JP7236476B2 - 造血細胞分化を誘導するための方法および組成物 - Google Patents

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Description

（関連出願）
本出願は、２０１５年１月２６日に出願された米国仮出願番号第６２／１０７，５１７
号および２０１５年１１月４日に出願された米国仮出願番号第６２／２５１，０１６号に
基づく優先権を主張しており、これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書中に
援用される。
（発明の分野）
本発明は一般に、多能性幹細胞から、全ての造血系の細胞を製造するための組成物およ
び方法に関する。特に、本発明は、ヒト人工（ｉｎｄｕｃｅｄ）多能性幹細胞を含む多能
性幹細胞から、全ての造血系の細胞を製造するための、改善された培養プラットフォーム
に関する。
（背景）
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）技術は、がんを含む、多数の血液悪性腫瘍および
非血液悪性腫瘍の処置のための治療において実行可能な造血細胞の、高度に有望であり潜
在的に無際限の供給源を代表する。造血細胞治療の同種供給源としての、ｈｉＰＳＣおよ
び遺伝子操作ｈｉＰＳＣ技術の有望性を推し進めるためには、造血幹細胞および前駆細胞
（ＨＳＣ）のみでなく、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＮＫリンパ系細胞、および
これらの前駆細胞の多様なサブセットを含む免疫エフェクター集団も、効率的かつ再現可
能に発生させることが可能なことが不可欠である。
リンパ球を生成するポテンシャルを伴うＨＳＣの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける導出は、
胚発生の間の時間的および空間的に異なる、少なくとも２つの血液形成の波：一次（ｐｒ
ｉｍｉｔｉｖｅ）造血および二次（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ）造血の存在により複雑である
。一次造血は、胚体外卵黄嚢内で起始し、一過性で限局的な造血レパートリーであって、
始原赤血球系細胞および骨髄性細胞を主に含むが、ＨＳＣを含まない造血レパートリーを
発生させる。新生ＨＳＣは、二次造血性内皮（ＨＥ）と称する動脈血管系内の、特化した
内皮前駆体からの二次波（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｗａｖｅ）の後期の間にのみ出現する
。次いで、二次ＨＥは、内皮から造血への移行を経て、ＨＳＣを発生させ、次いで、これ
らは、最終的に、骨髄へと移動し、成体寿命を通じて、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、お
よびＮＫリンパ系細胞を含む多系統造血を存続させる。従って、ＨＳＣおよびリンパ系エ
フェクター細胞の、多能性幹細胞からの発生は、良好に設計および検証された方法および
組成物を介して、早期の胚性造血発生の、二次プログラムへの複雑な段階を、正確に再現
する能力に依存する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ｈｉＰＳＣの、二次ＨＥへの指向性分化について記載して
いる研究の数は、限定されている。治療を目的とするｈｉＰＳＣの活用における主要な障
害は、多能性を維持し、そして分化を誘導するために、マウス由来の間質細胞またはヒト
由来の間質細胞と共に、組成未知の血清含有培地の存在下で、このような細胞をまず同時
培養することの要請であった。加えて、既存のプロトコールはまた、外胚葉細胞、中胚葉
細胞、および内胚葉細胞を含む多様な分化細胞を含む、異質性の細胞凝集物である胚葉体
（ＥＢ）を形成するように、ｉＰＳＣを培養することからなる戦略も採用している。これ
らの手順は、例えば、クランプを形成するようにスピンするか、細胞をウェル内で沈殿お
よび凝集させるか、または懸濁培養物中の受動的凝集およびクランプ形成を可能とするこ
とにより、多能性細胞を凝集させることを要請する。形成されたＥＢは、ある特定の持続
期間にわたり、分化下に維持し、典型的には、適正な分化を可能とするように、７～１０
日間にわたり、培養系を誘導し、次いで、ＥＢを、さらなる成熟のために、接着培養へと
移すか、または後続の分化ステップへと進むために、細胞型の選択のため単一細胞へと解
離させる（Kennedyら、Cell Reports、２０１２年、１７２２～１７３５頁；Knorrら、S
tem Cells Translational Medicine、２０１３年、２巻：２７４～２８３頁）。例え
ば、Kennedyらは、ｉＰＳＣの分化のためにＥＢを発生させることについて教示しており
、多能性細胞を、コラゲナーゼおよびトリプシンで処理して、小型の凝集物を形成するよ
うに、細胞のスクレーピングを可能とし、次いで、これを培養して、ＥＢが形成された。
ＥＢの形成は、多能性幹細胞の分化を容易とすることが示されているが、凝集物および後
続のＥＢを形成することの要請は労働集約的なものであり、この工程における細胞数の増
大は最小限であり、三次元的ＥＢ凝集物中の細胞内容物の、培地因子への曝露は、一貫せ
ず、不均等であり、これにより、分化段階が可変的な、異質性の細胞産物をもたらし、効
率的で合理的となるために要請される、製造工程のスケーラビリティーおよび再現性は大
きく損なわれる。
Kennedyら、Cell Reports、２０１２年、１７２２～１７３５頁 Knorrら、Stem Cells Translational Medicine、２０１３年、２巻：２７４～２８３頁
従って、同時培養または血清含有培地に依拠せず、かつ、中間体としての胚葉体凝集物
の形成を要請せずに、幹細胞を、二次造血へと分化させる方法および組成物が必要とされ
ている。
（発明の要旨）
本発明は一般に、幹細胞を培養し、造血細胞運命へと分化させるための、細胞培養条件
、培地、培養プラットフォーム、および方法に関する。
具体的には、本発明は、血清／フィーダーフリー条件下で、ＥＢの形成を必要とするこ
となく、スケーラブルな単層培養プラットフォームにより、ｈｉＰＳＣを含む多能性幹細
胞から導出した、二次造血性内皮（ＨＥ）および二次造血幹細胞（ＨＳＣ）を介して、造
血系統細胞を発生させるための方法および組成物を提供する。本発明の方法に従い分化さ
せうる細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞および分化転換細胞へとコミット
した前駆細胞、多能性中間体を経由せずに、造血運命へと直接移行する、多様な系統の細
胞にわたる範囲にある。同様に、幹細胞の分化により作製される細胞は、複能性幹細胞ま
たは前駆細胞から、最終分化幹細胞、および全ての介在する造血系統細胞にわたる範囲に
ある。
本発明は、単層培養において、造血系の細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大する
ための方法および組成物であって、多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子と、任意選択
で、ｂＦＧＦと接触させるステップを含む方法および組成物を提供する。従って、多能性
幹細胞由来の中胚葉細胞は、胚葉体を形成せずに、多能性幹細胞から得られ、拡大される
。次いで、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＷＮＴ経路活性化因子
との接触下に置いて、胚葉体を形成せずに、二次造血性内皮（ＨＥ）のポテンシャルを有
する、拡大された中胚葉細胞を、多能性幹細胞から得る。ｂＦＧＦと、任意選択で、ＲＯ
ＣＫ阻害剤と、かつ／またはＷＮＴ経路活性化因子との引き続く接触により、二次ＨＥの
ポテンシャルを有する中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させ、これまた、分化の間に
拡大される。
造血系の細胞を得るための、本明細書で提示される方法は、ＥＢの形成に至る細胞の拡
大は僅少～最小限であり、集団内の細胞の、均質な拡大および均質な分化を要求する、多
くの適用では重要であって、煩瑣かつ低効率である単層培養を可能としないため、ＥＢに
介在される多能性幹細胞の分化より優れている。
本明細書では、造血幹細胞、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＮＫ細胞な
ど、分化させた後代細胞の導出を結果としてもたらす二次造血性内皮への分化を容易とす
る単層分化プラットフォームが提供される。証明された単層分化戦略は、分化効率の増強
を、大スケールの拡大と組み合わせ、治療的に意味がある数の、多能性幹細胞由来の造血
細胞の、多様な治療適用のための送達を可能とする。さらに、本発明により、本明細書で
提示される方法を使用する単層培養は、全範囲にわたる、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化
、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるモジュレーション、ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける、長期に
わたる造血系の自己再生、再構成、および生着を可能とする機能的な造血系細胞をもたら
すことも開示された。
本発明の一態様は、多能性幹細胞由来の造血系細胞を得るための培養プラットフォーム
であって、群Ｉ：（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５
、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増
殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受
容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次ＨＳＣを、二次造血性内皮から、分化させ、拡大す
るのに適する培養培地；（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、
ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から、分化させ
、拡大するのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子
を含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するのに適する培養培地を含む
培養プラットフォームを提供する。
代替的に、多能性幹細胞由来の造血系細胞を得るための培養プラットフォームは、群Ｉ
Ｉ：（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１か
らなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選
択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポ
テンシャルを有する中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）
ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞を得るの
に適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを
含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地を含む
。一部の実施形態では、上記の培養プラットフォームの多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである
。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上
記の培養プラットフォームの群（ＩＩ）は、（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、お
よびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播
種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。
上記の培養プラットフォームについての一部の実施形態では、群（Ｉ）および（ＩＩ）
の各々は、さらなる培養培地をさらに含む。
群（Ｉ）は、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩ
Ｌ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１も
しくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子を含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細
胞由来のＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるのに適する培養培地、または（ｉｉ）Ｂ
ＭＰ活性化因子と；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からな
る群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数
のＮｏｔｃｈ経路活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へ
と分化させるのに適する培養培地をさらに含みうる。これらのさらなる培養培地は、多能
性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する。
群（ＩＩ）はさらに、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択さ
れる、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｂ
ＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞
由来のプレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養
培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｓ
ＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子
およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体
へと分化させるのに適する培養培地を含むことが可能であり；これらのさらなる培養培地
は、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する。
上記の培養プラットフォームについての一部の実施形態では、群（Ｉ）および（ＩＩ）
の各々はなお、さらなる培養培地をさらに含む。
群（Ｉ）は、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、
およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカイ
ンを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞
へと分化させるのに適する培養培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子；ＳＣＦ、Ｆｌｔ
３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、
１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを
、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地をさらに含むことが可能であり；こ
れらのさらなる培地は、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する。
群（ＩＩ）について述べると、上述の培地に加えて、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ
３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およ
びサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤
のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞
前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因
子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、
およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカイ
ンとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させる
のに適する培地をさらに含むことが可能であり；これらのさらなる培地は、多能性幹細胞
由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する。
さらに別の実施形態では、提供される培養プラットフォームの群（ＩＩ）は、（ｉ）Ｂ
ＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ
、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサ
イトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳＣを、
造血複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、Ｒ
ＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、
ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイ
トカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させ
るのに適する培養培地をさらに含み；これらの培養培地は、多能性幹細胞由来の造血複能
性前駆体を発生させるために提供される。
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物
であって、以下の群（Ｉ）または（ＩＩ）のうちの１または複数を含む組成物を提供する
。
群（Ｉ）：（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と；ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、Ｉ
Ｌ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因
子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、任意選択で、Ｗ
ｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次ＨＳＣを、多能
性幹細胞由来の二次造血性内皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）
ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と
；多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含み、二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚
葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害
剤、ＢＭＰ活性化因子と；ｉＰＳＣとを含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化さ
せ、拡大するのに適する培養培地。
群（ＩＩ）：（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、および
ＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；二
次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含み、任意選択
で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の、
造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培
地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含むが、ＴＧＦβ受
容体／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含まず、二次造血性内皮のポテ
ンシャルを有する中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大す
るのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦ
と；ｉＰＳＣとを含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適す
る培養培地。
多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物についての一部の実施
形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイー
ブｉＰＳＣである。
多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物についての一部の実施
形態では、群（ＩＩ）は、（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害
剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞とを含まず；多能性幹細胞を
播種し、拡大するのに適する培養培地など、さらなる組成物を含む。一部の実施形態では
、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳ
Ｃである。
上記の多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物についての一部
の実施形態では、群（Ｉ）は加えて、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ
２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子および
サイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子と；多能性幹細胞由来のＴ
細胞前駆体とを含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、
Ｔ細胞へと分化させるのに適する培養培地、または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ
、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１も
しくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因
子と；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣとを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、Ｔ細
胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地を含み；これらのさらなる培地は、多能性幹
細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する。
上記の多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物の群（ＩＩ）に
ついて、一部の実施形態では、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から
選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧ
Ｆ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数と；多能性幹細胞
由来のプレＴ細胞前駆体とを含まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前
駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因
子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７から
なる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞
由来の二次造血性内皮とを含み、二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化させるの
に適する培養培地をさらに含む。これらのさらなる培地は、多能性幹細胞由来のＴ系統細
胞を発生させるのに適する。
上記の多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物についての、さ
らに他の一部の実施形態では、群（Ｉ）は、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７
、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数
の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体とを含み、ＢＭＰ
活性化因子を含まず、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地；
または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、
ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサ
イトカインと；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣとを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣ
を、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地をさらに含む。これらのさらなる
培地は、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する。代替的に、上記の多
能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物の群（ＩＩ）は、（ｉ）Ｓ
ＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もし
くは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子
、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数と；多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前
駆体とを含まず、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化させ
るのに適する培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、
ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択さ
れる、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性
内皮とを含み、二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地を
さらに含む。これらの培養培地は、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適
する。
さらに他の一部の実施形態では、上記の多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大
するための組成物の群（ＩＩ）は、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるた
めの、１もしくは複数の培地をさらに含み、この培地は、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、Ｔ
ＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ
１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む
が、ＲＯＣＫ阻害剤と、多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳＣとを含まず、ｐｒｅ－ＨＳＣ
を、造血複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに／または（ｉｉ）Ｂ
ＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ
、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複
数の増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、二次
造血性内皮を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地を含む。
本発明の一態様は、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための培養プラットフ
ォームであって、群Ｉ：（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞
由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉ
ｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害
剤とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培
地；（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３
、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子お
よびサイトカインとを含み；任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／Ａ
ＬＫ阻害剤とを含まず、二次ＨＳＣを、二次造血性内皮から、分化させ、拡大するのに適
する培養培地；ならびに（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、Ｉ
Ｌ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子および
サイトカインと；１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み、Ｔ細胞前駆体を、
二次ＨＳＣから分化させるのに適する培養培地；ならびに、任意選択で、（ｖ）ＳＣＦ、
Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される
、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化
因子を含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、Ｔ細胞を、Ｔ細胞前駆体から分化させるのに適
する培養培地を含む培養プラットフォームを提供する。
代替的に、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための培養プラットフォームは
、群ＩＩ：（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由
来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ
）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受
容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、中胚葉細
胞から得るのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｓ
ＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およ
びサイトカインとを含み；任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造
血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大する
のに適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦ
ＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増
殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、二次造血性
内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに（ｖ）ＳＣＦ、
Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサ
イトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の
うちの１または複数と；多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体とを含まず、プレＴ細胞前
駆体を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地を含む。
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための、上記の培養プラットフォームにつ
いての一部の実施形態では、群ＩＩの培養プラットフォームは、（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、
ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻
害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。一部
の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、
ナイーブｉＰＳＣである。
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を発生させるための培養プラットフ
ォームであって、群Ｉ：（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞
を、中胚葉細胞へと分化させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ
活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み、中胚葉細胞を、二
次造血性内皮へと分化させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥ
ＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる
群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、
Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次造血性内皮を
、二次ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ
、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択
される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；二次ＨＳＣを、ＮＫ細胞
前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに、任意選択で、（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択
される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず
、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地を含む培養プラットフ
ォームを提供する。
代替的に、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を発生させるための培養プラットフォームは、
群ＩＩ：（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、多
能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と
、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を
含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞を、中胚葉細胞から得るのに
適する培養培地；（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、
およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイン
とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、二
次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞から分化させるのに適する培養培地；（
ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３
Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因
子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させる
のに適する培地；ならびに（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５
からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧ
Ｆ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず
、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養
培地を含む。
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を発生させるための、上記の培養プラットフォームについ
ての一部の実施形態では、群ＩＩの培養プラットフォームは、（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、Ｇ
ＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、
多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では
、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳ
Ｃである。
本発明のさらに別の態様は、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）を発生させ
るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦ
ＧＦとを含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培
地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、
ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉
細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ
）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１からなる群から選
択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、ＴＧＦβ
受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有
する中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地を含む培養プラットフォー
ムを提供する。
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）を発生させるための培養プラットフォー
ムについての一部の実施形態では、培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤、Ｇ
ＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、
多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。
本発明のなお別の態様は、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための培
養プラットフォームであって、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含
み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適す
る培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意
選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有す
る中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；（ｉｉｉ
）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群
から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャ
ルを有する中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活
性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥ
ＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖
因子およびサイトカインを含み；二次造血性内皮を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるのに
適する培養培地；ならびに（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、Ｅ
ＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される
、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、ｐｒ
ｅ－ＨＳＣを、造血複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地を含む培養プラット
フォームを提供する。一部の実施形態では、培養プラットフォームは、（ｖｉ）ＭＥＫ阻
害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を
含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施
形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイー
ブｉＰＳＣである。
本発明の別の態様は、多能性幹細胞の分化を、二次造血系細胞へと方向付けるための方
法であって、群Ｉ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含む組
成物と接触させて、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡
大を誘発するステップと；（ｉｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と
、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接
触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮細胞の、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞か
らの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内
皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６
、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイ
トカインとを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害
剤とを含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣの、造血性内皮細胞
からの分化および拡大を誘発するステップとを含む方法を提供する。
代替的に、多能性幹細胞の分化を、二次造血系細胞へと方向付けるための方法は、群Ｉ
Ｉ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物
と接触させて、中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと
；（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、
任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次ＨＥの
ポテンシャルを有する中胚葉細胞の、中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステッ
プと；（ｉｉｉ）二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂ
ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１また
は複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻
害剤を含まない組成物と接触させて、二次造血性内皮の、二次造血性内皮のポテンシャル
を有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップとを
含み；任意選択で、多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、造血性内皮を有する
中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置
くステップを含む。
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けるための方法についての一部の実施
形態では、群（ＩＩ）の方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およ
びＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて
、多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、多能性
幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである
。
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けるための方法についての一部の実施
形態では、多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化は、胚葉体の発生を欠き、単層培養形
態にある。
上記の方法についての一部の実施形態では、得られた多能性幹細胞由来の二次造血性内
皮細胞は、ＣＤ３４＋である。一部の実施形態では、得られた二次造血性内皮細胞は、Ｃ
Ｄ３４＋ ＣＤ４３－である。一部の実施形態では、二次造血性内皮細胞は、ＣＤ３４＋
ＣＤ４３－ ＣＸＣＲ４－ ＣＤ７３－である。
上記の方法についての他の一部の実施形態では、群Ｉは、（ｉ）多能性幹細胞由来の二
次ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およ
びＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１
または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来
の二次ＨＳＣの、Ｔ細胞前駆体への分化を誘発するステップと、任意選択で、Ｔ細胞前駆
体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群
から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；１または複数のＮｏｔ
ｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、Ｔ細胞前駆体の、Ｔ細胞への分化を誘
発するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、方法の群ＩＩは、（ｉ）多能性幹
細胞由来の二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦ
ＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増
殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮の、プレＴ細胞
前駆体への分化を誘発するステップと；任意選択で、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆体を、ＳＣ
Ｆ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およ
びサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害
剤のうちの１または複数を含まない組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆体の、Ｔ細胞前
駆体またはＴ細胞への分化を誘発するステップとをさらに含む。方法についての一部の実
施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体は、ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋である。
上記の多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けるための方法についての、さ
らに他の一部の実施形態では、方法の群Ｉは、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、
ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、および
ＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを
含む組成物と接触させて、二次ＨＳＣの、ＮＫ細胞前駆体への分化を誘発するステップと
；任意選択で、（ｉｉ）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖
因子およびサイトカインを含むが、ＢＭＰ活性化因子を含まない組成物と接触させて、Ｎ
Ｋ細胞前駆体の、ＮＫ細胞への分化を誘発するステップとをさらに含むか、または方法の
群ＩＩは、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ
阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５
からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成
物と接触させて、二次造血性内皮の、プレＮＫ細胞前駆体への分化を誘発するステップと
；任意選択で、（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ
、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因
子およびサイトカインを含む組成物であって、媒体が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性
化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まない組成物と接触させて、
プレＮＫ細胞前駆体の、ＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞への分化を誘発するステップと
をさらに含む。一部の実施形態では、方法の群ＩＩは、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造
血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、Ｅ
ＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される
、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次造血性
内皮の、ｐｒｅ－ＨＳＣへの分化を誘発するステップと；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、
ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩ
Ｌ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む
がＲＯＣＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳＣを、造血複能性前駆体へ
と分化させるのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法を使用
して得られた多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣは、ＣＤ３４＋ ＣＤ４５＋であり、長期に
わたる生着に適する。
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための方法であって
、群Ｉ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触
させて、中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉ
ｉ）中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分
化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と
、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯか
らなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；Ｗｎｔ
経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まない組成物と接触させて、二
次ＨＳＣの、二次造血性内皮からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｖ）二次
ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、および
ＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１ま
たは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、二次ＨＳＣの、Ｔ細
胞前駆体への分化を誘発するステップと；任意選択で、（ｖ）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、
Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される
、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化
因子とを含むが；ＢＭＰ活性化因子を含まない組成物と接触させて、Ｔ細胞前駆体の、Ｔ
細胞への分化を誘発するステップとを含む方法を提供する。
代替的に、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための方法は、群ＩＩ：（ｉ）
多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させ
て、中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉ）
中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含むが、ＴＧＦβ
受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次ＨＥのポテンシャルを有する
中胚葉細胞の、中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次
ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｓ
ＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およ
びサイトカインとを含み；ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて
、二次造血性内皮の、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞からの分化および拡大
を誘発するステップと；（ｉｖ）二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害
剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択され
る、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次造血
性内皮の、プレＴ細胞前駆体への分化を誘発するステップと；（ｖ）プレＴ細胞前駆体を
、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因
子およびサイトカインを含み；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ
阻害剤のうちの１または複数を含まない組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆体の、Ｔ細
胞前駆体またはＴ細胞への分化を誘発するステップとを含み；任意選択で、播種された多
能性幹細胞、中胚葉細胞、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞、および／または
二次造血性内皮を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くことができる。一部の実施
形態では、上記の方法の群ＩＩは、ｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、および
ＲＯＣＫ阻害剤を含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて
、多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、多能性
幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである
。方法についての一部の実施形態では、多能性幹細胞の、Ｔ系統細胞への分化は、胚葉体
の発生を欠き、単層培養フォーマットにある。
本発明のさらに別の態様は、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるための方法
であって、群Ｉ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含む組成
物と接触させて、多能性幹細胞の、中胚葉細胞への分化を誘発するステップと；（ｉｉ）
中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／
ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、中胚葉細胞の、二次造血性内皮への分化を誘
発するステップと；（ｉｉｉ）二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣ
Ｆ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択
される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；Ｗｎｔ経路活性化因子と
、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の
二次造血性内皮の、二次ＨＳＣへの分化を誘発するステップと；（ｉｖ）二次ＨＳＣを、
ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、および
ＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含
む組成物と接触させて、二次ＨＳＣの、ＮＫ細胞前駆体への分化を誘発するステップと；
任意選択で、（ｖ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ
、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１また
は複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＢＭＰ活性化因子を含まない組成物と接
触させて、ＮＫ細胞前駆体の、ＮＫ細胞への分化を誘発するステップとを含む方法を提供
する。代替的に、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるための方法は、群ＩＩ：
（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接
触させて、中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（
ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意
選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次ＨＥのポテ
ンシャルを有する中胚葉細胞の、中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと
；（ｉｉｉ）二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣ
Ｆ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子および
サイトカインと；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤
を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮の、二次ＨＥのポテ
ンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステ
ップと；（ｉｖ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、
Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物
と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮の、プレＮＫ細胞前駆体への分化を誘
発するステップと；（ｖ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３
Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因
子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣ
Ｋ阻害剤のうちの１または複数を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来のプレ
ＮＫ細胞前駆体の、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞への分化を誘発す
るステップとを含み；任意選択で、播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉
細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステ
ップを含む。一部の実施形態では、群ＩＩの多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させ
るための方法は、ｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を
含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、ｉＰＳＣを播種
し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳ
Ｃである。一部の実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるための方
法は、胚葉体の発生を欠き、単層培養フォーマットにある。
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための方法であ
って、（ｉ）ｉＰＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と
接触させて、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘
発するステップと；（ｉｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂ
ＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含ま
ない組成物と接触させて、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉
細胞の、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（
ｉｉｉ）二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ｂＦＧＦ
、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインと；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮の
、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞からの分化および拡
大を誘発するステップとを含み；任意選択で、播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由
来の中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下
に置くステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、上記の多能性幹細胞由来の
二次造血性内皮を発生させるための方法は、ｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤
、およびＲＯＣＫ阻害剤を含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接
触させて、ｉＰＳＣを播種し、拡大するステップをさらに含み、かつ／またはｉＰＳＣは
、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣを、二次造血性内皮の細胞へ
と分化させる上記の方法は、胚葉体の発生を欠き、単層培養フォーマットにある。
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来の、造血系の複能性前駆体を発生させるための
方法であって、（ｉ）ｉＰＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む
組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の、ｉＰＳＣからの分化および拡大
を誘発するステップと；（ｉｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と
、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組
成物と接触させて、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞の、中胚葉細胞からの分
化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉
細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１から
なる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ＴＧＦβ
受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次造血性内皮の、二次ＨＥのポ
テンシャルを有する中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｖ）二
次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ
、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択さ
れる、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次造
血性内皮の、ｐｒｅ－ＨＳＣへの分化を誘発するステップと；（ｖ）ｐｒｅ－ＨＳＣを、
ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣ
Ｆ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子および
サイトカインとを含むが、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、ｐｒｅ－ＨＳ
Ｃの、造血複能性前駆体への分化を誘発するステップとを含み；任意選択で、播種された
多能性幹細胞、中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％～約１０％の間の
低酸素圧下に置くステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、上記の多能性幹
細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤
、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含
まない組成物と接触させて、多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一
部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは
、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、多能性幹細胞の、上記の方法を使用す
る造血複能性前駆体への分化は、胚葉体の発生を欠き、単層培養フォーマットにある。
本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される培養プラットフォームから発生させる
、１または複数の細胞集団：多能性幹細胞由来の（ｉ）ＣＤ３４＋二次造血性内皮（ｉＣ
Ｄ３４）であって、上記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前
駆体、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ３４＋ ＣＤ４３－である
、ＣＤ３４＋二次造血性内皮；（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、上記ｉＨＥ
細胞がＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣで
あって、上記ｉＨＳＣがＣＤ３４＋ ＣＤ４５＋である、二次ＨＳＣ；（ｉｖ）造血複能
性前駆細胞であって、上記ｉＭＰＰ細胞が、ＣＤ３４＋ ＣＤ４５＋である、造血複能性
前駆細胞；（ｖ）ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体；（ｖｉ）ＣＤ４＋またはＣ
Ｄ８＋であるＴ細胞；（ｖｉｉ）ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ１６１＋であるＮＫ細胞前
駆体；ならびに（ｖｉｉｉ）ＣＤ５６＋ ＣＤ５７＋ ＣＤ１６＋ ＣＤ９４－であるＮ
Ｋ細胞を含む組成物を提供する。
本発明のなおさらなる態様は、本明細書で開示される方法を使用して発生させる、１ま
たは複数の細胞株またはクローン細胞：多能性幹細胞由来の（ｉ）ＣＤ３４＋二次造血性
内皮（ｉＣＤ３４）であって、上記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、
ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ３４＋ ＣＤ４
３－である、ＣＤ３４＋二次造血性内皮；（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、
上記ｉＨＥ細胞株またはクローン細胞が、ＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；（ｉｉｉ
）二次ＨＳＣであって、上記ｉＨＳＣがＣＤ３４＋ ＣＤ４５＋である、二次ＨＳＣ；（
ｉｖ）造血複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）であって、上記ｉＭＰＰ細胞が、ＣＤ３４＋ Ｃ
Ｄ４５＋である、造血複能性前駆細胞；（ｖ）ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体
；（ｖｉ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞；（ｖｉｉ）ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ Ｃ
Ｄ１６１＋であるＮＫ細胞前駆体；ならびに（ｖｉｉｉ）ＣＤ５６＋ ＣＤ５７＋ ＣＤ
１６＋ ＣＤ９４－であるＮＫ細胞を提供する。
本発明の別の態様は、開示される方法を使用して発生させる細胞集団、細胞株、または
クローン細胞：多能性幹細胞由来の（ｉ）ＣＤ３４＋二次造血性内皮（ｉＣＤ３４）であ
って、上記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞
、およびＮＫ細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ３４＋ ＣＤ４３－である、ＣＤ３４＋
二次造血性内皮；（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、上記ｉＨＥ細胞株または
クローン細胞がＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；（ｉｉｉ）二次ＨＳＣであって、上
記ｉＨＳＣが、ＣＤ３４＋ ＣＤ４５＋である、二次ＨＳＣ；（ｉｖ）造血複能性前駆細
胞であって、上記ｉＭＰＰ細胞がＣＤ３４＋ ＣＤ４５＋である、造血複能性前駆細胞；
（ｖ）ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体；（ｖｉ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であ
るＴ細胞；（ｖｉｉ）ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ１６１＋であるＮＫ細胞前駆体；なら
びに（ｖｉｉｉ）ＣＤ５６＋ ＣＤ５７＋ ＣＤ１６＋ ＣＤ９４－であるＮＫ細胞のう
ちの１または複数を使用して、造血系の自己再生、再構成、または生着を促進する方法を
提供する。
まとめると、本発明は、胚葉体を多能性幹細胞から発生させずに、単層内の、多能性幹
細胞の直接的な分化を可能とし、これにより、他の造血系細胞を、極めて高レベルの効率
を伴う、スケーラブルかつ信頼できる形で得ることができる、中胚葉細胞、二次ＨＥ、お
よび二次ＨＳＣの分化および拡大を達成する方法および組成物を達成する。
本発明の特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
多能性幹細胞の分化を、造血系細胞へと方向付けるための方法であって、（ｉ）前記多
能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて
、中胚葉細胞を得るステップと；（ｉｉ）前記中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子と、
ｂＦＧＦと、ＷＮＴ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮（ＨＥ
）のポテンシャルを有する中胚葉細胞を得るステップとを含み、二次造血性内皮（ＨＥ）
のポテンシャルを有する前記中胚葉細胞が、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）、造血
複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、プレＴ細胞の前駆細胞、プレＮＫ細胞の前駆細胞、Ｔ細胞の
前駆細胞、ＮＫ細胞の前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＢ細胞を含む造
血系細胞を提供することが可能であり；中胚葉細胞および二次ＨＥのポテンシャルを有す
る中胚葉細胞が、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）において、胚葉体を形成せずに得られる
方法。
（項目２）
二次ＨＥのポテンシャルを有する前記中胚葉細胞を、ｂＦＧＦとＲＯＣＫ阻害剤とを含
む組成物と接触させて、二次ＨＥ細胞を得るステップをさらに含む、項目１に記載の方法
。
（項目３）
前記二次ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、
ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１か
らなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と
接触させて、造血複能性前駆細胞（ＭＰＰ）を得るステップをさらに含む、項目２に記載
の方法。
（項目４）
前記二次ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、
１または複数の増殖因子およびサイトカインと；任意選択で、ＢＭＰ活性化因子、ＲＯＣ
Ｋ阻害剤、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦのうちの１または複数とを含む組成物と接触させて
、プレＴ細胞前駆体、Ｔ細胞前駆体、および／またはＴ細胞を得るステップをさらに含む
、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記二次ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選
択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、任意選択で、ＢＭＰ活性化因
子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦのうちの１または複数とを含む組成物と
接触させて、プレＮＫ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、および／またはＮＫ細胞を得るステ
ップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組
成物と接触させて、前記細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む、項目１に記載の
方法。
（項目７）
前記多能性幹細胞、前記中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮のポテンシャルを
有する前記中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含
む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記多能性幹細胞の、造血系細胞への分化が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まな
いか、またはこれらを本質的に含まない、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記多能性幹細胞の、造血系細胞への分化が、フィーダーフリー条件下である、項目１
に記載の方法。
（項目１０）
前記多能性幹細胞の、造血系細胞への分化が、間質フリー条件下にある、項目１に記載
の方法。
（項目１１）
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＷＮＴ経路活性化因子が、ＧＳＫ３阻害剤である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＢＭＰ経路活性化因子が、ＢＭＰ４である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、チアゾビビンまたはＹ－２７６３２である、項目２に記載の方
法。
（項目１７）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、項目２に記載の方法。
（項目１８）
多能性幹細胞の分化を、造血系の細胞へと方向付けるための方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触さ
せて、中胚葉細胞を得るステップと；
（ｉｉ）前記中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、造血性内皮を得るステップと
；
（ｉｉｉ）前記造血性内皮を、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、Ｉ
Ｌ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子および
サイトカインと；ＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、二次ＨＳＣを得るステ
ップであって、前記組成物が、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／
ＡＬＫ阻害剤とを含まないステップと
を含む方法。
（項目１９）
（ｉｖ）二次ＨＳＣを、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６
からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；ＢＭＰ活
性化因子と、１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、
Ｔ細胞前駆体を得るステップと、任意選択で、
（ｖ）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およ
びＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；
１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、Ｔ細胞を得る
ステップと
をさらに含むか、または
（ｖｉ）二次ＨＳＣを、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、お
よびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカイン
と；ＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、ＮＫ細胞前駆体を得るステップと；
任意選択で、
（ｖｉｉ）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３
、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子および
サイトカインを含む組成物と接触させて、ＮＫ細胞を得るステップであって、前記組成物
が、ＢＭＰ活性化因子を含まないステップと
をさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記二次ＨＳＣが、ＣＤ３４＋ ＣＤ４５＋である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記二次ＨＳＣが、長期にわたる生着に適する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｔ細胞前駆体が、ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋である、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記ＮＫ細胞前駆体が、ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ１６１＋である、項目１９に記載
の方法。
（項目２４）
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、胚葉体の発生を欠く、項
目１８に記載の方法。
（項目２５）
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、単層培養下である、項目
１８に記載の方法。
（項目２６）
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、フィーダーフリー条件下
である、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、間質フリー条件下である
、項目１８に記載の方法。
（項目２８）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目１８に記載の方法。
（項目２９）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための方法であって、前記方法が、
（Ｉ）多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、Ｉ
Ｌ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およ
びサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触さ
せて、Ｔ細胞を得るステップであって；前記組成物が、ＢＭＰ活性化因子を含まないステ
ップ
を含み；
前記多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、ＢＭＰ活
性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群か
ら選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏ
ｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることに
より得られ；
前記多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣが、多能性幹細胞由来の造血性内皮を、ＢＭＰ活性
化因子と；ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、および
ＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含
む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、
任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず；
前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＧＳＫ
３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む
組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性
化因子を含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られるか；
または前記方法が、
（ＩＩ）多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７
からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物
と接触させて、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体もしくはＴ細胞を得るステップであって
、前記組成物が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうち
の１もしくは複数を含まないステップ
を含み；
前記多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、Ｂ
ＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およ
びＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを
含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性
幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、
およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカイ
ンとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
二次ＨＥのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細
胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成
物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、
ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選
択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることに
より得られる、
方法。
（項目３１）
多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物
と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップ
をさらに含み、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、項目３０に記
載の方法。
（項目３２）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させることが、胚葉体の発生を欠く、項目３０に
記載の方法。
（項目３３）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させることが、単層培養下である、項目３０に記
載の方法。
（項目３４）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させることが、フィーダーフリー条件下である、
項目３０に記載の方法。
（項目３５）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させることが、間質フリー条件下である、項目３
０に記載の方法。
（項目３６）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目３０に記載の方法。
（項目３７）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるための方法であって、前記方法が、
（Ｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、
ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の
増殖因子およびサイトカインを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を
得るステップであって、前記組成物が、ＢＭＰ活性化因子を含まないステップ
を含み；
前記多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、ＢＭＰ活
性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５
からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成
物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣが、多能性幹細胞由来の造血性内皮を、ＢＭＰ活性
化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、および
ＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含
む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成
物が、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず；
前記多能性幹細胞由来の造血性内皮が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻
害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成
物と接触させて、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の分化を誘発して、細胞の分化および拡
大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性
化因子を含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ
るか；
または前記方法が、
（ＩＩ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、Ｉ
Ｌ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイ
トカインを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細
胞を得るステップであって、前記組成物が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、お
よびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まないステップ
を含み；
前記多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、
ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｉ
Ｌ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子お
よびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすること
により得られ；
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細
胞由来の中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およ
びＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと
を含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記
組成物が、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
二次ＨＥのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細
胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成
物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、
任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選
択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることに
より得られる、
方法。
（項目３９）
播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、造血性内皮のポテンシャル
を伴う中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％～約１０％の間の低酸素圧
下に置くステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物
と接触させて、前記細胞を播種し、拡大するステップをさらに含み、前記組成物が、ＴＧ
Ｆβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させることが、胚葉体の発生を欠く、項目３８
に記載の方法。
（項目４２）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させることが、単層培養下である、項目３８に
記載の方法。
（項目４３）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させることが、フィーダーフリー条件下である
、項目３８に記載の方法。
（項目４４）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させることが、間質フリー条件下である、項目
３８に記載の方法。
（項目４５）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目３８に記載の方法。
（項目４６）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための方法であって、
二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤
と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、
１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞
由来の二次造血性内皮を得るステップであって、前記組成物が、任意選択で、ＴＧＦβ受
容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないステップを含み；
二次ＨＥのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細
胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成
物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、
任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選
択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることに
より得られる、
方法。
（項目４８）
多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物
と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップ
をさらに含み、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、項目４７に記
載の方法。
（項目４９）
播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、二次造血性内皮のポテンシ
ャルを有する中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％～約１０％の間の低
酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目４７および４８に記載の方法。
（項目５０）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、胚葉体の発生を欠く、項目４
７に記載の方法。
（項目５１）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、単層培養下である、項目４７
に記載の方法。
（項目５２）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、フィーダーフリー条件下であ
る、項目４７に記載の方法。
（項目５３）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、間質フリー条件下である、項
目４７に記載の方法。
（項目５４）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体を発生させるための方法であって、
多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣ
ＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選
択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、多
能性幹細胞由来の複能性前駆体を得るステップであって、前記組成物が、ＲＯＣＫ阻害剤
を含まないステップを含み；
前記多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳＣが、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、Ｂ
ＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ
、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可
能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性
幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、
およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイン
とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前
記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
二次ＨＥのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細
胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成
物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、
ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性
化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および
拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含
まず；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選
択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることに
より得られる、
方法。
（項目５７）
多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物
と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップ
をさらに含み、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、項目５６に記
載の方法。
（項目５８）
播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、二次造血性内皮のポテンシ
ャルを有する中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％～約１０％の間の低
酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目５６および５７に記載の方法。
（項目５９）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、胚葉体の発生を欠く、項目５８に記載の
方法。
（項目６０）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、単層培養下にある、項目５８に記載の方
法。
（項目６１）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、フィーダーフリー条件下にある、項目５
８に記載の方法。
（項目６２）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、間質フリー条件下にある、項目５８に記
載の方法。
（項目６３）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目５８に記載の方法。
（項目６４）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
項目１から６４に記載の方法を使用して発生させる細胞集団、細胞株、またはクローン
細胞のうちの１または複数を含む組成物を使用して、造血系の自己再生、再構成、または
生着を促進する方法であって、前記細胞集団、細胞株、またはクローン細胞が、
（ｉ）多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋二次造血性内皮（ｉＣＤ３４ ＨＥ）であって、
前記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、およ
びＮＫ細胞へと分化する能力を有し、前記ｉＣＤ３４細胞がＣＤ３４＋ ＣＤ４３－であ
る、ＣＤ３４＋二次造血性内皮；
（ｉｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、前記ｉＨＥ細胞株ま
たはクローン細胞がＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；
（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣであって、前記ｉＨＳＣが、ＣＤ３４＋ Ｃ
Ｄ４５＋である二次ＨＳＣ；
（ｉｖ）多能性幹細胞由来の複能性前駆細胞であって、前記ｉＭＰＰ細胞が、ＣＤ３４
＋ ＣＤ４５＋である、複能性前駆細胞；
（ｖ）多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体であって、ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋であるＴ細胞
前駆体；
（ｖｉ）多能性幹細胞由来のＴ細胞であって、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞；
（ｖｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体であって、ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ
１６１＋であるＮＫ細胞前駆体；ならびに
（ｖｉｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞であって、ＣＤ５６＋ ＣＤ５７＋ ＣＤ１
６＋ ＣＤ９４－であるＮＫ細胞
から選択される、
方法。
（項目６６）
多能性幹細胞由来の造血系細胞を得るための培養プラットフォームであって、
Ｉ：
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ
６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子および
サイトカインとを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ
阻害剤とを含まず、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の二次造血性内
皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬ
Ｋ阻害剤とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚葉細
胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；および
（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞
を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
またはＩＩ：
（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１から
なる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選
択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、
二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ
、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性
内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；ならびに
（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の
中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地
を含む培養プラットフォーム。
（項目６７）
群ＩＩが、
（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさら
に含む、
項目６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目６８）
Ｉ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる
群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数の
Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＴ
細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地、または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、および
ＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１
もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、
多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適するか、
あるいはＩＩ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数
の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、および
ＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体
を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地
；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイ
トカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のプレＴ細
胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する、
項目６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目６９）
Ｉ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１
５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、Ｂ
ＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮ
Ｋ細胞へと分化させるのに適する培養培地；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ
６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイト
カインとを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体
へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適するか、
あるいはＩＩ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択され
る、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ
活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来
のプレＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化
させるのに適する培地；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の
増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレＮＫ
細胞前駆体へと分化させるのに適する培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する、
項目６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目７０）
群（ＩＩ）が、
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧ
Ｆ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖
因子およびサイトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ
－ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地；また
は
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰ
Ｏ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、
１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性
内皮を、多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み；
前記培養培地が、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるのに適する、項目
６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目７１）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目７２）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目７１に記載の培養プラットフォーム。
（項目７３）
多能性幹細胞由来の造血細胞を得、かつ拡大するための組成物であって、
Ｉ：
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ
６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子および
サイトカインと；多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路
活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣ
を、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮から得るのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬ
Ｋ阻害剤と；多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内
皮を、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；ならびに
（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子と；ｉＰＳＣとを含み、多能性幹細胞由
来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から得るのに適する培養培地；
またはＩＩ：
（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１から
なる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選
択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と；二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性
幹細胞由来の中胚葉細胞とを含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性
内皮のポテンシャルを伴う、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養
培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、ＴＧＦβ受容体
／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含まず、二次造血性内皮のポテン
シャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から
得るのに適する培養培地；ならびに
（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦと；多能性幹細胞とを含み、多
能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から得るのに適する培養培地
のうちの１または複数を含む組成物。
（項目７４）
群（ＩＩ）が、
（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞とを含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適
する培養培地
をさらに含む、項目７３に記載の組成物。
（項目７５）
Ｉ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる
群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数の
Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子と；多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体とを含み；ＢＭＰ活性化
因子を含まず、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＴ細胞へと分化
させるのに適する培養培地、または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、および
ＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１
もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子と；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣとを含み、
多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体へと分化させるのに
適し、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する培養培地
をさらに含み、
あるいはＩＩ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数
の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、および
ＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数と；多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体とを含
まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体もしく
はＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地、または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイ
トカインと；多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血
性内皮を、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する、
項目７３に記載の組成物。
（項目７６）
Ｉ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１
５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性
幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体とを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来の
ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地；ま
たは
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６
、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカ
インと；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣとを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多
能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適するか、
あるいはＩＩ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択され
る、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ
活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数と；多能性幹細胞由来のプレ
ＮＫ細胞前駆体とを含まず、多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由
来のＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培地；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の
増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、多能性幹
細胞由来の二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する、
項目７３に記載の組成物。
（項目７７）
群（ＩＩ）が、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための、１または複
数の培地をさらに含み、前記培地が、
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧ
Ｆ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖
因子およびサイトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤と；多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳ
Ｃとを含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の複能性前駆体
へと分化させるのに適する培養培地；ならびに／または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰ
Ｏ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、
１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来の二次造血性内皮と
を含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳＣへと
分化させるのに適する培養培地
を含む、項目７３に記載の組成物。
（項目７８）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目７３に記載の培養プラットフォーム。
（項目７９）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目７８に記載の培養プラットフォーム。
（項目８０）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、
Ｉ：
（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、
多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬ
Ｋ阻害剤とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚葉細
胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、
ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子お
よびサイトカインとを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／Ａ
ＬＫ阻害剤とを含まず、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の二次造血
性内皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；ならびに
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、および
ＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、１
もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を
、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣから分化させるのに適する培養培地；ならびに、任意選
択で、
（ｉｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６から
なる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複
数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来
のＴ細胞を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体から分化させるのに適する培養培地；
またはＩＩ：
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚
葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の二次ＨＥ
のポテンシャルを得るのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１
からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任
意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮
を、多能性幹細胞由来の造血性内皮のポテンシャルを伴う前記中胚葉細胞から、分化させ
、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイ
トカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のプレＴ細
胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに
（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数
の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、および
ＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体
を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地
を含むプラットフォーム。
（項目８１）
群（ＩＩ）が、
（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、任意選択で、
ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培
養培地
をさらに含む、項目８０に記載の培養プラットフォーム。
（項目８２）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目８０に記載の培養プラットフォーム。
（項目８３）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目８２に記載の培養プラットフォーム。
（項目８４）
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、
Ｉ：
（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞を、多能性幹細胞由来
の中胚葉細胞へと分化させるのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬ
Ｋ阻害剤とを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の二次造血性内
皮へと分化させるのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、
ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子お
よびサイトカインとを含み；任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／Ａ
ＬＫ阻害剤とを含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の二次
ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地；ならびに
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ
６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイト
カインとを含み；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体
へと分化させるのに適する培養培地；ならびに、任意選択で、
（ｉｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ
１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、
ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来の
ＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地；
またはＩＩ：
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚
葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造
血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１
からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任
意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮
を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から分化さ
せるのに適する培養培地；
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の
増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレＮＫ
細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに
（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択され
る、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ
活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来
のプレＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化
させるのに適する培養培地
を含むプラットフォーム。
（項目８５）
群（ＩＩ）が、
（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさら
に含む、
項目８４に記載の培養プラットフォーム。
（項目８６）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目８４に記載の培養プラットフォーム。
（項目８７）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目８６に記載の培養プラットフォーム。
（項目８８）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための培養プラットフォームであって
、
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚
葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造
血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；ならびに
（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１
からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意
選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を
、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の前記中胚葉細胞から、分
化させ、拡大するのに適する培養培地
を含む培養プラットフォーム。
（項目８９）
（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさら
に含む、
項目８８に記載の培養プラットフォーム。
（項目９０）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目８８に記載の培養プラットフォーム。
（項目９１）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目９０に記載の培養プラットフォーム。
（項目９２）
複能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための培養プラットフォームであっ
て、
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚
葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造
血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１
からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意
選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を
、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化さ
せ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰ
Ｏ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、
１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内
皮を、多能性幹細胞由来のｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地；ならびに
（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧ
Ｆ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因
子およびサイトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ－
ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地
を含む培養プラットフォーム。
（項目９３）
（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地
をさらに含む、項目９２に記載の培養プラットフォーム。
（項目９４）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目９２に記載の培養プラットフォーム。
（項目９５）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目９４に記載の培養プラットフォーム。
（項目９６）
（ａ）任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない培養培地；ならびに
（ｂ）項目４から７に記載の培養プラットフォームから発生させる、１または複数の細
胞集団：
（ｉ）多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋二次造血性内皮（ｉＣＤ３４ ＨＥ）であって
、前記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、お
よびＮＫ細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ３４＋ ＣＤ４３－である、ＣＤ３４＋二次
造血性内皮；
（ｉｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、前記ｉＨＥ細胞が
ＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；
（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣであって、前記ｉＨＳＣが、ＣＤ３４＋
ＣＤ４５＋である、二次ＨＳＣ；
（ｉｖ）多能性幹細胞由来の複能性前駆細胞であって、前記ｉＭＰＰ細胞が、ＣＤ３
４＋ ＣＤ４５＋である、複能性前駆細胞；
（ｖ）多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体であって、ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋であるＴ細
胞前駆体；
（ｖｉ）多能性幹細胞由来のＴ細胞であって、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞
；
（ｖｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体であって、ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ Ｃ
Ｄ１６１＋であるＮＫ細胞前駆体；ならびに
（ｖｉｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞であって、ＣＤ５６＋ ＣＤ５７＋ ＣＤ
１６＋ ＣＤ９４－であるＮＫ細胞
を含む組成物。
（項目９７）
（ｉ）ＣＤ３４＋ ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、ならびにｉＣＤ３４－Ｃ、ｉＭＰＰ－Ａ
、ｉＴＣ－Ａ１、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ１、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ１、ｉＮＫ－
Ａ２、ｉＮＫ－Ｂ１、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される、１または複数の培養培地；
（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）、ならびにｉＣＤ３４－Ｃ、ｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ
－Ａ１、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ１、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ１、ｉＮＫ－Ａ２、ｉ
ＮＫ－Ｂ１、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される、１または複数の培養培地；
（ｉｉｉ）二次ＨＳＣ、ならびにｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ１、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ
－Ｂ１、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ１、ｉＮＫ－Ａ２、ｉＮＫ－Ｂ１、およびｉＮＫ－Ｂ
２から選択される、１または複数の培養培地；
（ｉｖ）複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）およびｉＭＰＰ－Ａ；
（ｖ）Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏＴ）、ならびにｉＴＣ－Ａ１、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－
Ｂ１、およびｉＴＣ－Ｂ２から選択される、１または複数の培養培地；
（ｖｉ）Ｔ細胞（ｉＴＣ）、およびｉＴＣ－Ｂ１またはｉＴＣ－Ｂ２；
（ｖｉｉ）ＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏＮＫ）、ならびにｉＮＫ－Ａ１、ｉＮＫ－Ａ２、
ｉＮＫ－Ｂ１、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される、１または複数の培養培地；ならびに
（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞（ｉＮＫ）と、ｉＮＫ－Ｂ１またはｉＮＫ－Ｂ２
（ｉｘ）ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）、ならびにｉＨＳＣ－Ａ、ｉＨＳＣ－Ｂ、およびｉＨＳＣ
－Ｃ
からなる群から選択される、多能性幹細胞由来の造血細胞と、１または複数の培養培地と
を含む組成物であって；
ｉＨＳＣ－Ａが、Ｗｎｔ経路活性化因子およびＢＭＰ活性化因子を含み；
ｉＨＳＣ－Ｂが、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦ
β受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み；
ｉＨＳＣ－Ｃが、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、Ｉ
Ｌ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因
子およびサイトカインとを含み；
ｉＴＣ－Ａ１が、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３
、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイン
と、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４からなる群から選
択される、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；
ｉＴＣ－Ｂ１が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ
６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、Ｊａｇ１
、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４からなる群から選択される、１
または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；（ｉＨＳＣプラットフォーム）；
ｉＮＫ－Ａ１が、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ
３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子および
サイトカインとを含み；
ｉＮＫ－Ｂ１が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、お
よびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを
含み；
ｉＣＤ３４－Ｃが、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、および
ＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含
み；
ｉＭＰＰ－Ａが、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳ
Ｆ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択
される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｉＴＣ－Ａ２が、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦ
と；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖
因子およびサイトカインとを含み；
ｉＴＣ－Ｂ２が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１ま
たは複数の増殖因子およびサイトカインを含み；
ｉＮＫ－Ａ２が、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦ
と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の
増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｉＮＫ－Ｂ２が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択さ
れる、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む、
組成物。
（項目９８）
ｉＨＳＣ－Ｃが、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず
；ｉＴＣ－Ａ１が、ＶＥＧＦおよび／もしくはＩＬ１５を含まず；ｉＣＤ３４－Ｃが、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；ｉＴＣ－Ｂ１が、ＢＭＰ活性化因子を含まず；か
つ／またはｉＴＣ－Ｂ２が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻
害剤のうちの１もしくは複数を含まない、項目９７に記載の組成物。
図１は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の、完全に分化したＴ細胞への造血分化のための多段階工程についての、例示的な概略図を示す図である。
図２は、ｈｉＰＳＣの、完全に分化させたＮＫ細胞への造血分化のための多段階工程についての、例示的な概略図を示す図である。
図３Ａ～３Ｅは、９日間の経過にわたる形態の変化であって、ｈｉＰＳＣから造血細胞への移行を裏付ける形態の変化を示す図である。 図３Ａ～３Ｅは、９日間の経過にわたる形態の変化であって、ｈｉＰＳＣから造血細胞への移行を裏付ける形態の変化を示す図である。
図４Ａ～４Ｄは、それらが、多能性を離れて、造血運命へと完全に移行するときの、幹細胞の発現プロファイルを示す図である。 図４Ａ～４Ｄは、それらが、多能性を離れて、造血運命へと完全に移行するときの、幹細胞の発現プロファイルを示す図である。
図５Ａ～５Ｃは、多様な方法および出発インプットにより発生させたｈｉＰＳＣから分化させた造血細胞のＣＤ３４／ＣＤ４５発現プロファイルを示す図である。 図５Ａ～５Ｃは、多様な方法および出発インプットにより発生させたｈｉＰＳＣから分化させた造血細胞のＣＤ３４／ＣＤ４５発現プロファイルを示す図である。
図６Ａ～６Ｃは、記載される分化培養培地中の単層として介在された場合の、ＣＤ３４分化効率の改善を示す図である。 図６Ａ～６Ｃは、記載される分化培養培地中の単層として介在された場合の、ＣＤ３４分化効率の改善を示す図である。 図６Ａ～６Ｃは、記載される分化培養培地中の単層として介在された場合の、ＣＤ３４分化効率の改善を示す図である。
図７は、単一細胞解離の後、ＲＯＣＫ阻害下で分化させた造血細胞の生存および増殖を示す図である。
図８は、２２日培養後にｈｉＰＳＣから分化した造血細胞による、ＣＤ３４発現の維持を示す図である。
図９Ａ～９Ｂは、生着したＣＤ３４陽性細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける再構成であって、ヒトＣＤ４５マーカーをもっぱら発現する細胞の存在と、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方の存在を伴う、ＣＤ３４＋細胞の再構成とにより見られる再構成を示す図である。ＣＤ３４陽性細胞は、ＧＳＫ３阻害剤を伴い、単層フォーマットで、ＥＢまたは凝集中間体を伴わずに培養されたナイーブｈｉＰＳＣに由来する。 図９Ａ～９Ｂは、生着したＣＤ３４陽性細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける再構成であって、ヒトＣＤ４５マーカーをもっぱら発現する細胞の存在と、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方の存在を伴う、ＣＤ３４＋細胞の再構成とにより見られる再構成を示す図である。ＣＤ３４陽性細胞は、ＧＳＫ３阻害剤を伴い、単層フォーマットで、ＥＢまたは凝集中間体を伴わずに培養されたナイーブｈｉＰＳＣに由来する。
図１０は、ＣＤ５６－／ＣＤ７＋／ＣＤ３＋／ＴＣＲαβ＋ゲーティング戦略により導出され、ＣＤ５６陽性細胞および単一のＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞が、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性細胞を、間質細胞の非存在下で、かつ可溶性ＤＬＬ１およびＤＬＬ４組換えペプチド（Ｔ細胞に限る）の存在下で、分化培地中でさらに培養された場合に識別されたことを示す図である。
図１１は、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性細胞が、ＰＤ－Ｌ１表面発現の増強された発現に見られるように、薬理学的モジュレーションに応答しうることを示す図である。
図１２は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の、二次造血性内皮（ｉＨＥ）および複能性前駆体（ｉＭＰＰ）への造血分化のための多段階工程についての概略図を示す図である。培養は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知へと転換されうることに注意されたい。
図１３は、人工多能性幹細胞の、Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏＴ）および完全に分化させたＴ（ｉＴ）細胞への造血分化のための多段階工程についての概略図を示す図である。培養は、ＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉをＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で置き換えて完全規定に転換されうることに注意されたい。
図１４は、人工多能性幹細胞の、ＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏＮＫ）および完全に分化させたＮＫ（ｉＮＫ）細胞への造血分化のための多段階工程についての概略図を示す図である。培養は、ＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉをＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で置き換えて、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に完全規定組成既知へとに転換されうることに注意されたい。
図１５Ａ～Ｃは、１０日間の経過にわたるｉＨＥの出現、ならびにｉＰＳＣ分化当たりの、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞のアウトプットを示すフローサイトメトリープロファイルを示す図である。計算は、代表的な培養および最適化されていない培養についてのスナップショットに基づく。 図１５Ａ～Ｃは、１０日間の経過にわたるｉＨＥの出現、ならびにｉＰＳＣ分化当たりの、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞のアウトプットを示すフローサイトメトリープロファイルを示す図である。計算は、代表的な培養および最適化されていない培養についてのスナップショットに基づく。 図１５Ａ～Ｃは、１０日間の経過にわたるｉＨＥの出現、ならびにｉＰＳＣ分化当たりの、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞のアウトプットを示すフローサイトメトリープロファイルを示す図である。計算は、代表的な培養および最適化されていない培養についてのスナップショットに基づく。
図１６Ａ～Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目～６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。 図１６Ａ～Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目～６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。 図１６Ａ～Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目～６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。 図１６Ａ～Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目～６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。 図１６Ａ～Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目～６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。
図１７Ａ～Ｂは、１０日目のＨＥが、複能性であり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に依存する二次造血を表すことを示す図である。Ａ）７日間のＭＰＰアッセイにわたる形態の変化を、出現しつつあるＣＤ４５造血細胞についてのフローサイトメトリープロファイルと共に示す図である。Ｂ）ｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞が、ｉＭＰＰアッセイにおいて、Ｎｏｔｃｈ依存性二次ＣＤ４５＋細胞を発生させることを示す図である。 図１７Ａ～Ｂは、１０日目のＨＥが、複能性であり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に依存する二次造血を表すことを示す図である。Ａ）７日間のＭＰＰアッセイにわたる形態の変化を、出現しつつあるＣＤ４５造血細胞についてのフローサイトメトリープロファイルと共に示す図である。Ｂ）ｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞が、ｉＭＰＰアッセイにおいて、Ｎｏｔｃｈ依存性二次ＣＤ４５＋細胞を発生させることを示す図である。
図１８Ａ～Ｂは、低酸素条件下の分化の、ｉＨＥおよびｉＭＰＰ造血前駆体の発生に対する効果を示す図である。Ａ）低酸素状態下における単層分化が、１０日目において、ｉＣＤ３４陽性細胞およびｉＨＥ細胞の両方の百分率を増大させることを示す図である。Ｂ）低酸素条件下で発生させた、１０日目のｉＣＤ３４＋ ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰアッセイにおいて、さらに分化させうることを示す図である。 図１８Ａ～Ｂは、低酸素条件下の分化の、ｉＨＥおよびｉＭＰＰ造血前駆体の発生に対する効果を示す図である。Ａ）低酸素状態下における単層分化が、１０日目において、ｉＣＤ３４陽性細胞およびｉＨＥ細胞の両方の百分率を増大させることを示す図である。Ｂ）低酸素条件下で発生させた、１０日目のｉＣＤ３４＋ ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰアッセイにおいて、さらに分化させうることを示す図である。
図１９Ａ～Ｄは、ソートされていない１０日目の培養またはソートされた１０日目の培養が、低温保存され、造血ポテンシャルを維持する能力を示す図である。Ａ）低温保存された、１０日目の、ソートされていない分化培養が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）低温保存された、１０日目の、ｉＣＤ３４＋でソートされた細胞が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。 図１９Ａ～Ｄは、ソートされていない１０日目の培養またはソートされた１０日目の培養が、低温保存され、造血ポテンシャルを維持する能力を示す図である。Ａ）低温保存された、１０日目の、ソートされていない分化培養が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）低温保存された、１０日目の、ｉＣＤ３４＋でソートされた細胞が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。 図１９Ａ～Ｄは、ソートされていない１０日目の培養またはソートされた１０日目の培養が、低温保存され、造血ポテンシャルを維持する能力を示す図である。Ａ）低温保存された、１０日目の、ソートされていない分化培養が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）低温保存された、１０日目の、ｉＣＤ３４＋でソートされた細胞が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。 図１９Ａ～Ｄは、ソートされていない１０日目の培養またはソートされた１０日目の培養が、低温保存され、造血ポテンシャルを維持する能力を示す図である。Ａ）低温保存された、１０日目の、ソートされていない分化培養が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）低温保存された、１０日目の、ｉＣＤ３４＋でソートされた細胞が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。
図２０Ａ～Ｂは、１０日目の分化培養を、ＨＥポテンシャルを喪失せずに、周囲温度で、一晩にわたり出荷しうることを示す図である。Ａ）７日目における培養を、インキュベーター内で維持する（対照）か、または一晩にわたる出荷のために処理した後、続くさらなる２日間にわたり、インキュベーターへと再導入したことを示す図である。次いで、１０日目における両方の培養を、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞の存在について解析した。一晩にわたり出荷された培養中に、Ｔ字型フラスコは、７０％の基礎培地を伴う３０％の培養培地、または１００％の培養培地を含有した。Ｂ）細胞数の計算について示す図である。 図２０Ａ～Ｂは、１０日目の分化培養を、ＨＥポテンシャルを喪失せずに、周囲温度で、一晩にわたり出荷しうることを示す図である。Ａ）７日目における培養を、インキュベーター内で維持する（対照）か、または一晩にわたる出荷のために処理した後、続くさらなる２日間にわたり、インキュベーターへと再導入したことを示す図である。次いで、１０日目における両方の培養を、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞の存在について解析した。一晩にわたり出荷された培養中に、Ｔ字型フラスコは、７０％の基礎培地を伴う３０％の培養培地、または１００％の培養培地を含有した。Ｂ）細胞数の計算について示す図である。
図２１Ａ～Ｃは、ＣＤ４５＋ ＣＤ５６－ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋ Ｔ細胞前駆体、および成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期Ｔ系統細胞マーカーが、ＣＤ３４＋／ＣＤ７＋により規定されるｉｐｒｏＴ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟Ｔ細胞マーカーが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞により規定される成熟Ｔ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＴ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＴ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。 図２１Ａ～Ｃは、ＣＤ４５＋ ＣＤ５６－ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋ Ｔ細胞前駆体、および成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期Ｔ系統細胞マーカーが、ＣＤ３４＋／ＣＤ７＋により規定されるｉｐｒｏＴ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟Ｔ細胞マーカーが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞により規定される成熟Ｔ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＴ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＴ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。
図２２Ａ～Ｃは、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ１６１＋ ＮＫ細胞前駆体、および成熟ＣＤ５６＋ ＣＤ１６＋ ＣＤ８＋ ＮＫ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ７およびＣＤ５６により規定されるｉｐｒｏＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ５７、ＣＤ１６、ＣＤ９４、およびＣＤ５６により規定される成熟ＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＮＫ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＮＫ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。 図２２Ａ～Ｃは、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ１６１＋ ＮＫ細胞前駆体、および成熟ＣＤ５６＋ ＣＤ１６＋ ＣＤ８＋ ＮＫ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ７およびＣＤ５６により規定されるｉｐｒｏＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ５７、ＣＤ１６、ＣＤ９４、およびＣＤ５６により規定される成熟ＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＮＫ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＮＫ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。 図２２Ａ～Ｃは、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ１６１＋ ＮＫ細胞前駆体、および成熟ＣＤ５６＋ ＣＤ１６＋ ＣＤ８＋ ＮＫ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ７およびＣＤ５６により規定されるｉｐｒｏＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ５７、ＣＤ１６、ＣＤ９４、およびＣＤ５６により規定される成熟ＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＮＫ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＮＫ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。
図２３Ａ～Ｃは、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームが、ＥＢの形成の間には見られない、スケーラブルな拡大戦略を可能とすることを示す図である。Ａ．ｈｉＰＳＣを凝集させて、胚様体を形成し、１４日間にわたり分化させてから、ＣＤ３４およびＣＤ４３の発現について解析した。Ｂ．ｈｉＰＳＣを、単層として播種し、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＸＣＲ４およびＣＤ７３について解析する前に、８日間にわたり分化させた。Ｃ．単層に介在される造血分化およびＥＢに介在される造血分化の両方について、経時的にＤ３４陽性細胞をカウントしプロットした。 図２３Ａ～Ｃは、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームが、ＥＢの形成の間には見られない、スケーラブルな拡大戦略を可能とすることを示す図である。Ａ．ｈｉＰＳＣを凝集させて、胚様体を形成し、１４日間にわたり分化させてから、ＣＤ３４およびＣＤ４３の発現について解析した。Ｂ．ｈｉＰＳＣを、単層として播種し、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＸＣＲ４およびＣＤ７３について解析する前に、８日間にわたり分化させた。Ｃ．単層に介在される造血分化およびＥＢに介在される造血分化の両方について、経時的にＤ３４陽性細胞をカウントしプロットした。 図２３Ａ～Ｃは、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームが、ＥＢの形成の間には見られない、スケーラブルな拡大戦略を可能とすることを示す図である。Ａ．ｈｉＰＳＣを凝集させて、胚様体を形成し、１４日間にわたり分化させてから、ＣＤ３４およびＣＤ４３の発現について解析した。Ｂ．ｈｉＰＳＣを、単層として播種し、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＸＣＲ４およびＣＤ７３について解析する前に、８日間にわたり分化させた。Ｃ．単層に介在される造血分化およびＥＢに介在される造血分化の両方について、経時的にＤ３４陽性細胞をカウントしプロットした。
図２４は、オフザシェルフ（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ）のｉＮＫ細胞およびｉＴ細胞を産生するための、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームによる、スケーラブルな拡大戦略についての概略図を示す図である。計算は、代表的な培養および最適化されていない培養についてのスナップショットに基づく。
図２５は、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性細胞が、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の生存の抑制により、免疫調節特性を有することを示す図である。
図２６は、ＣＤ４５＋ ＣＤ５６－ゲーティング戦略を使用して、ｈｉＰＳＣから導出された成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞サブセットを示す図である。
図２７は、フィーダーベースの懸濁培養が、ｉＣＤ３４由来のＮＫ細胞の成熟を支援することを示す図である。
図２８は、ｉＣＤ３４由来のｉＮＫが、末梢血ＮＫ細胞と同様の様式で、サイトカインの刺激に応答して、炎症促進性サイトカインを分泌しうることを示す図である。
図２９は、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使用して、臍帯血ＣＤ３４陽性細胞から導出されたｐｒｏ－ＮＫ細胞の間質フリー分化が、従来の間質ベースの分化プラットフォームより急速であることを示す図である。
図３０は、ｉＰＳＣ由来のｉＣＤ３４＋細胞の、ＮＫ細胞への間質フリー分化を示す図である。プレートに結合させたＤＬＬ４は、ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ１６１＋ ＮＫ細胞前駆体の分化は支援するが、ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞の分化は支援しない。
図３１は、ＵＣＢ ＣＤ３４＋細胞の、Ｔ細胞への間質フリー分化を示す図である。
図３２は、ｉＰＳＣ由来のｉＣＤ３４＋細胞の、Ｔ細胞への間質フリー分化を示す図である。
図３３は、ｈｉＰＳＣ由来のｉＣＤ３４＋細胞の生着を示す図である。
（発明の詳細な説明）
本発明は一般に、幹細胞を、二次造血細胞運命へと分化させるための方法および組成物
に関する。より特定すると、本発明は、発生の種々の段階において、二次造血性内皮から
、完全に分化した造血細胞であって、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＮＫ細胞を含
む造血細胞にわたる範囲の二次造血表現型を呈するように、ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来
の細胞を誘導しうる、多段階分化プラットフォームを提供する。すなわち、本発明は、細
胞が、二次造血運命、例えば、ＣＤ３４＋二次造血幹細胞を、より呈しやすくなるように
するための方法および組成物を提供する。代替的に、本発明の方法および組成物は、ＥＢ
または凝集物の形成を回避することにより、二次造血性内皮（ＨＥ）を、ナイーブｉＰＳ
Ｃから、スケーラブルな様式で発生させる。
Ａ．定義
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語
および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ
意味を有する。下記では、本発明の目的で、以下の用語について規定する。本明細書では
、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」という冠詞を、その冠詞の文法的
目的語のうちの１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）を指すのに用いる
。例として述べると、「ある要素」とは、１つの要素または１つを超える要素を意味する
。
代替辞（例えば、「または」）の使用は、代替物の一方、両方、またはこれらの任意の
組合せを意味すると理解されたい。
「および／または」という用語は、代替物の一方または両方を意味すると理解されたい
。
本明細書で用いられる「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値
、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、最大で１５％、
１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％変化する、数量
、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施
形態では、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、
百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さの、±１５％、±１０％、±９％、±８％
、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％となる、ある範囲の
数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
本明細書で使用される「実質的に」または「本質的に」という用語は、基準の数量、レ
ベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、約９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％
、またはそれ超の、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、ま
たは長さを指す。一実施形態では、「本質的に同じ」または「実質的に同じ」という用語
は、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲
であって、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、また
は長さとほぼ同じ範囲を指す。
本明細書で使用される「～を実質的に含まない」および「～を本質的に含まない」とい
う用語は、互換的に使用され、細胞集団または培養培地などの組成物について記載するの
に使用される場合、指定された物質もしくはその供給源を、９５％含まない、９６％含ま
ない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まないか、または従来の手段で測定す
る場合に検出不能である組成物など、指定された物質またはその供給源を含まない組成物
を指す。組成物中の、ある特定の成分または物質「を含まない」またはこれ「を本質的に
含まない」という用語はまた、このような成分または物質が、（１）組成物中に、いかな
る濃度でも含まれないか、または（２）組成物中に、機能的に不活性であるが、低濃度で
含まれることも意味する。同様の意味は、「～が存在しない」という用語にも適用される
が、特定の物質またはその供給源が、組成物において存在しないことを指す。
本明細書で使用される「感知可能な」という用語は、事象の数量、レベル、値、数、頻
度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲であって、１または複数の標準
的な方法により、たやすく検出可能な範囲を指す。「感知不可能な」および「感知可能で
ない」という用語およびこれらの同義語は、事象の数量、レベル、値、数、頻度、百分率
、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲であって、標準的な方法により、たやすく
検出可能でないか、または検出不能である範囲を指す。一実施形態では、事象は、５％、
４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％未満の回数で生じる場合
、感知可能でない。
本明細書を通して、文脈によりそうでないことが要請されない限り、「～を含む（ｃｏ
ｍｐｒｉｓｅ）」、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「～を含むこと」とい
う語は、言明されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含は示唆
するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は示唆
しないことが理解される。特定の実施形態では、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「～
を有する」、「～を含有する」、および「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語を
、同義に使用する。
「～からなること」とは、「～からなること」という語句に後続するあらゆる語句を含
み、かつ、これに限定されることを意味する。従って、「～からなること」という語句は
、列挙される要素が要請されるかまたは必須であり、他の要素は存在しえないことを指し
示す。
「～から本質的になること」とは、この語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ
、列挙される要素について、本開示で指定される活性または作用に干渉または寄与しない
、他の要素に限定されることを意味する。従って、「～から本質的になること」という語
句は、列挙される要素が要請されるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、
それらが列挙される要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在しても
よく、存在しなくてもよいことを示す。
本明細書を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連
する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「さらなる実施形態」、もしくは「さらなる
実施形態」、またはこれらの組合せに対する言及は、この実施形態との関連において記載
されている特定の特色、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に組み
入れられていることを意味する。従って、本明細書を通した、多様な箇所における、前出
の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定
の特色、構造、または特徴を、１または複数の実施形態において、任意の適切な形で組み
合わせることもできる。
「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は一般に、生体外の人工的な環境、好ましくは、天然条
件の変更を最小とする環境における生組織内または生組織上で行われる実験または測定な
ど、生体外でなされる活動を指す。特定の実施形態では、「ｅｘ ｖｉｖｏ」における手
順が、生体から採取され、通常は無菌条件下にある実験装置内で、典型的には、状況に応
じて、数時間または最長で約２４時間であるが、最長で４８もしくは７２時間またはそれ
超を含む時間にわたり培養された生細胞または生組織を伴う。ある特定の実施形態では、
このような組織または細胞を回収し、凍結させ、その後、ｅｘ ｖｉｖｏにおける処理の
ために融解させることができる。数日間より長くかかる組織培養の実験または手順であっ
て、生細胞または生組織を使用する実験または手順は、典型的には、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ
」であると考えられるが、ある特定の実施形態では、この用語を、ｅｘ ｖｉｖｏと互換
的に用いることができる。
「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は一般に、生体内でなされる活動を指す。
本明細書で使用される「中胚葉」という用語は、早期の胚発生の間に現れ、循環系、筋
肉、心臓、皮膚、骨格、ならびに他の支持組織および結合組織の血液細胞を含む、多様な
特化した細胞型を発生させる、３つの胚芽層のうちの１つを指す。
本明細書で使用される「二次（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ）造血性内皮」（ＨＥ）または「
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮」（ｉＨＥ）という用語は、内皮から造血への移行と
呼ばれる過程において、造血幹細胞および前駆細胞を発生させる、内皮のサブセットを指
す。胚内の造血細胞の発生は、側板中胚葉から、血管芽細胞を経て、二次造血性内皮およ
び造血前駆体へと、逐次的に進む。
本明細書で使用される「造血幹細胞」または「二次造血幹細胞」という用語は、Ｔ細胞
、ナチュラルキラー細胞、およびＢ細胞を含む、成熟骨髄性細胞型およびリンパ系細胞型
の両方を発生させることが可能なＣＤ３４＋幹細胞を指す。
本明細書で使用される「再プログラム化すること」、または「脱分化」、または「細胞
能力を増大させること」、または「発生能を増大させること」という用語は、細胞の能力
を増大させること、または細胞を低分化状態へと脱分化させる方法を指す。例えば、細胞
能力を増大させた細胞は、再プログラム化されていない状態にある同じ細胞と比較して、
発生可塑性が大きい（すなわち、より多くの細胞型へと分化しうる）。言い換えれば、再
プログラム化された細胞とは、再プログラム化されていない状態にある同じ細胞より低分
化状態にある細胞である。
本明細書で使用される「分化」という用語は、特化していない（「コミットしていない
」）細胞または低特化細胞が、例えば、血液細胞または筋肉細胞など、特化した細胞の特
色を獲得する工程である。分化細胞または分化誘導細胞とは、細胞の系統内で、より特化
した（「コミットした」）位置を占める細胞である。分化過程へと適用される場合の「コ
ミットした」という用語は、分化経路において、正常な状況下では、特異的細胞型または
細胞型のサブセットへと引き続き分化し、かつ、正常な状況下では、異なる細胞型へと分
化することも、低分化細胞型へと戻ることもありえない点まで進んだ細胞を指す。
本明細書で使用される「分化マーカー遺伝子」または「分化遺伝子」という用語は、そ
の発現が、多能性細胞など、細胞内で生じる細胞の分化を示す遺伝子を指す。分化マーカ
ー遺伝子は、以下の遺伝子：ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ
、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣ
Ｒ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、
ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４
、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、Ｍ
ＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、
ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮ
ＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、Ｌ
ＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａ
ｃｈｙｕｒｙ）、ＺＩＣ１、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡ
Ｃ７、ＨＤＡＣ９、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ４、ＰＡＸ５、ＲＢＰＪ、
ＲＵＮＸ１、ＳＴＡＴ１、およびＳＴＡＴ３を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「分化マーカーの遺伝子プロファイル」、または「分化遺伝子プ
ロファイル」、「分化遺伝子の発現プロファイル」、「分化遺伝子の発現シグネチャー」
、「分化遺伝子の発現パネル」、「分化遺伝子パネル」、または「分化遺伝子シグネチャ
ー」という用語は、複数の分化マーカー遺伝子の発現または発現レベルを指す。
本明細書で使用される「能力」という用語は、細胞にアクセス可能な、全ての発生選択
肢の総体（すなわち、発生能）を指す。細胞能力の連続体（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）は、全
能性細胞、多能性細胞、複能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、および最終分化細胞を含
むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、身体また
は体細胞（すなわち、胚本体）の全ての系統を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚性
幹細胞とは、３つの胚芽層である、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の各々から、細胞を形
成することが可能な、多能性幹細胞の種類である。多能性とは、完全な生体を発生させる
ことが不可能である、不完全または部分的な多能性細胞（例えば、胚盤葉上層幹細胞また
はＥｐｉＳＣ）から、完全な生体を発生させることが可能な、より始原性で、より多能性
の細胞（例えば、胚性幹細胞）にわたる範囲の、発生能の連続体である。
本明細書で使用される「人工（ｉｎｄｕｃｅｄ）多能性幹細胞」またはｉＰＳＣという
用語は、幹細胞が、分化した成体細胞、新生児細胞、または胎児細胞であって、３つの胚
芽層（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒまたはｄｅｒｍａｌ ｌａｙｅｒ）：中胚葉、内胚葉、およ
び外胚葉全ての組織へと分化することが可能な細胞へと誘導されるか、または変化した、
すなわち、再プログラム化された細胞から作製されることを意味する。作製されたｉＰＳ
Ｃとは、天然で見出される細胞を指さない。
本明細書で使用される「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊による、天然
に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は、多能性であり、発生の間に、３つの主要
な胚芽層：外胚葉、内胚葉、および中胚葉の全ての派生物を発生させる。胚性幹細胞は、
胚体外膜または胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。
本明細書で使用される「複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、１
または複数の胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）の細胞へと分化する発生ポテンシャ
ルを有するが、３つ全ての細胞へと分化する発生ポテンシャルは有さない細胞を指す。従
って、複能性細胞はまた、「部分的に分化した細胞」とも称することができる。複能性細
胞は、当技術分野で周知であり、複能性細胞の例は、例えば、造血幹細胞および神経幹細
胞など、成体幹細胞を含む。「複能性」とは、細胞が、所与の系統内の、多くの種類の細
胞を形成しうるが、他の系統の細胞は形成しえないことを指し示す。例えば、複能性造血
細胞は、多くの異なる種類の血液細胞（赤血球、白血球、血小板など）を形成しうるが、
ニューロンは形成しえない。従って、「複能性」という用語は、発生ポテンシャルの程度
が、全能性および多能性より低度な細胞の状態を指す。
多能性幹細胞の分化は、培養培地中の刺激剤または細胞の物理的状態の変化など、培養
系の変化を要請する。従来の戦略の大半は、胚葉体（ＥＢ）の形成を、系統特異的分化を
誘発する、一般的かつ極めて重要な中間体として活用する。ＥＢとは、それらの三次元的
領域内で、多数の系統を発生させるので、胚発生を模倣することが示されている三次元ク
ラスターである。典型的には、数時間～数日間の分化過程を通して、単純ＥＢ（例えば、
分化するように誘発された凝集多能性幹細胞）は、成熟し続け、嚢胞性ＥＢへと発生し、
この時点で、分化し続けるように、典型的に、数日間～数週間にわたり、これらをさらに
処理する。ＥＢの形成は、多能性幹細胞を、細胞の三次元的多層クラスター内で、互いと
近接させることにより誘発するが、これは、液滴内に多能性細胞を沈降させること、細胞
を「Ｕ」字型底ウェル－プレートへと沈降させることを含むいくつかの方法のうちの１つ
、または機械的撹拌により達成することが典型的である。多能性培養物維持培地中で維持
された凝集物は、適正なＥＢを形成しないので、ＥＢの発生を促進するために、多能性幹
細胞凝集物は、さらなる分化キューを要請する。従って、多能性幹細胞凝集物は、えり抜
きの系統への誘発キューをもたらす、分化培地へと移すことが必要である。多能性幹細胞
の、ＥＢベースの培養物は、ＥＢ細胞クラスター内の増殖がわずかである分化細胞集団（
外胚葉、中胚葉、および内胚葉）の発生を結果としてもたらすことが典型的である。細胞
の分化を容易とすることは実証されているが、三次元構造にある細胞の、環境からの分化
キューに対する曝露が一貫せず、分化状態が可変性であるため、ＥＢは、異質性の細胞を
発生させる。加えて、ＥＢは、創出および維持が煩瑣である。さらに、ＥＢを介する細胞
の分化に伴う細胞の拡大はわずかであるが、これもまた、低分化効率に寄与する。
これに対して、「ＥＢの形成」とは顕著に異なる「凝集物の形成」を使用して、多能性
幹細胞の分化を誘導し、かつ／または多能性幹細胞由来の細胞の集団を拡大することがで
きる。例えば、凝集物ベースの多能性幹細胞の拡大では、増殖および多能性を維持するよ
うに、培養培地を選択する。細胞の増殖は一般に、凝集物のサイズを増大させ、大型の凝
集物を形成するが、これらの凝集物は慣用的に、小型の凝集物へと、機械的または酵素的
に解離させて、培養物中の細胞増殖を維持し、細胞数を増大させることができる。ＥＢ培
養物と顕著に異なり、維持培養物中の凝集物内で培養された細胞は、多能性のマーカーを
維持する。
本明細書で使用される「単層分化」とは、細胞の三次元多層クラスター、すなわち、「
ＥＢの形成」を介する分化と顕著に異なる分化法を指す用語である。本明細書で開示され
る他の利点の中でも、単層分化は、分化を誘発するためのＥＢの形成に対する必要を回避
する。単層培養は、ＥＢの形成など、胚発生を模倣しないため、特異的系統への分化は、
ＥＢにおける３つの胚葉全てへの分化と比較して、最小限である。
多能性は部分的に、細胞の多能性特徴について評価することにより決定することができ
る。多能性特徴は、（ｉ）多能性幹細胞形態；（ｉｉ）無際限の自己再生のポテンシャル
；（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスに限る）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６
０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、Ｃ
Ｄ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９
０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０および／またはＣＤ５０を
含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現；（ｉｖ）３つの体系統細胞（
外胚葉、中胚葉、および内胚葉）全てへと分化する能力；（ｖ）３つの体系統細胞からな
る奇形腫形成；ならびに（ｖｉ）３つの体系統細胞に由来する細胞からなる胚葉体の形成
を含むがこれらに限定されない。
多能性の２つの種類：後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）と類似する、多能
性の「プライミング」状態または「準安定」状態、および早期／植込み前胚盤胞の内部細
胞塊と類似する、多能性の「ナイーブ」状態または「基底」状態については、既に記載さ
れている。いずれの多能性状態も、上記で記載した特徴を呈示するが、ナイーブ状態また
は基底状態は、（ｉ）雌性細胞内のＸ染色体の前不活化または再活性化；（ｉｉ）単一細
胞の培養の間における、クローン性および生存の改善；（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化のグロ
ーバルな低減；（ｉｖ）発生調節性遺伝子プロモーター上の、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抑制性ク
ロマチンマークの沈着の低減；ならびに（ｖ）プライミング状態の多能性細胞と比べた、
分化マーカーの発現の低減をさらに呈示する。細胞を再プログラム化する標準的な方法で
あって、外因性の多能性遺伝子を、体細胞へと導入し、発現させ、次いで、結果として得
られる多能性細胞からサイレンシングまたは除去する方法は一般に、多能性のプライミン
グ状態の特徴を有することが見られる。標準的な多能性細胞培養条件下では、基底状態の
特徴が観察される、外因性トランス遺伝子の発現を維持しない限り、このような細胞は依
然として、プライミング状態にある。
本明細書で使用される「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態
特色を指す。通常の胚性幹細胞形態は、球状で、かつ、小型であり、核対細胞質比が大き
く、核小体の存在が注目すべきであり、典型的な細胞間間隔を伴うことにより特徴付けら
れる。
本明細書で使用される「フィーダー細胞」または「フィーダー」とは、フィーダー細胞
は、第２の細胞型を支援するための増殖因子および栄養物を供給するので、第２の種類の
細胞と同時培養される、１つの種類の細胞であって、第２の種類の細胞が増殖しうる環境
を用意する細胞について記載する用語である。フィーダー細胞は、任意選択で、それらが
支援する細胞と異なる種に由来する。例えば、幹細胞を含むヒト細胞のある特定の種類は
、マウス胚性線維芽細胞、または不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養物により支援す
ることができる。フィーダー細胞は典型的に、他の細胞と共に同時培養する場合、それら
が支援している細胞を、それらが凌駕することを防止するように、照射またはマイトマイ
シンなどの抗有糸***剤による処理により不活化することができる。フィーダー細胞は、
内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞または線維芽細胞）、および白血病性細胞を含み
うる。前出を限定せずに述べると、１つの特異的フィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細
胞などのヒトフィーダーでありうる。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（
ＭＥＦ）でありうる。一般に、多様なフィーダー細胞を使用して、多能性を部分的に維持
し、ある特定の系統への分化を方向付け、エフェクター細胞など、特化した細胞型への成
熟を促進することができる。
本明細書で使用された、「フィーダーフリー」（ＦＦ）環境は、培養条件、細胞培養物
、または培養培地などの環境であって、フィーダー細胞もしくは間質細胞を本質的に含ま
ず、かつ／またはフィーダー細胞の培養によりあらかじめ馴化されていない環境を指す。
「あらかじめ馴化された」培地とは、フィーダー細胞を、培地中で、少なくとも１日間な
ど、ある期間にわたり培養した後で収集された培地を指す。あらかじめ馴化された培地は
、培地中で培養されるフィーダー細胞により分泌される増殖因子およびサイトカインを含
む、多くのメディエーター物質を含有する。
本明細書で使用される「対象」という用語は、任意の動物、好ましくは、ヒト患者、家
畜、または他の飼育動物を指す。
「多能性因子」または「再プログラム化因子」とは、単独で、または他の薬剤と組み合
わせて、細胞の発生能を増大させることが可能な薬剤を指す。多能性因子は、限定せずに
述べると、細胞の発生能を増大させることが可能な、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、
および低分子を含む。例示的な多能性因子は、例えば、転写因子および低分子の再プログ
ラム化剤を含む。
「～に接着する」とは、容器に付着する細胞、例えば、適切な培養培地の存在下で、無
菌のプラスチック製（またはコーティングされたプラスチック製）の細胞培養ディッシュ
またはフラスコに付着する細胞を指す。ある特定のクラスの細胞は、細胞培養容器に接着
しない限り、培養物中で存続または増殖（ｇｒｏｗ）しない。ある特定のクラスの細胞（
「非接着性細胞」）は、接着せずに、培養物中で維持され、かつ／または増殖（ｐｒｏｌ
ｉｆｅｒａｔｅ）する。
「培養」または「細胞培養」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境における、細胞の維持、増殖
（ｇｒｏｗｔｈ）、および／または分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（各場
合において、単一の「培地」）、「サプリメント」、および「培地サプリメント」とは、
細胞培養物を培養する栄養組成物を指す。
「～を培養する」、または「～を維持する」とは、組織外または体外、例えば、無菌の
プラスチック製（またはコーティングされたプラスチック製）の細胞培養ディッシュ内ま
たはフラスコ内において、細胞を存続、繁殖（増殖）、および／または分化させることを
指す。「培養」または「～を維持すること」は、培養培地を、栄養物、ホルモン、および
／または細胞を繁殖および／または存続させるのに一助となる他の因子の供給源として活
用しうる。
本明細書で使用された、「解離」細胞とは、他の細胞または表面（例えば、培養プレー
ト表面）から、実質的に分離または精製された細胞を指す。例えば、細胞は、機械的方法
または酵素的方法により、動物または組織から解離させることができる。代替的に、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいて凝集する細胞は、クラスター、単一細胞、または単一細胞とクラス
ターとの混合物による懸濁液への解離などにより、酵素的または機械的に、互いから解離
させることができる。さらに別の代替的な実施形態では、接着性細胞を、培養プレートま
たは他の表面から解離させる。従って、解離は、細胞の、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）
および基質（例えば、培養物表面）との相互作用の破壊、または細胞間のＥＣＭの破壊を
伴いうる。
Ｂ．概観
本発明は一般に、ナイーブ多能性細胞を、中胚葉細胞、二次造血性内皮、二次造血幹も
しくは二次造血前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、複能性前駆体（ＭＰＰ）（好中球前駆体を含
む骨髄性細胞へと分化することが可能である）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体を含む、
非多能性細胞または部分的に分化した細胞；あるいは、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ
細胞、またはＮＫ細胞など、完全に分化した最終造血細胞へと分化させる多段階工程に関
する。本発明はまた、開示される方法で使用される組成物；および開示される方法を使用
して発生させた細胞集団、細胞株、またはクローン細胞にも関する。
当技術分野で使用される方法とは対照的に、本発明は、ｉＰＳＣの分化におけるＥＢの
形成を回避した。提示される通り、ｉＰＳＣから導出される造血系細胞は、クローンｉＰ
ＳＣ細胞を、ＴＧＦβフリーの培養培地に播種して、それらの多能性の基底状態またはナ
イーブ状態を維持し、クローンｉＰＳＣ細胞を、ＥＢの形成を伴わない単層フォーマット
で分化させ、段階的戦略を活用して、低分子の化学物質、増殖因子、およびサイトカイン
の適正な組合せを、分化の早期段階および中期段階に適用することにより得た。従って、
本発明は、ｉＰＳＣからのＥＢの形成を要請しない即時の分化のために、拡大されたクロ
ーンｉＰＳＣの、単層の形態にある接着培養物への直接的移行を可能とする。
従って、本発明は、ＳＢ４３１５３２を含む、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を使用せ
ずに、幹細胞を、二次造血細胞および機能的な造血系細胞へと、高効率で分化させること
を可能とする培養プラットフォームを提供する。なおさらに、既往の研究と異なり、本発
明はまた、ｉＰＳＣに由来する、ＥＢまたは凝集中間体への必要を伴わずに、単層培養物
中の、ｉＰＳＣの直接的分化を支援する、フィーダーフリーの無血清条件を使用する培養
プラットフォームも提供する。
Ｃ．培養プラットフォーム
多能性細胞を培養するための既存の方法は、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞で
あらかじめ馴化され、ウシ胎仔血清を含有する培地に大きく依存するが、このような環境
は、臨床使用および治療における使用のための細胞を作製するのに適さない場合がある。
例えば、動物成分への曝露は、免疫拒絶の重大な危険性、および識別されていない病原体
を、処置される患者へと伝染させる重大な危険性を提示する可能性があり、動物レトロウ
イルスを潜在的に再活性化させうるため、このような異種夾雑環境で培養された細胞は一
般に、ヒトへの細胞移植に適さないと考えられる。本明細書で想定されるフィーダーフリ
ー環境など、動物フリーの培養培地を使用する培養系は、臨床的グレードの細胞株、特に
、ｈＥＳＣ、ｈｉＰＳＣ、および多能性幹細胞由来のＨＳＣ、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、ＮＫ
Ｔ細胞株、またはＮＫ細胞株の製造を容易とする。
特定の実施形態では、フィーダーフリー環境は、ヒトフィーダー細胞を本質的に含まず
、限定せずに述べると、マウス胚性線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、角化細胞、および胚性
幹細胞を含むフィーダー細胞であらかじめ馴化されていない。フィーダーフリーの細胞培
養培地は、多能性細胞の培養、細胞の再プログラム化、単一細胞の培養、解離、および多
能性細胞の継代培養、多能性細胞の細胞ソート、基底状態の多能性細胞の発生、基底状態
の多能性の維持、多能性細胞の分化の誘導における使用に適する。特定の実施形態では、
フィーダーフリー環境を使用して、多能性を誘導し、再プログラム化の効率を改善し、細
胞の能力を増大させるかもしくは維持し、かつ／または分化を誘導する。ある特定の実施
形態では、フィーダーフリー環境は加えて、サイトカインおよびｂＦＧＦを含む増殖因子
も実質的に含まない。
本発明の一部の態様では、上記で記載したｉＰＳＣ分化の段階のうちの１または複数は
、フィーダーフリー条件下で実行することができる。このようなフィーダーフリー条件は
、単層培養および懸濁培養を含むがこれらに限定されない形態でありうる。本発明の一実
施形態では、多能性細胞の、中胚葉細胞への分化は、単層フィーダーフリー条件下で実行
する。本発明の別の実施形態では、中胚葉細胞の、二次造血性内皮への分化は、単層フィ
ーダーフリー条件下で実行する。さらに本発明の別の実施形態では、二次造血性内皮の、
造血幹細胞への分化は、単層フィーダーフリー条件下で実行する。本発明の一実施形態で
は、二次造血幹細胞の、複能性前駆体、Ｔ細胞前駆体、またはＮＫ細胞前駆体への分化は
、懸濁フィーダーフリー条件下または単層フィーダーフリー条件下に続く、懸濁フィーダ
ーフリー条件下で実行する。本発明の別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体の、完全に分化し
たＴ細胞への分化、またはＮＫ細胞前駆体の、完全に分化したＮＫ細胞への分化は、懸濁
フィーダーフリー条件下または単層フィーダーフリー条件下に続く、懸濁フィーダーフリ
ー条件下で実行する。
任意の適する容器または細胞培養コンテナを、基礎培地中および／または細胞培養サプ
リメント中の細胞培養物のための支持体として使用することができる。しかし、一部の実
施形態では、培養容器の表面を、接着促進性マトリックス／基質（例えば、コラーゲン、
フィブロネクチン、ＲＧＤ含有ポリペプチド、ゼラチンなど）でコーティングすることに
より、細胞の付着を促進し、特定の実施形態では、本明細書で開示される、細胞培養培地
およびサプリメントの効果を増強することができる。当技術分野では、細胞を培養および
継代培養するのに適する基質が公知であり、限定せずに述べると、ビトロネクチン、ゼラ
チン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、トロ
ンボスポンジン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）など、天然に存在する細胞株により産生され
るマトリックスと、ポリアミン単層およびカルボキシ末端化単層など、合成または人工の
表面との混合物を含む。一部の実施形態では、フィーダーフリー条件の準備は、マトリッ
クスでコーティングした表面上の細胞の培養を含む。一実施形態では、本明細書で想定さ
れる培養プラットフォームは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはビトロネクチンを含むマ
トリックス／基質を含む。培養物についての一部の実施形態では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商
標）を使用し、従って、培養物は、完全に組成既知である。
本発明の一部の態様では、上記で記載した分化段階のうちの１または複数は、無血清条
件下で実行することができる。細胞の付着および／または誘導に適する、市販の無血清培
地の例は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａ
ｎａｄａ）製のｍＴｅＳＲ（商標）１またはＴｅＳＲ（商標）２、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ（
Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）製のＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）製のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ製のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭ、およびＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅ
ｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＸ－ＶＩＶＯ（商標）を含む。
さらなる実施形態では、培養プラットフォームの培地のうちの１または複数は、フィー
ダーフリー環境であり、任意選択で、サイトカインおよび／または増殖因子を実質的に含
まない。他の実施形態では、細胞培養培地は、血清、抽出物、増殖因子、ホルモン、サイ
トカインなどのサプリメントを含有する。一般に、培養プラットフォームは、段階特異的
な、フィーダーフリーの無血清培地のうちの１または複数を含むが、これらの各々は、以
下：栄養物／抽出物、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、および培地添加剤のうちの１
または複数をさらに含む。適切な栄養物／抽出物は、例えば、多くの異なる哺乳動物細胞
の増殖を支援するために広く使用される基礎培地である、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉ
ｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）；ＫＯＳＲ（ノックアウト血清置換）；Ｌ－グルタミン；ＮＥＡ
Ａ（非必須アミノ酸）を含みうる。他の培地添加剤は、ＭＴＧ、ＩＴＳ、βＭＥ、抗酸化
剤（例えば、アスコルビン酸）を含みうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では
、本発明の培養培地は、以下のサイトカインまたは増殖因子：上皮増殖因子（ＥＧＦ）、
酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血病
阻害因子（ＬＩＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１
）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因
子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β
）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン
、多様なインターロイキン（ＩＬ－１～ＩＬ－１８など）、多様なコロニー刺激因子（顆
粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）など）、多様なインターフェロ
ン（ＩＦＮ－γなど）、ならびに幹細胞因子（ＳＣＦ）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ
）など、幹細胞に対して効果を及ぼす他のサイトカインのうちの１または複数を含む。こ
れらのサイトカインは、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍ
ｉｎｎ）製の市販品を得ることができ、天然の場合もあり、組換えの場合もある。他の一
部の実施形態では、本発明の培養培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）、インスリン様
増殖因子１（ＩＧＦ－１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖
因子（ＶＥＧＦ）、造血増殖因子（例えば、ＳＣＦ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＥＰＯ、Ｉ
Ｌ３、ＴＰＯ、ＥＰＯ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）；およ
び白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１１、ＩＬ１５に由来する
、１または複数のサイトカインのうちの１または複数を含む。一部の実施形態では、増殖
因子／マイトジェンおよびサイトカインは、経験的に、または確立されたサイトカイン技
術分野により誘導される通りに決定される濃度において、段階特異的および／または細胞
型特異的である。
一般に、人工多能性細胞を分化させるための技法は、特異的細胞経路の、直接的または
間接的なモジュレーションであって、ポリヌクレオチドベースの手法、ポリペプチドベー
スの手法、および／または低分子ベースの手法を使用するモジュレーションを伴う。細胞
の発生能は、例えば、細胞を、１または複数のモジュレーターと接触させることにより、
モジュレートすることができる。本明細書で使用される「～を接触させること」は、１ま
たは複数の因子（例えば、低分子、タンパク質、ペプチドなど）の存在下で細胞を培養す
ることを伴いうる。一部の実施形態では、細胞を、１または複数の薬剤と接触させて、細
胞の分化を誘導する。このような接触は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける培養の間に
、１または複数の薬剤を、細胞へと導入することにより行うことができる。従って、接触
は、１または複数の薬剤を、栄養細胞培養培地中の細胞へと導入することにより行うこと
ができる。細胞は、１または複数の薬剤を含む培養培地中で、細胞が所望の分化表現型を
達成するのに十分な時間にわたり維持することができる。他の一部の実施形態では、「接
触」は、ベクターを介して、１または複数の因子を、細胞へと導入する場合に生じる。一
部の実施形態では、１または複数のベクターを、レトロウイルス、センダイウイルス、お
よびアデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを伴うベクター系、また
はｍＲＮＡにより導入する。
他の実施形態では、本明細書で開示される培養プラットフォームの、段階特異的な、フ
ィーダーフリーの無血清培地のうちの１または複数はさらに、１または複数の低分子を含
む。一部の実施形態では、培養プラットフォームは、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、
Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む細胞培養培地を含み、ＴＧＦβ受容体またはＡ
ＬＫ５の阻害剤に限定されないがこれらを含めた、ＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経
路の低分子阻害剤から構成されないか、または含まない。
本明細書で想定される培養プラットフォームはまた、自発性の分化を低減し、かつ／ま
たは基底状態の多能性を達成した、業務グレードまたは臨床グレードの多能性細胞の均質
な集団を活用することにより、多数の利点ももたらす。一実施形態では、均質なｉＰＳＣ
を、ＧＳＫ－３阻害剤と、ＭＥＫ阻害剤と、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤とを含む
組成物中に維持するが、組成物は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない。本明細書
で使用される「均質な」という用語は、細胞の集団であって、各細胞が、集団内の他の細
胞と同じであるか、または実質的に同じである集団を指す。一実施形態では、細胞は、各
細胞が、本明細書で想定される、同じ多能性マーカー、例えば、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ
１－８１のうちの１または複数を発現する場合に、集団内の他の細胞と同じである。一実
施形態では、集団は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なく
とも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ超の細胞が、集団内の他
の細胞と同じであるか、または実質的に同じである場合に、均質である。
様々な実施形態では、本明細書の二次造血性内皮を介して、造血系統細胞を発生させる
ための、培養プラットフォームの細胞培養培地は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤
およびＡＬＫ５阻害剤を含む、ＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の阻害剤を含まな
いか、またはこれを本質的に含まない。一実施形態では、培養プラットフォームは、ナイ
ーブｈｉＰＳＣを維持するための培地であって、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およ
びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地の播種を含む。いかなる特定の理論に束
縛されることも望まないが、本発明者らは、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤が、再プログラ
ム化の効率は増大させるが、多能性細胞集団の長期にわたる維持、品質、および均質性に
は反することを発見した。すなわち、ＴＧＦβ経路シグナル伝達の阻害は、細胞の再プロ
グラム化の効率を改善したが、この阻害の解除は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養系、特に、フ
ィーダー細胞フリーで、単一細胞の、酵素的継代培養を使用する系であって、自発性の分
化を低減し、「基底」多能性状態または「ナイーブ」多能性状態にとどまる、均質な多能
性集団が好ましい系内の、多能性細胞集団の、その後の維持に寄与する。本明細書で使用
される「長期」という用語であって、継代培養の数に限定されないが、これにより測定さ
れる「長期」という用語は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４
５、５０代、またはそれ超の継代培養を意味することが多い。規定される通り、「継代培
養」とは、細胞が、所望の程度まで増殖したら、細胞を、複数の細胞培養表面または細胞
培養容器へと分け、播種する行為を指す。加えて、準安定性の多能性細胞を、本明細書で
開示される、ＧＳＫ３阻害剤と、ＭＥＫ阻害剤と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む
が、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まない培地中で培養することにより、自発性の分化
の低減を達成し、かつ／または基底状態の多能性を達成するように、多能性細胞を移行さ
せる。
ｉＰＳＣの、基底状態の多能性またはナイーブ型の多能性を達成することはまた、ＥＢ
中間体を形成せずに、ｉＰＳＣを分化させることにより、造血系細胞を得るのにも重要で
ある。加えて、ナイーブｉＰＳＣの、二次ＨＥへの分化の効率はまた、ＥＢおよびその凝
集物を形成しない単層培養の使用にも、大きく影響される。一部の実施形態では、培養プ
ラットフォームは、ＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、
またはこれらを本質的に含まない培地を含む。他の一部の実施形態では、培養プラットフ
ォームは、ＧＳＫ３阻害剤を含む培地を含むが、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まず、
この培地は、本明細書で提示される培養プラットフォームを使用して、二次ＨＥおよび／
または二次ＨＳＣ細胞の発生を促進する。
１．ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤
ＴＧＦβ受容体（例えば、ＡＬＫ５）阻害剤は、ＴＧＦβ受容体（例えば、ＡＬＫ５）
に対する抗体、これらのドミナントネガティブの変異体、およびこれらの発現を抑制する
アンチセンス核酸を含みうる。例示的なＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ４３１５
４２（例えば、Inmanら、Molecular Pharmacology、６２巻（１号）：６５～７４頁（２
００２年）を参照されたい）；３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４
－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミドとしてもまた公知のＡ
－８３－０１（例えば、Tojoら、Cancer Science、９６巻（１１号）：７９１～８００
頁（２００５年）を参照されたい；例えば、Ｔｏｉｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから
市販されている）；２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－
４－イル）－１，５－ナフチリジン；Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（例えば、参照により本明細書
に組み込まれる、Daltonら、ＷＯ２００８／０９４５９７を参照されたい）；ＧＷ７８８
３８８（－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］ピリジ
ン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド）（例え
ば、Gellibertら、Journal of Medicinal Chemistry、４９巻（７号）：２２１０～２
２２１頁（２００６年）を参照されたい）；ＳＭ１６（例えば、Suzukiら、Cancer Rese
arch、６７巻（５号）：２３５１～２３５９頁（２００７年）を参照されたい）；ＩＮ－
１１３０（３－（（５－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（キノキサリン－６－
イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）ベンズアミド）（例えば、Kimら、Xen
obiotica、３８巻（３号）：３２５～３３９頁（２００８年）を参照されたい）；ＧＷ６
６０４（２－フェニル－４－（３－ピリジン－２－イル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）
ピリジン）（例えば、de Gouvilleら、Drug News Perspective、１９巻（２号）：８
５～９０頁（２００６年）を参照されたい）；ＳＢ－５０５１２４（２－（５－ベンゾ［
１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イ
ル）－６－メチルピリジン塩酸塩）（例えば、DaCostaら、Molecular Pharmacology、６
５巻（３号）：７４４～７５２頁（２００４年）を参照されたい）；およびピリミジン誘
導体（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Stieflら、ＷＯ２００８／００６５
８３において列挙されているピリミジン誘導体を参照されたい）を含むがこれらに限定さ
れない。さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包摂することを意図
しないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、例えば、ＳＢ－４３１５４２（例えば、Inmanら、J.
Mol. Pharmacol.、６２巻（１号）：６５～７４頁（２００２年）を参照されたい）な
ど、ＡＬＫ５に加えて、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７も阻害する阻害剤を包摂するこ
とを理解されたい。本発明の範囲を限定することを意図せずに述べると、ＡＬＫ５阻害剤
は、間葉から上皮への転換／移行（ＭＥＴ）過程に影響を与えることが考えられる。ＴＧ
Ｆβ／アクチビン経路は、上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）の駆動因子である。従って、
ＴＧＦβ／アクチビン経路を阻害することにより、ＭＥＴ（すなわち、再プログラム化）
過程を促進することができる。
ＡＬＫ５の阻害の効果を示すデータを考慮すると、ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害は
、同様のＡＬＫ５阻害の効果を及ぼすことが考えられる。従って、ＴＧＦβ／アクチビン
経路の任意の阻害剤（例えば、上流または下流の）を、本明細書の各段落で記載される通
り、ＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて使用することもでき、これらの代わりに使用すること
もできる。例示的なＴＧＦβ／アクチビン経路阻害剤は、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＳＭＡ
Ｄ２／３のリン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤、なら
びにＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストを含むがこれらに限定されな
い。なおさらに、下記で記載される類別化は、構成上の目的でなされるものであり、当業
者は、化合物が、経路内の１または複数の地点に影響を与える可能性があり、従って、化
合物が、規定された類別のうちの１つを超える類別において機能しうることを知るであろ
う。
ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤は、ＴＧＦβ受容体に対する抗体、そのドミナン
トネガティブの変異体、およびそれをターゲティングするｓｉＲＮＡまたはアンチセンス
核酸を含みうる。ＴＧＦβ受容体阻害剤の具体例は、ＳＵ５４１６；２－（５－ベンゾ［
１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イ
ル）－６－メチルピリジン塩酸塩（ＳＢ－５０５１２４）；レルデリムマブ（lerdelimum
b）（ＣＡＴ－１５２）；メテリムマブ（ＣＡＴ－１９２）；ＧＣ－１００８；ＩＤ１１
；ＡＰ－１２００９；ＡＰ－１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３
６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ－５０５１２４；ＳＢ－４３１５４２；ＳＤ－２
０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ－３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ－２０３５８０；ＳＤ－０
９３；Ｇｌｅｅｖｅｃ；３，５，７，２’，４’－ペンタヒドロキシフラボン（Ｍｏｒｉ
ｎ）；アクチビン－Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２－Ｆｃ；およびＴＧＦβ受容
体をターゲティングするアンチセンストランスフェクトされた腫瘍細胞（例えば、Wrzesi
nskiら、Clinical Cancer Research、１３巻（１８号）：５２６２～５２７０頁（２０
０７年）；Kaminskaら、Acta Biochimica Polonica、５２巻（２号）：３２９～３３７
頁（２００５年）；およびChangら、Frontiers in Bioscience、１２巻：４３９３～４
４０１頁（２００７年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
ＳＭＡＤ２／３のリン酸化の阻害剤は、ＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３に対する抗体、こ
れらのドミナントネガティブの変異体、およびこれらをターゲティングするアンチセンス
核酸を含みうる。阻害剤の具体例は、ＰＤ１６９３１６；ＳＢ２０３５８０；ＳＢ－４３
１５４２；ＬＹ３６４９４７；Ａ７７－０１；および３，５，７，２’，４’－ペンタヒ
ドロキシフラボン（Ｍｏｒｉｎ）（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Wrzesi
nski、前出；Kaminska、前出；Shimanukiら、Oncogene、２６巻：３３１１～３３２０頁
（２００７年）；およびKataokaら、ＥＰ１９９２３６０を参照されたい）を含む。
ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤は、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３および
／またはｓｍａｄ４に対する抗体、これらのドミナントネガティブの変異体、およびこれ
らをターゲティングするアンチセンス核酸を含みうる。ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との
相互作用の阻害剤の具体例は、Ｔｒｘ－ＳＡＲＡ、Ｔｒｘ－ｘＦｏｘＨ１ｂ、およびＴｒ
ｘ－Ｌｅｆ１（例えば、Cuiら、Oncogene、２４巻：３８６４～３８７４頁（２００５年
）；およびZhaoら、Molecular Biology of the Cell、１７巻：３８１９～３８３１
頁（２００６年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
ＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストは、ＳＭＡＤ６またはＳＭＡＤ
７に対する抗体、これらのドミナントネガティブの変異体、およびこれらをターゲティン
グするアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。阻害剤の具体例は、Ｓｍａｄ７
（ＰＴＯオリゴヌクレオチドとしての）（例えば、それらのいずれもが参照により本明細
書に組み込まれる、Ｍｉｙａｚｏｎｏら、ＵＳ６５３４４７６、およびＳｔｅｉｎｂｒｅ
ｃｈｅｒら、ＵＳ２００５１１９２０３を参照されたい）を含むがこれらに限定されない
。
２．Ｗｎｔ経路アゴニスト
本明細書で使用される「Ｗｎｔシグナル促進剤」、「Ｗｎｔ経路活性化因子」、「Ｗｎ
ｔ経路活性化剤」、または「Ｗｎｔ経路アゴニスト」という用語は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２
、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎ
ｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎ
ｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、およびＷ
ｎｔ１６のうちの１または複数のアゴニストを含むがこれらに限定されない、Ｗｎｔシグ
ナル伝達経路のアゴニストを指す。Ｗｎｔ経路アゴニストはさらに、以下のポリペプチド
またはそれらの断片：Ｄｋｋポリペプチド、Ｃｒｅｓｃｅｎｔポリペプチド、Ｃｅｒｂｅ
ｒｕｓポリペプチド、Ａｘｉｎポリペプチド、Ｆｒｚｂポリペプチド、Ｔ細胞因子ポリペ
プチド、またはドミナントネガティブのＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄポリペプチドのうちの１ま
たは複数を含むがこれらに限定されない。
Ｗｎｔ経路アゴニストの非限定的な例はさらに、以下：Ｗｎｔポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含む核酸、Ｗｎｔポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド
、活性化Ｗｎｔ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、活性化Ｗｎｔ受容体の
アミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達を促進する有機低
分子、Ｗｎｔアンタゴニストの発現または活性を阻害する有機低分子、Ｗｎｔアンタゴニ
ストの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を
阻害するリボザイム、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を阻害するＲＮＡｉ構築物、ｓｉＲＮ
Ａ、またはｓｈＲＮＡ、Ｗｎｔアンタゴニストに結合し、その活性を阻害する抗体、β－
カテニンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、β－カテニンポリペプ
チドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｌｅｆ－１ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む核酸、およびＬｅｆ－１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド
のうちの１または複数を含む。
Ｗｎｔ経路アゴニストはさらに、例えば、ドミナントネガティブのＧＳＫ－３ポリペプ
チド、ＧＳＫ３αポリペプチド、またはＧＳＫ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を含む核酸、ドミナントネガティブのＧＳＫ－３ポリペプチド、ＧＳＫ３αポリペプ
チド、またはＧＳＫ３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＧＳＫ－３、Ｇ
ＳＫ３α、またはＧＳＫ３に結合し、その発現または活性を阻害する有機低分子、ＧＳＫ
－３、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ３に結合し、その発現および／または活性を阻害するＲ
ＮＡｉ構築物、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、ＧＳＫ－３、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ
３に結合し、その発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧＳＫ－３、ＧＳＫ
３α、またはＧＳＫ３に結合し、その発現および／または活性を阻害する抗体、ＧＳＫ－
３、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ３に結合し、その発現を阻害するリボザイム、およびβ－
カテニン標的遺伝子を活性化させる任意のＧＳＫ－３非依存性試薬であって、ＧＳＫ－３
の阻害への効果において類似する試薬などのＧＳＫ３阻害剤を含む。
３．ＧＳＫ３阻害剤
ＧＳＫ３阻害剤は、本明細書で想定される組成物における使用に適する、特異的な例示
的Ｗｎｔ経路アゴニストであり、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子を含み
うるがこれらに限定されない。本明細書で想定されるＧＳＫ３阻害剤は、ＧＳＫ３α／β
の発現および／またはＧＳＫ３α／βの活性を減殺しうる。本明細書で想定されるＧＳＫ
３阻害剤の例示的な例は、ＧＳＫ３をターゲティングする抗ＧＳＫ３抗体、ドミナントネ
ガティブのＧＳＫ３変異体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス
核酸を含むがこれらに限定されない。
他の例示的なＧＳＫ３阻害剤は、ケンパウロン、１－アザケンパウロン、ＣＨＩＲ９９
０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＣＴ ９９０２１、ＣＴ ２００
２６、ＳＢ２１６７６３、ＡＲ－Ａ０１４４１８、リチウム、ＴＤＺＤ－８、ＢＩＯ、Ｂ
ＩＯ－アセトキシム、（５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－（２－フェニルキ
ナゾリン－４－イル）アミン、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニル（cyclopenad
ienyl）ルテニウム錯体、ＴＤＺＤ－８ ４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チア
ジアゾリジン－３，５－ジオン、２－チオ（３－ヨードベンジル）－５－（１－ピリジル
）－［１，３，４］－オキサジアゾール、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモセトフェ
ノン、ＡＲ－ＡＯ１４４－１８、３－（１－（３－ヒドロキシプロピル）－１Ｈ－ピロロ
［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル］－４－ピラジン－２－イル－ピロール－２，５－ジ
オン、ＴＷＳ１ １９ピロロピリミジン化合物、Ｌ８０３Ｈ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ
－ＮＨ２またはそのミリストイル化形態、２－クロロ－１－（４，５－ジブロモ－チオフ
ェン－２－イル）－エタノン、ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＲＯ３１８２２０、ＴＤＺＤ－８、
ＴＩＢＰＯ、およびＯＴＤＺＴを含むがこれらに限定されない。
特定の例示的な実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、また
はケンパウロンである。
好ましい実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
別の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＢＲＤ０７０５である。
４．ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤
本明細書で想定される組成物における使用に適するＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ポリヌク
レオチド、ポリペプチド、および低分子を含むがこれらに限定されない。本明細書で想定
されるＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫもしくはＥＲＫの発現および／またはＭＥＫもし
くはＥＲＫの活性を減殺しうる。本明細書で想定されるＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の例示的な
例は、ＭＥＫまたはＥＲＫをターゲティングする抗ＭＥＫ抗体または抗ＥＲＫ抗体、ドミ
ナントネガティブのＭＥＫ変異体またはＥＲＫ変異体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲ
ＮＡ、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。
他の例示的なＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ９８０５９、ＵＯ１
２６、ＳＬ３２７、ＡＲＲＹ－１６２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ１８４３５２、スニチニ
ブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、ＧＳＫ１ １２０２１２
、ＡＲＲＹ－４３８１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ５１８、ＡＺＤ８３３０、ＲＤＥ
Ａ１ １９、ＡＺＤ６２４４、ＦＲ１８０２０４、およびＰＴＫ７８７を含むがこれらに
限定されない。
さらなる例示的なＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、国際特許公開第ＷＯ９９／０１４２６号、
同第ＷＯ０２／０６２１３号、同第ＷＯ０３／０７７９１４号、同第ＷＯ０５／０５１３
０１号、および同第ＷＯ２００７／０４４０８４号において開示されている化合物を含む
。
ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤のさらに例示的な例は、以下の化合物：６－（４－ブロモ－２－
クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５
－カルボン酸（２，３－ジヒドロキシ－プロポキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－
クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－（テトラヒドロ－ピラン－２－イルメチ
ル）－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミ
ド、１－［６－（４－ブロモ－２－クロロフェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル
－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル］－２－ヒドロキシ－エタノン、６－（４－ブロ
モ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾ
ール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－１，１－ジメチル－エトキシ）－アミド、６－
（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－（テトラヒドロ－フ
ラン－２－イルメチル）－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ
－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－フルオロ－フェニルアミノ）－７－フル
オロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エト
キシ）－アミド、６－（２，４－ジクロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチ
ル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド
、以下、ＭＥＫ阻害剤１と称する、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－
７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキ
シ－エトキシ）－アミド、２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－Ｎ－
（２－ヒドロキシエトキシ）－１，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリジ
ン－３－カルボキサミド（以下、ＭＥＫ阻害剤２と称する）、４－（４－ブロモ－２－フ
ルオロフェニルアミノ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１，５－ジメチル－６－オ
キソ－１，６－ジヒドロピリダジン－３－カルボキサミド、および薬学的に許容されるこ
れらの塩を含む。
好ましい実施形態では、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９である。
５．ＲＯＣＫ阻害剤
Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）とは、Ｒｈｏキナーゼ（その３つのアイソフォーム（
ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣ）が存在する）の下流のエフェクターとして働くセ
リン／トレオニンキナーゼである。本明細書で想定される組成物における使用に適するＲ
ＯＣＫ阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子を含むがこれらに限定
されない。本明細書で想定されるＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫの発現および／またはＲＯ
ＣＫの活性を減殺しうる。本明細書で想定されるＲＯＣＫ阻害剤の例示的な例は、ＲＯＣ
Ｋをターゲティングする抗ＲＯＣＫ抗体、ドミナントネガティブのＲＯＣＫ変異体、ｓｉ
ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されな
い。
本明細書で想定される、例示的なＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、フ
ァスジル、ＡＲ１２２－８６、Ｙ２７６３２、Ｈ－１１５２、Ｙ－３０１４１、Ｗｆ－５
３６、ＨＡ－１０７７、ヒドロキシル－ＨＡ－１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ－
７７２０７７－Ｂ、Ｎ－（４－ピリジル）－Ｎ’－（２，４，６－トリクロロフェニル）
尿素、３－（４－ピリジル）－１Ｈ－インドール、および（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－
Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド、な
らびに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０４４，２０１
号において開示されているＲＯＣＫ阻害剤を含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、またはピリンテグ
リンである。
好ましい実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンである。
本明細書で想定される組成物中および細胞培養培地中の低分子の量は、変動させること
ができ、使用される特異的分子および組合せ、培地中で培養される細胞の種類、および特
異的適用を含む特異的培養条件に従い最適化することができる。一実施形態では、低分子
は、多能性を誘導し、再プログラム化の効率を改善し、細胞の能力を増大させるかもしく
は維持するか、または基底状態の多能性を誘導もしくは維持するのに十分な濃度で、組成
物中に存在する。
本発明の別の態様は、本発明による使用のためのＮｏｔｃｈ活性化因子に関する。Ｎｏ
ｔｃｈは、Ｎｏｔｃｈ１を含むがこれらに限定されない、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーの
全てのメンバーを包摂する。Ｎｏｔｃｈ活性化因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体のアゴニストを
含むがこれらに限定されない。Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合し、例
えば、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインを切断させ、核へと移行させるなど、Ｎｏｔｃｈ受容
体と関連するシグナル伝達事象も、誘発または介在する。Ｎｏｔｃｈ活性化因子は、Ｊａ
ｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４を含むがこれらに限定され
ない。Ｎｏｔｃｈ活性化因子は、それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ
Ｐ２６０６８８４、ＵＳ６６８９７４４、およびＵＳ５７８０３００において開示されて
いるＮｏｔｃｈ活性化因子を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｎｏｔ
ｃｈリガンドのうちの１または複数を、可溶性ペプチドとして導入することもでき、固体
材料上に固定化させることもできる。固体材料は、ポリスチレンプレート、またはビーズ
を含みうるがこれらに限定されない。Ｎｏｔｃｈリガンドの固定化のためのビーズは、ア
ガロースビーズ、磁気ビーズ、およびラテックスビーズでありうる。一実施形態では、Ｎ
ｏｔｃｈリガンドペプチドを、ビーズへとコンジュゲート／固定化させる。別の実施形態
では、Ｎｏｔｃｈリガンドペプチドを、ポリスチレンプレートの表面へとコンジュゲート
／固定化させる。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドの固定化は、非共有結合的で
ある。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドペプチドを、細胞により提示する。
本発明のさらに別の態様は、それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる以下の
公報：ＷＯ２０１４０１１５４０、ＷＯ２０１４０６２１３８、およびＷＯ２００５１１
７９９４において開示されている薬剤を含むＢＭＰ経路活性化因子に関する。本発明によ
る使用のためのＢＭＰ経路活性化因子は、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ
－８、ＢＭＰ－２、およびＢＭＰ－４を含むがこれらに限定されない。本発明の非限定的
実施形態では、ＢＭＰ経路活性化因子は、ＢＭＰ－４である。ＢＭＰとは、形質転換増殖
因子ベータスーパーファミリーのメンバーである、多機能性サイトカインである。骨形成
タンパク質（ＢＭＰ）受容体は、Ｓｍａｄの活性化を介して、ＢＭＰシグナル伝達を介在
する。ＢＢＭＰリガンドは、ＢＭＰ受容体である、ＢＭＰＲＩおよびＢＭＰＲＩＩに結合
する。ＢＭＰＲＩＩがリン酸化した後、続いて、ＢＭＰＲＩが活性化する。ＢＭＰＲＩが
リン酸化すると、その後、ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｍａｄ（Ｒ－Ｓｍ
ａｄ）タンパク質がリン酸化し、これが、ｃｏｍｍｏｎ ｍｅｄｉａｔｏｒ－Ｓｍａｄ（
ｃｏ－Ｓｍａｄ）と会合し、核に入り、そこで、遺伝子の発現を調節する。一実施形態で
は、ＢＭＰ経路活性化因子は、ＢＭＰ４である。
本発明は、ｉＰＳＣから分化させた二次ＨＳＣを介して、またはｉＰＳＣから分化させ
た二次造血性内皮を介して、ｉＰＳＣから造血系細胞を得るための組成物を提供するが、
これらの手法の各々は、所望の細胞を分化させるための、ｉＰＳＣからのＥＢの形成を欠
く。
６．ｈｉＰＳＣ分化プラットフォーム
Ｉ．ｉＨＳＣプラットフォーム
本発明の一態様は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞から得るための培養培
地を提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一実施形態
では、培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子およびＢＭＰ活性化因子を含む。一実施形態で
は、培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地と
を含む。一実施形態では、培養培地中のＷｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である
。一実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。一実施形態では、Ｂ
ＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリッ
クスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、
および／またはサイトカインを、表１に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、
培養培地は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎではなく、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を使用する場
合、完全に組成既知である。
Figure 0007236476000001
本発明の一態様は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から得るための培養培地を提供する
。一実施形態では、培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選
択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む。一実施形態では、培養培地は、Ｗｎｔ経
路活性化因子、ＢＭＰ活性化因子を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、
またはこれらを本質的に含まない。一実施形態では、培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子
と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基
礎培地とを含む。一実施形態では、培養培地中のＷｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害
剤である。一実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。一実施形態
では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一実施形態では、任意選択のＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。一部の実施形態では、本明細書の培養培
地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、培養培地は、低分子、
増殖因子、および／またはサイトカインを、表２に示される濃度範囲で含む。一部の実施
形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える
場合、完全に組成既知である。
Figure 0007236476000002
本発明の一態様は、二次ＨＳＣを、造血性内皮から得るための培養培地を提供する。一
実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ
１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインとを含む。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧ
Ｆ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群
から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培養培地は、Ｗｎ
ｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まない。一実施形態では、培
養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、Ｉ
Ｌ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子および
サイトカインとを含むｉＨＳＣ基礎培地を含む。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、
ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含
む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイ
トカインを、表３に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔ
ｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
Figure 0007236476000003
本発明の一態様は、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから得るための培養培地を提供する。
一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７
からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む。一実施
形態では、培養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＢＭＰ活性化因子と、ＩＬ２、Ｉ
Ｌ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカ
インと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含むｉＴＣ基礎培地を含む。一実
施形態では、ｉＴＣ基礎培地は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、１または複数のＮｏｔｃｈ経
路活性化因子の組合せを含む。一実施形態では、ｉＴＣ基礎培地は、フィブロネクチンを
含まない。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一実施形態では、Ｎ
ｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬ
Ｌ－４を含むがこれらに限定されないＮｏｔｃｈリガンドである。一部の実施形態では、
ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプ
チド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドと
して導入することができる。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタン
パク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／
またはサイトカインを、表４に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地
は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既
知である。
Figure 0007236476000004
本発明の一態様は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞前駆体から得るための培養培地を提供する。一実
施形態では、培養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＧＦからなる群から選
択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む。一実施形態では、ＳＣＦ
、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイト
カインと、ＩＧＦとを含む培養培地は、ＢＭＰ活性化因子を含まない。一実施形態では、
培養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦからなる群から選択される増殖因子お
よびサイトカイン、ならびにＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、
１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因
子とを含むｉＴＣ基礎培地の組合せを含む。一実施形態では、ｉＴＣ基礎培地は、ＩＬ２
、ＩＬ３、ＩＬ６、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子の組合せを含む。一実施形
態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、
およびＤＬＬ－４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ－１および／またはＤＬＬ－４を
、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲート
させたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。一
部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４を含む。一部の実施形態では、培養培
地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は
、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表５に示される濃度範囲で含む。
一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉ
ｎに代える場合、完全に組成既知である。
Figure 0007236476000005
本発明の一態様は、ＮＫ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから得るための培養培地を提供する
。一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＶＥ
ＧＦからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む。
一実施形態では、培養培地は、ＳＣＦと、Ｆｌｔ３Ｌと、ＶＥＧＦと、ＢＭＰ活性化因子
と、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地とを含む。一実施形態では、ｉＮＫ
基礎培地は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５の組合せを含む。一実施形態では
、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マト
リックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因
子、および／またはサイトカインを、表６に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態で
は、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、
完全に組成既知である。
Figure 0007236476000006
本発明の一態様は、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞前駆体から得るための培養培地を提供する。
一実施形態では、培養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、およびＩＬ７からなる群か
ら選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む。一実施形態では、培
養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７と、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩ
Ｌ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉ
ＮＫ基礎培地とを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まない。一実施形態では、ｉＮＫ基礎培地
は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５の組合せを含む。一部の実施形態では、培
養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培
地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表７に示される濃度範囲で含
む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃ
ｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。一部の実施形態では、ＮＫの増殖、発生、
および成熟を刺激する人工抗原を、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、または抗原
提示細胞の形態で導入する。
Figure 0007236476000007
本発明の別の態様は、Ｔ細胞を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＳＣ
Ｆ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＧＦからなる群から選択される、１または複数の増殖
因子およびサイトカイン、ならびにＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択さ
れる、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活
性化因子とを含むｉＴＣ基礎培地を含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、Ｔ細胞を、Ｔ細胞
前駆体から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイト
カインと、ｉＴＣ基礎培地とを含み、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適
する培養培地；（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、
ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイト
カインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と
、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次ＨＳＣを、造血性内皮から発生させる
のに適する培養培地；（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ
阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、造血性内皮を、中胚葉細
胞から発生させるのに適する培養培地；ならびに（ｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化
因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適す
る培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形
態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
一実施形態では、Ｔ細胞を得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ
３Ｌ、ＩＧＦ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子および
サイトカイン、ならびにＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１ま
たは複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子と
を含むｉＴＣ基礎培地を含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、Ｔ細胞を、Ｔ細胞前駆体から
発生させるのに適する培養培地を含む。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラ
ットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７から
なる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ｉＴＣ基礎培地
とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから
発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラ
ットフォームは、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６
、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイ
トカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、
培養培地（ｉｉｉ）は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含
まず、二次ＨＳＣを、造血性内皮から発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地
（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＧＳＫ３
阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培
養培地をさらに含み、培養培地（ｉｖ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させ
るのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉ
ｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含
む培養培地をさらに含み、培養培地（ｖ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるの
に適する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
本発明の一態様は、Ｔ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）
ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１
または複数の増殖因子およびサイトカインと、ｉＴＣ基礎培地とを含み、Ｔ細胞前駆体を
、二次ＨＳＣから発生させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３
Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１ま
たは複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地と
を含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを
、二次造血性内皮から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任
意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内
皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地；ならびに（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤
と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する培養
培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では
、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
一実施形態では、Ｔ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＢＭＰ活
性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複
数の増殖因子およびサイトカインと、ｉＴＣ基礎培地とを含む培養培地を含み、培養培地
（ｉ）は、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する。一実施形態では、培
養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、
ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または
複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含
む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容
体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する。一
実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ
）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地
とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞
から発生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉ
ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地と
を含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｖ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生さ
せるのに適する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
本発明の一態様は、二次ＨＳＣを得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）Ｖ
ＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからな
る群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子
を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻
害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉ
）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地
とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ
）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させ
るのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一
部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
一実施形態では、二次ＨＳＣを得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＶＥＧＦ、
ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から
選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉ
ＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地を含み、培養培地（ｉ）は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、
ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるの
に適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）Ｇ
ＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを
含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発
生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラ
ットフォームは、（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさ
らに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する。
一部の実施形態では、得られる二次ＨＳＣは、ＣＤ３４＋ ＨＳＣである。一部の実施形
態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
本発明のなお別の態様は、造血性内皮を得るための培養プラットフォームであって、（
ｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ＢＭＰ活性化因
子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに
適する培養培地；ならびに（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚
葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養
プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣであ
る。
一実施形態では、造血性内皮を得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＧＳＫ３阻
害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳ
Ｃ基礎培地とを含む培養培地を含み、培養培地（ｉ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞
から発生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォ
ームは、（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、
培養培地（ｉｉ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する。一部の実施形
態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
本発明のさらなる態様は、ＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ
）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインと、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群
から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地を含
み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞前駆体から発生させるのに適する
培養培地；（ｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＶＥＧＦからなる群から選択される、１
または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子と、ｉＮＫ基礎培地とを
含み、ＮＫ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ）Ｖ
ＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからな
る群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子
を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻
害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する培養培地；（ｉｖ
）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子
を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適
する培養培地；ならびに（ｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細
胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラ
ットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
ＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームについての一実施形態は、（ｉ）ＳＣＦ、
Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサ
イトカインと、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１
または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地とを含む培養培地を含み
、培養培地（ｉ）は、ＢＭＰ活性化因子を含まず、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞前駆体から発生
させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（
ｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＶＥＧＦからなる群から選択される、１または複数の
増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子と、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、および
ＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む
ｉＮＫ基礎培地を含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、ＮＫ細胞前駆体を、
二次ＨＳＣから発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）
を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、
ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖
因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地
をさらに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬ
Ｋ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する。一実施形態
では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（
ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎
培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｖ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細
胞から発生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ
）、および（ｉｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ
基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｖ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣか
ら発生させるのに適する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
本発明の別の態様は、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームであって、（
ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦからなる群から選択される、１
または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５
からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基
礎培地とを含み、ＮＫ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する培養培地；（
ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰ
Ｏからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活
性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／
ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する培養培地
；（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳ
Ｃ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地
；ならびに（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰ
ＳＣから発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォー
ムを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームについての一実施形態は、（ｉ）Ｂ
ＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＶＥＧＦからなる群から選択される、１
または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５
からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基
礎培地とを含む培養培地を含み、培養培地（ｉ）は、ＮＫ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから
発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは
、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、および
ＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭ
Ｐ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）
は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二
次造血性内皮から発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ
）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ
受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（
ｉｉｉ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する。別の実施形態で
は、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉ
ｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｖ
）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する。一部の実施形態では、ｉＰＳ
Ｃは、ナイーブｉＰＳＣである。
ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームについての一実施形態は、ビーズコ
ンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態の人工抗原であって
、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激するための人工抗原のうちの１または複数を含む
。
本発明のなお別の態様は、二次ＣＤ３４＋細胞を発生させるための培養プラットフォー
ムであって、（ｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ
、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイン
と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧ
Ｆβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適
する培養培地；（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤
と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適す
る培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉
細胞を、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞から発生させるのに適する培養培地のうちの１また
は複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイ
ーブｉＰＳＣである。
ＩＩ．ｉＣＤ３４プラットフォーム
本発明のさらなる態様は、多能性幹細胞を使用して二次造血性内皮を得るための培養プ
ラットフォームを提供する。本明細書で使用される二次造血性内皮とは、二次造血へと方
向付けられた造血性細胞集団であって、二次ＨＳＣ、造血複能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細
胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、成熟Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含むがこれらに限定さ
れない、全ての造血細胞を発生させる能力を伴う造血細胞集団である。
一実施形態では、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞を使用して、二次造血性内皮を得るため
の培養プラットフォームは、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地の播種を
含む。一部の実施形態では、培地の播種は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか
、またはこれらを本質的に含まない。一実施形態では、本発明の培養培地の播種における
低分子の組合せを、表９に、運命維持培地（ＦＭＭ）として示す。培地の成分は、表９に
示される濃度範囲内の量で、培地中に存在しうる。一実施形態では、二次造血性内皮を得
るために使用されるｉＰＳＣは、運命再プログラム化培地（ＦＲＭ）を使用して発生させ
、本明細書で開示される段階特異的分化に適する、ｉＰＳＣ細胞株の基底状態またはナイ
ーブ状態を確立し、持続させるように、ＦＭＭ中でさらに維持された細胞株であった。こ
のようにして得られた基底状態ｉＰＳＣまたはナイーブｉＰＳＣは、低温保存に適する。
本発明では、保持されたｉＰＳＣ細胞株またはクローンｉＰＳＣを、二次造血性内皮への
後続の分化のために、ＦＭＭに播種することができる。
Figure 0007236476000008
本発明の一態様は、中胚葉の、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞からの分化および拡大のた
めの培養培地を提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦと、低分子を
、表１０に示される組合せで含むＣＤ３４基礎培地とを含む。一部の実施形態では、培養
培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地
は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１０に示される濃度範囲で含
む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃ
ｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
Figure 0007236476000009
一実施形態では、中胚葉の、多能性幹細胞からの分化および拡大のための、上記の培養
培地は、０．２～５０ｎｇの間のｂＦＧＦをさらに含む。
本発明の一態様は、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、ｉＰＳＣを含
む多能性幹細胞から得るための培養培地を提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、
ナイーブｉＰＳＣである。一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＧＳＫ３
阻害剤と、ｂＦＧＦとを含む。一実施形態では、二次ＨＥのポテンシャルを達成するため
に、ＧＳＫ３阻害剤を含む培養培地を、中胚葉細胞への特化後に限り適用する。一実施形
態では、ＢＭＰ活性化因子と、ＧＳＫ３阻害剤と、ｂＦＧＦとを含む培養培地は、低分子
を、表１１に示される組合せで含むＣＤ３４基礎培地をさらに含む。一実施形態では、上
記の培養培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない。一部の実施形態では、培養
培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地
は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１１に示される濃度範囲で含
む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃ
ｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
Figure 0007236476000010
本発明の一態様は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から得るための培養培地を提供する
。一実施形態では、培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ
６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカ
インとを含む。一実施形態では、培養培地は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、Ｉ
Ｌ１１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、低分子を、表１２に示される組合せで含むＣＤ３４基礎培
地とを含む。一実施形態では、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１と、ＲＯ
ＣＫ阻害剤とを含む培養培地は、ＩＧＦ１および／またはＥＰＯを含まない。他の実施形
態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表
１２に示される濃度範囲で含む。
Figure 0007236476000011
本発明の一態様は、複能性前駆体（ＭＰＰ）細胞を、二次造血性内皮から得るための培
養プラットフォームを提供する。ＭＰＰは、好中球前駆体を含む骨髄性細胞へとさらに分
化させることができる。一実施形態では、培養プラットフォームは、（ｉ）ＢＭＰ活性化
因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ
、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子
およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるのに適
する培養培地（表１３）を含む。別の実施形態では、二次造血性内皮を、ｐｒｅ－ＨＳＣ
へと分化させるための培養培地を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因
子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、お
よびＩＬ１１とを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、ｐｒｅ－ＨＳＣを、複能性前駆体へと
分化させるのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、
チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２
７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。他の実施
形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、
表１３に示される濃度範囲で含む。
Figure 0007236476000012
本発明の一態様は、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を、二次造血性内皮から発生させるため
の培養プラットフォームを提供する。一実施形態では、培養プラットフォームは、（ｉ）
ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、お
よびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを
含み、二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体（ｐｒｅ－ｐｒｏＴ）へと分化させるのに適
する培地；ならびに（ｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択され
る、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活
性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず、プレＴ細胞前駆体を、
Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるのに適する培地（表１４）を含む。一部の実施
形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態
では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子
は、ＢＭＰ４である。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、お
よび／またはサイトカインを、表１４に示される濃度範囲で含む。
Figure 0007236476000013
本発明の一態様は、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を、二次造血性内皮から発生させる
ための培養プラットフォームを提供する。一実施形態では、培養プラットフォームは、（
ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ
、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子
およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体（ｐｒｅ－ｐｒｏ
ＮＫ）へと分化させるのに適する培地；ならびに（ｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、
ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイ
トカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうち
の１または複数を含まず、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞へと分
化させるのに適する培地を含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン
またはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２であ
る。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。他の実施形態では、本
明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１５に示さ
れる濃度範囲で含む。
Figure 0007236476000014
本発明の別の態様は、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフォームで
あって、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または
複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、お
よびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まず
、プレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるのに適する培地；（ｉ
ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ
、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイン
とを含み、二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地；（ｉｉ
ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる
群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内
皮の、中胚葉細胞からの分化および拡大に適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と
、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、中胚葉細胞内の二次造血性内皮のポテンシャル
を得るのに適する培養培地；（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み
、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生し、拡大するのに適する培養培地；ならびに（ｖｉ）
ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まな
いか、またはこれらを本質的に含まず、ナイーブｉＰＳＣを播種し、拡大するのに適する
培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態
では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれら
を本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２また
はＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。
一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部
の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ
活性化因子は、ＢＭＰ４である。
一実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を発生させるための培養プラットフォーム
は、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性
化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質
的に含まず、プレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるのに適する
培地を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフ
ォームであって、培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子
と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からな
る群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性
内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地をさらに含む。別の実施形態で
は、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）
および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ
、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分化およ
び拡大に適する培養培地をさらに含む。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ
細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉ
ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ
３阻害剤とを含み、中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培
養培地をさらに含む。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための
培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）を
含む培養プラットフォームは、（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含
み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。別
の実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフォームであって
、培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）を含む培養プラットフォ
ームは、（ｖｉ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬ
Ｋ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、ナイーブｉＰＳＣを播種し、拡
大するのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実
施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形
態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ
阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害
剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である
。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ因子を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を発生させるため
の培養プラットフォームにおいて使用する。一部の実施形態では、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、
ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４を含むＮｏｔｃｈ因子を、可溶性ペプチド、
ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、ま
たは細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
本発明の別の態様は、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォー
ムであって、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群か
ら選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ
、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、または
これらを本質的に含まず、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞へと分
化させるのに適する培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、
ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択さ
れる、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、プレＮ
Ｋ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地；（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、
ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の
増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分化および
拡大に適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを
含み、中胚葉細胞内の二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；（ｖ）
ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生
し、拡大するのに適する培養培地；（ｖｉ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含
み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、ナイ
ーブｉＰＳＣを播種し、拡大するのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プ
ラットフォームを提供する。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体
／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、
ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳ
Ｋ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チ
アゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７
６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施
形態では、ＮＫの成熟は、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、
ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入され
る人工抗原のうちの１または複数を使用して行う。
一実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を発生させるための培養プラットフォ
ームは、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選
択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｂ
ＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれ
らを本質的に含まず、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞へと分化さ
せるのに適する培地を含む。一部の実施形態では、ＮＫの成熟は、ＮＫの増殖、発生、お
よび成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および
／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数を使用して行う
。別の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォーム
であって、培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、Ｒ
ＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩ
Ｌ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、
二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地をさらに含む。別
の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであ
って、培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻
害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択され
る、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮の、中胚葉細
胞からの分化および拡大に適する培養培地をさらに含む。さらに別の実施形態では、ＮＫ
細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（
ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と
、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャ
ルを得るのに適する培養培地をさらに含む。さらに別の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体ま
たはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉ
ｉｉ）、および（ｉｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、任
意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生し、拡大するのに適する
培養培地をさらに含む。別の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための
培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および
（ｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖｉ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉ
を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、
ナイーブｉＰＳＣを播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態
では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれら
を本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２また
はＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。
一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部
の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ
活性化因子は、ＢＭＰ４である。
本発明の一態様は、二次造血性内皮を発生させるための培養プラットフォームであって
、（ｉ）二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分化および拡大のための培養培地であり、
ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群か
ら選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培養培地；（ｉｉ）
中胚葉細胞内の、二次造血性ポテンシャルを得るための培養培地であり、ＢＭＰ活性化因
子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む培養培地；（ｉｉｉ）中胚葉細胞を、ナイー
ブｉＰＳＣから分化させ、拡大するための培養培地であり、ＢＭＰ活性化因子と、任意選
択で、ｂＦＧＦとを含む培養培地；ならびに（ｉｖ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣ
Ｋｉを含む、ナイーブｉＰＳＣの播種および拡大培養物であり、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ
阻害剤を含まない播種培養物のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供す
る。一部の実施形態では、二次造血性内皮は、ＣＤ３４＋である。一部の実施形態では、
上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質
的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩ
Ｏである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の
実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施
形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化
因子は、ＢＭＰ４である。
一実施形態では、二次造血性内皮を得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＲＯＣ
Ｋ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択
される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、中胚
葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地を含む。一実施形態では、培養培地
（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳ
Ｋ３阻害剤とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、中胚葉細胞内の、二次
造血性ポテンシャルを得るのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ
）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧ
Ｆとを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、中胚葉細胞を、ナイーブｉＰ
ＳＣから、分化させ、拡大するのに適する。さらに別の実施形態では、培養培地（ｉ）、
（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫ
ｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｖ）はＴＧＦβ受容体／
ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、培養培地（ｖ）は、ナイー
ブｉＰＳＣを播種し、拡大するのに適する。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、
ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の
実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施
形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣ
Ｋ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻
害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４であ
る。
本発明の一態様は、ＣＤ３４＋二次造血性内皮を発生させるための培養プラットフォー
ムであって、（ｉ）二次造血性内皮を、中胚葉細胞から分化させ、拡大するための培養培
地であり、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１か
らなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造
血性内皮が、ＣＤ３４＋二次造血性内皮を含む培養培地；（ｉｉ）中胚葉細胞内の、二次
造血性ポテンシャルを得るための培養培地であり、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、Ｇ
ＳＫ３阻害剤とを含む培養培地；（ｉｉｉ）中胚葉細胞を、ナイーブｉＰＳＣから分化さ
せ、拡大するための培養培地であり、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含
む培養培地；ならびに（ｉｖ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む、ナイーブ
ｉＰＳＣの播種または拡大培養物であり、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、
またはこれらを本質的に含まない播種培養物のうちの１または複数を含む培養プラットフ
ォームを提供する。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ
阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３
阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害
剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビ
ンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２で
ある。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。
本発明の一態様は、中胚葉細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、（
ｉ）中胚葉細胞を、ナイーブｉＰＳＣから分化させ、拡大するための培養培地であり、Ｂ
ＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培養培地；ならびに（ｉｉ）ＭＥＫｉ
、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む、ナイーブｉＰＳＣの播種または拡大培養物であり
、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない播種培
養物のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では
、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本
質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢ
ＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部
の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実
施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性
化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、中胚葉細胞を発生させるための培養プ
ラットフォームは、（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含
み、中胚葉細胞内の、二次造血性ポテンシャルを得るための培養培地をさらに含みうる。
一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む培養培
地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない。
Ｃ．ＣＤ３４＋細胞、二次造血性内皮、複能性前駆体、Ｔ細胞前駆体またはＮＫ細胞前駆
体、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を得る方法
本発明は、１または複数の培養培地を含む多段階培養プラットフォームを使用して、多
能性幹細胞由来の二次造血細胞を発生させる方法を提供する。方法は、フィーダーフリー
条件に適する。方法はまた、単層培養にも適し、従って、当技術分野で公知の方法と比較
して、多能性幹細胞を分化させるために、ＥＢの形成または凝集中間体を要請しない。提
供される方法により、複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）、ナチュラルキラー細胞前駆体（ｉｐ
ｒｏ－ＮＫ）、Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）、成熟ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、およびＴ細胞
（ｉＴ）へとさらに分化させることが可能な、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨ
Ｅ）、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）、ＣＤ３４＋ ＨＥ（ｉＣＤ３４）を発生し、同時に、こ
れらを拡大する。本発明のさらなる態様はまた、多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋細胞、Ｈ
Ｅ、ＨＳＣ、および／またはＭＰＰから分化させた骨髄性細胞を発生させる方法も提供す
る。
一実施形態では、本発明は、単層培養において、造血系の細胞を、多能性細胞から分化
させ、拡大するための方法であって、多能性細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子と、任意選択
で、ｂＦＧＦと接触させるステップを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、胚葉体を
形成せずに、多能性幹細胞から得られ、拡大され、次いで、これが、ＢＭＰ経路活性化因
子と、ｂＦＧＦと、ＷＮＴ経路活性化因子との接触下に置かれ、胚葉体を形成せずに、多
能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ＨＥ）のポテンシャルを有する、拡大された中胚葉細
胞が、多能性幹細胞から得られる方法を提供する。ｂＦＧＦと、任意選択で、ＲＯＣＫ阻
害剤と、かつ／またはＷＮＴ経路活性化因子との後続の接触により、二次ＨＥのポテンシ
ャルを有する中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させ、これを分化の間にまた、拡大も
する。
造血系の細胞を得るための、提供される方法は、ＥＢの形成が細胞の拡大をもたらさず
、単層培養を可能とせず、かつ煩瑣かつ低効率であるため、ＥＢに介在される多能性幹細
胞の分化より優れている。加えて、本発明により、本明細書で提示される方法を使用する
単層培養は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、長期にわたる造血系の自己再生、再構成、および
生着を可能とする、機能的な造血系細胞をもたらすことも開示された。
下記で詳述される通り、本発明は、二次ＨＳＣまたは二次造血性内皮を得ることを介し
て、造血系細胞を、多能性細胞から得る方法を提供する。特に、本発明は、分化のために
ＥＢを形成せずに、造血系細胞の、多能性細胞からの分化を方向付ける方法を提供する。
Ｉ．ｉＨＳＣプラットフォーム
１．ｉＨＳＣを、多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉、またはＨＥから分化さ
せ、拡大すること（ｉＨＳＣプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を発生し、拡大す
る方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させる第１段
階で始まり、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、造血性内皮（ＨＥ）へと分化させ、拡
大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）へと分化させ、これを同時
にまた、拡大もする。本発明はまた、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を発生させる方法であって
、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥへと分化させ、拡大することと、ＨＥを、ｉＨ
ＳＣへと分化させることとを含む方法も提供する。代替的に、本発明は、二次ＨＳＣ（ｉ
ＨＳＣ）を発生し、拡大する方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分
化させることを含む方法を提供する。上記の方法についての一部の実施形態では、多能性
幹細胞は、ｉＰＳＣを含む。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである
。
二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を、ナイーブ多能性幹細胞から作製する方法についての一実施
形態では、方法は、（１）多能性細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性
化因子、および細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触
させることにより、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させること、そして分化させた
中胚葉細胞を拡大することと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎ
ｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つ
を含む第２の培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させ
ること、そして二次ＨＥ細胞を拡大することと；（３）二次ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因
子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰ
Ｏからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第３
の培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣへと分化させること、そし
て二次ＨＳＣが拡大することを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣを
含む。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では
、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、
上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、
得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ソー
トすることは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソー
トすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部
の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およ
びＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞を、ＢＭ
Ｐ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、およびＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの
少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと
分化させることを含む。
二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生し、拡大する方法
についての一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎ
ｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つ
を含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させることで
あって、二次ＨＥ細胞を拡大することと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥ
ＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる
群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む第２の培地と接触
させることにより、得られたＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させることであって、ｉＨＳ
Ｃを拡大することとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞
は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、Ｃ
Ｄ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートす
ることをさらに含む。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ
４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３
陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートすることは、Ｃ
Ｄ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生し、拡大する方法につい
ての一実施形態では、方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆ
ｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される
、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることであって、
ｉＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＨＥから分化させ、拡大することを含む。一部の実施形
態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態
では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用
して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートすることをさらに含む。
２．ＨＥを、多能性幹細胞または多能性幹細胞由来の中胚葉から分化させ、拡大する
こと（ｉＨＳＣプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、二次造血性内皮を発生し、拡大する方法を
提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させる第１段階で始ま
り、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、拡大し、造血性内皮へと分化させる。出発多能
性細胞は、基底状態の人工多能性幹細胞またはナイーブ人工多能性幹細胞および胚性幹細
胞を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、発生させ、拡大される造血性内
皮は、二次造血性内皮である。一部の実施形態では、発生させる二次造血性内皮は、ＣＤ
３４陽性である。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、二次造血性内
皮へと分化させることにより、造血性内皮を発生し、拡大する方法を提供する。
二次造血性内皮を、多能性幹細胞から分化させ、拡大する方法についての一実施形態で
は、方法は、（１）細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、およ
び細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む第１の培地と接触させる
ことにより、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させることと；（２）中胚葉細胞を、
ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受
容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させることにより、中胚葉細
胞を、造血性内皮へと分化させることであって、二次ＨＥ細胞を拡大することとを含む。
一部の実施形態では、上記の方法から得られたＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の
実施形態では、上記の方法は、ＧＳＫ３阻害剤を、Ｗｎｔ経路活性化因子として含む。一
部の実施形態では、上記の方法は、ＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯを、ＧＳＫ３阻害剤
として含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＨＩＲ９９０２１を、ＧＳＫ３阻害
剤として含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＳＢ４３１５４２またはＡ８３－０
１を、ＴＧＦβ受容体阻害剤として含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＳＢ４３
１５４２を、ＴＧＦβ受容体阻害剤として含む。
造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から分化させ、拡大する方法についての
一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性
化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地
と接触させることにより、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させることを含む。一部の
実施形態では、上記の方法から得られた二次ＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。
３．中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから分化させ、拡大すること（ｉＨＳＣプラットフォー
ム）
本発明の一態様は、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。出発
多能性細胞は、基底状態の人工多能性幹細胞またはナイーブ人工多能性幹細胞および胚性
幹細胞を含むがこれらに限定されない。
中胚葉細胞を、多能性幹細胞から発生し、拡大する方法についての一実施形態では、方
法は、多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細
胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより
、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させることを含む。一部の実施形態では、上記の
方法は、ＧＳＫ３阻害剤を、Ｗｎｔ経路活性化因子として含む。一部の実施形態では、上
記の方法は、ＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯを、ＧＳＫ３阻害剤として含む。一部の実
施形態では、上記の方法は、ＣＨＩＲ９９０２１を、ＧＳＫ３阻害剤として含む。
４．Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞から得ること、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、
ＨＥ、または二次ＨＳＣから得ること（ｉＨＳＣおよびｉＴＣプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞から発生さ
せる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させ、中胚
葉細胞を拡大する第１段階で始まり、次いで、第２段階で、造血性内皮を、分化させ、拡
大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）へと分化させ、ｉＨＳＣを
拡大する。第４段階では、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させる。本発明はまた、Ｔ
細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥへと分化
させること、次いで、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させること、次いで、ｉＨＳＣを、Ｔ細
胞前駆体へと分化させることを含む方法も提供する。本発明は、Ｔ細胞前駆体を発生させ
る方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させること、次いで、ｉ
ＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させることを含む方法をさらに提供する。代替的に、本
発明は、Ｔ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣを、Ｔ細
胞前駆体へと分化させることを含む方法を提供する。
Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、
（１）多能性細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞
外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、
多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させること、そして中胚葉細胞が拡大することと；
（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任
意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させる
ことにより、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させること、そしてＨＥ細胞を拡大する
ことと；（３）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ
１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ＨＥ細胞を
、二次ＨＳＣへと分化させること、そしてｉＨＳＣが拡大することと；（４）ｉＨＳＣを
、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６か
らなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数
のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第４の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、
Ｔ細胞前駆体へと分化させることとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られ
たｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４
、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳ
Ｃ）をソートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４
陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４
陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソート
することは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用
する。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一実施形態では、Ｎｏｔ
ｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－
４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、可溶性ペプチド、ビー
ズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または
細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施
形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子
、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触
させることにより、中胚葉細胞を、ＨＥ細胞へと分化させると、ＨＥが拡大することと；
（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、Ｉ
Ｌ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因
子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させることにより、得られたＨＥ細胞を
、ｉＨＳＣへと分化させること、そしてｉＨＳＣを拡大することと；（３）ｉＨＳＣを、
ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６から
なる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数の
Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第３の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ
細胞前駆体へと分化させることとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られた
ｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、
ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ
）をソートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽
性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽
性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートす
ることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用す
る。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、
ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－
４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲ
ートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる
。
Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生させる方法についての一実施形態で
は、方法は、（１）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、
ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または
複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、ＨＥを、ｉＨ
ＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（２）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性
化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から
選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ
経路とを含む第２の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化さ
せるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、
ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７
３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするス
テップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソー
トするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽
性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３
４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソー
トするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性
を使用する。
Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣから発生させる方法についての一実施形
態では、方法は、ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ
２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサ
イトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む培地と接触させること
により、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させるステップを含む。一部の実施形態では
、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して
、多能性幹細胞由来のＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートし、得るステップをさらに含む。一実
施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－
３、およびＤＬＬ－４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、可
溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせ
たペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
５．Ｔ細胞を、多能性幹細胞から得ること、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、ＨＥ、
ｉＨＳＣ、またはＴ細胞前駆体から得ること（ｉＨＳＣおよびｉＴＣプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、Ｔ細胞を、多能性幹細胞から発生させる方
法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉
細胞が分化しながら拡大する第１段階で始まり、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、造
血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳ
Ｃ（ｉＨＳＣ）へと分化させると、ｉＨＳＣが拡大する。第４段階では、ｉＨＳＣを、Ｔ
細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）へと分化させる。第５段階では、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞へと分
化させる。本発明はまた、Ｔ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉
細胞を、ＨＥへと分化させ、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させ、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体
へと分化させ、次いで、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップを含む方法も提
供する。本発明は、Ｔ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨ
ＳＣへと分化させ、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させ、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へ
と分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、Ｔ細胞を発生
させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させ、Ｔ細
胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、
Ｔ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化
させるステップを含む方法を提供する。
Ｔ細胞を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、（１）
多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞外マ
トリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多能
性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大するステップと；（２）中
胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で
、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させることによ
り、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大するステップと；（３
）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３
、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子お
よびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへ
と分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（４）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子
と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択さ
れる、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活
性化因子とを含む第４の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分
化させるステップと；（５）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、Ｉ
Ｌ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子および
サイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第５の培地と接触さ
せることにより、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施
形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形
態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使
用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形
態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部
の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。
一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ
７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、
ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一実施形態では、ＢＭ
Ｐ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａ
ｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４である。一部の実施形態で
は、ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせた
ペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチ
ドとして導入することができる。
Ｔ細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態で
は、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、およ
び、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させる
ことにより、中胚葉細胞を、ＨＥ細胞へと分化させると、二次ＨＥ細胞が拡大するステッ
プと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１
５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の
増殖因子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させることにより、得られたＨＥ
細胞を、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（３）ｉＨＳＣを
、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６か
らなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数
のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第３の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、
Ｔ細胞前駆体へと分化させるステップと；（４）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、
ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複
数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む
第４の培地と接触させることにより、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップと
を含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現
する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／ま
たはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに
含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップ
をさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４
３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４
３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップ
は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一
実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ
－３、およびＤＬＬ－４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、
可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさ
せたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
Ｔ細胞を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生させる方法についての一実施形態では、方
法は、（１）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１
５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の
増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞由来の
ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（２）ｉＨＳＣを
、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６か
らなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数
のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第２の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、
Ｔ細胞前駆体へと分化させるステップと；（３）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、
ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複
数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む
第３の培地と接触させることにより、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップと
を含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現
する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／ま
たはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＳＣをソートするステップをさらに含む。一部
の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含
む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使
用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、お
よびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３
４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一実施形態で
は、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およ
びＤＬＬ－４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、可溶性ペプ
チド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチ
ド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
Ｔ細胞を、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣから発生させる方法についての一実施形態では
、方法は、（１）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ
２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサ
イトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む培地と接触させること
により、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；
（２）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、および
ＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１ま
たは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む培地と接触させることにより、Ｔ細胞前駆
体を、Ｔ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、Ｃ
Ｄ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、多能性幹細胞由来
のＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートし、得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、上
記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態
では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施
形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を
使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰
性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路
活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４である
。一部の実施形態では、ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコ
ンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞によ
り提示されたペプチドとして導入することができる。
Ｔ細胞を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体から発生させる方法についての一実施形態
では、方法は、Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３
、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイン
と、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む培地と接触させることにより、Ｔ
細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップを含む。
６．ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞から得ること、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞
、ＨＥ、またはｉＨＳＣから得ること（ｉＨＳＣおよびｉＮＫプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞から発生
させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると
、中胚葉細胞が拡大する第１段階で始まり、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、造血性
内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣへ
と分化させると、二次ＨＳＣが拡大する。第４段階では、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へ
と分化させる。本発明はまた、ＮＫ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞
由来の中胚葉細胞を、ＨＥへと分化させ、次いで、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させ、次い
で、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法も提供する。本発明
は、ＮＫ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへ
と分化させ、次いで、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法を
さらに提供する。代替的に、本発明は、ＮＫ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能
性幹細胞由来のｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法を提供す
る。
ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は
、（１）多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および
細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることによ
り、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大するステップと；
（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任
意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させる
ことにより、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大するステップ
と；（３）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５
、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増
殖因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ＨＥ細胞を、ｉ
ＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（４）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活
性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５
からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第４の
培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップとを
含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現す
る。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／また
はＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含
む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップを
さらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３
陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３
陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは
、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実
施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因
子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接
触させることにより、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥ細胞へと分化させると、Ｈ
Ｅ細胞が拡大するステップと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣ
Ｆ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択
される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させるこ
とにより、得られたＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステッ
プと；（３）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２
、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子
およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞
前駆体へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られた
ｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、
ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ
）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽
性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステッ
プは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするス
テップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実
施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およ
びＣＸＣＲ４陰性を使用する。
ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生させる方法についての一実施形態
では、方法は、（１）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ
、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１また
は複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、多能性幹細
胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（２）ｉ
ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ
６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカ
インとを含む第２の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化
させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は
、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ
７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートする
ステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソ
ートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４
陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ
３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソ
ートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰
性を使用する。
ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣから発生させる方法についての一実施
形態では、方法は、ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、
ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増
殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞
前駆体へと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、
ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、多能性幹細胞由来のＨＳＣ
（ｉＨＳＣ）をソートし、得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法
は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソ
ートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では
、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する
。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ
７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
７．ＮＫ細胞を、多能性幹細胞から得ること、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、ＨＥ
、ｉＨＳＣ、またはＮＫ細胞前駆体から得ること（ｉＨＳＣおよびｉＮＫプラットフォー
ム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、ＮＫ細胞を、多能性幹細胞から発生させる
方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚
葉細胞が拡大する第１段階で始まり、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、造血性内皮へ
と分化させると、ＨＥ細胞が拡大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣ（ｉＨＳ
Ｃ）へと分化させると、ＨＳＣが拡大する。第４段階では、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体
（ｉｐｒｏ－ＮＫ）へと分化させる。第５段階では、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞へと分化させ
る。本発明はまた、ＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞
を、ＨＥへと分化させ、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させ、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へ
と分化させ、次いで、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップを含む方法も
提供する。本発明は、ＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、
ｉＨＳＣへと分化させ、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させ、ＮＫ細胞前駆体を、
ＮＫ細胞へと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、Ｎ
Ｋ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと
分化させ、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップを含
む方法を提供する。さらに、本発明は、ＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細
胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、（１
）多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞外
マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多
能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大するステップと；（２）
中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択
で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させることに
より、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大するステップと
；（３）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、
ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖
因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ＨＥ細胞を、ｉＨ
ＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（４）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性
化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５か
らなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第４の培
地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップと；（
５）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、および
ＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む
第５の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステッ
プとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を
発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および
／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさ
らに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、
およびＷｎｔ経路活性化因子、およびＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含
む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させるステップ
を含む。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態
では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、お
よび、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させ
ることにより、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥ細胞へと分化させると、中胚葉細
胞が拡大するステップと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、
Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択され
る、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させることに
より、得られたＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させると、二次ＨＥ細胞が拡大するステッ
プと；（３）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２
、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子
およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞
前駆体へと分化させるステップと；（４）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ
７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインを含む第４の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆
体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から
得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、Ｃ
Ｄ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（
ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、Ｃ
Ｄ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートす
るステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソー
トするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の
一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰
性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞
を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、およびＴＧＦβ受容体阻害剤
のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次造血性
内皮へと分化させるステップを含む。
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生させる方法についての一実施形態では、
方法は、（１）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ
１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞由来
の二次ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（２）ｉＨ
ＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６
、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイ
ンとを含む第２の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化さ
せるステップと；（３）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ
３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子および
サイトカインを含む第３の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へ
と分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ
細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３
、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソー
トするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用
してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、Ｃ
Ｄ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは
、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態で
は、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣ
Ｒ４陰性を使用する。
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣから発生させる方法についての一実施形態で
は、方法は、（１）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、
ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増
殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞
前駆体へと分化させるステップと；（２）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ
７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数
の増殖因子およびサイトカインを含む第２の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆
体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、
ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、多能性幹細胞由
来のＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートし、得るステップをさらに含む。
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体から発生させる方法についての一実施
形態では、方法は、ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、
ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイ
トカインを含む第５の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分
化させるステップを含む。
ＩＩ．ｉＣＤ３４プラットフォーム
１．二次ｉＨＥを導出し、拡大すること（ｉＣＤ３４プラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、二次造血性内皮（ｉＨＥ）を
発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種し、拡大する第１段階
で始まる。次いで、この段階で、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉
細胞が拡大する。次いで、拡大された中胚葉集団を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴
う中胚葉集団へと分化させ、次いで、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャル
を伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大する。代替的に、本発明は、二次造血性内皮（ｉ
ＨＥ）を発生させる方法であって、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大し
；次いで、二次造血性内皮（ｉＨＥ）を、中胚葉細胞から、分化させ、拡大するステップ
を含む方法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の
実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。本発明は、二次造血性内皮（ｉＨ
Ｅ）を発生し、拡大する方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を分化させ、拡大
し、二次ｉＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を得、次いで、これらを、ｉＨＥへと
分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、二次造血性内皮
を発生し、拡大する方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化さ
せるステップを含む方法を提供する。本明細書で開示される方法は、ＥＢの形成を伴わな
い、最適化された単層ｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬ
Ｋ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用す
る。
二次造血性内皮（ｉＨＥ）を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態で
は、方法は、（１）細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と
接触させることにより、中胚葉集団を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するステップと
；（２）細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地
と接触させることにより、中胚葉集団を分化させ、拡大して、中胚葉細胞内の、二次ＨＥ
のポテンシャルを得るステップと；（３）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧ
Ｆ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカ
インのうちの１または複数とを含む培地と接触させるにより、二次ＨＥのポテンシャルを
伴う中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させ、拡大するステップとを含む。一部の実施
形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイー
ブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３
４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、お
よび／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに
含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を
使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、
およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ
３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施
形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれ
らを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４であ
る。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施
形態では、二次ＨＥのポテンシャルを達成するために、細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む培
養培地と接触させることは、中胚葉細胞への特化後に限る。一部の実施形態では、上記の
方法は、播種されたｉＰＳＣおよび／または中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸
素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性細胞を
、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させることにより、多能性幹
細胞を播種すると、多能性幹細胞が拡大するステップをさらに含む。
二次造血性内皮（ｉＨＥ）を、播種された多能性幹細胞から発生させる方法についての
一実施形態では、方法は、（１）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂ
ＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ
、拡大するステップと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子
、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、二次ｉＨＥのポテンシャルを有す
る中胚葉細胞を得るステップと；（３）中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂ
ＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイ
トカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、
ｉＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップとを含む。一
部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは
、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は
、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ
７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップ
をさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートする
ステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およ
びＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性
、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートする
ステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用
する。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まな
いか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子
は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤で
ある。一部の実施形態では、上記の方法は、播種されたｉＰＳＣおよび／または中胚葉細
胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
二次造血性内皮（ｉＨＥ）を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法につ
いての一実施形態では、方法は、（１）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活
性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥのポテンシャル
を有する中胚葉細胞を得るステップと；（２）中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧ
Ｆ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およ
びサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細
胞を、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップとを
含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する
。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳ
Ｃは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４
３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートする
ステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およ
びＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性
、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートする
ステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用
する。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まな
いか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子
は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤で
ある。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸
素圧下に置くステップをさらに含む。
多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮（ｉＨＥ）のポテンシャルを得る
方法についての一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、
ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサ
イトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させると、中胚葉細胞が拡大するス
テップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態
では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法から得ら
れたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４
、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソ
ートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧ
Ｆβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では
、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、上記の方法は
、中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
２．二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を導出し
、拡大すること（ｉＣＤ３４プラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来の中胚葉細
胞を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種する第１段階で始
まる。次いで、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと発生させる。第３段階では、中胚
葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと、さらに分化させる。代替的
に、本発明は、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を発生させる方法であって、播種された多
能性幹細胞を、中胚葉へと分化させるステップを含む方法と、中胚葉を、二次造血性ポテ
ンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させる方法とを提供する。本発明は、二次ＨＥのポテ
ンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を発生させる方法をさらに提供するが
、方法は、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細
胞へと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣであ
る。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。本明細書で開示される
方法は、最適化されたｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬ
Ｋ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用す
る。
多能性幹細胞から導出された中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得る方
法についての一実施形態では、方法は、（１）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任
意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、多能性幹細胞
から分化させ、拡大するステップと；（２）細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性
化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞内の、二次造血
性内皮のポテンシャルを得るステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、
ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実
施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこ
れらを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４で
ある。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実
施形態では、上記の方法は、多能性幹細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置く
ステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、細胞を、ＭＥＫｉ、ＧＳＫ
ｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を播種するステ
ップをさらに含む。
二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹
細胞由来の中胚葉から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、細胞を、ＢＭ
Ｐ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることによ
り、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させるステップ
を含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、
ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は
、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形
態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路
活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞
を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
３．中胚葉を、多能性幹細胞から導出し、拡大すること
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来の中胚葉を
発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種する第１段階で始まり
、次いで、第２段階で、播種された細胞を、中胚葉へと分化させる。一部の実施形態では
、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳ
Ｃである。本明細書で開示される方法は、最適化されたｉＣＤ３４培養プラットフォーム
であって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まな
い培養プラットフォームを活用する。
多能性幹細胞由来の中胚葉を、多能性細胞から作製する方法についての一実施形態では
、方法は、細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させ
ることにより、中胚葉細胞を、播種された多能性幹細胞から分化させ、拡大するステップ
とを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では
、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法における培地
は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施
形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、上記の方
法は、播種されたｉＰＳＣを、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさら
に含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性細胞を、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およ
びＲＯＣＫを含む培地と接触させることにより、ｉＰＳＣを播種し、拡大するステップを
さらに含む。
４．造血複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を導出すること（ｉＣＤ３４プラットフォームお
よびｉＭＰＰプラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来の複能性前
駆体（ｉＭＰＰ）を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種す
る第１段階で始まる。播種された細胞を拡大し、中胚葉細胞へと分化させる。中胚葉を、
二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと拡大し、分化させ、その後、中胚葉
細胞を、二次造血性内皮へと分化させる。ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと拡大し、分化
させ、次いで、好中球前駆体を含む骨髄性細胞へと分化することが可能な、複能性前駆体
へと拡大し、分化させる。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来の複能性前駆体（ｉＭ
ＰＰ）を発生させる方法であって、播種された多能性細胞を、中胚葉へと分化させ、中胚
葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、中胚葉細
胞を、二次ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉＭＰＰへと分化させるステップを
含む方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞由来のｉＭＰＰを発生させる方法であって
、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分
化させ、次いで、中胚葉細胞を、二次ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉＭＰＰ
へと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、多能性幹細
胞由来のｉＭＰＰを発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、二次ｉ
ＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉＭＰＰへと分化させるステップを含む方法を提
供する。さらに、本発明は、多能性幹細胞由来のｉＭＰＰを発生させる方法であって、多
能性幹細胞由来のｉＨＥを、ｉＭＰＰへと分化させるステップを含む方法を提供する。一
部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは
、ナイーブｉＰＳＣである。本明細書で開示される方法は、ＥＢの形成を伴わない、最適
化された単層ｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤
を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
造血複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形
態では、方法は、（１）多能性細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを
含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大する
ステップと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂ
ＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシ
ャルを得るステップと；（３）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ
、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうち
の１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次造血性内皮
のポテンシャルを有する中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップと；（４）ＨＥ細胞
を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、
ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカイン
のうちの１または複数と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることに
より、二次ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では
、上記の方法は、細胞を、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させ
ることにより、多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態
では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、Ｉ
Ｌ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１から
なる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と
接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるステップをさら
に含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるステップを
含む方法は、ｐｒｅ－ＨＳＣ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ
、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択さ
れる増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まな
いか、またはこれを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－ＨＳＣを、
ｉＭＰＰへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、
ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実
施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこ
れらを本質的に含まない。一部の実施形態では、上記の方法は、播種された多能性幹細胞
、中胚葉、および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％～
約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方
法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は
、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨ
Ｅ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは
、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステッ
プは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形
態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣ
ＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４で
ある。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実
施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。
多能性幹細胞由来の複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を、多能性幹細胞由来の中胚葉から発生
させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子
、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、多能性幹
細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るステップと；（２）細
胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からな
る群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接
触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞
から分化させ、拡大するステップと；（３）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、
ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１か
らなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択
で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰへ
と分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである
。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上
記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、Ｇ
ＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群か
ら選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させ
ることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるステップをさらに含む。
他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるステップを含む方法
は、ｐｒｅ－ＨＳＣ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ
、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖
因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないか、ま
たはこれを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－ＨＳＣを、ｉＭＰＰ
へと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法における培地は
、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形
態では、上記の方法は、中胚葉および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚
葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
多能性幹細胞由来の複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴
う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法
は、（１）細胞を、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群か
ら選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、ＲＯＣＫ阻害剤とを
含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴
う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップと；（２）ＨＥ細胞
を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、
ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカイン
のうちの１または複数と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることに
より、二次ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では
、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳ
Ｃである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯ
ＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｉ
Ｌ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１
または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと
分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ＨＳＣ
へと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ－ＨＳＣ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、Ｔ
ＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ
１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み
、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないか、またはこれを本質的に含まない培地と接触させることに
より、ｐｒｅ－ＨＳＣを、ｉＭＰＰへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形
態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれら
を本質的に含まない。一部の実施形態では、上記の方法は、二次造血性内皮のポテンシャ
ルを伴う中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む
。
多能性幹細胞由来の複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を、多能性幹細胞由来の二次ＨＥ細胞か
ら発生させる方法についての一実施形態では、方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と
、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、および
ＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と
、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、
ｉＭＰＰへと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳ
Ｃである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態
では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、Ｉ
Ｌ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１から
なる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と
接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるステップをさら
に含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ＨＳＣへと分化させるステップを
含む方法は、ｐｒｅ－ＨＳＣ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ
、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択さ
れる増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まな
いか、またはこれを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－ＨＳＣを、
ｉＭＰＰへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法におけ
る培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部
の実施形態では、上記の方法は、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約
２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
５．多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）またはＴ細胞を導出すること
（ｉＣＤ３４プラットフォームおよびｉＴプラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来のＴ細胞前
駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）または多能性幹細胞由来のＴ細胞を発生させる方法を提供する。一
般に、方法は、中胚葉細胞を、分化させ、拡大する多能性幹細胞で始まる。一部の実施形
態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブ
ｉＰＳＣである。次いで、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へ
と分化させる。その後、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、二次造血性
内皮へと分化させ、同時に、培地中で、これらを拡大する。次いで、二次ＨＥ細胞を、ｐ
ｒｅ－ｐｒｏＴへと分化させ、次いで、Ｔ細胞前駆体（ｐｒｏ－Ｔ）へと分化させ、同じ
培地中で、これらを、引き続き、Ｔ細胞へと分化させることができる。代替的に、本発明
は、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）またはＴ細胞を発生させる方法で
あって、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと分化させ、中胚葉を、二次造血性内皮の
ポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、二次造血性内皮のポテンシャルを
伴う中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞
へと分化させるステップを含む方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞由来のＴ細胞前
駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）またはＴ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚
葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、これらを
、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉｐｒｏ－ＴまたはＴ細胞へと分化させるス
テップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のＴ細胞前
駆体またはＴ細胞を発生させる方法であって、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多
能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉｐｒｏ－Ｔ
またはＴ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、多能性
幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）またはＴ細胞を発生させる方法であって、多
能性幹細胞由来のｉＨＥを、ｉｐｒｏ－ＴまたはＴ細胞へと分化させるステップを含む方
法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態
では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。本明細書で開示される方法は、最適化され
たｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない
か、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。一部の実施形態
では、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４を含むがこれら
に限定されないＮｏｔｃｈ因子を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペ
プチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチド
として導入することができる。
多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）またはＴ細胞（ｉＴ）を、多能性幹
細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＢＭＰ活性
化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、播種された多能
性幹細胞を、中胚葉へと分化させるステップと；（２）細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎ
ｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉を、二次
造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させるステップと；（３）細胞を、
ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群か
ら選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させ
ることにより、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分
化させるステップと；（４）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群
から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥ
ＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、
ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ－Ｔま
たはｉＴへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、細胞を
、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させることにより、多能性幹
細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、
ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実
施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣ
Ｆ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子
およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次Ｈ
Ｅ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒｏＴへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、
二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒｏＴへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ－ｐｒ
ｏＴ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およ
びサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、
およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含ま
ない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－ｐｒｏＴを、ｉｐｒｏ－ＴまたはｉＴへと分
化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性幹細胞由来
のｐｒｏ－Ｔを、１または複数のＮｏｔｃｈ因子と共にステップを含む。一部の実施形態
では、Ｎｏｔｃｈ因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、またはＤＬＬ
－４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、可溶性ペプチド、ビ
ーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、また
は細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。一部の実施形態では、上
記の方法は、播種された多能性幹細胞、中胚葉、および／または二次造血性内皮のポテン
シャルを伴う中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに
含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する
。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／または
ＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の
実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎ
ｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、
Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地
は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）またはＴ細胞を、多能性幹細胞由来
の中胚葉から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＢＭＰ
活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより
、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させるステップと
；（２）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ
１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含
む培地と接触させることにより、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、二
次ＨＥ細胞へと分化させるステップと；（３）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、および
ＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、
任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１また
は複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を
、ｉｐｒｏ－ＴまたはｉＴへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、多能
性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣであ
る。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻
害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択さ
れる増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることに
より、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒｏＴへと分化させるステップをさらに含む。他の実
施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒｏＴへと分化させるステップを含む方法は、
ｐｒｅ－ｐｒｏＴ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される
増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ
活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを
本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－ｐｒｏＴを、ｉｐｒｏ－Ｔまた
はｉＴへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能
性幹細胞由来のｐｒｏ－Ｔを、１または複数のＮｏｔｃｈ因子と接触させるステップを含
む。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ
－３、またはＤＬＬ－４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、
可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさ
せたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。一部
の実施形態では、上記の方法は、中胚葉および／または二次造血性内皮のポテンシャルを
伴う中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一
部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の
実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ
４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態
では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活
性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６
３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧ
Ｆβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）またはＴ細胞（ｉＴ）を、二次造血
性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法につい
ての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、
ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカイン
のうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次造血性内皮のポテンシ
ャルを伴う中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させるステップと；（２）ＨＥ細胞を、
ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカイ
ンのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からな
る群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させる
ことにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ－ＴまたはｉＴへと分化させるステップとを含む
。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳ
Ｃは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭ
Ｐ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＶＥＧＦ、およびｂ
ＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを
含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒｏＴへと分化させるス
テップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒｏＴへと分化さ
せるステップを含む方法は、ｐｒｅ－ｐｒｏＴ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ
７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、
ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を
含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－ｉ
ｐｒｏＴを、ｉｐｒｏ－ＴまたはｉＴへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施
形態では、上記の方法は、多能性幹細胞由来のｐｒｏ－Ｔを、１または複数のＮｏｔｃｈ
因子と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ因子は、Ｊａｇ１、
Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、またはＤＬＬ－４である。一部の実施形態では、Ｄ
ＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチ
ド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとし
て導入することができる。一部の実施形態では、上記の方法は、二次造血性内皮のポテン
シャルを伴う中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに
含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する
。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／または
ＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の
実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎ
ｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、
Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地
は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－Ｔ）またはＴ細胞（ｉＴ）を、多能性幹
細胞由来のＨＥ細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、二次ＨＥ細
胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイ
トカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子
からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触
させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ－ＴまたはＴへと分化させるステップを含
む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰ
ＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、Ｂ
ＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＶＥＧＦ、および
ｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と
を含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒｏＴへと分化させる
ステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒｏＴへと分化
させるステップを含む方法は、ｐｒｅ－ｐｒｏＴ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩ
Ｌ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み
、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数
を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－
ｉｐｒｏＴを、ｐｒｏ－ＴまたはｉＴへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施
形態では、上記の方法は、多能性幹細胞由来のｐｒｏ－Ｔを、１または複数のＮｏｔｃｈ
因子と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ因子は、Ｊａｇ１、
Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、またはＤＬＬ－４である。一部の実施形態では、Ｄ
ＬＬ－１およびＤＬＬ－４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチ
ド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとし
て導入することができる。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性幹細胞由来のＨＥ
細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形
態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態で
は、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用し
て、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法
のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は
、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２または
チアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体
阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
６．多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）またはＮＫ細胞を得るこ
と（ｉＣＤ３４プラットフォームおよびｉＮＫプラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞
前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を発生させる方法を提供する。一般
に、方法は、一部の実施形態では、播種される、多能性幹細胞で始まる。多能性幹細胞を
、中胚葉細胞へと発生させ、これらを拡大し、その後、二次造血性内皮のポテンシャルを
伴う中胚葉細胞へと分化させる。次いで、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシ
ャルを伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大する。ＨＥ細胞は、ｐｒｅ－ｐｒｏＮＫへと
分化させ、次いで、ＮＫ細胞前駆体（ｐｒｏ－ＮＫ）へと分化させることが可能であり、
同じ培地中で、これらを、引き続き、ＮＫ細胞へと分化させることができる。代替的に、
本発明は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）またはＮＫ細胞を発生
させる方法であって、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと分化させ、中胚葉を、二次
造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、二次造血性内皮のポ
テンシャルを伴う中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ＮＫ細胞前駆
体へと分化させるステップを含む方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞由来のＮＫ細
胞前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）またはＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由
来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、
二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これ
らを、ｉｐｒｏ－ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップを含む方法をさらに提供する
。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体またはｉＮＫを発生させる方
法であって、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、
ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉｐｒｏ－ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるス
テップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（
ｉｐｒｏ－ＮＫ）またはＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＥ
を、ｉｐｒｏ－ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップを含む方法を提供する。一部の
実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナ
イーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラット
フォームは、ｐｒｏ－ＮＫ細胞を、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原で
あって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で
導入される人工抗原のうちの１または複数と接触させることにより、ＮＫ細胞を導出する
ステップを含む。本明細書で開示される方法は、最適化されたｉＣＤ３４培養プラットフ
ォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に
含まない培養プラットフォームを活用する。
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を、
播種されたｉＰＳＣから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞
を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、
中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するステップと；（２）中胚葉細胞を、
ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させること
により、中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るステップと；（３）細胞
を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる
群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触
させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞か
ら分化させ、拡大するステップと；（４）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、Ｉ
Ｌ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１
または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択
される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、
二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ－ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップとを含む。一部の
実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナ
イーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化
因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＶＥＧＦ
、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１また
は複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｉｐｒｏＮＫへ
と分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒ
ｏＮＫへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ－ｐｒｏＮＫ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイ
トカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、および
ＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培
地と接触させることにより、ｐｒｅ－ｐｒｏＮＫを、ｐｒｏ－ｉＮＫまたはｉＮＫへと分
化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養
プラットフォームは、ｐｒｏ－ＮＫ細胞を、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人
工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞
の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数と接触させることにより、ＮＫ細胞を
導出するステップを含む。一実施形態では、上記の方法は、多能性細胞を、ＭＥＫｉ、Ｇ
ＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させることにより、ナイーブ多能性細胞を播
種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、播種された
ｉＰＳＣ、中胚葉、および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、
約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、
上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記
の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得ら
れたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするス
テップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートす
るステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部
の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、
およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、Ｂ
ＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。
一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部
の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、また
はこれらを本質的に含まない。
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を、
多能性幹細胞由来の中胚葉から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１
）中胚葉を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接
触させることにより中胚葉を分化させ、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細
胞を得るステップと；（２）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、
ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの
１または複数とを含む培地と接触させることにより二次造血性内皮のポテンシャルを伴う
中胚葉細胞を分化させ、二次ＨＥ細胞を得るステップと；（３）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆ
ｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサ
イトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因
子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接
触させることにより二次ＨＥ細胞を分化させ、ｉｐｒｏ－ＮＫまたはｉＮＫを得るステッ
プとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態で
は、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細
胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、
ＩＬ１５、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカ
インのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒ
ｅ－ｐｒｏＮＫへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞
を、ｐｒｅ－ｐｒｏＮＫへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ－ｐｒｏＮＫ細胞
を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増
殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活
性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本
質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－ｐｒｏＮＫを、ｉｐｒｏ－ＮＫま
たはｉＮＫへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体
を得るための培養プラットフォームは、ｐｒｏ－ＮＫ細胞を、ＮＫの増殖、発生、および
成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／ま
たは抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数と接触させることに
より、ＮＫ細胞を導出するステップを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉
および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％～約１０％の
間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得ら
れたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４
、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソ
ートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４
陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ
３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソ
ートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰
性を使用する。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部
の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では
、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上
記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に
含まない。
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を、
二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方
法についての一実施形態では、方法は、（１）二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚
葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１か
らなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地
と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を分化させ、拡大するステップと；（２）ＨＥ細
胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される
増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ
、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤
とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ－ＮＫまたはｉＮＫへ
と分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである
。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上
記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ
、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖
因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二
次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｉｐｒｏ－ＮＫへと分化させるステップをさらに含む。他の実施
形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｐｒｏ－ＮＫへと分化させるステップを含む方法は
、ｐｒｅ－ｐｒｏＮＫ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５か
らなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥ
ＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含ま
ないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－ｐｒｏ
ＮＫを、ｉｐｒｏ－ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施
形態では、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、ｐｒｏ－ＮＫ細胞を、
ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション
、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１また
は複数と接触させることにより、ＮＫ細胞を導出するステップを含む。一部の実施形態で
は、上記の方法は、播種された多能性幹細胞、中胚葉、および／または二次造血性内皮の
ポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップを
さらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発
現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／
またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。
一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用す
る。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、および
ＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽
性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態で
は、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性
化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３
２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦ
β受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ－ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を、
多能性幹細胞由来のＨＥ細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、二
次ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選
択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、
ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣ
Ｋ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ－ＮＫまたは
ｉＮＫへと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ
である。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態で
は、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌ
ｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択され
る増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることによ
り、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｉｐｒｏＮＫへと分化させるステップをさらに含む。他の
実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ－ｉｐｒｏ－ＮＫへと分化させるステップを含む
方法は、ｐｒｅ－ｐｒｏＮＫ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ
１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み
、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数
を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ－
ｐｒｏＮＫを、ｉｐｒｏ－ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップをさらに含む。一部
の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、ｉｐｒｏ－ＮＫ
細胞を、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲ
ーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうち
の１または複数と接触させることにより、ＮＫ細胞を導出するステップを含む。一部の実
施形態では、上記の方法は、播種された多能性幹細胞、中胚葉、および／または二次造血
性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くス
テップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ
３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、
および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさら
に含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性
を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性
、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、Ｃ
Ｄ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実
施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ
経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ
２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は
、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
上記に照らすと、本明細書で想定される培養プラットフォームにより提示される利点の
うちの１つは、多能性幹細胞の分化のためのＥＢの形成を伴わずに、単一多能性細胞を培
養し、継代培養し、解離させることによる生存率および生存の増強である。一部の実施形
態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブ
ｉＰＳＣである。単一細胞懸濁液への解離など、細胞の、単一細胞への解離は、酵素的手
段または機械的手段により達することができる。本発明の方法では、細胞の、単一細胞へ
の解離を可能とすることが当技術分野で公知である、任意の酵素的薬剤を使用することが
できる。一実施形態では、解離剤を、トリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ－Ｓｅｌｅｃ
ｔ、コラゲナーゼＩＶ、およびディスパーゼから選択する。また、ＥＤＴＡ、Ａｃｃｕｔ
ａｓｅ、またはＡｃｃｕＭａｘなどのキレート剤も、本明細書で想定される方法に従う細
胞の解離において、単独で、または酵素的薬剤と組み合わせて、使用することができる。
解離剤は、単一細胞への解離を容易とするように、カルシウムおよびマグネシウムを含ま
ないＰＢＳ中に溶解させることができる。一部の実施形態では、解離の間および解離後に
おける細胞の生存を増強するために、生存促進物質、例えば、１または複数の増殖因子、
細胞死およびアポトーシスに関与する細胞経路の阻害剤、または馴化培地を添加する。一
実施形態では、生存促進物質は、チアゾビビンを含むがこれらに限定されない、ＲＯＣＫ
阻害剤である。
細胞培養および培地回収における技法については、Huら、Curr. Opin. Biotechnol.
、８巻：１４８頁、１９９７年；K. Kitano、Biotechnology、１７巻：７３頁、１９９
１年；Curr. Opin. Biotechnol.、２巻：３７５頁、１９９１年；Birchら、Bioprocess
Technol.、１９巻：２５１頁、１９９０年；「Teratocarcinomas and embryonic st
em cells: A practical approach」（E. J. Robertson編、IRL Press Ltd.、１
９８７年）；「Guide to Techniques in Mouse Development」（P. M. Wasserman
ら編、Academic Press、１９９３年）；「Embryonic Stem Cell Differentiation i
n vitro」（M. V. Wiles、Meth. Enzymol.、２２５巻：９００頁、１９９３年）；「
Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application
to Human Biology and Gene Therapy」（P. D. Rathjenら、１９９３年）にお
いて概括されている。幹細胞の分化については、Robertson、Meth. Cell Biol.、７５
巻：１７３頁、１９９７年；およびPedersen、Reprod. Fertil. Dev.、１０巻：３１頁
、１９９８年において総説されている。
本発明では、特異的特徴付けにより細胞の集団を濃縮するための戦略が、方法の多様な
段階で提供される。一実施形態では、多能性幹細胞を、細胞集団から濃縮する方法は、集
団内の細胞を解離させることにより、単一細胞懸濁液を制作するステップと、細胞を再懸
濁させるステップとを含む。解離させた細胞は、細胞を維持するか、または細胞ソートを
実施するのに適する、任意の溶液中または培地中に再懸濁させることができる。特定の実
施形態では、多能性単一細胞懸濁液は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ
阻害剤を含有し、ＴＦＧβ阻害剤を欠く。ある特定の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、
ＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１であり、かつ／または
Ｒｏｃｋ阻害剤は、チアゾビビンである。
特定の実施形態では、多能性細胞をポジティブに選択するように、細胞の集団をソート
し、かつ／または集団から、再プログラム化されていないか、もしくは非多能性細胞を枯
渇させ、これにより、多能性細胞について濃縮された細胞の集団を得る。一実施形態では
、単一細胞懸濁液を調製し、次いで、例えば、適切な抗体を使用して多能性のマーカーに
ついて染色することなどによりソートするための単一細胞を調製する。細胞は、磁気ビー
ズソートまたはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）ソートなどにより細胞をソートする、
任意の適切な方法によりソートすることができる。
細胞は、限定せずに述べると、ＳＳＥＡ３／４、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８
５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１
３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮ
ＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＳＳＥＡ１（マウス）、ＣＤ３０、ＳＳＥＡ５、ＣＤ９０、
および／またはＣＤ５０の発現を含む、多能性についての１もしくは複数のマーカー、ま
たは細胞の分化を指し示すマーカーに基づきソートすることができる。様々な実施形態で
は、細胞を、多能性または分化についての、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少
なくとも４つのマーカーに基づきソートする。ある特定の実施形態では、細胞は、ＳＳＥ
Ａ４の発現に基づきソートし、ある特定の実施形態では、ＴＲＡ１－８１および／または
ＴＲＡ１－６０と組み合わせた、ＳＳＥＡ４の発現に基づきソートする。ある特定の実施
形態では、細胞を、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１、またはＴＲＡ１－６０、および／また
はＣＤ３０の発現に基づきソートする。一実施形態では、細胞を、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１
－８１、およびＣＤ３０に基づきソートする。別の実施形態では、細胞を、ＳＳＥＡ４、
ＴＲＡ１－６０、およびＣＤ３０に基づきソートする。ある特定の実施形態では、分化に
ついての１または複数の表面マーカーを使用する細胞のソートは、ＣＤ１３、ＣＤ２６、
ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６およびＣＤ７、ならびにＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１
－８１、および／またはＣＤ３０などの多能性マーカーを含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、再プログラム化を経る細胞の集団、または多能性細胞の集団は、
分化した細胞から枯渇される。一実施形態では、多能性細胞の集団、または再プログラム
化するように誘導された細胞は、分化した細胞についての、１または複数の細胞表面マー
カーを有する細胞から枯渇され得る。分化する細胞についての細胞表面マーカーの例示的
な例は、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、およびＣＤ７
を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ＣＤ１３を、分化細胞についての
表面マーカーとして使用する。
他の実施形態では、細胞の集団を、所望の系統へと分化するように誘導し、多能性細胞
を枯渇させて、濃縮された分化しているか、または分化した細胞の集団を得る。一部の実
施形態では、分化した細胞の集団は、特異的系統へと分化するように誘導されたＥＳＣま
たはｉＰＳＣなどの細胞の集団を含む。一部の実施形態では、上記で記載したネガティブ
細胞ソート法（「パニング」）、など、多能性のマーカーに基づく磁気ビーズまたはＦＡ
ＣＳに従う、集団内の細胞のソートを使用して、細胞の集団から、多能性細胞を枯渇させ
ることができる。一部の実施形態では、分化細胞を含む細胞の集団を、多能性マーカーを
使用するＦＡＣＳによりソートし、多能性マーカーを発現する細胞を枯渇させた画分を得
る。他の実施形態では、細胞の集団を、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ
３１、ＣＤ４６、およびＣＤ７を含むがこれらに限定されない系統特異的マーカーなど、
分化についてのマーカーに基づくＦＡＣＳによりソートして、多能性のマーカーを枯渇さ
せた画分を得る。本発明の一部の特定の実施形態では、ＣＤ１３を、分化細胞についての
表面マーカーとして使用する。
Ｄ．本明細書で提示される方法およびプラットフォームにより発生させた細胞集団および
細胞株
一部の実施形態では、再プログラム化の後で培養した細胞を、少なくとも１、２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２
８、３０、３２、３５、４０、４２、もしくは４５日間、またはこれらの間の任意の日数
にわたり、分化するように誘導する。一部の実施形態では、再プログラム化の後で培養し
た細胞を、約１～４２日間、２～４０日間、２～３５日間、２～２０日間、２～１０日間
、４～３０日間、約４～２４日間、約６～２２日間、または約８～約１２日間にわたり誘
導する。一部の実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞である。一部の実施
形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一実施形態では、濃縮は、クローン多
能性幹細胞由来の分化細胞コロニーを、比較的短時間で得、これにより、多様な段階にあ
る、多能性幹細胞由来の分化細胞を発生させる効率を改善するための方法をもたらす。一
実施形態では、濃縮は、ＣＤ３４を発現するＨＥ細胞、ＣＤ３４を発現するＨＳＣ細胞、
Ｔ細胞前駆体またはＮＫ細胞前駆体、およびＴ細胞またはＮＫ細胞を導出し、これにより
、細胞集団の各々を発生させる効率を改善するための方法をもたらす。濃縮は、分化段階
／細胞型を示す特異的な特徴的マーカーを発現する細胞を識別し、得るように、細胞の集
団をソートすることを含みうる。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４、Ｃ
Ｄ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用する。一部の実施形態では、ソート
することは、ＣＤ３４陽性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３
４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３
４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソー
トすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使
用する。さらなる濃縮法は、所望されない細胞型を表すマーカーを発現する細胞の枯渇で
あって、所望される細胞型の、濃縮された集団を得る枯渇を含む。
従って、本発明の一態様は、（ｉ）多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋ ＨＥ細胞（ｉＣＤ
３４）であって、上記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ
３４＋ ＣＤ４３－である、ＣＤ３４＋ ＨＥ細胞；（ｉｉ）多能性幹細胞由来の二次造
血性内皮（ｉＨＥ）であって、上記ｉＨＥ細胞株またはクローン細胞がＣＤ３４＋である
、二次造血性内皮；（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）であって、Ｃ
Ｄ３４＋ ＣＤ４５＋であり、長期にわたる生着に適するｉＨＳＣ；（ｉｖ）多能性幹細
胞由来の複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）であって、上記ｉＭＰＰ細胞がＣＤ３４＋ ＣＤ４
５＋である、複能性前駆細胞；（ｖ）多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏＴ）で
あって、ＣＤ３４＋ ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体；（ｖｉ）多能性幹細胞由来のＴ細胞
（ｉＴＣ）であって、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞；（ｖｉｉ）多能性幹細胞由
来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏＮＫ）であって、ＣＤ５６＋ ＣＤ３－であるＮＫ細胞前
駆体；ならびに（ｖｉｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞（ｉＮＫ）であって、ＣＤ５６
＋ＣＤ５７＋ＣＤ１６＋であるＮＫ細胞の、１または複数の細胞集団、細胞株、またはク
ローン細胞を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、上記の組成物、細胞集団、細
胞株、またはクローン細胞は、低温保存に適する。一部の実施形態では、組成物、細胞集
団、細胞株、またはクローン細胞は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間を超える
が、３日間、４日間、５日間、６日間、または１週間を超えない期間にわたる周囲保存条
件に適する。
本発明の別の態様は、（ｉ）ＣＤ３４＋ ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、ならびにｉＭＰＰ
－Ａ、ｉＴＣ－Ａ１、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ１、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ１、ｉＮ
Ｋ－Ａ２、ｉＮＫ－Ｂ１、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される、１もしくは複数の培養培
地；（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）、ならびにｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ１、ｉＴＣ
－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ１、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉＮＫ－Ａ１、ｉＮＫ－Ａ２、ｉＮＫ－Ｂ１、お
よびｉＮＫ－Ｂ２から選択される、１もしくは複数の培養培地；（ｉｉｉ）二次ＨＳＣ、
ならびにｉＭＰＰ－Ａ、ｉＴＣ－Ａ１、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ１、ｉＴＣ－Ｂ２、ｉ
ＮＫ－Ａ１、ｉＮＫ－Ａ２、ｉＮＫ－Ｂ１、およびｉＮＫ－Ｂ２から選択される、１もし
くは複数の培養培地；（ｉｖ）複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）およびｉＭＰＰ－Ａ；（ｖ）
Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏＴ）、ならびにｉＴＣ－Ａ１、ｉＴＣ－Ａ２、ｉＴＣ－Ｂ１、お
よびｉＴＣ－Ｂ２から選択される、１もしくは複数の培養培地；（ｖｉ）Ｔ細胞（ｉＴＣ
）、およびｉＴＣ－Ｂ１もしくはｉＴＣ－Ｂ２；（ｖｉｉ）ＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏＮ
Ｋ）、ならびにｉＮＫ－Ａ１、ｉＮＫ－Ａ２、ｉＮＫ－Ｂ１、およびｉＮＫ－Ｂ２から選
択される、１もしくは複数の培養培地；ならびに／または（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞（ｉＮＫ
）、およびｉＮＫ－Ｂ１もしくはｉＮＫ－Ｂ２；（ｉｘ）ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）、ならびに
ｉＨＳＣ－Ａ、ｉＨＳＣ－Ｂ、およびｉＨＳＣ－Ｃに由来する多能性幹細胞のうちの１ま
たは複数を含む混合物であって、
ａ．ｉＨＳＣ－Ａが、Ｗｎｔ経路活性化因子およびＢＭＰ活性化因子を含み；
ｂ．ｉＨＳＣ－Ｂが、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、Ｔ
ＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み；
ｃ．ｉＨＳＣ－Ｃが、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５
、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増
殖因子およびサイトカインとを含む。一部の実施形態では、組成物が、Ｗｎｔ経路活性化
因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず；
ｄ．ｉＴＣ－Ａ１が、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、Ｉ
Ｌ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカ
インと、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４からなる群か
ら選択される、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；一部の実施形態では
、組成物が、ＶＥＧＦおよび／またはＩＬ１５を含まず；
ｅ．ｉＴＣ－Ｂ１が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、および
ＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、Ｊａ
ｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、およびＤＬＬ－４からなる群から選択される
、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み（ｉＨＳＣプラットフォーム）；一
部の実施形態では、組成物が、ＢＭＰ活性化因子を含まず；
ｆ．ｉＮＫ－Ａ１が、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、
ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子お
よびサイトカインとを含み；
ｇ．ｉＮＫ－Ｂ１が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６
、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイ
ンを含み；
ｈ．ｉＣＤ３４－Ｃが、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、お
よびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと
を含み；ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
ｉ．ｉＭＰＰ－Ａが、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭ
ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から
選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｊ．ｉＴＣ－Ａ２が、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、およびｂＦ
ＧＦと；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の
増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｋ．ｉＴＣ－Ｂ２が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、
１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み；組成物が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｂ
ＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず；
ｌ．ｉＮＫ－Ａ２が、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、およびｂＦ
ＧＦと、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ１５からなる群から選択される、１または複
数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｍ．ｉＮＫ－Ｂ２が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選
択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む
混合物を提供する。
以下の実施例は、例示を目的として提示されるものであり、限定を目的として提示され
るものではない。
（実施例１）
ｈｉＰＳＣの発生および維持
ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＬａｒｇｅＴ、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２、またはＯＣＴ４／ＳＯＸ２
／ＮＡＮＯＧ／ＬａｒｇｅＴを含む多様な因子の組合せを、ＲＯＣＫ経路阻害剤、ＭＥＫ
経路阻害剤、ＧＳＫ３経路阻害剤、およびＴＧＦβ受容体阻害剤を含有する再プログラム
化培地（Valamehrら、Sci Rep.、２０１２年、２巻：２１３頁）の存在下で使用して、
線維芽細胞および血液細胞を含む体細胞を、多能性状態へと再プログラム化するように誘
導した。誘導の１４日後、再プログラム化集団を、ＲＯＣＫ経路阻害剤、ＧＳＫ３経路阻
害剤、およびＭＥＫ経路阻害剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および白血病
阻害因子（ＬＩＦ）を含有する維持培地（Valamehrら、Stem Cell Reports、２０１４
年、２巻（３号）：３６６～３８１頁）へと切り換えた。細胞を、無制限に、維持培地中
で保った。
誘導のおよそ３週間後、再プログラム化集団を、９６ウェルプレートの個々のウェルへ
とソートした。選択されたクローンを特徴付け、完全に再プログラム化されたクローンで
あって、ナイーブｈｉＰＳＣを表すクローンを、分化研究のために選択した（Valamehrら
、Stem Cell Reports、２０１４年、２巻（３号）：３６６～３８１頁）。維持の間お
よび分化後における未分化細胞パーセントを決定するために、フローサイトメトリー解析
を、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１８１、およびＣＤ３０の同時表面発現について行った。
（実施例２）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する造血分化
造血系統細胞への分化を誘発するために、ナイーブｈｉＰＳＣを、維持培地中単層とし
て播種し、およそ２５％のコンフルエンシーに達するまで拡大させた。この時点で、培養
培地を、ｉＨＳＣ－Ａへと切り換えることにより、造血分化を誘発した（図１を参照され
たい）。図１に例示される通り、その後、分化の誘発の４８時間後に、培養物を、ｉＨＳ
Ｃ－Ｂへと切り換えるのに続き、分化の誘発の４～５日目に、ｉＨＳＣ－Ｃへと切り換え
た。付着培養物は、接着させたまま維持し、培地交換の間に撹乱しなかった。
分化工程中の早期に、指向性分化を、系統マーカーである、ＣＤ５７、ＮＥＳＴＩＮ、
ＳＯＸ１７、およびＢＲＡＣＨＹＵＲＹによりモニタリングした。図３は、指向性分化に
よる、外胚葉系統から離れ、中胚葉系統に向かうシフトを示す。後続の分化段階を通して
、造血細胞のクラスターと類似する形態である丸い細胞（図４Ａ）、ｈｉＰＳＣ関連表面
マーカーの喪失（図４Ｂ）、ならびにＢｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、およ
びＣＤ４５など、表面マーカーの出現（図４Ｃおよび４Ｄ）からなるｈｉＰＳＣ形態が、
分化集団へと付与された。９日目（この時点は、最適には１４日目まで延長されうる）に
、細胞を、単一細胞へと解離させ、ＣＤ３４およびＣＤ４５の表面発現について解析した
（図５Ａ～５Ｃ）。単一細胞の解離は、最も一般的にはＡｃｃｕｔａｓｅによって支援さ
れ、４０μｍのメッシュを通して濾過して単一細胞を回収した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａまた
はＭＡＣＳによる濃縮を使用して、ＣＤ３４陽性細胞またはＣＤ３４およびＣＤ４５陽性
細胞を、さらなる処理および試験のために回収した。
（実施例３）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する分化に続く、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける特徴付
けおよび試験
分化させた二次造血幹細胞の拡大可能性およびそれが維持されるかを決定するため、Ｃ
Ｄ３４でソートまたは濃縮された集団を、Ｓｔｅｍｓｐａｎ造血幹細胞培養培地（Ｓｔｅ
ｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）、１×Ｃ
Ｃ１１０サプリメント（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍ
ＬのｂＦＧＦ、および５μＭのチアゾビビンまたは１０μＭの２７６３２ ＲＯＣＫ阻害
剤を補充した（最初の数日間、生存を改善するために培養中に）懸濁培養物へと移した。
培養に、新鮮培地を、隔日でフィードし、ピペッティングして、ＣＤ３４陽性でソートさ
れた細胞の***から生じる凝集物をバラバラにした。数週間培養した後、スケーリングさ
れた懸濁培養を、表面マーカーの発現および生細胞数によって評価および測定した。図８
で裏付けられる通り、ＣＤ３４ソート集団は、ＣＤ３４集団の喪失を最小限として、培養
で２２日間にわたり維持された。懸濁培養物の生存率を改善するために、ＲＯＣＫ経路の
低分子阻害剤を添加した。図７は、ＲＯＣＫ阻害の存在下における、単一細胞解離物の継
代培養後の細胞の生存および増殖を示す。図６Ａ～６Ｃは、図１に記載される分化法の改
善であって、単層培養およびＥＢ培養の両方へと適用された改善を示すが、単層フォーマ
ットでは、ＥＢにより介在される分化と比較して、より高パーセントのＣＤ３４細胞が存
在することが示された。
（実施例４）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する分化に続く、ｉｎ ｖｉｖｏにおける再構成
導出された二次造血幹細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける機能性および生着のポテンシャ
ルを示すために、上記で記載したｈｉＰＳＣ分化工程から導出されたＣＤ３４陽性細胞を
、ＦＡＣＳ Ａｒｉａを使用してソートするか、またはＭＡＣＳビーズを使用して濃縮し
た。回収された細胞を、トリパンブルー染色によりカウントして、生存率を決定した。お
よそ３０，０００個のＣＤ３４陽性生細胞を、ＨＢＳＳ中に再懸濁させ、眼窩後注射を介
して、ＮＳＧマウスへと導入した。ＮＳＧマウスは、生着研究の前に、致死線量未満の３
００ｒａｄで、２４時間にわたり照射した。加えて、ソートされていない分化集団（最大
で２５０，０００個）のほか、ヒト末梢血もまた、対照として、ＮＳＧマウスへと導入し
た。２週間ごとに、マウスから採血し、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、およびＣＤ３
を含むヒト特異的マーカーを使用して、ヒト血液の寄与について評価した。図９Ａは、ヒ
トＣＤ４５マーカーをもっぱら発現する細胞の存在と共に見られる通り、生着したＣＤ３
４陽性細胞の、１２週間にわたる再構成を裏付ける。データはまた、骨髄系集団およびリ
ンパ系集団の両方を発生させる、生着細胞の多系統能も示す。図９Ｂは、Ｔ細胞およびＢ
細胞の両方を伴う、ＣＤ３４＋細胞の、１８週間にわたる再構成を裏付ける。
（実施例５）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する分化に続く、低分子モジュレーション
薬理学的モジュレーションに応答する、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性二次造血幹細胞
の能力について評価するため、ＣＤ３４でソートまたは濃縮された細胞を、公知のモジュ
レーターで処理した。３７℃で一晩にわたるインキュベーションの後、ＣＤ３４陽性細胞
を、表面ＰＤＬ１発現の上方調節を含む薬理学的応答についてフローサイトメトリーによ
り評価した。媒体対照と比較して、優により多く処理されたＣＤ３４細胞は、開示される
方法を使用して、ナイーブｈｉＰＳＣから導出されたＣＤ３４陽性細胞の、免疫調節潜在
力の指標である、集団全般の全発現の増大に加えて、ＰＤＬ１表面タンパク質の上方調節
（図１１を参照されたい）を裏付けた。
（実施例６）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する分化に続く、特異的造血系への分化の継続
ソートまたは濃縮されたＣＤ３４陽性細胞を、造血系へと、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含
む、多様な特異的細胞型に向かってさらに分化させた。Ｔ細胞に特異的なＣＤ３４陽性細
胞を濃縮して、フィーダー細胞を含有しない懸濁培養物またはＯＰ９間質細胞を含有する
接着培養物またはマトリゲルコーティングされた表面へと移した。設定に関わりなく、培
養物に、可溶性ＤＬＬ１およびＤＬＬ４を含有するｉＴＣ－Ａ１を補充した（図１）。お
よそ１０日後、培養の設定を、ｉＴＣ－Ｂ１へと切り換えて、Ｔ細胞の成熟を完了させた
。およそ３０～４０日後（当初の分化誘導後）、細胞集団を、ＣＤ３、ＣＤ７、ＴＣＲα
β、ＣＤ４、およびＣＤ８の表面発現を含むＴ細胞の組成について評価した。図１０は、
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、導出されたＣＤ３４陽性細胞の分化能力であって、ＣＤ７集
団からの、ＣＤ４およびＣＤ８の発現により規定される、別個のＴ細胞の集団を発生させ
る分化能力を示す。
ＮＫ細胞に特異的なＣＤ３４陽性細胞を、ＩＬ１５、ｉＮＫ－Ａ１培地（図２）を含む
分化培地で、およそ１０日間にわたり処理し、ｉＮＫ－Ｂ１培地（図２）へと切り換えて
、さらに１０～２０日間にわたり処理した（図１０におけるＣＤ５６陽性集団を参照され
たい）。培養は、懸濁フォーマットで実施した。
本明細書で記載される多段階分化プラットフォームは、逐次的分化法を使用して、二次
造血幹細胞を、多能性幹細胞を含む、様々な幹細胞、前駆細胞、または分化転換細胞から
導出する工程を示した。導出されたＣＤ３４陽性造血幹細胞は、スケーリングのために、
懸濁培養物中で保つことができ、造血幹細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を含む、多系統の
造血細胞型を発生させうる。さらに、導出されたＣＤ３４陽性二次造血幹細胞は、免疫調
節性表面タンパク質であるＰＤＬ１を上方調節することにより、薬理学的モジュレーショ
ンに応答することも示された（図１１）。なおさらに、生着させると、導出されたＣＤ３
４陽性細胞は、骨髄系集団およびリンパ系集団の両方の再構成を含む、ｉｎ ｖｉｖｏに
おける再構成が可能であった（図９）。多能性幹細胞を含む多様な集団から導出された二
次造血幹細胞は、患者特異的治療および再生への医学適用に理想的な候補物質である。
（実施例７）
ｉＣＤ３４培養プラットフォームを使用する造血分化、および生着のポテンシャルを有す
るＨＥ集団の識別
上記のｉＨＳＣプラットフォームを、造血系細胞の分化のためにさらに最適化した。造
血系への分化を誘発するため、ｈｉＰＳＣを、０日目（Ｄ０）に、維持培地中の単層とし
て播種し、約２４時間にわたり、接着および拡大を可能とした。１日目であるこの時点で
、維持培地を除去し、維持因子を伴わない基礎培地に置きかえた。培養培地を、ｉＣＤ３
４－Ａへと切り換えることにより、約２日目に、造血分化を誘発した（図１２を参照され
たい）。図１２に例示される通り、３日目に、培養培地に増殖因子であるｂＦＧＦを補充
し、その後、分化のために、ｉＣＤ３４－Ｂ培地へと切り換えた。それらを単一細胞へと
解離させる時点である約５日目～６日目まで、単層を維持し、約１０日目における分化ま
で、ｉＣＤ３４－Ｃ培地中の、低密度の単層として播種した。約２日目における造血分化
の開始から、分化の約１０日目まで、低酸素圧（２～１０％のＯ２）を維持した。
培養工程中に、造血系への指向性分化を、単層の、単一細胞への解離と、ＣＤ３４、な
らびに、任意選択で、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ７３である表面マー
カーの発現についての解析とによりモニタリングした（図１５Ａ）。分化の約８日目に、
ＨＥを表す細胞集団の出現を、細胞表面発現シグネチャーであるＣＤ３４＋により観察し
た。ＣＤ３４＋細胞内ではまた、ＣＤ４３－ ＣＸＣＲ４－ ＣＤ７３－も観察された。
ＣＤ３４＋集団は、約１０日目まで維持された（図１５Ａ）。約９日目まで早めることも
でき、約１２日目まで延期することもできる、１０日目時点で、細胞を、単一細胞へと解
離させ、ＣＤ３４＋ ＨＥ集団を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａを使用するＦＡＣＳにより
、さらなる解析および機能的な評価のためにソートした。造血アウトプット能の例として
、単一のｉＰＳＣのインプットに対し、合計４６３個のＣＤ３４＋細胞（図１５Ａ）およ
び４１個のＣＤ３４＋ ＣＤ４３－ ＣＸＣＲ４－ ＣＤ７３－細胞（図１５Ａ）が発生
し、二次ＨＥ細胞への転換率は、少なくとも２．５％であった。
ｈｉＰＳＣ由来のｉＨＥの生着のポテンシャルを裏付けるため、１０日目におけるＣＤ
３４＋細胞をソートし、上記で記載したｉＭＰＰアッセイにおいて、７日間にわたり培養
した。培養（１０日間にわたるｉＣＤ３４の培養に、７日間にわたるｉＭＰＰの培養を加
えた）合計１７日間の後、眼窩後注射を介して、およそ４００，０００個の細胞を、ＮＳ
Ｇへと注射した。２００，０００個の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、対照としての別個のマウ
スへと注射した。図３３は、マウスの末梢血中の、ヒトＣＤ４５マーカーを発現する細胞
の存在により見られる通り、生着したＣＤ３４陽性細胞の、５週間にわたる再構成を裏付
ける。
（実施例８）
低分子、サイトカイン、およびプレーティング密度のモジュレーションによる、ＨＥ発生
の最適化
約１０日間にわたる分化の後における、ＨＥの、ｈｉＰＳＣからの効率的な発生を最適
化するため、いくつかのパラメータについて検討した。分化の０日目における、単層の最
適なプレーティング密度を、ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングした６ウェル培養
ディッシュ上にｈｉＰＳＣをプレーティングし、ウェル１つ当たり７．５×１０４個から
ウェル１つ当たり１．５×１０５個へと量を増大させ、次いで、約１０日目に、ＣＤ３４
＋ ＨＥ集団の発生を解析することにより評価した。図１６Ａは、細胞のプレーティング
密度を増大させると、ＣＤ３４＋細胞の全百分率は増大するが、ＣＸＣＲ４－ ＣＤ７３
－ ＨＥ亜集団は減少することを裏付ける。この減少にも拘らず、１０日間にわたる単層
分化の後における、ｈｉＰＳＣの、ＨＥへの転換率は、ウェル１つ当たり１．５×１０５
個の最高被験プレーティング密度のときに最高であった（図１５Ｃ）。
造血分化の初期段階における、ＢＭＰ４の濃度のモジュレーションの、ＨＥの発生に対
する効果は、分化の約２日目～約６日目において、０ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌの範囲
にわたり濃度を増大させるＢＭＰ４で培養物を処理することにより評価した。１０日目に
おけるＨＥの発生を、ＣＤ３４＋ ＨＥ集団の検出により評価した。図１６Ｃは、２日目
～６日目においてＢＭＰ４の濃度を増大させると、１０日目において、閾値を下回るＢＭ
Ｐ４濃度で、ＨＥ集団が増大することから、約３ｎｇ／ｍＬの最適濃度が指し示されるこ
とを裏付ける。
Ｗｎｔ経路活性化因子であるＣＨＩＲ９９０２１は、ｈｉＰＳＣからの二次造血プログ
ラムの誘導の一因である。造血分化プロトコールの誘導相における、ＣＨＩＲのモジュレ
ーションの効果は、約３．７５日目～約６日目において、ＣＨＩＲの濃度を増大させて培
養を処理することによって評価した。図１６Ｄは、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度を増大させ
ると、ＣＤ３４＋細胞の全百分率は増大するが、ＨＥ亜集団の百分率は減少することから
、ＣＨＩＲ９９０２１の最適濃度は、およそ１ｕＭであることを裏付ける。
指向性分化プロトコールの６日目において、単層培養物を、単一細胞へと解離させ、Ｈ
Ｅへとさらに分化させるために、単層として再プレーティングした。６日目におけるプレ
ーティング密度は、図１６Ｅで裏付けられる通り、ＨＥの発生に影響を及ぼすことが示さ
れた。この図は、細胞の濃度を、１．５×１０５個から、７．４×１０４個へと減少させ
ると、ＨＥ集団の百分率は増大することを示す。
指向性分化のための先のプロトコールは、ＨＥの発生の間に、ＩＧＦ１サイトカインお
よびＥＰＯサイトカインの添加を要求した。図１６Ｆは、ＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が
、約１０日目において観察される、ＨＥの百分率を減少させ、これらの因子の除去が、分
化法の改善を結果としてもたらすことを示す。
（実施例９）
Ｎｏｔｃｈ依存性の造血およびＭＰＰの分化による、ＨＥの造血ポテンシャルの決定
ｈｉＰＳＣ由来の二次集団の造血ポテンシャルを裏付けるため、ＦＡＣＳを使用して、
ＨＥ細胞をソートし、図１２の複能性前駆体アッセイ（ｉＭＰＰ）で記載される通り、Ｃ
Ｄ４５＋造血前駆体を発生させる、内皮から造血への移行を経るそれらの能力について評
価した。およそ３０，０００個のＣＤ３４＋ ＨＥ細胞を、懸濁液中の凝集物として、ｉ
ＭＰＰ－Ａ培地中で、一晩にわたり培養し、次いで、単層としてプレーティングし、６～
８日間にわたり、さらに培養した。図１７Ａは、丸い造血細胞の出現を伴う、単層培養物
中の表現型の変化、およびフローサイトメトリー染色により、６～８日間の培養期間にわ
たってＣＤ４５＋の存在が識別されることを示す。
指向性分化プロトコールの１０日目に発生したＨＥ集団が、二次ＨＥを表すのかどうか
について評価するため、ＣＤ３４＋でソートされたＨＥ細胞を、Ｎｏｔｃｈ経路阻害剤で
あるガンマセクレターゼ阻害剤（γＳＩ）で、ｉＭＰＰアッセイの持続期間である７～９
日間にわたり処理した。新鮮なγＳＩを、２日ごとに、ｉＭＰＰ－Ａ培養培地へと添加し
た。約８日後、単層培養物を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４５＋造血細胞の出現
について評価した。γＳＩで処置された培養中では、媒体対照と比較して、有意により少
ないＣＤ４５＋細胞が見られたことから、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路への依存性、およ
び二次ＨＥの存在が裏付けられる（図１７Ｂ）。
（実施例１０）
酸素条件の操作を介する、ＨＥおよびｉＭＰＰの発生の最適化
酸素環境が、二次ＨＥおよびｉＭＰＰ造血前駆体の発生に影響を与えるのかどうかにつ
いて評価するため、ｈｉＰＳＣを、図１２で記載されている通り、正常酸素（２１％のＯ
２）条件下または低酸素（５％のＯ２）条件下で分化させた。分化の約１０日目に、単層
を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ３４＋ ＨＥ集団の存在について、カウントし、
評価した。図１８Ａに見られる通り、低酸素条件下の分化は、発生するＣＤ３４＋ ＨＥ
の量の増大を結果としてもたらした。低酸素条件下で発生させたＨＥが、ＣＤ４５＋造血
前駆体を発生させるポテンシャルを保持していたことを確認するために、正常酸素条件お
よび低酸素分化条件によるＣＤ３４＋細胞を、ＦＡＣＳにより単離し、ｉＭＰＰアッセイ
により評価した。いずれの条件下で発生させたＨＥも、同等のｉＭＰＰポテンシャルを有
することから、低酸素条件下の造血分化は、二次ＨＥのアウトプットを増大させることが
指し示される（図１８Ｂ）。
（実施例１１）
８日目の分化培養物およびＨＥの低温保存
直接的分化プロトコールの約１０日目において、全培養物を、解離させて、１０％のＤ
ＭＳＯを補充した８日目の培地中の低温保存後において、造血ポテンシャルを維持するそ
れらの能力について評価した。融解させた細胞を、再懸濁させ、その後、図１２で記載さ
れている通り、ｉＭＰＰ－Ａ培地中で、７日間にわたり培養してから、フロー解析にかけ
た。図１９Ａに見られる通り、低温保存された１０日目の細胞は、凍結／融解工程後も生
存し、ＣＤ４５＋細胞の存在により見られる通り、非凍結対照と同等の造血ポテンシャル
を有していた。
ソートされたＣＤ３４＋細胞を、低温保存後において、造血ポテンシャルを維持するそ
れらの能力について評価した。低酸素条件下で発生させた、１０日目のｉＣＤ３４を単離
し、図１２で記載されている通り、直接ｉＭＰＰアッセイへとプレーティングするか、ま
たはｉＭＰＰ－Ａ培地中で７日間にわたり低温保存し、次いで、融解させ、ｉＭＰＰアッ
セイにプレーティングした。図１９Ｂに見られる通り、低温保存されたＨＥは、凍結／融
解工程後も生存し、非凍結対照と比較して効率は低下しているが、ＣＤ４５＋細胞の存在
により見られる通り、造血ポテンシャルを維持することが可能であった（図１９Ｂ上パネ
ル）。低温保存されたｉＣＤ３４はまた、より高い密度（ウェル１つ当たり細胞２００，
０００個）でもプレーティングしたが、これは、ＣＤ４５＋細胞のアウトプットを増大さ
せるように見えた（図１９Ｄ）。
（実施例１２）
一晩にわたる出荷後における、８日目の分化培養物の回復
６ウェルプレートによる６日目の分化培養物を、フラスコ１つ当たり細胞２００，００
０個の播種密度で、Ｔ２５培養フラスコへと継代培養し、次いで、８日目に培地で完全に
満たし、発泡スチロール製の箱の中で一晩にわたり保って、新鮮な細胞を、低温保存の必
要なしに、直接出荷することの実施可能性について評価した。可能な限りにわたり３７℃
の温度を保持するために、当初に３７℃の水浴中で保たれた保冷パックもまた、発泡スチ
ロール製の箱に添付した。２つの培地組成物：８日目のステップで活用される、３０％の
濃度のサイトカインおよびモルフォゲンを伴うフラスコ（図１２）と、１００％の濃度の
サイトカインおよびモルフォゲンを伴うフラスコとについて、３７℃のインキュベーター
内で保たれた対照フラスコと共に調べた。９日目に、これらのフラスコを箱から取り出し
、フラスコに新たなキャップを取り付けると共に、培地を、８日目の培地１０ｍＬで置き
かえ、回復させてから、ＣＤ３４＋ ＨＥ集団の存在についての、１０日目のフロー解析
のために処理した。図２０に見られる通り、ＨＥの全般的なアウトプットは、全ての条件
間で同等であったことから、８日目の培養物の新鮮なままでの一晩にわたる出荷の、ＨＥ
細胞を送達するための有効な手段としての実施可能性が裏付けられる。
（実施例１３）
ＤＬＬ４を発現する間質細胞を使用する、ＨＥの、成熟Ｔリンパ系および成熟ＮＫリンパ
系への分化の継続
ソートされたＣＤ３４＋ ＨＥ細胞を、Ｔリンパ系およびＮＫリンパ系へとさらに分化
させた。Ｔ細胞に特異的なＨＥ細胞をソートして、低付着型組織培養物プレート上で、Ｂ
ＭＰ４、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＴＣ－Ａ無血清分化培地（図１
３）中の凝集物として、１６時間にわたり培養した。１６時間後、凝集した細胞を、ＳＣ
Ｆ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＴＣ－Ｂ分化培地に、ＤＬＬ４を発現する間
質細胞を含有する接着培養に移した。５日後、ｉＴＣ－Ｂ培地を維持して、Ｔ細胞の分化
を完了させた。培養のおよそ１０日後（ＨＥの単離後）、細胞表面マーカーであるＣＤ３
４およびＣＤ７の同時発現により、培養物を、Ｔ細胞前駆体の発生について評価した。お
よそ１５～２０日間にわたるさらなる分化の後で、これらのＣＤ３４＋ ＣＤ７＋ Ｔ細
胞前駆体は、ＣＤ４およびＣＤ８の発現により見られる通り、成熟Ｔ細胞の別個の集団を
発生した。図２１は、同時培養物中で発生したＣＤ４５＋ ＣＤ５６－集団についての解
析により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、１０日目のＨＥ集団の分化能力であって、早期Ｔ
細胞前駆体および成熟Ｔ細胞サブセットを発生させる分化能力について示す。図２６は、
培養のおよそ３０日後（ＨＥの単離後）、同時培養物中で発生したＣＤ４５＋ ＣＤ５６
－集団についての解析により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、１０日目のＨＥ集団の分化能
力であって、成熟Ｔ細胞サブセットを発生させる分化能力について示す。
ＮＫ細胞に特異的なＨＥ細胞をソートして、低付着型組織培養物プレート上で、ＢＭＰ
４、ＳＣＦ、ＩＬ３、ＩＬ１５、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＮＫ－Ａ無血清
分化培地（図１４）中の凝集物として、１６時間にわたり培養した。１６時間後、凝集し
た細胞を、ＳＣＦ、ＩＬ３、ＩＬ１５、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＮＫ－Ｂ
分化培地中に、ＤＬＬ４を発現する間質細胞を含有する接着培養へと移した。５日後、ｉ
ＮＫ－Ｂ培地を維持して、ＮＫ細胞の分化を完了させた。培養のおよそ１０～１５日後（
ＨＥの単離後）、培養物を、ＮＫ細胞前駆体の発生について評価した後、さらに１０～１
５日間にわたる培養の後において、成熟ＮＫサブセットについても評価した。ＣＤ５６お
よびＣＤ１６１（ＮＫＲ－Ｐ１Ａ）は、早期ＮＫ細胞の発生の間に発現する第１の細胞表
面マーカーであり、これに続いて、後期の成熟ＮＫ細胞サブセット上では、ＣＤ１６、Ｋ
ＩＲ、ＣＤ８、およびＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）が発現する。図２２は、同時培養物中で
発生したＣＤ４５＋集団についての解析により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、１０日目の
ＨＥ集団の分化能力であって、早期ＮＫ細胞前駆体および成熟ＮＫ細胞サブセットを発生
させる分化能力について示す。ＮＫ細胞前駆体の成熟を増強する代替的な方法は、懸濁培
養物中の、フィーダー細胞との同時培養である。２０日目のｉＮＫ細胞を、ＤＬＬ４－間
質細胞培養物から、ＳＣＦ、ＩＬ１５、ＦＬＴ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＮＫ－Ｂ
培地中のフィーダーベースの懸濁培養物へと移し、さらに１２日間にわたる培養下に置い
た。図２７は、間質およびフィーダーベースの同時培養物中で発生したＣＤ４５＋集団に
ついての、末梢血由来のＮＫ細胞と比較した解析により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、フ
ィーダー懸濁培養物を使用する、１０日目のＨＥ集団の分化能力であって、成熟ＮＫ細胞
サブセットを発生させる分化能力について示す。ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞を、Ｎ
Ｋ系統細胞へと、２０日間にわたり分化させ、次いで、さらに成熟させるために、懸濁培
養物に入れた。成熟ＮＫ系統マーカーは、ＣＤ５６、ＣＤ１２２、ＮＫｐ３０、ＣＤ９４
、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、およびＫＩＲにより規定される成熟ＮＫ細胞の存在を識別する
。
（実施例１４）
高度にスケーラブルな拡大戦略を可能とする、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォーム
ｈｉＰＳＣを、図１２～１４で記載される、組成既知、無血清で、フィーダーフリーの
培養物中の単層として播種し、造血細胞へと分化させ、凝集下にあるｈｉＰＳＣ状態であ
って、造血分化の誘発の前に胚葉体を形成するｈｉＰＳＣセットアップ（Kennedyら、Cel
l Reports、２０１２年、１７２２～１７３５頁）と比較した。いずれの培養物セットも
、初期出発数として、１００，０００個のｈｉＰＳＣを使用した。造血分化工程において
、細胞カウントおよび表現型の評価を慣用的に行って、各系の拡大ポテンシャルを裏付け
た。図２３で示される通り、分化の６日目までに、単層培養物では、顕著な数のＣＤ３４
陽性細胞（ＣＤ３４陽性細胞が検出されなかったＥＢフォーマットと対比して、２００万
個超のＣＤ３４＋細胞）が検出された。分化の８日目に、単層フォーマットは、およそ２
４０万個の細胞を発生させたが、ＥＢフォーマットでは、ＣＤ３４陽性細胞の検出は、お
よそ１００，０００個に過ぎず、出発材料としてのｉＰＳＣがほぼ同数であるにも拘らず
、およそ２４倍の差が見られた。加えて、評価時に、単層フォーマットからは、二次造血
を示唆するＣＤ３４＋ ＣＤ４３－細胞のみが作製されたのに対し、ＥＢフォーマットか
らは、一次造血を示唆するＣＤ３４＋ ＣＤ４３＋が大半の細胞が作製された（Kennedy
ら、２０１２年）。図２４は、オフザシェルフのｉＮＫ細胞およびｉＴ細胞を産生するた
めの、本明細書で開示される、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームのスケーラブル
な拡大をさらに示す。本明細書で提示される多能性細胞クローン拡大プラットフォームは
、例えば、１個の多能性細胞クローンから、各々が治療的に機能的な、１０６個を下回ら
ないＮＫ細胞またはＴ細胞を有する、治療用量のバイアル約１００万本への、オフザシェ
ルフ用のスケーラビリティーを確保する。開示されるクローン拡大は、広範な均質性をさ
らにもたらし、従って、製品の一貫性、品質管理、および品質保証を確保する。一部の実
施形態では、１個の多能性細胞クローンは、遺伝子操作される。
（実施例１５）
ｉＣＤ３４＋細胞の免疫調節特性
ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性細胞（ｉＣＤ３４）の免疫調節能力を決定するため、Ｃ
Ｄ３４でソートされた細胞を、ｉＭＰＰ－Ａ培地中で、末梢血由来の、ＣＤ３を発現する
活性化Ｔ細胞と共に同時培養した。３７℃で５日間にわたるインキュベーションの後、同
時培養物を、カウンティングビーズと混合し、フローサイトメトリーを介してアッセイし
て、各試料中の細胞の絶対数を決定した。図２５は、ＣＤ３＋ Ｔ細胞単独を含有する培
養物との比較により見られる、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞の免疫調節ポテンシャル
について示すが、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞と共に同時培養されたＣＤ３＋ Ｔ細
胞が、細胞の生存を低減したのに対し、培養物中のＣＤ３４＋細胞の総数は、影響を受け
なかった。
（実施例１６）
サイトカインの放出および脱顆粒により見られる、サイトカイン誘導性活性化による、ｉ
ＮＫ細胞機能の決定
ｈｉＰＳＣ由来の成熟ｉＮＫ細胞の機能性を裏付けるため、２０日目（ＨＥの単離後）
に、ｉＮＫ細胞を、ＳＣＦ、ＩＬ１５、ＩＬ７、およびＦｌｔ３Ｌを含有するｉＮＫ－Ｂ
培地に、さらに１０日の間、フィーダーベースの懸濁培養物へと移した。１０日間にわた
るさらなる培養の後、ｉＮＫ細胞を、ＩＬ１２およびＩＬ１８で刺激して、ｉＮＫ細胞の
活性化を誘導した。ｉＣＤ３４由来のｉＮＫは、末梢血ＮＫ細胞と同様の様式で、サイト
カインの刺激に応答し、炎症促進性サイトカインを分泌した。図２８は、ＣＤ１０７Ａ（
脱顆粒を表す細胞表面マーカー）の発現、およびＣＤ４５＋ ＣＤ５６＋ゲーティング戦
略に基づく、インターフェロンガンマについての細胞内染色により見られる、ｉＮＫ細胞
の活性化であって、同じ間質およびフィーダー懸濁液による同時培養物と、末梢血由来の
ＮＫ細胞とを使用して発生させた、臍帯血由来のＮＫ細胞と比較した活性化について示す
。
（実施例１７）
Ｔ細胞およびＮＫ細胞を発生させるための間質フリーの分化培養物の確立
間質フリーの分化プラットフォームを使用して、臍帯血由来のｉＴ前駆体およびｉＮＫ
前駆体、ならびにｈｉＰＳＣ由来のｉＴ前駆体およびｉＮＫ前駆体を発生させるためにさ
らに、上記のＴリンパ系およびＮＫリンパ系の分化プラットフォームを最適化した。
ＮＫ細胞に特異的な、濃縮された臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、ＤＬＬ４タンパク質または
対照タンパク質を含有する培養プレート内の、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ１５、
およびＩＬ７を含有するｉＮＫ－Ａ無血清分化培地にプレーティングした。５日後、ｉＮ
Ｋ－Ｂ培地を維持して、ＮＫ細胞の分化を完了させた。培養のおよそ１０～１５日後、培
養物を、ＮＫ細胞前駆体の発生および骨髄性細胞が存在しないことについて評価した。Ｃ
Ｄ５６、ＣＤ７、およびＣＤ１６１は、ＮＫ細胞の発生の間に発現する、最初の細胞表面
マーカーである。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４は、骨髄性細胞サブセット上で発現する細胞
表面マーカーである。図２９は、臍帯血ＣＤ３４＋細胞の、ＮＫ細胞への間質フリー分化
について示す。ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使用したところ、プレートに結合させたＤ
ＬＬ４は、ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ１６１＋ ＮＫ細胞前駆体の、間質ベースの培養
物および間質フリーの対照培養物と比較して、より急速で効率的な分化を支援し、臍帯血
ＣＤ３４＋細胞は、ＤＬＬ４を発現する、間質フリーの分化プラットフォームにおいて、
従来の間質ベースの分化プラットフォームと同様の様式（表現型に関して）で、早期ＮＫ
細胞前駆体（ｐｒｏ－ＮＫ）を発生させる、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化能力を有する
ことが示された。早期ＮＫ系統マーカーにより、ＣＤ５６、ＣＤ７、およびＣＤ１６１に
より規定されるｐｒｏＮＫ細胞が存在することと、骨髄性マーカーである、ＣＤ１１ｂお
よびＣＤ１４が存在しないこととが識別される。
間質フリーの分化プラットフォームにおいて、ｉＮＫ細胞前駆体を発生させるときの、
ｈｉＰＳＣ由来のＨＥ細胞の能力を裏付けるため、１０日目のＣＤ３４＋ ｉＨＥソート
細胞を、ｉＮＫ－Ａ２培地において、ＤＬＬ４タンパク質または対照タンパク質を含有す
る培養物中で培養した。次いで、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞を、ＮＫ系統細胞へと
、２０日間にわたり分化させ、次いで、さらに成熟させるために、懸濁培養に置いた。図
３０は、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使用して、ＣＤ５６、ＣＤ１６１、およびＣＤ９
４の発現により見られるような、ｉＮＫ細胞前駆体を発生させるｈｉＰＳＣ由来のｉＨＥ
の能力を示す。プレートに結合したＤＬＬ４は、ＣＤ５６＋ ＣＤ７＋ ＣＤ１６１＋
ＮＫ細胞前駆体の分化は支援するが、ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞の分化は支援しない。５日
後、ｉＮＫ－Ｂ２培地を維持して、ＮＫ細胞の分化を完了させた。フィーダーベースの懸
濁培養物中の、ｈｉＰＳＣ由来のｉＮＫ細胞の成熟は、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使
用すると、末梢血ＮＫ細胞に表現型が似ている、成熟ＮＫ細胞を結果としてもたらす。成
熟ＮＫ系統マーカーは、ＣＤ５６、ＣＤ１２２、ＮＫｐ３０、ＣＤ９４、ＣＤ１６、ＮＫ
Ｇ２Ｄ、およびＫＩＲにより規定される成熟ＮＫ細胞の存在を識別する。
Ｔ細胞に特異的なＣＤ３４＋細胞であって、臍帯血から濃縮されたＣＤ３４＋細胞を、
ｉＴ－Ａ２培地において、ＤＬＬ４タンパク質または対照タンパク質を含有する培養物に
プレーティングした。５日後、Ｔ細胞前駆体（ｐｒｏＴ）を発生させるために、ｉＴ－Ｂ
２培地を維持した。培養のおよそ１０～１５日後、細胞表面マーカーであるＣＤ３４およ
びＣＤ７の同時発現により、培養物を、Ｔ細胞前駆体の発生について評価した。図３１は
、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使用して、ＤＬＬ４を発現する、間質フリーの分化プラ
ットフォームにおいて、Ｔ細胞前駆体を発生させるＣＤ３４＋臍帯血細胞の能力について
示す。ＣＤ４５＋ ＣＤ５６－ゲーティング戦略を使用したところ、臍帯血ＣＤ３４陽性
細胞から導出されたｐｒｏＴ細胞の間質フリー分化プラットフォームは、従来の間質ベー
スの分化プラットフォームより急速であることが示された。早期Ｔ系統マーカーは、ＣＤ
３４、ＣＤ５、およびＣＤ７により規定されるようなｐｒｏＴ細胞の存在を識別する。
間質フリーのプラットフォームにおいて、ｉＴ細胞を発生させる、ｈｉＰＳＣ由来のＨ
Ｅ細胞の能力を裏付けるため、１０日目のＣＤ３４＋ ｉＨＥソート細胞を、ＤＬＬ４タ
ンパク質または対照タンパク質を含有する培養においてｉＴ－Ａ２培地中で培養した。図
３２は、ＣＤ４５およびＣＤ７の発現により見られるように、ｉＴ前駆体を発生させる、
ｈｉＰＳＣ由来のｉＨＥの能力を例示する。
当業者は、本明細書で記載される方法、組成物、および産物が、例示的な実施形態を表
すものであり、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではないことをたやすく
察知するであろう。当業者には、本明細書で開示される本開示には、本発明の範囲および
精神から逸脱せずに、様々な代替および改変を施しうることがたやすく明らかであろう。
本明細書で言及される、全ての特許および刊行物は、本開示が関する技術分野の当業者
の水準を示す。全ての特許および刊行物は、各個別の刊行物が、参照により組み込まれる
ものとして、具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組
み込まれる。
本明細書で例示的に記載される本開示は、本明細書では具体的に開示されない、任意の
１または複数の要素、１または複数の限定の非存在下で、適切に実施することができる。
従って、例えば、本明細書の各場合において、「～を含むこと」、「～から本質的になる
こと」、および「～からなること」という用語のうちのいずれかは、他の２つの用語のう
ちのいずれかで置きかえることができる。採用してきた用語および表現は、限定的な用語
ではなく、記載的な用語として使用されており、このような用語および表現の使用におい
て、示され、記載される特色を有する、任意の同等物またはそれらの部分を除外する意図
は存在せず、特許請求される本開示の範囲内では、多様な改変が可能であることが認識さ
れている。従って、本開示は、好ましい実施形態および任意選択の特色により、具体的に
開示されているが、当業者は、本明細書で開示される概念の改変および変化を利用する場
合があり、このような改変および変化も、付属の特許請求の範囲により規定される、本発
明の範囲内にあると考えられることを理解されたい。

Claims (37)

  1. 多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法は、
    多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体またはＴ細胞を得るステップを含み；
    該組成物が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず；
    該多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＩＬ７、ＳＣＦ、およびＦｌｔ３Ｌ、必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤を含む組成物と接触させて、細胞分化および拡大を可能にすることにより得られ；
    該多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、（ｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＧＳＫ３阻害剤を含む組成物と接触させて、細胞分化および拡大を可能にするステップであって、該組成物がＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、ステップ、ならびに（ｉｉ）ステップ（ｉ）の該接触された細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６およびＩＬ１１を含む組成物と接触させて、細胞分化および拡大を可能にするステップであって、該組成物がＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、ステップにより得られ；
    該多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、細胞分化および拡大を可能にすることにより得られる、方法。
  2. 前記多能性幹細胞と接触させる組成物が、ｂＦＧＦをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法が、ステップ（ｉ）の前に、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む組成物と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含み、該組成物がＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない；
    または、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生することが、胚葉体の発生を欠く、単層培養下である、フィーダーフリー条件下である、もしくは間質フリー条件下である；
    または、前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣまたはナイーブｉＰＳＣである、
    請求項１に記載の方法。
  4. 造血系細胞を得るための分化プラットフォームであって、該分化プラットフォームは、
    （ｉ）ＩＬ７、ＳＣＦ、およびＦｌｔ３Ｌ、ならびに必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤を含み、二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化するのに適する培養培地；および／または
    （ｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず、プレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化するのに適する培養培地
    を含む、分化プラットフォーム。
  5. （ａ）ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するのに適する培養培地；
    （ｂ）ＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＧＳＫ３阻害剤を含む培養培地；ならびに
    （ｃ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１を含み、二次造血性内皮を、（ｂ）における該培養培地と接触させられた細胞から分化させ、拡大するのに適する培養培地
    のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項４に記載の分化プラットフォーム。
  6. （ａ）における前記培養培地がｂＦＧＦをさらに含む、請求項５に記載の分化プラットフォーム。
  7. （ｂ）における前記培養培地が、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項５または６に記載の分化プラットフォーム。
  8. （ｃ）における前記培養培地が、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項５～７のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
  9. （ｄ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適している、培養培地
    をさらに含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
  10. 前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣまたはナイーブｉＰＳＣである、請求項５に記載の分化プラットフォーム。
  11. 多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を得、かつ拡大するための分化プラットフォームであって、
    （ｉ）ＢＭＰ活性化因子および多能性幹細胞を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、該多能性幹細胞から得るのに適する培養培地；
    （ｉｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞と、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない培養培地；ならびに
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）における該培養培地と接触させられた細胞と、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１を含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、（ｉｉ）における該培養培地と接触させられた細胞から得るのに適する培養培地
    を含む、分化プラットフォーム。
  12. （ｉ）における前記培養培地がｂＦＧＦをさらに含む、請求項１１に記載の分化プラットフォーム。
  13. （ｉｉｉ）における前記培養培地がＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項１１または１２に記載の分化プラットフォーム。
  14. （ｉｖ）多能性幹細胞と、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適している培養培地
    をさらに含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
  15. （ａ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮、ＩＬ７、ＳＣＦ、およびＦｌｔ３Ｌ、ならびに必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤を含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；または
    （ｂ）多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず、
    該多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるのに適している培養培地
    をさらに含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
  16. 前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣまたはナイーブｉＰＳＣである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
  17. 多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための分化プラットフォームであって、
    （ｉ）ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
    （ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む培養培地；
    （ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１を含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、（ｉｉ）における該培養培地と接触させられた細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
    （ｉｖ）ＩＬ７、ＳＣＦ、およびＦｌｔ３Ｌ、必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤を含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに
    （ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地を含む、分化プラットフォーム。
  18. （ｉ）における前記培養培地がｂＦＧＦをさらに含む、請求項１７に記載の分化プラットフォーム。
  19. （ｉｉ）における前記培養培地がＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項１７または１８に記載の分化プラットフォーム。
  20. （ｉｉｉ）における培養培地がＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
  21. （ａ）前記プラットフォームが、（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む；または
    （ｂ）前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣまたはナイーブｉＰＳＣである
    請求項１７～２０のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
  22. （ｖｉ）における前記培養培地が、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項２１に記載の分化プラットフォーム。
  23. 多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、該方法は、
    （ｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞分化および拡大を可能にするステップ；ならびに
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）の該接触された細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６およびＩＬ１１を含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を得るステップ
    を含み、該多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、細胞分化および拡大を可能にすることにより得られる、方法。
  24. ステップ（ｉ）の前記接触された細胞と接触させた前記組成物が、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項２３に記載の方法。
  25. ステップ（ｉｉ）の前記接触された細胞と接触させた前記組成物が、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記多能性幹細胞と接触させる前記組成物が、ｂＦＧＦをさらに含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. （ａ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子を含む前記組成物と接触させて、細胞分化および拡大を可能にして、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を得るステップ；
    （ｂ）前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む前記組成物と接触させて、細胞分化および拡大を可能にするステップ；ならびに
    （ｃ）ステップ（ｂ）の前記接触された細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６およびＩＬ１１を含み、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない前記組成物と接触させて、細胞分化および拡大を可能にして、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を得るステップ
    を含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. （ａ）における前記多能性幹細胞と接触する前記組成物が、ｂＦＧＦをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
  29. ステップ（ｂ）の前記接触された細胞と接触させた前記組成物が、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 前記方法が、ステップ（ａ）の前に、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、該多能性幹細胞を播種し、拡大するステップを含み、該組成物が、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、ステップ；および／または播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％～約１０％の間の低酸素圧下に置くステップを含み；あるいは
    多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生することが、胚葉体の発生を欠く、単層培養下である、フィーダーフリー条件下である、または間質フリー条件下である；あるいは
    前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣまたはナイーブｉＰＳＣである、
    請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＩＬ７、ＳＣＦ、およびＦｌｔ３Ｌ、必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤を含む組成物を接触させて、細胞分化および拡大を可能にするステップをさらに含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. 多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための分化プラットフォームであって、
    （ｉ）ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
    （ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む培養培地；ならびに
    （ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１を含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、（ｉｉ）における該培養培地と接触させられた細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地
    を含む、分化プラットフォーム。
  33. （ｉ）における前記培養培地がｂＦＧＦをさらに含む、請求項３２に記載の分化プラットフォーム。
  34. （ｉｉ）における培養培地が、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項３２または３３に記載の分化プラットフォーム。
  35. （ｉｉｉ）における前記培養培地が、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まない、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
  36. （ａ）前記プラットフォームが、（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む；または
    （ｂ）前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣまたはナイーブｉＰＳＣである、
    請求項３２～３５のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
  37. ＩＬ７、ＳＣＦ、およびＦｌｔ３Ｌ、必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤を含み、二次造血性内皮細胞を拡大し、分化させるのに適している培養培地をさらに含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の分化プラットフォーム。
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