluate the blood cell production ability of mesoderm.
  • the essence of this study can be summarized in the point that it is concluded that the fate of blood cells is determined by day 4 regarding the timing of the cell lineage fate decision in the mesoderm population through the verification of the found ABC protocol.
  • Yolk Sac cells are transferred to in vitro and cultured under different conditions from in vivo, they show B-cell differentiation and behave inconsistent with the definition of primitive (Tanaka, Y. et al. P Natl Acad Sci Usa 109, 4515-4520 (2012) Considering this, it may not be easy to mention whether the blood cells obtained in this experiment are primitive or definitive.
  • Hematopoietic stem cells that can differentiate into all blood cells are used for the treatment of various diseases, mainly hematopoietic diseases, and their applicability is extremely wide.
  • mice In mice, several methods are known that enable the induction of hematopoietic stem cells (Kyba, M., Perlingeiro, R. C. R. & Daley, G. Q. Cell 109, 29-37 (2002); Kitajima, K., Minehata, K.-I., Sakimura, K., Nakano, T. & Hara, T. Blood 117, 3748-3758 (2011); Suzuki, N. et al. The journal of the American Society of Gene Therapy 21, 1424-1431 (2013)). Hematopoietic stem cells have not been successfully induced in blood cells induced by a medium or a culture method.
  • hematopoietic stem cells that can be engrafted in mice by exogenously inducing transcription factors into differentiated blood cells (HoxB4, Lhx2).
  • HexB4, Lhx2 differentiated blood cells
  • hematopoietic stem cells are induced to differentiate in the teratomas, and iPS cell-derived hematopoietic stem cells can be detected in mouse bone marrow by homing.

Abstract

本発明は、多能性幹細胞と骨形成タンパク質4（bone morphogenetic protein；BMP4）又はCHIRとを３日間以上接触させる工程を含む、中胚葉誘導方法、を提供する。

Description

血球分化能の高い中胚葉誘導方法
　本発明は、新規中胚葉誘導方法、特に、ヒト多能性幹細胞から血球分化能の高い中胚葉を誘導する方法及びこれを用いた巨核球細胞及び血小板の製造方法に関する。
　血液関連疾患を治療する場合、あるいは、外科的な治療を行う場合、治療に供される血球系細胞が必要とされる。血球系細胞の中でも、血液凝固（止血）のために必須の細胞である血小板、血小板前駆体（proplatelet）、さらには血小板を産生する細胞である巨核球細胞は特にニーズの高い細胞である。とりわけ血小板は、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおける需要が多く、安定供給の必要性は高い。
　ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、血小板などの血球系細胞を人工的に製造するためのソースとして利用されている。しかしながら、多能性幹細胞から血球前駆中胚葉（Hematopoietic mesoderm)への分化系譜およびメカニズムは様々な報告が散見し、現在までに結論が得られていない（非特許文献１）。
Kardel MD, Eaves CJ. Modeling Human Hematopoietic Cell Development From Pluripotent Stem Cells. Experimental Hematology. 2012 Apr 14;40(8):601-11
　マウス発生においては、中胚葉の形成にはNodal/ActivinA/TGFβ, WNT3, BMP4の３つの液性因子グループが重要な役割を果たすことが知られているが、ヒト発生過程においての詳細な細胞系譜制御のシグナルは不明であった。
　ヒト多能性幹細胞から中胚葉系細胞への分化系譜及びメカニズムの解明は血球細胞群への分化誘導促進にも資すると考えられる。
　本発明者らは、ヒト多能性幹細胞から血液前駆中胚葉への分化にBMP4又はCHIRが重要な役割を果たしていることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］多能性幹細胞と骨形成タンパク質4（bone morphogenetic protein；BMP4）又はCHIRとを３日間以上接触させる工程を含む、中胚葉誘導方法。
［２］多能性幹細胞が更にアクチビンAと接触される、［１］に記載の方法。
［３］前記中胚葉がCD56陽性で且つAPJ陽性の細胞である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記CD56陽性で且つAPJ陽性の細胞と、VEGF、bFGF及びTGFβ阻害剤とを接触させる工程を更に含む、［１］～３のいずれか１に記載の方法。
［５］前記接触工程が無血清条件及び／又はフィーダーフリーで実施される、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］巨核球又は巨核球前駆細胞を含む培養物の製造方法であって、［１］～［５］のいずれかに記載の方法で誘導された中胚葉を巨核球細胞に分化誘導する工程を含む、方法。
［７］［６］に記載の方法で製造された巨核球から血小板を製造する方法。
［８］［７］に記載の方法で製造された血小板を含有する血小板製剤。
［９］［７］に記載の方法で製造された血小板を被験者に移植又は輸血する方法。
　BMP4又はCHIRを用いた本発明の新規分化誘導方法によれば、多能性幹細胞から中胚葉へ、より高効率で分化誘導することが可能になるだけでなく、血球細胞群への分化誘導も促進させることができる。本発明は更に、巨核球細胞、血小板のみならず、造血幹細胞を含めた各種血液細胞の高効率分化誘導をも可能にする。
マウスにおける血球発生の系譜。左に発生系譜の階層性マップを樹形図として、右に対応する時期の胚構造の概略を示す。 図２Ａは、C3H10T1/2細胞とKhES3の共培養による血球分化系を、時系列で細胞回収して表面抗原発現パターンを解析した図である。図２Ｂは初期ステップでのCD56+APJ+細胞集団の出現パターンを示す。図２Ｃは中期ステップでのCD34+細胞集団の出現パターンを示す。図２Ｄは後期ステップでのCD43+細胞の出現パターンを示す。図２Ｅは各細胞集団での、発生段階指標となる遺伝子群の発現パターンをqRT-PCRで解析した結果を示す。結果は平均値と標準偏差で示した (n=3)。 図３Ａは分化開始4日目のFACS plotを示す。図３Ｂは2つのヒトES細胞株でのCD56+APJ+細胞の割合を、平均値と標準偏差で示す(n=3)。図３Ｃは分化開始10日目のFACS plotを示す。図３Ｄは2つのヒトES細胞株でのCD43+細胞の割合を、平均値と標準偏差で示す(n=3)。 図４Ａは初期ステップへの介入によって、３つの重要なシグナル因子を同定した実験の概略を示す。Day0-4に介入因子を添加し、day4での中胚葉細胞の出現割合を解析した。図４Ｂは各因子を添加した条件でのday4 CD56+APJ+細胞の出現パターンを示す。図４ＣはSB431542 (TGFβ阻害薬)による効果をcontrol群と比較した結果を示す。結果を平均値と標準偏差で示した。SB431542添加によって、低濃度条件から有意に中胚葉細胞集団の減少を認めた(n=3, **p<0.01, paired t test)。図４ＤはNOGGIN (BMPアンタゴニスト)による効果をcontrol群と比較した結果を示す。結果を平均値と標準偏差で示した。NOGGIN添加によって中胚葉細胞集団の減少を認めた(n=3, *p<0.05, **p<0.01, paired t test)。図４ＥはXAV939 (canonical WNTシグナル阻害薬)による効果をcontrol群と比較した結果を示す。結果を平均値と標準偏差で示した。統計学的に有意ではなかったが、XAV939添加によって中胚葉細胞集団の減少傾向を認めた(n=3, paired t test)。図４Ｆは各シグナルの影響力には差があり、TGFβシグナルが最も強く影響していたことを示す図である。矢印の大きさで影響の程度を表現した。 図５Ａは、中期ステップにおいて、2つの因子によって分化の改善が得られたことを示す実験の概略を示す。Day4-7の中期ステップに各因子を添加し、day10での血球の出現割合を解析した。図５ＢはbFGFの添加の効果をcontrol群と比較した結果を示す。統計学的に有意ではなかったが、bFGFの添加によってday10血球の出現効率を改善する傾向を認めた。結果を平均値と標準偏差で示した(n=3, paired t test)。図５ＣはSB431542の添加の効果をDMSO群と比較した結果を示す。SB431542の添加によってday10血球の出現効率を有意に改善した。結果を平均値と標準偏差で示した(n=3, *p<0.05, **p<0.01, paired t test)。 図６Ａは、中期ステップでの介入により、血球分化効率の劇的な改善が得られたことを示す実験の概略を示す。最終的に得られる血球細胞数を指標とするため、それぞれの条件での初期播種数を一致させる必要があった。そのためにシングルセルの状態で分化開始した。図６ＢはbFGFとSB431542は相乗効果を示し、既報と比較して40倍程度の血球細胞産生数の増加を達成した結果を示す。KhES3のデータを平均値と標準偏差で示した(n=5, *p<0.05, paired t test)。図６ＣはConventional vs. improved methodで誘導した分化細胞全てのFACS plotを示す。Conventional methodではほとんどの分化細胞がCD43陰性であったが、improved methodによってCD43+細胞の割合が増加した。KhES3のデータを示した。 図７Ａは、中胚葉を純化することで、安定した血球分化を達成できた実験の概略を示す。Day4の時点でCD56+APJ+中胚葉細胞のみをソーティングし、新しいフィーダー上に播種した。これを培養継続し、day14での血球を解析した。図７Ｂはday4 CD56+APJ+細胞がCD56-APJ-細胞よりも効率良く血球への分化を起こした結果を示す。結果を平均値と標準偏差で示した(n=3, *p<0.05, paired t test)。図７Ｃはday14では球形の細胞がコロニー状に出現する様子が確認できた結果を示す。図７Ｄはday4でのCD56+APJ+細胞の出現割合を示す。結果をドットで表示し、平均値と標準偏差を示した。試行間に10%以上のバラつきがある。図７ＥはDay14でのCD43+血球の出現割合を示す。結果をドットで表示し、平均値と標準偏差を示した。全体の20-60%が血球系に分化しており、高効率な分化系を構築することができた。 図８Ａは、無血清無フィーダー系で初期ステップを行うことで、血球前駆中胚葉細胞の誘導が可能な条件が複数あることを見出した結果を示す。各ステップにおいて必要なシグナル因子を図示した。図８Ｂは実験の概略を図示する。Day0-4での分化をマトリゲルと３つのシグナル因子の組み合わせで行い、day4で細胞をソーティングして新しいマトリゲルコートしたプレートに播種し、培養を継続、day14で全ての細胞を解析し、血球分化効率を評価した。各因子はActivinA 50 ng / mL, BMP4 50 ng / mL, CHIR99021 3 μMで使用した。図８Ｃはday4での各条件におけるCD56+APJ+細胞の出現パターンを示す。図８Ｄは各条件でのCD56+APJ+細胞の出現割合を棒グラフで示す。どの条件でも出現は認められ、ACとABCが最も効率良く中胚葉細胞を誘導した。図８ＥはDay14でのCD43+細胞の出現パターンを示す。図８Ｆは、各条件でのCD43+細胞の出現割合を、ABを基準として平均値と標準偏差で示す。ABとACでは効率よく血球に分化しているが、ABCでは血球になる細胞が顕著に減少していた(n=3, **p<0.01, paired t test)。図８Ｇはday14での血管内皮細胞（KDR+VE-Cadherin+細胞）の出現パターンを示す。図８Ｈは各条件でのKDR+VE-Cadherin+細胞の出現割合を、ABを基準として平均値と標準偏差で示す。各条件間に統計学的な有意差を認めなかった。(n=3, paired t test) 図９Ａは、１つのシグナルをブロックしても血球分化に影響はなかったことを示す実験の概略を示す。AB条件ではcanonical WNTシグナルブロックのためにアンタゴニストDKK1 (100 ng / mL)や阻害剤XAV939 (2.5 μM)を添加(ABD, ABX条件)、AC条件ではBMPシグナルブロックのためにアンタゴニストであるNOGGIN (125 ng / mL)を添加した（ACN条件）。Day4以降は全て共通の条件で培養を継続した。細胞株はKhES3を用いた。図９ＢはABD条件での分化開始4日目と14日目のFACS plotを示す。図９ＣはABX条件での分化開始4日目と14日目のFACS plotを示す。図９ＤはACN条件での分化開始4日目と14日目のFACS plotを示す。全てにおいて、CD56+APJ+細胞集団とCD43+細胞集団の出現を高効率に認めた。 図１０Ａは遺伝子発現パターン解析により、各条件間の差を見出した結果を示す。Day0 hPSCとAB, AC, ABC条件で誘導したDay4 CD56+APJ+細胞の遺伝子発現解析を行い、各条件のDay4細胞とhPSCを比較してFold change > 2であった遺伝子群を抽出し、クラスタリング解析を行った。図１０Ｂは、Day4 CD56+APJ+細胞とhPSCを各条件で比較し、Fold change > 2であった遺伝子群で構成したVenn’s diagram。各条件で共通して変動していた遺伝子群には、多能性に関連する遺伝子群、中胚葉に関連する遺伝子群、EMTに関連する遺伝子群が含まれていた。図１０Ｃは、Day4 CD56+APJ+細胞を各条件間で比較し、Fold change > 2であった遺伝子群で構成したVenn’s diagram。AB, ACとABC間で変動を認める遺伝子群に関して、GO解析を行った。TOP 10 termsを表に示す。血球・血管以外の組織に関する遺伝子群の変動が確認できた。図１０ＤはDay14 CD43+細胞をAB, AC条件で誘導して比較解析した。AB優位に変動している遺伝子群のGO解析を行った。TOP 10 termsを表に示す。免疫関係の遺伝子群の変動が確認できた。 図１１Ａは、KhES3を用い、ABとACの条件間には、誘導した血球の能力に差が認められなかったことを示す実験の概略を示す。初期ステップで2つの条件で誘導した中胚葉を血球に分化させ、得られた血球をそれぞれのアッセイに用いた。図１１Ｂはコロニー形成能アッセイの結果を図示する(n=3)。G: Granulocyte colony, M: Macrophage colony, GM: Granulocyte + Macrophage colony, E: Erythroid colony, Mix: E+G　or E+M or E+GM. 各コロニーの数に有意な差を認めなかった。図１１Ｃは赤芽球分化の結果を図示する。どちらの条件でもFACSではCD41-CD235+の赤芽球集団を認め(C)、その分化効率には有意な差を認めなかった(D) (n=3, paired t test)。図１１Ｄは赤芽球分化の結果を図示する。どちらの条件でもFACSではCD41-CD235+の赤芽球集団を認め(C)、その分化効率には有意な差を認めなかった(D) (n=3, paired t test)。図１１Ｅは巨核球分化の結果を図示する。どちらの条件でもFACSではCD41+CD42b+の巨核球集団を認め(E)、その分化効率には有意な差を認めなかった(F) (n=3, paired t test)。図１１Ｆは巨核球分化の結果を図示する。どちらの条件でもFACSではCD41+CD42b+の巨核球集団を認め(E)、その分化効率には有意な差を認めなかった(F) (n=3, paired t test)。 図１１ＧはT細胞分化の結果を図示する。どちらの条件でもCD2+CD7+細胞集団を確認でき(G)、CD2+CD7+細胞(赤いドット)は全てがCD4+CD8+であった(H)。その分化効率には有意な差を認めなかった(I) (n=3, paired t test)。図１１ＨはT細胞分化の結果を図示する。どちらの条件でもCD2+CD7+細胞集団を確認でき(G)、CD2+CD7+細胞(赤いドット)は全てがCD4+CD8+であった(H)。その分化効率には有意な差を認めなかった(I) (n=3, paired t test)。図１１ＩはT細胞分化の結果を図示する。どちらの条件でもCD2+CD7+細胞集団を確認でき(G)、CD2+CD7+細胞(赤いドット)は全てがCD4+CD8+であった(H)。その分化効率には有意な差を認めなかった(I) (n=3, paired t test)。 実施例の実験結果のまとめを図示する。ActivinA存在下に、BMP4かcanonical WNTシグナルのどちらかが入ると血球前駆中胚葉に分化し、その後適切な条件(VEGF, bFGF,  SB431542存在下)で血球へと高効率に分化できた。しかし、ActivinA存在下に、BMP4とcanonical WNTシグナルの両方が入ると、血管内皮にはなれるものの血球にはなれないポテンシャルを持った中胚葉に分化した。HM: Hematopoietic mesoderm, HB: Hemangioblast, hPSC: human pluripotent stem cell. 図１３はアクチビンA単独、アクチビンA及びBMP4、又はアクチビンA及びCHIRを添加した条件でのday4 CD56+APJ+細胞の出現パターンを比較した結果を示す。 図１４は中胚葉の定義に関するイメージを示す。
（中胚葉系細胞の製造方法）
　本発明に係る中胚葉系細胞の製造方法は、多能性幹細胞とBMP4又はCHIRとを３日間接触させる工程を含む。本明細書で使用する場合、「中胚葉」又は「中胚葉系細胞」とはCD56陽性で且つAPJ陽性の細胞を意味する。また、本発明により誘導される中胚葉は、CD56陽性で且つAPJ陽性の細胞の中でも、血球分化能の高い細胞である（図１４）。
　本発明において、多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹(ES)細胞(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）、***幹細胞（「GS細胞」）(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)、胚性生殖細胞（「EG細胞」）(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)、人工多能性幹(iPS)細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。より好ましくは、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。
　多能性幹細胞と、骨形成因子の一つであるBMP4又は、Wnt シグナルを活性化する薬剤又はGSK-3β阻害剤として知られるCHIR（CHIR-99021又はCHIR-98014）とを所望の期間接触させることで、多能性幹細胞が中胚葉系細胞へと分化誘導される。BMP4又はCHIRは多能性幹細胞を培養する培地等に添加することで多能性幹細胞と接触される。本発明の別の態様においては、CHIRの代わりに、その他のGSK-3β阻害剤（例えば3F8、A 1070722、AR-A 014418、BIO、BIO-acetoxime、10Z-Hymenialdisine、Indirubin-3'-oxime、Kenpaullone、L803、L803-mts、MeBIO、NSC 693868、SB 216763、SB 415286、TC-G 24、TCS 2002、TCS 21311、TWS 119等）を使用することも意図される。培地は、その他の成分、例えば中胚葉系細胞への分化誘導に必要な成分、例えばアクチビンAを含んでもよい。培養条件は無血清条件及び／又はフィーダーフリー条件で行うことが好ましい。接触の期間は３日以上、例えば３～５日間、特に３～４日間であることが好ましい。
　上記接触工程を経ることにより得られる中胚葉系細胞は、CD56陽性で且つAPJ陽性となる。CD56とAPJはそれぞれ単独で中胚葉のマーカーとして報告されている（Evseenko, D. et al. P Natl Acad Sci Usa 107, 13742-13747 (2010)；Vodyanik, M. A. et al. Cell stem Cell 7, 718-729 (2010)；Yu, Q. C. et al. Blood 119, 6243-6254 (2012)）。CD56はNCAMとしても知られている接着因子であり、APJはApelin分子などのレセプター(APLNR)として報告されている機能分子である。
　CD56陽性で且つAPJ陽性の細胞は更に、血管内皮増殖因子（Vascular endothelial growth factor；VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（Basic fibroblast growth factor；bFGF）及びトランスフォーミング増殖因子（Transforming growth factor beta ；TGFβ）阻害剤と接触されてもよい。これにより、中胚葉から血球血管前駆細胞への分化効率が向上する。例えば、CD56陰性で且つAPJ陰性の細胞と比較した場合、CD56陽性で且つAPJ陽性の細胞は高効率に血球を産生することができる。TGFβ阻害剤の例として、SB431542が挙げられる。
（巨核球又は巨核球前駆細胞を含む培養物の製造方法）
　本発明に係る巨核球又は巨核球前駆細胞を含む培養物の製造方法は、上記の方法で製造された中胚葉系細胞から巨核球細胞へと分化誘導する工程を含む。
　本発明において用いる培地は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。サイトカインとは、血球系分化を促進するタンパク質であり、例えば、VEGF、TPO、SCFなどが例示される。本発明において好ましい培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、TPOを含むIMDM培地である。より好ましくは、さらにSCFを含む。また、Tet-on（登録商標）又はTet-off（登録商標）システムのような薬剤応答性のプロモーターを含む発現ベクターを用いた場合、強制発現する工程においては、対応する薬剤、例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンを培地に含有させることが望ましい。
　培養条件は、特に限定されないが、例えば、TPO（10～200ng/mL、好ましくは50～100ng/mL程度）の存在下で、TPO（10～200ng/mL、好ましくは50～100ng/mL程度）及びSCF（10～200ng/mL、好ましくは50ng/mL程度）の存在下で、又は、TPO（10～200ng/mL、好ましくは50～100ng/mL程度）及びSCF（10～200ng/mL、好ましくは50ng/mL程度）及びHeparin（10～100U/mL、好ましくは25U/ml程度)の存在下で、細胞を培養してもよい。培養温度については、35.0℃以上の温度で培養することにより、巨核球または巨核球前駆細胞の分化が促進されることが確認されている。培養温度は細胞にダメージを与えない程度の温度、例えば、35.0℃～42.0℃が好ましく、36.0℃～40.0℃がより好ましく、37.0℃～39.0℃がより更に好ましい。
　培養期間については、当業者であれば、巨核球または巨核球前駆細胞の数などをモニターしながら適宜決定することが可能である。例えば、培養物中に占める巨核球細胞の割合は、フローサイトメトリーを用いて巨核球特異的に発現する細胞表面マーカーを解析することにより決定することができ、例えば、培養物に含まれる全細胞のうち、巨核球又は巨核球前駆細胞、特に巨核球が占める割合が５０％以上、例えば６０％、７０％、８０％、９０％以上となるように培養してもよい。所望の巨核球前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、3日間以上が好ましく、6日以上がより好ましく、9日以上がより更に好ましい。しかしながら、培養期間が長いことは問題とされないので、12日以上、18日以上、24日以上、30日以上、42日以上、48日以上、54日以上、60日以上でもよい。また、培養期間中は、適宜、継代を行うことが望ましい。
　薬剤耐性遺伝子で細胞を形質転換する場合、使用することができる薬剤は、ピューロマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、アンピシリン、ゼオシン、ブラストサイジンＳ、又はヒスチジノールなどが挙げられる。
　本発明の効果を損なわない限り、巨核球の製造に関して当業者に公知の技術を本発明の製造方法に適用することができる。例えば、本発明の巨核球の製造方法の一態様は、さらに、(a)p53遺伝子産物の発現又は機能を阻害する物質、(b)アクトミオシン複合体機能阻害剤、(c)ROCK阻害剤および(d)HDAC阻害剤をさらに培地に含んでもよい。これらの方法は、例えば、WO2012/157586に記載された方法にしたがって実施し得る。
　更に、WO2011/034073に記載されているような、c-MYC遺子等の癌遺伝子やポリコーム遺伝子等の外来性遺伝子を強制発現させて巨核球細胞の生産量を増大することもできる。このような態様において、本願発明の製造方法は、巨核球または巨核球前駆細胞に対して、強制発現を停止して培養する工程をさらに含んでもよい。強制発現を停止する方法として、例えば、薬剤応答性ベクターを用いて強制発現をしている場合には、対応する薬剤と当該細胞と接触させないことによって達成させてもよい。この他にも、上記のLoxPを含むベクターを用いた場合は、Creリコンビナーゼを当該細胞に導入することによって達成させてもよい。さらに、一過性発現ベクター、およびRNAまたはタンパク質導入を用いた場合は、当該ベクター等との接触を止めることによって達成させてもよい。本工程において用いられる培地は、上記と同一の培地を用いて行うことができる。
　強制発現を停止して培養する際の条件は、特に限定されないが、例えば、35.0℃～42.0℃が好ましく、36.0℃～40.0℃がより好ましく、37.0℃～39.0℃がより更に好ましい。
　また、強制発現を停止した後の培養期間については、細胞数、特に巨核球細胞数などをモニターしながら、適宜決定することが可能であるが、強制発現を停止してから少なくとも２日以上であることが好ましく、例えば、２日間～１４日間である。培養期間は３日間～１２日間がより好ましく、４日間～１０日間がより更に好ましい。培養期間中は、適宜、培地交換または継代を行うことが望ましい。
　本発明によって得られる巨核球は、十分に成熟させることで機能的な血小板を効率よく産生することができる。本明細書において、巨核球の成熟とは、巨核球が十分に多核化し、機能的な血小板を産生できることをいう。巨核球の成熟は、例えば、GATA1、p45 NF-E2、beta1-tubulinなどの巨核球成熟関連遺伝子群の発現の上昇、proplateletの形成、細胞内の多核化によっても確認することができる。当該血小板は、既に、in vivo及びin vitroにおいて、高い血栓形成能を有していることが確認されている。
　また、巨核球および／または巨核球前駆細胞は、凍結保存後、融解しても機能的な血小板を産生することができる。なお、本発明において作成された巨核球細胞株は、凍結保存した状態で流通させることができる。
（血小板の製造方法）
　本発明に係る血小板の製造方法は、上記製造方法で製造された培養物を用いることを特徴とする。より具体的な態様において、本発明に係る血小板の製造方法は、上述の方法で得られた巨核球、巨核球前駆細胞、及び／又は巨核球細胞株を培養し、培養物から血小板を回収する工程を含む。
　培養条件は、限定はしないが、例えば、TPO（10～200ng/mL、好ましくは50～100ng/mL程度）の存在下で、あるいは、TPO（10～200ng/mL、好ましくは50～100ng/mL程度）、SCF（10～200ng/mL、好ましくは50ng/mL程度）及びHeparin（10～100U/mL、好ましくは25U/ml程度)の存在下で、培養してもよい。
　培養期間は、少なくとも３日以上であることが望ましいが、製造される血小板の機能が維持されている限り特に限定されない。例えば、培養期間は３日間～１４日間である。培養期間は４日間～１２日間が好ましく、５日間～１０日間がより好ましい。
　培養温度は、特に限定されず、例えば35.0℃～42.0℃である。培養温度は36.0℃～40℃が好ましく、37.0℃～39.0℃がより好ましい。
　本発明に係る製造方法では、巨核球の培養工程を、血清フリー及び／又はフィーダー細胞フリーの条件で行ってもよい。好ましくは、TPOを含有する培地で本発明の方法にしたがって製造された巨核球を培養することで行う方法である。なお、フィーダー細胞を用いない場合、一態様として、conditioned mediumを使用してもよい。conditioned mediumは、特に限定されず、当業者が公知の方法等に従って作製することができるが、例えば、フィーダー細胞を適宜培養し、培養物からフィーダー細胞をフィルターで除去することによって得ることができる。
　本発明に係る血小板の製造方法の一態様では、培地にROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加える。ROCK阻害剤及びアクトミオシン複合体機能阻害剤としては、上述した多核化巨核球の製造方法で使用したものと同じものを使用することができる。ROCK阻害剤としては、例えばY27632、ファスジル塩酸塩、H1152 Dihydrochlorideなどが挙げられる。アクトミオシン複合体機能阻害剤としては、例えば、ミオシンATPase活性阻害剤又はミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤である。ブレビスタチン、ML-7、ML-9が挙げられる。ROCK阻害剤又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を単独で加えてもよく、ROCK阻害剤とアクトミオシン複合体機能阻害剤を組み合わせて加えてもよい。
　ROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤は、例えば、0.1μM～30.0μMで加えてもよい。阻害剤の濃度は0.5μM～25.0μMが好ましく、1.0μM～20.0μMがより好ましく、5.0μM～15.0μMがより更に好ましい。
　ROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加えての培養期間は、例えば１日～１５日とすることができる。培養期間は３日～１３日が好ましく、５日～１１日がより好ましく、６日、７日、８日、９日、１０日がより更に好ましい。ROCK阻害剤及び／又はアクトミオシン複合体機能阻害剤を加えることにより、CD42b陽性血小板の割合をさらに増加させることが可能である。
　血小板は、当業者に公知の方法で培地から単離することができる。本発明によって得られる血小板は、外来遺伝子を発現することのない安全性の高い血小板である。本発明で得られる巨核球は、特に限定しないが、例えば外来性のアポトーシス抑制遺伝子および癌遺伝子が発現していてもよい。この場合、血小板生産工程では、当該外来性の遺伝子の発現が抑制された状態になる。
　本発明で得られた血小板は、製剤として患者に投与することができる。投与に当たっては、本発明の方法で得られる血小板は、例えば、ヒト血漿、輸液剤、クエン酸含有生理食塩液、ブドウ糖加アセテートリンゲル液を主剤とした液、PAS（platelet additive solution）（Gulliksson, H. et al., Transfusion, 32：435-440, (1992））等にて保存、製剤化してもよい。保存期間は、製剤化直後から１４日間程度である。好ましくは１０日間。より好ましくは、８日間である。保存条件として、室温（20-24℃）で振盪撹拌して保存することが望ましい。
（血小板の移植又は輸血方法）
　本発明に係る血小板の移植又は輸血方法は、上記の方法で製造された血小板を被験者に移植又は輸血する工程を含む。本発明の方法に従い製造された血小板は、常用の方法で調製される血小板と同様の方法で輸血可能なものであり、当業者であれば適宜被験者に投与することができる。
　本明細書中で使用する場合、用語「被験者」は、血小板の移植等を必要とする哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーなどのサル）及びヒト）を含む、任意の脊椎動物を指す。実施形態によって、被験者はヒト又はヒト以外の動物であってよい。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
細胞・動物
　ヒトES細胞KhES3株は京都大学末盛博文博士より、ヒトES細胞H1株は、京都大学中畑龍俊博士より提供頂いたものを使用した。実験に用いたICRマウスは日本SLCより購入した。動物実験に関しては、東京大学及び京都大学の規定に従って行った。ヒトES細胞の使用は所定の講習会を受講し、東京大学での使用計画書「ヒト胚性幹細胞からの造血幹細胞および分化血液細胞の誘導」、及び、京都大学iPS細胞研究所での使用計画書「ヒトES細胞からの血球・神経分化に関する研究」に則って行った。
ゼラチンコート
　60 mm dishでは2 mL / dish, 100 mm dishでは4 mL / dishのゼラチン液を入れ、全体に分布するようにディッシュを揺らし、37℃で1時間以上インキュベートしコーティングした。
マトリゲルコート
　コーティングする6-well plate, 60 mm dishとピペット類は4℃に予め冷やしておいた。4℃で保存してある50倍希釈マトリゲル液を冷えたまま、6-well plateでは2 mL / well, 60 mm dishでは3 mL / dishで添加し、37℃で1時間以上インキュベートしコーティングした。
マウス胎仔線維芽細胞（MEF）の樹立
　マウス胎仔線維芽細胞は、ICRマウスE12.5の胎仔を用いて樹立した。妊娠12日目のマウスを安楽死させ、無菌的に子宮を取り出し、用手的に胎仔を胎盤などから分離した。頭部と腹部内蔵を用手的に取り除き、鋏を用いて細かくした。0.05% Trypsin EDTA 1mL / 匹を添加して細胞培養用のフラスコに入れ、室温下に磁気スターラーバーで300 rpmで20分間撹拌し、細胞を分離した。MEF培地を2倍量添加して反応を止め、50mLの遠沈管に移し、400g, 10分遠心分離した後に上清を除去した。ペレットを1匹あたり10 mLのDMEM + 10%FBS + L-glutamine培地を用いて懸濁し、1匹分の細胞を1枚の100 mm dishに播種し、10% CO2, 37.0℃でインキュベートした(day0)。day1に培地を全交換した。day2で細胞を0.05% Trypsin EDTAを用いて剥離し回収、1枚の100mm dishから1.2枚の150 mm dishの計算で継代・拡大培養した。day4に細胞を回収し、4x106cells / tubeでTCプロテクターを用いて-80℃に凍結保存した。
　MEFをiPS細胞培養に用いる場合、以下のようにして行った。凍結チューブを解凍し、1本あたり1枚の100 mm dishに播種した。解凍翌日に1mg / mL MMC溶液を10 mg / mLの終濃度で添加し、37℃で2時間インキュベートして細胞***を不活化した。0.05% Trypsin EDTAで細胞を回収し、3x105 cellsを予めゼラチンコートしておいた60 mm dishに播種し、翌日以降に用いた。
C3H10T1/2細胞の培養
　C3H10T1/2細胞はサブコンフルエント時に1枚から8-10枚へ拡大するように希釈し維持継代した。継代は3-4日毎に行い、培地交換は1日おきに行った。
　用いるときは、サブコンフルエントの細胞ディッシュに1 mg / mL MMC溶液を10 mg / mLの終濃度となるように添加し、37℃で2時間インキュベートして細胞***を不活化した。0.05% Trypsin EDTAで細胞を回収し、8x105 cells を予めゼラチンコートしておいた100 mm dishに播種し、翌日以降に用いた。
OP9-DL1細胞の培養
　OP9-DL1細胞はサブコンフルエント時に1枚から8-10枚へ拡大するように希釈し維持継代した。継代は3-4日毎に行い、培地交換は1日おきに行った。用いるときは、ゼラチンコートしておいた6-well plateに播種して培養継続し、コンフルエントとしたものを用いた。
hPSCのMEFを用いた維持培養
　培地はKSR培地を用いた。培養中は毎日培地交換を行った。継代はTK溶液を用いて行った。培養上清を吸引除去後、TK溶液を1 mL / dishで添加し、37℃で5分インキュベートした。上清を吸引除去し、KSR培地を3-4 mL添加。タッピングによって底面からコロニーをある程度剥離した。ピペットマン（p1000）によるピペッティングである程度コロニーを細かく砕き、必要量を新しいMEFを播種したディッシュ上に播種した。継代翌日に培地交換し、以後毎日培地交換を行った。
hPSCのマトリゲルを用いた維持培養
　培地はStemFit培地を用いた。1日おきに培地交換を行った。継代時はPBSで2回洗浄した後、TrypLE selectを1 mL / dishで添加して3分 37℃で反応させ、p1000 ピペットマンでピペッティングして15 mL遠沈管に回収した。MEF培地で反応を止め、遠心し上清除去した後にStemFitを1-2 mL添加して懸濁し、細胞カウントした。播種時は、3x104 - 1x105 cells / 60 mm dishで継代し、細胞死を防ぐために培地にY27632を10 mMで添加した。
　継代翌日にStemFit培地で培地交換し、以後1日おきに培地交換を行った。
hPSCからのC3H10T1/2を用いた血球分化法
　MEFで維持培養していたヒトES細胞を、継代時と同様にコロニーのままディッシュ底面から剥がし、前日に用意しておいた不活化C3H10T1/2ディッシュに播種した。細胞数カウント出来ないためおおよそになるが、5 x 104-2 x 105 cells / 10cm dishとなるようにした。培地は血球分化用培地にVEGFを終濃度20 ng / mLとなるように添加したものを用いた。必要に応じて、0.05% Trypsin EDTAを用いてシングルセルで回収し、細胞数カウントを行い、Y27632 10 mMとなるように添加してシングルセルのまま分化させた。
　分化後はday3, day6, day9, day11, day13に培地交換を行った。
　分化途中の細胞を解析する際には、培養上清を除去後にPBSで2回洗浄し、0.25% Trypsin EDTAを2mL / dishで添加して37℃で5分インキュベートした。ピペットマン(p1000)でピペッティングして細胞をシングルセルの状態にし、15 mL遠沈管に回収した。血球分化培地を添加して反応を止め、遠心分離後に上清除去し、必要な培地に懸濁して解析した。
hPSCからの無血清無フィーダー系での血球前駆中胚葉分化法
　マトリゲルで維持培養していたhPSCを、継代時と同様にシングルセルでディッシュから剥がして回収し、マトリゲルコートした60 mm dishに播種した。培地は、CDMまたはStemFit培地にActivinA 50 ng / mL, BMP4 50 ng / mL, CHIR99021 3 mM, NOGGIN 125 ng / mL, DKK-1 100 ng / mL, XAV939 2.5 mMを必要に応じて添加し、day2で同様の組成で培地交換を行った。Day0-2のみ細胞死を抑制するためY27632 10 mMを添加した。
　Day4で細胞を回収した。PBSで2回洗浄後に、TrypLE selectを1 mL / dishで添加して37℃で3分反応させた。ピペットマン（p1000）でピペッティングして細胞を剥離し、15 mL遠沈管に回収した。血球分化用培地を添加して反応を止め、遠心分離し上清を除去後、血球分化用培地で懸濁して細胞数カウントした。この細胞を以下の2種類の方法を用いて血球へと分化させた。
スフェロイド形成を介した無フィーダー血球分化
　day4で回収した細胞を2x106 cells / 100 mm EZSPHERE dish (AGCテクノグラス)で播種した。血球分化用培地にVEGF 50 ng / mL, bFGF 50 ng / mL, SB431542 10 mM, ヘパリン 10単位 / mLを添加したものを用いた。day7に形成されたスフェロイドをピペッティングで遠沈管に回収し、遠心分離・上清除去後に血球分化用培地で懸濁し、1枚から1-3枚の拡大倍率でPrimeSurface 90 mm dish (住友ベークライト)上に継代した。培地にはVEGF 50 ng / mL, bFGF 50 ng / mL,ヘパリン 10単位 / mLを添加した。以後day10, 12に同組成で培地交換を行った。Day14で、プレート内の細胞全てをピペッティングで撹拌し、40 mmのセルストレーナーを通して50mL遠沈管に回収した。遠心後に上清除去し、血球分化用培地で懸濁して細胞数カウントした。
セルソーターを用いた無フィーダー血球分化
　day4で回収した細胞を抗体で反応させた後に、FACSAriaIIを用いてマトリゲルコートした6-wellに3x104 cell / wellで直接ソーティングした。Wellはマトリゲル液を除去した後に、血球分化用培地 + VEGF 50 ng / mL, bFGF 50 ng / mL, SB431542 10 mM, ヘパリン 10単位 / mL + Y27632 10 mMを添加したものを2 mL / wellで予め入れておいた。
　day7, day10, day12に血球分化用培地にVEGF 50 ng / mL, bFGF 50 ng / mL,ヘパリン 10単位 / mLを添加したもので培地交換を行った。day14で、上清を15 mL遠沈管に回収し、PBSで2回洗浄してこれも同じ遠沈管に回収し、TrypLE select 1mL / wellで添加し、37℃で5分反応させ、ピペットマン（p1000）でピペッティングして底面から細胞を剥離させ、シングルセルの状態として同じ遠沈管に回収した。遠心分離後に上清除去し、血球分化用培地で懸濁して、その後の解析に用いた。
得られた血球からの巨核球・赤芽球・T細胞分化誘導法
　誘導したday14の血球を用いて、各血球種への分化誘導を行った。巨核球誘導では、C3H10T1/2細胞を播種した6-well plateに血球1x105 cells / wellで播種。培地は血球分化用培地を用い、SCF 50 ng / mL, TPO 50 ng / mLを添加した。7日間培養した後に回収し、フローサイトメトリーで解析を行った。
　赤芽球誘導では、C3H10T1/2細胞を播種した6-well plateに血球1x105 cells / wellで播種。培地は血球分化用培地を用い、SCF 50 ng / mL, EPO 3 units / mLを添加した。7日間培養した後に回収し、フローサイトメトリーで解析を行った。
　T細胞誘導では、OP9-DL1細胞を播種しコンフルエントとした6-well plateに血球を1x105-6 cells / wellで播種。培地はOP9用培地を用い、SCF 10 ng / mL + FLT3 ligand 5 ng / mL + IL-7 5 ng / mLを添加した。14日間培養した後に回収し、フローサイトメトリーで解析を行った。
コロニー形成能アッセイ
　誘導したday14の血球を用いて、コロニー形成能を測定した。Methocult H4434 classic 4 mLに対して血球5x104-1x105個を混和し、60 mm dishに播種した後14日間、37℃ 5% CO2環境下で培養し、形成されたコロニーを顕微鏡下に観察した。
フローサイトメトリー
　シングルセルの状態の細胞を必要量用意し、蛍光ラベルされた抗体を、細胞数に合わせた量を必要に応じて組み合わせて用いた。抗体を必要量添加後に30分以上4℃でインキュベートして反応させた。その後にSMで希釈し、遠心、上清除去し、必要量のSMPIで懸濁して解析した。解析時にはhPSC由来の細胞とフィーダー細胞が混在している場合は、FSC, SSCのゲート、及びhPSCに発現させたGFPによって分離した。
qRT-PCR
　回収対象の細胞をRNeasyまたはmiRNeasy (QIAGEN)を用いて、使用説明書に準じてRNAを回収した。RNAはPrimeScript2 (TAKARA Bio)またはReverTraAce (TOYOBO)を用いて、使用説明書に準じてcDNA合成した。
　qRT-PCRでは、反応液をRocheのMasterMixとUniversal probeを用いて以下のように調製した。
　2xMasterMix　　　　　　　10 mL / sample
　Probe (10 mM)　　　　　　　0.4 mL / sample
　Fwd Primer (10 mM)　　　　　0.4 mL / sample
　Rev Primer (10 mM)　　　　　0.4 mL / sample
　Template cDNA　　　　　　　1 mL / sample
　H2O　　　　　　　　　　　7.8 mL / sample
　Total　　　　　　　　　　　20 mL / sample
　反応・データ取得はStepOnePlusを用いて行った。反応プログラムは以下の通り。
　1st step　　(1 cycle)　95℃　10 minutes
　2nd step　　 (40 cycle)　95℃　10 seconds
　　　　　　　　　　　　60℃　30 seconds
　Primer listは以下のとおり。Primer設計はRoche Universal Primer websiteのAssay design centerを用いて設計した。
（https://lifescience.roche.com/webapp/wcs/stores/servlet/CategoryDisplay?tab=Assay+Design+Center&identifier=Universal+Probe+Library&langId=-1)）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
遺伝子発現アレイ解析
　Affymetrix社製のGeneChipを用いた。解析にはGeneSpring 13.0を用いた。GeneChip（登録商標） WT PLUS Reagent Kitを用いてサンプルRNAを解析した。使用説明書に準じてサンプル調製した。Gene Ontology解析はDAVIDを用いて行った。
結果
hPSCからの血球分化系は細胞表面マーカーを用いて各段階を追跡できる
　hPSCから血球までの分化過程は、中胚葉、血球血管前駆細胞を経て血球になることが想定されている。以前に報告された方法（Takayama, N. et al. Blood 111, 5298-5306 (2008)）を用いて、この過程を細胞表面マーカーでトレースできるかをヒトES細胞株のKhES3を用いて検証した。
　C3H10T1/2細胞と共培養する系において、hPSCの細胞表面マーカーの変化を追うために、共培養開始 (day0)から血球が出現するまで(day12)を経時的に解析した。培養中の細胞全てを回収し、フローサイトメトリーで細胞表面抗原の発現を調べた。解析した表面抗原は既報を参考とした（Evseenko, D. et al. P Natl Acad Sci Usa 107, 13742-13747 (2010)；Vodyanik, M. A. et al. Cell stem Cell 7, 718-729 (2010)；Vodyanik, M. A., et al., Blood 108, 2095-2105 (2006)）。図2Aに実験の概略を図示し、図2B-Dに結果を呈示する。
　共培養開始からday3で新しい細胞集団を確認することができた。この細胞集団は、CD56+APJ+で特徴づけることができた。
　Day5になって初めて、血球血管前駆細胞のマーカーとして知られるCD34+細胞が出現し、day6,7と細胞集団の割合が増加した。Day8以降に初期血球マーカーとして知られているCD43+細胞の出現が認められた。これはDay12以降も細胞集団が増加した。
　以上の結果から、まずday0-4でCD56+APJ+細胞、day5-7でCD34+、day8以降にCD43+細胞が出現することが分かった。この時間軸は非常に安定しており、再現性良く確認できた。
　この結果から、分化過程は4つの細胞状態と、その間の3つのステップから構成されることが分かった。即ち、hPSC、CD56+APJ+細胞、CD34+細胞、CD43+細胞の4つである。これらの間のステップを初期ステップ(day0-4), 中期ステップ(day4-7), 後期ステップ(day7-)と呼ぶこととした。
　各細胞集団が実際にどういった細胞であるかを確認するために、細胞をFACSでソートして回収し、定量PCRによって遺伝子発現を確認した。図1Eに結果を示す。多能性幹細胞のマーカーであるNANOGやOCT3/4はhPSCでのみ高発現をしており、中胚葉に特徴的な遺伝子であるT (BRACHYURY)やAPJはday4で同定したCD56+APJ+細胞でのみ高く、血球血管前駆細胞で重要なETV2やKDRはday7で同定したCD34+細胞でのみ高い事が明らかになった。また血球発生に必須な重要遺伝子として知られているRUNX1はday4 CD56+APJ+細胞集団以降で上昇し、day7 CD34+細胞でさらに上昇していた。以上のことから、分化過程で同定した各細胞集団は、発生過程で認められる各段階（中胚葉、血球血管前駆細胞、血球）に一致していることが示唆され、分化過程は表面マーカーを用いることでトレースできることが分かった。また、RUNX1陽性であるday4 CD56+APJ+細胞は、血球産生中胚葉であることが強く示唆された。
既存の血球分化系では中期ステップ以降に改善の余地がある
　既存の系で十分な分化誘導効率が得られているかどうかを検証するために、Day4のCD56+APJ+細胞とDay10のCD43+細胞の、分化した細胞全体に対する割合を測定した。その結果、初期のステップでは既にCD56+APJ+細胞は20-40%程度の割合(図3A,B)で誘導可能であった。つまり、フィーダー細胞との共培養のみで十分に中胚葉誘導が獲得できることを示唆した。一方でCD43+細胞は全体の数%に留まっており、非常に低効率であることも分かった(図3C,D)。即ち、中期以降のステップにおいては中胚葉を十分に血球に誘導できていないことが示唆された。本研究の目的のためには中胚葉からの血球分化誘導効率はある程度は高い必要があり、改善すべきであると考えられた。
初期ステップでは３つのシグナルが重要な役割を果たし、その重要性には差がある
　次に、各ステップ段階ごとに機能する個別の重要なシグナル因子を調べることとした。まず初期のステップに関して検証した。
　そこで細胞表面マーカーを評価基準として、初期のステップに介入することで、CD56+APJ+細胞の出現にどういった変化が認められるかをKhES3, H1を用いて検証した。C3H10T1/2細胞と血清を用いた系であり、多数の未知の物質からの影響下にあるため、この検証には発生過程の中胚葉誘導で重要と考えられている3つの因子（Nodal/ActivinA/TGFβ, BMP4 canonical WNTシグナル）に関して阻害剤及びアンタゴニストを添加することで、3つのシグナルが重要な役割をしているのかどうかを検証する必要性があった。図4Aに実験の概略を示す。各因子の添加濃度は、既報を参考として最高濃度を決定し、そこから希釈した濃度を検討した（Inman, G. J. et al.  Mol. Pharmacol. 62, 65-74 (2002)；Xu, R.-H. et al. Nat Meth 2, 185-190 (2005)；Huang, S.-M. A. et al. Nature 461, 614-620 (2009)）。
　図4Bに、各因子添加による、KhES3分化開始day4のCD56+APJ+細胞の出現の様子をFACS plotで示した。
　先ず、Nodal/ActivinA/TGFβの阻害剤であるSB431542を添加することで、初期ステップでのTGFβシグナルの必要性を検証した。図4Cに結果を示す。結果として、低濃度の時点からCD56+APJ+細胞の程度の強い減少が確認できた。影響は極めて強いことから、初期ステップでのTGFβシグナルは必須因子であることが示唆された。
　次に、BMP4の影響を確認するために、BMPの生理的なアンタゴニストであるNOGGINを添加した。図4Dに結果を示す。CD56+APJ+細胞の減少が確認できたが、この影響は限定的であり、高濃度でも消失するまでには至らなかった。
　最後に、canonical WNTシグナルの影響を確認するために、canonical WNT経路の阻害因子であるAXINの安定化剤であるXAV939を添加した。これによって、b-cateninの分解が亢進し、canonical WNTシグナルは阻害される。図4Eに結果を示す。すると、CD56+APJ+細胞の減少が確認された。BMP同様に、この影響も限定的であり、高濃度でも消失するまでには至らなかった。
　以上のことから、発生学的に同定された中胚葉誘導因子としての３つの異なったシグナルであるNodal/ActivinA/TGFβシグナル、BMPシグナル、canonical WNTシグナルはそれぞれがhPSCから中胚葉の過程の分化誘導プロセスに影響を与えていた。その強度には差があり、Nodal/ActivinA/TGFβは必須因子であったが、BMP4やcanonical WNTシグナルは中胚葉誘導に関与しているものの、その効果は限定的であった。図4Fに結果の概略を図示した。矢印の大きさがシグナルの影響力を表している。
中期ステップの改善により血球分化効率が著しく改善した
　次に中期ステップについて検証した。既存の系ではday10でのCD43+細胞の出現率は1%未満と低効率であった(図3C,D)。血球への誘導効率が低いことは、中胚葉の血球産生能を評価するためには不都合である。具体的には、血球産生能が高い細胞も低い細胞も、血球になる効率が悪いためにどちらも低いと評価してしまう可能性が排除しきれないということである。
　そこで、中期過程の培養条件（外的要因）を改善することで、血球誘導効率をより上昇させることを目的として、KhES3, H1を用いて実験を行った。
　この過程においては、既存のプロトコールにあるVEGF存在下に、血球誘導を促進する可能性のある分子、及び血球誘導を阻害している可能性のある分子の阻害薬を添加した。実験の概略を図 5Aに示す。
　bFGFはHemangioblastを誘導する際に必須の分子として報告がある。BL-CFCの誘導にはbFGFが必須である。そこで、この系にbFGFを添加するとともに、その効果を増強するためにbFGFの安定化作用があるヘパリンを合わせて添加した。結果を図5Bに示す。bFGFとヘパリンの添加によって、day10時点での血球産生効率が上昇した。
　TGFβシグナルの阻害が血球産生効率を上昇させる報告があることから、阻害剤であるSB431542をこの時点で添加した。結果を図5Cに示す。すると既存の報告と一致するように、day10時点での血球産生功率が上昇した。
中胚葉の純化により、より厳密な血球分化能を評価することができた
　初期ステップと中期ステップにおいて重要な因子が複数見つかり、中胚葉の血球分化ポテンシャルを評価する系を立ち上げる準備が出来た。しかし、今までの解析から、day4では半数近くがCD56+APJ+以外の細胞であり、その後も培養環境の中で共存していることから、パラクライン作用などの何らかの作用によって血球分化が影響を受ける可能性が考えられた。CD56+APJ+細胞の割合は試行毎にばらつきがあり（図 7D）、影響が有る可能性は排除する必要があると考えられた。
　そこで、中胚葉自体の血球分化ポテンシャルをより正確に評価するために、中胚葉を純化して血球誘導を行えるかどうか検証した。図7Aに図示したように、day4時点で中胚葉になった細胞のみをFACSによって純化し、新しい培養皿で規定の条件下で培養を継続し、血球を産生できるかどうかをKhES3, H1を用いて確認した。併せて、CD56-APJ-細胞の血球分化能を同様の方法で評価した。
　結果を図7Bに示す。CD56+APJ+細胞はCD56-APJ-細胞よりも高効率に血球を産生することが分かった。図7Cの写真で確認できる通り、ソートした細胞からは球形の細胞がコロニー状に出現してくることが確認できた。また血球マーカーを有した細胞がFCMで認められた。全分化細胞中のCD43+細胞の割合を図7Eに示す。全体の20%から、多い時は60%程度が血球に分化できていることが明らかになった。以上より、CD56+APJ+細胞集団から血球が産生されるものの、その産生にはそれ以外の細胞集団は不要であること、さらには本方法により血球分化を高効率に誘導可能であることを実証した。
血球前駆中胚葉の誘導には単一ではなく複数の経路があることを確認した
　今までの結果から、各ステップに必要な因子を図8Aに示した。多能性幹細胞から血球までの経路に中胚葉の段階があること、この中胚葉の誘導に必要と考えられる因子群が3つあること、中胚葉の血球産生能を評価できる系が出来上がったことが示された。これらを組み合わせることで、目的である多能性幹細胞から血球までの経路、特に血球の元になる中胚葉が多能性幹細胞からどのように生じるのかを検討する準備が整った。
　より正確にシグナルを調節するためには、未知の物質は限りなく減らした方が良いと考えられた。フィーダー細胞や血清は細胞生存や分化にとって有用であるが、未知の要因である点に関しては不利である。そこで、初期の中胚葉までの過程に関してどのようなシグナルが重要なのかを知るために、初期ステップでのみ無血清無フィーダー環境下で分化可能かどうかを調べた。実験の概略を図8Bに示す。無血清培地とマトリゲルを用いて分化を試みた結果、この条件での血球分化の効率が高いことを確認したため、以後の実験を無血清無フィーダー条件で実施した。中期ステップ以降に関しては、無血清条件を試みたが効率が著しく低下したため、血球産生能を評価するために血清は使用する条件を依然付与した。
　そこで、どのような誘導条件であれば血球分化ポテンシャルを持つ中胚葉が出現するのかを検証するために、初期ステップに重要な3つの因子について様々な組み合わせを用いて中胚葉の誘導を試みた。図4の結果からNodal/ActivinA/TGFβetaのシグナルは必須であると考えられたため、これにBMP4とcanonical WNTシグナルを組み合わせる形で3通りのプロトコールを試した。KhES3とH1を用いて実験を行った。
　全ての条件においてCD56+APJ+細胞が確認でき、中胚葉への分化を達成できたものと考えられた。結果を図8Cに示す。各条件での誘導割合には差が認められ、AB＜AC<ABCの順で効率よくCD56+APJ+細胞を誘導できた。結果を図8Dに示す。
　これらの細胞をFACSで純化し、day14まで血球分化条件で培養して血球誘導効率を評価した。結果を図8E,Fに示す。驚いたことに、ABC条件下では血球誘導効率が著しく低下していた。
　より詳細に中胚葉の性質を確認するために、day14で併せて血管内皮細胞マーカーを確認した。結果を図8G,Hに示す。各条件間には大きな差は認められなかった。
　ActivinA, BMP4, WNTは互いに発現を誘導し合うとされているため、ABやACに関しては本当に干渉がないことを示すために、それぞれにアンタゴニストや阻害剤を添加することとした。ActivinA + BMP4 + XAV939 (ABにcanonical WNT阻害を追加したもの), ActivinA + BMP4 + DKK-1 (ABにWNTシグナル阻害を追加したもの), ActivinA + CHIR99021 + NOGGIN (ACにBMP4シグナルを阻害したもの)のどの条件下でも、やはり高効率に血球分化を示した（図9）。
　以上のことから、無血清無フィーダー条件でも、特定の因子によって血球産生中胚葉を分化させることが可能であることが示された。また、初期ステップに重要であった3つの因子は、全て揃うと血球分化ポテンシャルのない中胚葉が誘導される一方で、2つの因子を組み合わせた2通りの方法では高い血球分化ポテンシャルを有する中胚葉を誘導できることが分かった。
条件の異なる中胚葉、血球間に遺伝子発現の差を認めた
　AB, ACで誘導したCD56+APJ+細胞には血球分化ポテンシャルが備わっており、ABCで誘導したCD56+APJ+細胞からは失われていた。この原因を探るために、それぞれの細胞の遺伝子発現パターンをKhES3を用いて調べた。分化させた細胞からRNAを回収し、遺伝子発現アレイによって解析した結果を図10に示す。図10AにhPSCとday4 AB, AC, ABC間で変動した遺伝子群を用いてクラスタリング解析をした結果を示す。Day0 hPSCと比較して、Day4 AB, AC, ABC間は非常によく似た発現パターンを示した。各比較間の共通部分を解析したVenn図を図10Bに示す。全ての条件に共通していた遺伝子を詳細に見ると、day4細胞では多能性に関連する遺伝子群の発現低下が認められるのと同時に、中胚葉系に特徴的な遺伝子群の発現上昇と、Epithelial-Mesenchymal transition (EMT)関連遺伝子の発現上昇が確認できた。よって、AB, AC, ABC条件で誘導したday4 CD56+APJ+細胞は典型的な中胚葉系細胞の特徴を有していることが分かった。
　次に、AB, ACとABC間の差を見た結果を図10Cに示す。血球分化に関係していると考えられるのは、AB vs. ABCとAC vs. ABC間で共通して変動し、AB vs. AC間では変動していない群であるため、この遺伝子群に対してGene Ontology (GO)解析を行った。Top10のGO termを示す。血管関係の用語に混じって、筋骨格系や神経系に関連した遺伝子群が確認された。血球分化に関係しない遺伝子群がABC条件では上昇していることが、血球分化ポテンシャルを失う原因であることが示唆された。
　さらに、ABとAC条件で誘導したCD43+血球間に差があるのかどうかを確認した。遺伝子発現パターンのプロットを図10Dに示す。ほとんどの遺伝子がFold change < 2以内に収まっており、非常によく似た性質を示していると考えられた。しかし、AB条件で一部の遺伝子がACと比較して高発現しており、この遺伝子群をGO解析したところ、免疫系に関係していることが示唆された。この結果から、AB, AC間の血球は大変よく似た遺伝子発現パターンを示したが、免疫系への分化に関して能力に差がある可能性が示唆された。
2つの条件で誘導した血球には機能的な差を認めなかった
　ABとACの条件で誘導した血球は良く似た遺伝子発現パターンを示したが若干の差も認めた。この差が2つの条件で誘導した血球の機能に影響を及ぼしているかどうかを検証するために、得られたday14の血球前駆細胞をさらに分化させることとした。具体的には、血球前駆細胞の標準的な機能アッセイであるコロニー形成能アッセイ、in vitroで赤芽球・巨核球・T細胞に分化させるアッセイを行った。結果を図11に示した。
　図11Aに実験の概略を図示した。Day0-4の条件をABまたAC条件とし、得られた中胚葉から誘導した14日目の血球を使用して、さらなる分化を行った。
　図11Bにコロニー形成能の結果を示した。2つの条件で誘導した血球は複数種のコロニーを形成する能力を持ち、種類やコロニー数には有意な差を認めなかった。
　赤芽球・巨核球・T細胞への分化は、既存の報告に則って行った（Ochi, K. et al. Stem Cells Translational Medicine 3, 792-800 (2014)；Takayama, N. & Eto, K.； Nishimura, T. et al. Cell stem Cell 12, 114-126 (2013)）。赤芽球分化の結果を図11C,Dに、巨核球分化の結果を図11E,Fに、T細胞分化の結果を図11G,H,Iに示した。各細胞種は特有の細胞表面マーカーを用いて検出した。赤芽球分化条件ではCD41a-CD235+細胞を赤芽球とし、巨核球分化条件ではCD41a+CD42b+細胞を巨核球とした。T細胞に関しては、CD2+CD7+細胞をT細胞として用いた。この際にCD4とCD8を同時に解析したところ、CD2+CD7+細胞は全てCD4+CD8+であった。
　ABとACの2つの条件で誘導した血球を、各細胞への分化効率を指標とした比較したところ、有意な差を認めなかった。以上より、得られた血球は機能的に近いと考えられた。
　以上の結果を図12に図示した。ActivinA存在下で、BMP4またはcanonical WNTシグナルのどちらかの入力が有る場合に血球前駆中胚葉が誘導され、至適条件下で効率よく血球への分化がなされた。一方で、ActivinA, BMP4, canonical WNTシグナル全てからの入力が有る場合には、中胚葉系の細胞には分化するものの非血球系の遺伝子群の上昇を伴い、血球への分化能は失われた状態になった。血管内皮系への分化能はどの条件下でも保たれていた。
考察
分化初期過程に焦点を当てることで複数の経路の存在を見出した
　本研究では、ヒト発生過程を研究するためにhPSCを用いて血球分化系譜を解析した。その結果、既報の複数の論文が示唆しているような単一の発生系譜でなく、主要な液性因子が必須であることは再確認されたものの、その組み合わせによって複数の発生系譜を経て、血液細胞が生み出されていることが初めて明らかにされた。またその制御方法は、液性因子の濃度勾配（グラジエント）による緻密なコントロールに依存していることが強く示唆された。
　マウス発生では多能性幹細胞と同等性があると考えられているEpiblastは、中胚葉になる際にTGFβシグナル、BMPシグナル、canonical WNTシグナルの３つの液性因子シグナルの相互作用が必須である。外胚葉として形成される領域では、これらのアンタゴニストがvisceral endodermから産生され、上記のシグナル遮断が生じることにより、原腸陥入が起こらない。実際に、図2で見たように、TGFβシグナル阻害薬、NOGGIN、canonical WNTシグナル阻害薬の添加によって、中胚葉系細胞の誘導は抑制・阻害された。今回の新たな知見としては、この３つのシグナルの阻害効果が一様でなく個別のシグナル強度が分化系譜の運命決定に大きく影響を及ぼすことが明らかとされた。例えば、TGFβシグナル阻害が強力な中胚葉分化抑制効果を示す一方で、BMPシグナル阻害やcanonical WNTシグナル阻害は限定的な効果に留まったことが挙げられる。本研究では、無血清無フィーダーの純化した分化系を新たに開発したことで、さらに興味深いことに３つ全てのシグナルを導入することが逆に血球分化を抑制することも新たに見出した。逆に２因子シグナルの組み合わせであるActivinA + BMP4またはActivinA + CHIR99021（canonical WNTシグナル）は、おそらくそれぞれが異なった系譜を経由して効率良く血球産生能を有する血球中胚葉集団を誘導した。
　既報と異なるこれらの結果は、以下の２つの可能性を示唆する。（１）ヒトとマウスの発生過程には分子メカニズム上の違いがあること、（２）マウスにおいても同様のメカニズムが存在するが今までの研究では見出されていなかったこと、である。シグナル同士の相互作用はSignaling crosstalkと呼ばれており注目されている分野であり、特に中胚葉において幾つかの報告があることからも（Singh, A. M. et al. Cell stem Cell 10, 312-326 (2012)； Yu, P., Pan, G., Yu, J. & al, Cell stem Cell 8, 326-334 (2011)）、今後細胞内部でのmergeする標的分子の探索を通じて更なる詳細な解析を継続することが必須である。
　本分野での別の課題として、分化誘導をした中胚葉がどういったポテンシャルを発揮でき得るのかに関しての詳細な検証もほとんど報告がない。実際に、多分化能を持つ幹細胞の多様性が指摘されている。例えば、造血幹細胞において、全ての幹細胞は全血球への分化能を持つ一方で、骨髄球系とリンパ球系への分化指向性には1つ1つで異なっている（Morita, Y., Ema, H. & Nakauchi, H. Journal of Experimental Medicine 207, 1173-1182 (2010)）。また、最新の研究によって巨核球への分化指向性も存在していることが報告された（Sanjuan-Pla, A. et al. Nature 502, 232-236 (2013)）。こういった現象は造血幹細胞の多様性、Heterogeneityと呼ばれ、細胞集団は必ずしも均一な性質を持たないことを示唆している。中胚葉においても同様のことを考察する必要があり、初期の中胚葉だからといって必ずしも全ての中胚葉系細胞への分化能を持つわけではないことを考慮するべきである。
hPSCを用いたin vitro分化系によって発生学上の未知の過程に新たな知見を見出した
　既存の血球分化プロトコールでは、様々な組み合わせ、様々な方法が用いられていた。特に、EB法では細胞間相互作用がより強く働くため、個々の細胞一つ一つを分離させてコントロールすることが困難であると考えられた。その点では、2次元培養かつ疎な条件下での実験は、一つ一つの細胞の制御をより正確なものとし、増殖因子や阻害剤の作用を均一化することにより安定した評価系の確立に貢献した。細胞間相互作用自体がランダムに血球分化ポテンシャルを持つ中胚葉の誘導を達成する可能性があり、これがプロトコールの冗長性、非統一性に影響していたと考えられる。
　本研究が得た結論の一つである“1つの細胞が分化する上で、複数の経路が存在する”という原理にはどういった意義があるのだろうか。例えば、遺伝子における冗長性(Redundancy)は、複数の分子が同じ役割を果たすことを意味する。ある分子のノックアウトマウスを作製した際に、全く変化が認められなかった場合、他の分子が同様の役割を果たす、あるいは相補的に機能したことがその理由であることがある。血球系は発生初期において極めて重要な細胞であり、血球が出来ない変異のある胎仔は早期に胎生致死となる。そのため、血球発生経路が複数存在することは、単一経路よりもより安定した血球産生に寄与すると考えられる。
　他の考察として以下の考え方を併記する。マウス発生の知見では、Epiblastの後方近位部でPrimitive streakが形成されるときにNodal, BMP4, WNT3の発現が重要であった。しかし、primitive streakでepithelial-mesenchymal transitionを起こして潜り込んだ中胚葉細胞が遊走していく中で、各細胞がどういったシグナルを受けているのかに関しては十分に考察されていなかった。卵黄嚢中胚葉になった際には既に血球と血管内皮になるか、mesenchymeのままか、血管内皮のみになるのかが運命決定されていた可能性もあり得る。つまり、発現細胞との接触の仕方によっては、3つのうち2つのみからシグナルをうけるものも多数存在した可能性がある。
　実験結果からは、day0-4でのシグナル入力は、day7以降になって初めてその影響が結果として現れる、つまり時間差があるということであった。このことから、ある細胞の状態を説明するためには、その細胞の発生学的な系譜、つまりどこに由来してどういったシグナルを受けてきたのかという細胞運命決定のヒストリー（歴史）を知る必要があることを示唆する。必ずしも、細胞の現段階の環境を知るだけでは十分ではないということになる。こういった情報が、ゲノム以外の状態として細胞内に保存されているかもしれない（エピゲノム情報）。
分化系の再構築と効率の改善は既報とよく一致していた
　本研究の特異的な点は、2種類のシグナルが入ることで血球になる一方、3種類のシグナルが入ることで血球への運命決定を抑制しているということである。既存のプロトコール（Takayama, N. et al. Blood 111, 5298-5306 (2008)）では、day10 CD43+細胞は分化由来細胞のうちの1%未満しか存在せず、その他の細胞は全て別の系統に分化しており、分化誘導系の効率が大変低い事が明らかになった（図3D）。day4のCD56+APJ+細胞は再構築後の分化系では最大60%以上が血球になる能力を示していたことから(図4E)、既存のプロトコールには中期～後期のシグナルに問題があると結論付けられた。プロトコールの改善は、VEGF, bFGF, TGFβ阻害によって確立できた。VEGFやbFGFは血管内皮細胞の増殖を促す因子として知られている。Hemangioblastはニワトリの胚の観察から提唱された概念であり、血球と血管の共通前駆細胞として定義されている。ES細胞の系ではBlast colony forming cell (BL-CFC)として呼ばれる。BL-CFCの誘導にはbFGFが必須とされる。また、bFGFはVEGFR2の発現を誘導するとされている（Murakami, M. et al. The Journal of clinical investigation 121, 2668-2678 (2011)）。これらのことから、中胚葉からHemangioblastへの特異性獲得、specificationにはこれらが作用していることが予想される。また、TGFβのデータは過去の文献と一貫性がある結果となった（図3C）（Evseenko, D. et al.P Natl Acad Sci Usa 107, 13742-13747 (2010)；Wang, C. et al.Cell Res 22, 194-207 (2012)）。TGFβのシグナルは、ALK5を介した場合は血球産生を抑制する一方で、ALK1を介した場合は血球産生が亢進し、これにEndoglinが関与しているという報告がある（Zhang, L. et al. Blood 118, 88-97 (2011)）。SB431542はALK5阻害効果を示すため、血球産生の抑制が解除された結果になったと考えられた。
　血球分化の効率を出来る限り上昇させた条件によって、フィーダー細胞なしでも血球分化を達成することが出来た。これによって、ようやく中胚葉の血球産生能を評価できる系として使用できるようになった。本研究の本質は、見出したABCプロトコールの検証を通じて、中胚葉集団の中での細胞系譜運命決定の時期に関してはday4までで血球への運命が決まっていると結論つけられる点に集約できる。
　また、ヒトPSCを用いた発生学研究は有用であることは事実だが、実際のタイムラインとの整合性は大きな問題と言える。Carnegie stage分類によれば、Blood islandの形成は受精後18日目とされる。Epiblastの形成は受精後7日以降であるため、時系列はよく整合している。しかし、血球発生過程は二相性であることはよく知られた事実である。今回のタイミングでは、初期造血の様子のみを観察していることが予想される。AGM領域で背側大動脈の腹側部に存在するHemogenic endotheliumは造血幹細胞の出現元として知られている。この時点から、definitive hematopoiesisが開始されるとされるのが一般的である。今回の観察系、実験系はdefinitive hematopoiesis過程までを網羅していないと考えられる。しかしながら、definitive hematopoiesisとyolk sac hematopoiesisの関係は断絶しているというよりも、継続していると報告されている（Samokhvalov, I. M., Samokhvalova, N. I. & Nishikawa, S.-I. Nature 446, 1056-1061 (2007)）。lineage tracingの手法を用いて、yolk sac hematopoiesisの段階でラベルした細胞は、成体となったあとでラベル付きの血球が確認できることから、継続しているという主張である。また、ExMにあるGata1-Runx1+細胞は、その後にAGM領域に遊走している様子も観察されており（Tanaka, Y. et al. Cell Reports 8, 31-39 (2014)）、連続性の原理に一致しているように思える。現に、Yolk Sacの細胞はin vitroに移して、in vivoとは条件を変えて培養した場合にはB-cell分化を示し、primitiveの定義とは相容れない挙動を示す（Tanaka, Y. et al. P Natl Acad Sci Usa 109, 4515-4520 (2012）。このことを考慮すれば、今回の実験で得られた血球がprimitiveかdefinitiveかに言及することは実は、容易ではないのかもしれない。
造血幹細胞の誘導に関して
　hPSCから血球を誘導するに当たり、研究者の究極の目標となっているのは造血幹細胞の誘導である。全ての血球に分化可能な造血幹細胞は、造血器疾患を主とした様々な疾患の治療に用いられており、応用可能性は極めて広い。
　マウスでは、造血幹細胞の誘導を可能とした方法が幾つか知られている（Kyba, M., Perlingeiro, R. C. R. & Daley, G. Q. Cell 109, 29-37 (2002)；Kitajima, K., Minehata, K.-I., Sakimura, K., Nakano, T. & Hara, T. Blood 117, 3748-3758 (2011)；Suzuki, N. et al. the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 1424-1431 (2013)）。培地の工夫や培養法の工夫によって誘導した血球では、造血幹細胞を誘導することには成功していない。しかし、分化誘導した血球に転写因子を外来性に誘導する方法（HoxB4, Lhx2）によって、マウスに生着可能な造血幹細胞を誘導することに成功した。また、マウスiPS細胞によってマウスの体内に奇形腫を作成すると、奇形腫の中で造血幹細胞は分化誘導され、ホーミングによってマウス骨髄中にiPS細胞由来造血幹細胞が検出できるようになる。
　hPSCでも同様に、in vivoで奇形腫を介した造血幹細胞様の活性を持つ細胞が誘導可能であることが報告された（Suzuki, N. et al. the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 1424-1431 (2013)；Amabile, G. et al. Blood 121, 1255-1264 (2012)）。
　２つの報告では奇形腫を介するという点で共通点があるため、hPSCから造血幹細胞様の活性を持つ細胞、即ち免疫不全マウスへの生着可能な細胞を誘導することが可能であることが示されたと言える。しかし、奇形腫を介するという点からは、どのようにして造血幹細胞が誘導されたのかを解明することは困難である。その点では、in vitroでの研究の方が望ましいと言える。hPSCをin vitroで誘導した報告はいくつか存在する（Wang, L. et al. J. Exp. Med. 201, 1603-1614 (2005)；Ledran, M. H. et al. Cell stem Cell 3, 85-98 (2008)；Gori, J. L. et al. The Journal of clinical investigation 125, 1243-1254 (2015)）。どれも方法が異なっており、これらの再現性に関しては検証を要する段階である。本研究で用いた方法で誘導した血球は、誘導効率は劇的に改善しているが、コロニー形成能でMixコロニーの頻度が高いというわけでもないことから、造血幹細胞が多数含まれているとは考えにくい。今後、免疫不全マウスへの移植実験を行う必要があると考えている。
　本研究では、hPSCを用いることによって、今までに明らかにすることが出来なかった発生初期過程の細胞特性を新たに見出し、血球分化の経路としてシグナル要求性に複数の条件があり得ることが示された。発生過程に置いて、ある解剖学的な構造において条件は1種類と考えがちであるが、このような明瞭な前提は必ずしも必須ではないと言える。本研究結果は血球に限られるものではなく、他の臓器においてもこのような複数の経路による制御を可能性として内包させることで、よりロバストな恒常性が担保される可能性がある。本研究結果は、再生医療のプロトコールという意味付けにとどまらず、発生過程の頑強性、安定性のメカニズムの一旦を示している。

Claims (9)

  1. 　多能性幹細胞と骨形成タンパク質4（bone morphogenetic protein；BMP4）又はCHIRとを３日間以上接触させる工程を含む、中胚葉誘導方法。
  2. 　多能性幹細胞が更にアクチビンAと接触される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記中胚葉がCD56陽性で且つAPJ陽性の細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記CD56陽性で且つAPJ陽性の細胞と、VEGF、bFGF及びTGFβ阻害剤とを接触させる工程を更に含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記接触工程が無血清条件及び／又はフィーダーフリーで実施される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　巨核球又は巨核球前駆細胞を含む培養物の製造方法であって、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法で誘導された中胚葉を巨核球細胞に分化誘導する工程を含む、方法。
  7. 　請求項６に記載の方法で製造された巨核球から血小板を製造する方法。
  8. 　請求項７に記載の方法で製造された血小板を含有する血小板製剤。
  9. 　請求項７に記載の方法で製造された血小板を被験者に移植又は輸血する方法。
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