BRPI0922345B1

BRPI0922345B1 - Composto, métodos in vitro para estabilizar uma célula animal isolada e para manter a sobrevivência da célula, e, composição

Info

Publication number: BRPI0922345B1
Application number: BRPI0922345-2A
Authority: BR
Inventors: Yue Xu; Sheng Ding
Original assignee: The Scripps Research Institute
Priority date: 2008-12-03
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2022-03-22
Also published as: CN105001196B; PT3623374T; WO2010065721A1; EP3623374B1; EP4296270A3; CA2995883C; EP2370445A1; JP2023073420A; ES2779001T3; AU2017200667A1; US20110224233A1; IL213205A0; CA2995883A1; SG196784A1; AU2009322346B2; AU2021204635A1; AU2023251440A1; EP3103804A1; EP2789618A1; ES2712074T3

Abstract

COMPOSTO, MÉTODOS PARA ESTABILIZAR UMA CÉLULA ANIMAL ISOLADA IN VITRO E PARA MANTER A SOBREVIVÊNCIA DA CÉLULA, E, POPULAÇÃO CÉLULAS ISOLADAS a Tiazovivin/Tzv Pirintegrin/Pn Figura 1 A presente invenção diz respeito aos compostos para estabilizar células e métodos de seu uso.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. No 61/200.808, depositado em 3 de dezembro de 2008, que é aqui incorporado na sua totalidade para todos os propósitos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] As células tronco embrionárias (ESCs) são células pluripotentes que têm a capacidade para se auto-renovar indefinidamente e para diferenciar em todos os tipos de célula do corpo (Thomson, J. A. et al., Science 282 (5391): 1145-1147 (1998); Thomson, J. A. & Odorico, J. S., Trends Biotechnol 18 (2): 53-57 (2000)). Esta capacidade fornece esperança de que as ESCs um dia serão usadas para substituir células perdidas e danificadas, e fornecem terapias além do alcance dos medicamentos convencionais. Entretanto, para constatar completamente os potenciais clínicos das hESCs, condições de cultura quimicamente definidas, isentas de mecanismo de alimentação e de produtos de animal, robustas têm que ser estabelecidas. Embora diversos meios quimicamente definidos tenham sido relatados (Yao, S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 103 (18): 6907-6912 (2006); Lu, J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 103 (15): 5688-5693 (2006); Ludwig, T. E. et al., Nat Biotechnol 24 (2): 185-187 (2006)), estes são ainda grandemente insatisfatórios devido ao desempenho subótimo de células neles. Especialmente sob estas condições, quando as células são passadas pela tripsina para células únicas, elas sofrem a morte celular extensiva. Vários caminhos de sinalização que medeiam a auto-renovação de hESC são conhecidos, incluindo FGF, TGF-β, Wnt, etc. (James, D. et al., Development 132 (6): 1273-1282 (2005); Xu, R. H. et al., Nat Methods 2 (3): 185-190 (2005); Beattie, G. M. et al., Stem Cells 23 (4): 489-495 (2005); Greber, B., Lehrach, H., & Adjaye, J., Stem Cells 25 (2): 455-464 (2007); Sato, N. et al., Nat Med 10 (1): 55-63 (2004)). Entretanto, nenhum deles parece atuar como um fator de sobrevivência neste processo, o mecanismo molecular dos quais sendo indefinível.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção fornece compostos tendo a fórmula:

em que o anel A é um cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído; o anel B é um heterocicloalquila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído; L1 é -C(O)-NR2- ou -C(O)-NR2-; L2 é uma ligação, alquileno substituído ou não substituído ou heteroalquileno substituído ou não substituído; e R1 e R2 são independentemente hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterociclo-alquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[004] Em algumas formas de realização, o anel A é um arila substituído ou não substituído.

[005] Em algumas formas de realização, o anel A é um fenila substituído ou não substituído.

[006] Em algumas formas de realização, o anel B é um heterocicloalquila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[007] Em algumas formas de realização, o anel B é um heteroarila substituído ou não substituído.

[008] Em algumas formas de realização, o anel B é um pirazolila substituído ou não substituído, furanila substituído ou não substituído, imidazolila substituído ou não substituído, isoxazolila substituído ou não substituído, oxadiazolila substituído ou não substituído, oxazolila substituído ou não substituído, pirrolila substituído ou não substituído, piridila substituído ou não substituído, pirimidila substituído ou não substituído, piridazinila substituído ou não substituído, tiazolila substituído ou não substituído, triazolila substituído ou não substituído, tienila substituído ou não substituído, diidrotieno-pirazolila substituído ou não substituído, tianaftenila substituído ou não substituído, carbazolila substituído ou não substituído, benzotienila substituído ou não substituído, benzofuranila substituído ou não substituído, indolila substituído ou não substituído, quinolinila substituído ou não substituído, benzotriazolila substituído ou não substituído, benzotiazolila substituído ou não substituído, benzooxazolila substituído ou não substituído, benzimidazolila substituído ou não substituído, isoquinolinila substituído ou não substituído, isoindolila substituído ou não substituído, acridinila substituído ou não substituído, benzoisazolila substituído ou não substituído, ou dimetilidantoína substituído ou não substituído.

[009] Em algumas formas de realização, L2 é alquila C1-C10 substituído ou não substituído.

[0010] Em algumas formas de realização, L2 é alquila C1-C10 não substituído.

[0011] Em algumas formas de realização, L2 é metileno.

[0012] Em algumas formas de realização, o anel A é arila substituído ou não substituído; o anel B é heteroarila substituído ou não substituído; R1 é hidrogênio; e L2 é alquila C1-C10 não substituído.

[0013] Em algumas formas de realização, R2 é hidrogênio.

[0014] Em algumas formas de realização, R1 é hidrogênio ou alquila C1-C10 não substituído.

[0015] Em algumas formas de realização, R1 é hidrogênio.

[0016] Em algumas formas de realização, o composto tem a fórmula:

em que, y é um número inteiro de 0 a 3; z é um número inteiro de 0 a 5; X é -N=, -CH= ou -CR5=; R3, R4 e R5 são independentemente CN, 6 7 8 9 10 11 12 13 14 S(O)nR , NR R , C(O)R , NR -C(O)R , -NR -C(O)-OR , -C(O)NR R15, _-NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterociclo-alquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído, em que n é um número inteiro de 0 a 2, em que se z é maior do que 1, duas porções de R3 são opcionalmente unidas entre si para formar um cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 não substituído; e R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R e R são independentemente hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[0017] Em algumas formas de realização, L2 é alquila C1-C10 substituído ou não substituído.

[0018] Em algumas formas de realização, L2 é alquila C1-C10 não substituído.

[0019] Em algumas formas de realização, L2 é metileno.

[0020] Em algumas formas de realização, X é -N= ou -CH=.

[0021] Em algumas formas de realização, z é 2 e duas porções de R3 em vértices adjacentes são unidas entre si para formar um heterocicloalquila substituído ou não substituído.

[0022] Em algumas formas de realização, z é 1.

[0023] Em algumas formas de realização, y é 0 ou 1.

[0024] Em algumas formas de realização, R3 é -OR18, e R18 é hidrogênio ou alquila C1-C10 não substituído.

[0025] Em algumas formas de realização, L2 é metileno; X é -N= ou - CH=; R1 é hidrogênio; e y e z são 0.

[0026] Em algumas formas de realização, o composto tem a fórmula:

[0027] A presente invenção também fornece compostos tendo a fórmula:

em que

[0028] O Anel D é arila substituído ou não substituído ou heteroarila substituído ou não substituído; L3 é -C(O)NH- ou -S(O)2NH-; R20 é alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído; R21 é -NR22R23 ou -OR24; R22 e R23 são independentemente hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterociclo-alquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, heteroarila substituído ou não substituído, ou unidos entre si para formar um heterocicloalquila substituído ou não substituído ou heteroarila substituído ou não substituído; R24 é alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, heteroarila substituído ou não substituído, ou unidos entre si para formar um cicloalquila substituído ou não substituído de heterocicloalquila substituído ou não substituído.

[0029] Em algumas formas de realização, o anel D é fenila substituído ou não substituído.

[0030] Em algumas formas de realização, R20 é alquila substituído ou não substituído ou cicloalquila substituído ou não substituído.

[0031] Em algumas formas de realização, R20 é alquila C1-C10 substituído ou não substituído ou substituído ou cicloalquila de 3 a 7 membros não substituído.

[0032] Em algumas formas de realização, R20 é alquila C1-C5 substituído ou não substituído ou cicloalquila de 3 a 6 membros substituído ou não substituído.

[0033] Em algumas formas de realização, R20 é alquila C1-C5 não cicloalquila de 3 a 6 membros substituído ou não substituído.

[0034] Em algumas formas de realização, R22 é hidrogênio; e R23 é cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[0035] Em algumas formas de realização, R22 é hidrogênio; e R23 é arila substituído ou não substituído.

[0036] Em algumas formas de realização, R22 e R23 são unidas entre si para formar um heterocicloalquila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[0037] Em algumas formas de realização, R22 e R23 são unidas entre si para formar um pirrolila substituído ou não substituído, isoindolinila substituído ou não substituído, piperidinila substituído ou não substituído, ou tetraidroquinolinila substituído ou não substituído.

[0038] Em algumas formas de realização, o composto tem a fórmula

em que, w é um número inteiro de 0 a 1; q é um número inteiro de 0 a 7; R25, R26, R27 e R28 são independentemente -CN, -NR29R30, 31 32 33 34 35 36 37 38 39 C(O)R , -NR -C(O)R , -NR -C(O)-OR , -C(O)NR R , -NR S(O)2R , - OR40, -S(O)2NR41, -S(O)vR42, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído, em que v é 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 um número inteiro de 0 a 2; R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R40, R41, e R42 são independentemente hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído, em que R25 e R26, ou R26 e R27, podem ser unidos para formar um cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[0039] Em algumas formas de realização, R28 é -OR40, em que R40 é hidrogênio ou alquila C1-C10 não substituído.

[0040] Em algumas formas de realização, R40 é hidrogênio ou alquila C1 a C5 não substituído.

[0041] Em algumas formas de realização, o composto tem a fórmula:

[0042] Em algumas formas de realização, R20 é alquila C1 a C10 não substituído.

[0043] Em algumas formas de realização, R28 é -OR40, em que R40 é hidrogênio ou alquila C1 a C10 não substituído, ou alquila C1 a C10 substituído com cicloalquila C3 a C6 substituído ou não substituído.

[0044] Em algumas formas de realização, q é 1.

[0045] Em algumas formas de realização, o composto tem a fórmula:

[0046] Em algumas formas de realização, o composto tem a fórmula:

[0047] A presente invenção também fornece métodos de estabilizar uma célula isolada in vitro. Em algumas formas de realização, o método compreende contatar uma célula de animal com uma quantidade suficiente de um composto da fórmula I ou III para estabilizar a célula.

[0048] Em algumas formas de realização, o método compreende ainda mudar as condições ou ambiente da célula na presença do composto, em que a etapa de mudança na ausência do composto resultaria em uma mudança na programação celular da célula. Em algumas formas de realização, a etapa de mudança compreende pelo menos um de descongelar as células e dissociar as células de outras células.

[0049] Em algumas formas de realização, a célula é aderente. Em algumas formas de realização, a célula está em suspensão.

[0050] Em algumas formas de realização, o método compreende ainda determinar um fenótipo da célula.

[0051] Em algumas formas de realização, o método compreende isolar as células de um animal. Em algumas formas de realização, o animal é um ser humano. Em algumas formas de realização, o animal é um animal não humano.

[0052] Em algumas formas de realização, o composto é um composto da fórmula I. Em algumas formas de realização, o composto é um composto da fórmula III.

[0053] A presente invenção também fornece métodos de melhorar uma condição em um animal. Em algumas formas de realização, o método compreende administrar uma quantidade suficiente de um composto da fórmula I ou III a um animal em necessidade deste para melhorar a condição.

[0054] Em algumas formas de realização, a condição é selecionada do grupo que consiste de dano a tecido, acidente vascular cerebral, e câncer. Em algumas formas de realização, o tecido é selecionado do grupo que consiste de pâncreas, fígado, intestino, pulmão, e rim.

[0055] Em algumas formas de realização, a condição compreende pelo menos a rejeição parcial de um tecido ou órgão transplantado. Em algumas formas de realização, o transplante compreende transplante de medula óssea, sangue do cordão umbilical, células tronco ou progenitor hematopoiéticas purificadas, células cardíacas, células neurais, células beta pancreáticas, ou células hepáticas.

[0056] Em algumas formas de realização, o composto é um composto da fórmula I. Em algumas formas de realização, o composto é um composto da fórmula III.

[0057] A presente invenção também fornece métodos para manter a sobrevivência da célula. Em algumas formas de realização, o método compreende gerar células tronco, células progenitoras, ou células diferenciadas isoladas; e induzindo a estabilização de E-caderina nas células isoladas, mantendo deste modo a sobrevivência da célula.

[0058] Em algumas formas de realização, a etapa indução compreende contatar a célula tronco isolada com uma quantidade de um composto da fórmula I suficiente para melhorar a sobrevivência das células tronco isoladas em pelo menos 2 vezes comparadas com a ausência do composto.

[0059] Em algumas formas de realização, a etapa indução compreende cultivar as células tronco isoladas em uma superfície, em que uma molécula compreende um ectodomínio E-Caderina é preso à superfície.

[0060] A presente invenção também fornece populações de células isoladas que compreende uma quantidade de uma molécula que estabiliza E- caderina nas células suficiente para melhorar a sobrevivência de células isoladas em pelo menos 2 vezes comparadas com a ausência a molécula.

[0061] Em algumas formas de realização, a molécula compreende um composto da fórmula I.

[0062] Em algumas formas de realização, as células são selecionadas do grupo que consiste de células tronco, células tronco induzidas, células tronco pluripotentes, células progenitoras, células diferenciadas, células beta e fibroblastos.

[0063] A presente invenção também fornece para a população de células isoladas que compreende uma quantidade de um composto da fórmula I ou III suficiente para melhorar a sobrevivência de células isoladas em pelo menos 2 vezes comparadas com a ausência do composto.

[0064] Em algumas formas de realização, as células são selecionadas do grupo que consiste de células tronco, células tronco induzidas, células tronco pluripotentes, células progenitoras, células diferenciadas, células beta e fibroblastos.

[0065] A presente invenção também fornece métodos para manter a sobrevivência da célula tronco. Em algumas formas de realização, o métodos compreende gerar as células isoladas; e ativar a cinase C de proteína (PKC) nas células isoladas, mantendo deste modo a sobrevivência da célula.

[0066] Em algumas formas de realização, a etapa de ativação compreende contatar uma quantidade suficiente de forbol 12-miristato 13- acetato (PMA) com as células isoladas para melhorar a sobrevivência da células comparado com a taxa de sobrevivência na ausência do PMA.

[0067] A presente invenção também fornece populações das células tronco isoladas que compreende uma quantidade do ativador da cinase C de proteína suficiente para melhorar a sobrevivência das células tronco isoladas em pelo menos 2 vezes comparadas com a ausência do ativador da PKC.

DEFINIÇÕES

[0068] As abreviações aqui usadas tem seu significado convencional dentro das técnicas químicas e biológicas.

[0069] O termo “estabilizar uma célula” refere-se a substancialmente reduzir ou eliminar a resposta de uma célula a uma mudança nas condições ou ambiente aos quais a célula é exposta. “Reduzir substancialmente” neste contexto significa que a resposta é pelo menos 50 % menor do que aquela que teria ocorrido na ausência de um componente de estabilização (por exemplo, os compostos da invenção).

[0070] O termo “mudar as condições ou ambiente de uma célula” refere-se a mudar a temperatura, meio de cultura (por exemplo, fonte de carbono, concentração salina, fator de crescimento), dissociar as células nas células isoladas, descongelar células, ou de outro modo mudar um fator de um ambiente imediato da célula. Como aqui debatido, mudar a condição ou ambiente de uma célula frequentemente mudará o fenótipo ou programação celular da célula. Por exemplo, as células tronco, assim como algumas outras células, quando isoladas diferenciar-se-ão e/ou morrerão em resposta a certas mudanças tais como isolação, descongelamento, etc. Assim, mudar as condições pode reduzir ou eliminar a viabilidade da célula ao passo que as células estabilizadas como aqui descrito não têm viabilidade substancialmente reduzida sob as mesmas mudanças de condição. A mudança na programação da célula também pode ser monitorada como uma resposta da célula a um estímulo específico que é característico para um certo tipo de célula e/ou como pela expressão de um ou um conjunto de genes característicos ou produtos de gene. Como um exemplo não limitante, as células tronco pluripotentes humanas são conhecidas expressar pelo menos alguns, e opcionalmente todos, dos marcadores da seguinte lista: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-caderina, UTF-1, Oct4, Rex1, e Nanog. Tal expressão pode mudar conforme uma célula tronco perde a pluripotência ou de outro modo se diferencia. Uma célula tronco pluripotente humana estabilizada manteria o seu padrão de expressão característico a seguir de uma mudança na condição.

[0071] Uma célula “isolada” foi substancialmente separada ou purificada de outras células de um organismo.

[0072] O termo “dissociar” células refere-se a um processo de isolar as células de outras células ou de uma superfície (por exemplo, uma superfície de placa de cultura). Por exemplo, as células podem ser dissociadas de um animal ou tecido pelos métodos mecânicos ou enzimáticos. Alternativamente, as células que agregam in vitro podem ser dissociadas uma das outras. Já em uma outra alternativa, as células aderentes são dissociadas de uma placa de cultura ou outra superfície. A dissociação assim pode envolver romper as interações celulares com a matriz extracelular (ECM) e substrato (por exemplo, superfícies de cultura) ou romper a ECM entre as células.

[0073] “Determinar um fenótipo de uma célula” refere-se a avaliar uma qualidade ou característica da célula. Os fenótipos podem incluir, por exemplo, a expressão de gene característica do tipo de célula, ou padrões de expressão de gene, a resposta da célula a um estímulo ou ambiente, a capacidade para diferenciar ou desdiferenciar, têm uma morfologia particular, etc.

[0074] Onde grupos substituintes químicos são especificados pelas suas fórmulas químicas convencionais, escritas da esquerda para a direita, eles igualmente abrangem os substituintes quimicamente idênticos que resultariam de escrever a estrutura da direita para a esquerda, por exemplo, -CH2O- é equivalente a -OCH2-.

[0075] O termo “alquila,” por si só ou como parte de um outro substituinte, significa, a menos que de outro modo estabelecido, uma cadeia reta (isto é, não ramificada) ou ramificada, ou combinação destas, que podem ser totalmente saturadas, mono- ou poliinsaturadas e podem incluir radicais di- e multivalente, tendo o número de átomos de carbono designados (isto é, C1-C10 significa de um a dez carbonos). Exemplos de radicais de hidrocarboneto saturados incluem, mas não são limitados a, grupos tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, t-butila, isobutila, sec-butila, ciclohexila, (ciclohexil)metila, ciclopropilmetila, homólogos e isômeros, por exemplo, de n-pentila, n-hexila, n-heptila, n-octila, e outros. Um grupo alquila insaturado é um tendo uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas. Os exemplos de grupos alquila insaturados incluem, mas não são limitados a, vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienila), 2,4-pentadienila, 3- (1,4-pentadienila), etinila, 1- e 3-propinila, 3-butinila, e os homólogos e isômeros superiores. Os grupos alquila pcitados são grupos alquila C1-6.

[0076] O termo “alquileno” por si só ou como parte de um outro substituinte significa um radical bivalente derivado de um alquila, como exemplificado, mas não limitado, por -CH2CH2CH2CH2-. Tipicamente, um grupo alquila (ou alquileno) terá de 1 a 24 átomos de carbono, com estes grupos tendo 10 ou menos átomos de carbono sendo exemplificados na presente invenção. Um “alquila inferior” ou “alquileno inferior” é um grupo alquila ou alquileno de cadeia mais curta, no geral tendo oito ou menos átomos de carbono. os grupos alquileno pcitados são grupos alquileno C1-6.

[0077] O termo “heteroalquila,” por si só ou em combinação com um outro termo, significa, a menos que de outro modo estabelecido, uma cadeia reta ou ramificada estável, ou radical de hidrocarboneto cíclico, ou combinações destes, que consiste de pelo menos um átomo de carbono e pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo que consiste de O, N, P, Si e S, e em que os átomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N, P e S e Si podem ser colocados em qualquer posição interior do grupo heteroalquila ou na posição na qual o grupo alquila está ligado ao resto da molécula. Os exemplos incluem, mas não são limitados a, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S- CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, - Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, O-CH3, -O-CH2-CH3, e -CN. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos, tais como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3 e -CH2-O-Si(CH3)3. Similarmente, o termo “heteroalquileno” por si só ou como parte de um outro substituinte significa um radical bivalente derivado de heteroalquila, como exemplificado, mas não limitado por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para os grupos heteroalquileno, os heteroátomos também podem ocupar cada um ou ambos dos términais da cadeia (por exemplo, alquilenoóxi, alquilenodióxi, alquilenoamino, alquileno-diamino, e outros). Além disso ainda, para os grupos de ligação de alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo de ligação é implicado pela direção em que a fórmula do grupo de ligação é escrita. Por exemplo, a fórmula -C(O)2R’- representa tanto - C(O)2R’- quanto -R’C(O)2-. Como descrito acima, grupos heteroalquila, como aqui usados, incluem aqueles grupos que são ligados ao resto da molécula através de um heteroátomo, tal como -C(O)R’, -C(O)NR’, -NR’R”, -OR’, - SR’, e/ou -SO2R’. Onde “heteroalquila” é citado, seguido pelas recitações de grupos heteroalquila específicos, tais como -NR’R’ ou coisa parecida, será entendido que os termos heteroalquila e -NR’R” não são redundantes ou mutuamente exclusivos. Particularmente, os grupos heteroalquila específicos são citados para acrescentar clareza. Assim, o termo “heteroalquila” não deve ser aqui interpretado como excluindo grupos heteroalquila específicos, tais como -NR’R’ ou coisa parecida. Os grupos heteroalquila preferidos são grupos heteroalquila C1-6.

[0078] Como aqui usado, o termo “heteroalquileno” refere-se a um grupo heteroalquila, como definido acima, ligando pelo menos dois outros grupos. As duas porções ligadas ao heteroalquileno podem ser ligadas ao mesmo átomo ou átomos diferentes do heteroalquileno. Os grupos heteroalquileno preferidos são grupos heteroalquileno C1-6.

[0079] Os termos “cicloalquila” e “heterocicloalquila”, por eles mesmos ou em combinação com outros termos, representam, a menos que de outro modo estabelecido, versões cíclicas de “alquila” e “heteroalquila”, respectivamente. Adicionalmente, para heterociclo-alquila, um heteroátomo pode ocupar a posição na qual o heterociclo está ligado ao resto da molécula. Os exemplos de cicloalquila incluem, mas não são limitados a, ciclopentila, ciclohexila, 1-ciclohexenila, 3-ciclohexenila, cicloheptila, e outros. Os exemplos de heterocicloalquila incluem, mas não são limitados a, 1-(1,2,5,6- tetraidropiridila), 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-morfolinila, 3-morfolinila, tetraidrofuran-2-ila, tetraidrofuran-3-ila, tetraidrotien-2-ila, tetraidrotien-3-ila, 1-piperazinila, 2-piperazinila, e outros. Um “cicloalquileno” e “heterocicloalquileno” referem-se a um radical bivalente derivado de cicloalquila e heterocicloalquila, respectivamente. Os grupos cicloalquila e heterocicloalquila podem ser grupos cicloalquila C3-8 e heterocicloalquila C3-8, ou cicloalquila C5-8 e heterocicloalquila C5-8.

[0080] Os termos “halo” ou “halógeno,” por eles mesmos ou como parte de um outro substituinte, significam, a menos que de outro modo estabelecido, um átomo de flúor, cloro, bromo, ou iodo. Adicionalmente, os termos tais como “haloalquila,” são intencionados a incluir monohaloalquila e polihaloalquila. Por exemplo, o termo “haloalquila (C1-C4)” é intencionado incluir, mas não ser limitado a, trifluorometila, 2,2,2-trifluoroetila, 4- clorobutila, 3-bromopropila, e outros.

[0081] O termo “arila” significa, a menos que de outro modo estabelecido, um substituinte de hidrocarboneto poliinsaturado, aromático, que pode ser um único anel ou anéis múltiplos (preferivelmente de 1 a 3 anéis) que são fundidos juntos ou covalentemente ligados. O termo “heteroarila” refere-se a grupos arila (ou anéis) que contêm de um a quatro heteroátomos selecionados de N, O, e S, em que os átomos de nitrogênio e enxofre são opcionalmente oxidados, e o(s) átomo(s) de nitrogênio são opcionalmente quaternizados. Um grupo heteroarila pode ser ligados ao resto da molécula através de um carbono ou heteroátomo. Os exemplos não limitantes de grupos arila e heteroarila incluem fenila, 1-naftila, 2-naftila, 4- bifenila, 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3-pirazolila, 2-imidazolila, 4- imidazolila, pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 2-fenil-4-oxazolila, 5- oxazolila, 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5- tiazolila, 2-furila, 3-furila, 2-tienila, 3-tienila, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidila, 4-pirimidila, 5-benzotiazolila, purinila, 2-benzimidazolila, 5- indolila, 1-isoquinolila, 5-isoquinolila, 2-quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 3- quinolila, e 6-quinolila. Os substituintes para cada um dos sistemas de anel de arila e heteroarila mencionados acima são selecionados do grupo de substituintes aceitáveis descrito abaixo. “Arileno” e “heteroarileno” referem- se a um radical bivalente derivado de um arila e heteroarila, respectivamente. Os grupos arila da presente invenção preferivelmente têm de 5 a 12 membros no anel, mais preferivelmente de 6 a 10 membros no anel. Os grupos heterorila da presente invenção preferivelmente têm de 5 a 12 membros no anel, mais preferivelmente de 5 a 10 membros no anel.

[0082] Para brevidade, o termo “arila” quando usado em combinação com outros termos (por exemplo, arilóxi, ariltióxi, arilalquila) inclui tanto anel de arila quanto de heteroarila como definido acima. Assim, o termo “arilalquila” é intencionado a incluir aqueles radicais em que um grupo arila é ligado a um grupo alquila (por exemplo, benzila, fenetila, piridilmetila e outros) incluindo aqueles grupos alquila em que um átomo de carbon (por exemplo, um grupo metileno) foi substituído, por exemplo, por um átomo de oxigênio (por exemplo, fenoximetila, 2-piridiloximetila, 3-(1- naftilóxi)propila, e outros).

[0083] O termo “oxo” como aqui usado significa um oxigênio que é ligado por uma ligação dupla a um átomo de carbono.

[0084] O termo “alquilsulfonila” como aqui usado significa uma porção tendo a fórmula -S(O2)-R’, onde R’ é um grupo alquila como definido acima. R’ pode ter um número especificado de carbonos (por exemplo “alquila C1-C4 sulfonila”).

[0085] Cada um dos termos acima (por exemplo, “alquila,” “heteroalquila,” “arila” e “heteroarila”) são intencionados a incluir tanto as formas substituídas quanto as não substituídas do radical indicado. Os substituintes exemplares para cada tipo de radical são fornecidos abaixo.

[0086] Os substituintes para os radicais de alquila e heteroalquila (incluindo aqueles grupos frequentemente aludidos como alquileno, alquenila, heteroalquileno, heteroalquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila, e heterocicloalquenila) podem ser um ou mais de uma variedade de grupos selecionados de, mas não limitados a: -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, -NR’R”, -SR’, -halógeno, SiR’R”R”’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, -NR”C(O)R’, -NR’-C(O)NR”R”’, -NR”C(O)2R’, -NR-C(NR’R”R’”)=NR””, -NR-C(NR’R”)=NR”’, -S(O)R’, S(O)2R’, - S(O)2NR’R”, -NRSO2R’, -CN e -NO2 em um número variando de zero a (2m’+1), onde m’ é o número total de átomos de carbono em tal radical. R’, R”, R”’ e R”” cada um de modo preferível independentemente refere-se a hidrogênio, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído (por exemplo, arila substituído com 1 a 3 halógenos), alquila substituído ou não substituído, grupos alcóxi ou tioalcóxi, ou grupos arilalquila. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são cada um dos grupos R’, R”, R’ e R”” quando mais do que um destes grupos está presente. Quando R’ e R” são ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 4, 5, 6, ou 7 membros. Por exemplo, NR’R” é intencionado a incluir, mas não ser limitado a, 1- pirrolidinila e 4-morfolinila. A partir do debate acima de substituintes, uma pessoa de habilidade na técnica entenderá que o termo “alquila” é intencionado a incluir grupos que incluem átomos de carbono ligados aos grupos outros que não grupos hidrogênio, tais como haloalquila (por exemplo, -CF3 e -CH2CF3) e acila (por exemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, - C(O)CH2OCH3, e outros).

[0087] Similar aos substituintes descritos para o radical alquila, os substituintes para os grupos arila e heteroarila são variados e são selecionados de, por exemplo: halógeno, -OR’, -NR’R”, SR’, -halógeno, -SiR’R”R”’, - OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, -NR”C(O)R’, -NR’- C(O)NR”R”’, -NR”C(O)2R’, -NR-C(NR’R”R’”) =NR””, -NR- C(NR’R”)=NR’”, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R”, -NRSO2R’, -CN e -NO2, -R’, -N3, CH(Ph)2, fluoroalcóxi (C1-C4), e fluoroalquila (C1-C4), em um número variando de zero até o número total de valências abertas no sistema de anel aromático; e onde R’, R”, R”’ e R”” são de modo preferível independentemente selecionados de hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído e heteroarila substituído ou não substituído. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como o são cada um dos grupos R’, R”, R”’ e R”” quando mais do que um destes grupos está presente.

[0088] Dois dos substituintes nos átomos adjacentes do anel de arila ou heteroarila pode opcionalmente formar um anel da fórmula -T-C(O)- (CRR)q-U-, em que T e U são independentemente -NR-, -O-, -CRR’- ou uma ligação única, e q é um número inteiro de 0 a 3. Alternativamente, dois dos substituintes nos átomos adjacentes do anel de arila ou heteroarila podem ser opcionalmente substituídos com um substituinte da fórmula -A-(CH2)r-B-, em que A e B são independentemente -CRR’-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, - S(O)2NR’- ou uma ligação única, e r é um número inteiro de 1 a 4. Uma das ligações únicas do novo anel assim formado pode ser opcionalmente substituída com uma ligação dupla. Alternativamente, dois dos substituintes nos átomos adjacentes do anel de arila ou heteroarila podem ser opcionalmente substituídos com um substituinte da fórmula -(CRR’)s-X’- (C”R”‘)d-, onde s e d são independentemente números inteiros de 0 a 3, e X’ é -O-, -NR’-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, ou -S(O)2NR’-. Os substituintes R, R’, R” e R’” são de modo preferível independentemente selecionados de hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, e heteroarila substituído ou não substituído.

[0089] Como aqui usados, o termo “heteroátomo” ou “heteroátomo do anel” é intencionado incluir oxigênio (O), nitrogênio (N), enxofre (S), fósforo (P), e silício (Si).

[0090] Um “grupo substituinte,” como aqui usado, significa um grupo selecionado das seguintes porções: (A) -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, oxo, halógeno, alquila não substituído, heteroalquila não substituído, cicloalquila não substituído, heterocicloalquila não substituído, arila não substituído, heteroarila não substituído, e (B) alquila, heteroalquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, e heteroarila, substituídos com pelo menos um substituinte selecionado de: (i) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquila não substituído, heteroalquila não substituído, cicloalquila não substituído, heterocicloalquila não substituído, arila não substituído, heteroarila não substituído, e (ii) alquila, heteroalquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, e heteroarila, substituído com pelo menos um substituinte selecionado de: (a) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquila não substituído, heteroalquila não substituído, cicloalquila não substituído, heterocicloalquila não substituído, arila não substituído, heteroarila não substituído, e (b) alquila, heteroalquila, cicloalquila, heterociclo-alquila, arila, ou heteroarila, substituído com pelo menos um substituinte selecionado de oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquila não substituído, heteroalquila não substituído, cicloalquila não substituído, heterocicloalquila não substituído, arila não substituído, e heteroarila não substituído.

[0091] Um “substituinte limitado no tamanho” ou “grupo de substituinte limitado no tamanho,” como aqui usados significam um grupo selecionado de todos os substituintes descritos acima por um “grupo substituinte,” em que cada alquila substituído ou não substituído é um alquila C1-C20 substituído ou não substituído, cada heteroalquila substituído ou não substituído é um heteroalquila de 2 a 20 membros substituído ou não substituído, cada cicloalquila substituído ou não substituído é um cicloalquila C4-C8 substituído ou não substituído, e cada heterocicloalquila substituído ou não substituído é um heterocicloalquila de 4 a 8 membros substituído ou não substituído.

[0092] Um “substituinte inferior” ou “grupo substituinte inferior,” como aqui usado significa um grupo selecionado de todos os substituintes descritos acima para um “grupo substituinte,” em que cada alquila substituído ou não substituído é um alquila C1-C8 substituído ou não substituído, cada heteroalquila substituído ou não substituído é um heteroalquila de 2 a 8 membros substituído ou não substituído, cada cicloalquila substituído ou não substituído é um cicloalquila C5-C7 substituído ou não substituído, e cada heterocicloalquila substituído ou não substituído é um heterocicloalquila de 5 a 7 membros substituído ou não substituído.

[0093] O termo “sais farmaceuticamente aceitáveis” é intencionado a incluir sais dos compostos ativos que são preparados com ácidos ou bases relativamente não tóxicos, dependendo dos substituintes particulares encontrados nos compostos aqui descritos. Quando os compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente ácidas, os sais de adição de base podem ser obtidos contatando-se a forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente da base desejada, pura ou em um solvente inerte adequado. Os exemplos de sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis incluem sal de sódio, potássio, cálcio, amônio, amino orgânico, ou magnésio, ou um sal similar. Quando compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente básicas, os sais de adição de ácido podem ser obtidos contatando-se a forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente do ácido desejado, puro ou em um solvente inerte adequado. Os exemplos de sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos como ácidos clorídrico, bromídrico, nítrico, carbônico, monoidrogenocarbônico, fosfórico, monoidrogenofosfórico, diidrogenofosfórico, sulfúrico, monoidrogeno- sulfúrico, iodídrico, ou ácidos fosforosos e outros, assim como os sais derivados de ácidos orgânicos relativamente não tóxicos como acético, propiônico, isobutírico, maléico, malônico, benzóico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, benzenossulfônico, p-tolilsulfônico, cítrico, tartárico, metanossulfônico, e outros. Também incluídos são os sais de aminoácidos tais como arginato e outros, e sais de ácidos orgânicos como glicurônico ou galacturônico e outros (ver, por exemplo, Berge et al., “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Certos compostos específicos da presente invenção contêm funcionalidades tanto básicas quanto ácidas que permitem que os compostos sejam convertidos em seus sais de adição de base ou ácido.

[0094] Assim, os compostos da presente invenção podem existir como sais com ácidos farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção inclui tais sais. Os exemplos de tais sais incluem cloridretos, bromidretos, sulfatos, metanossulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartaratos (por exemplo, (+)-tartaratos, (-)-tartaratos ou misturas destes incluindo misturas racêmicas, succinatos, benzoatos e sais com aminoácidos tais como ácido glutâmico. Estes sais podem ser preparados pelos métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[0095] As formas neutras dos compostos são preferivelmente regeneradas contatando-se o sal com uma base ou ácido e isolando-se o composto precursor na maneira convencional. A forma precursora do composto difere das várias formas salinas em certas propriedades físicas, tais como solubilidade em solventes polares.

[0096] Além das formas salinas, a presente invenção fornece compostos, que estão em uma forma de pró-medicamento. Os pró- medicamentos dos compostos aqui descritos são aqueles compostos que facilmente sofrem mudanças químicas sob condições fisiológicas para fornecer os compostos da presente invenção. Adicionalmente, pró- medicamentos podem ser convertidos aos compostos da presente invenção pelos métodos químicos ou bioquímicos em um ambiente ex vivo. Por exemplo, os pró-medicamentos podem ser lentamente convertidos aos compostos da presente invenção quando colocados em um reservatório de emplastro transdérmico com uma enzima ou reagente químico adequados.

[0097] Certos compostos da presente invenção podem existir nas formas não solvatadas assim como formas solvatadas, incluindo formas hidratadas. No geral, as formas solvatadas são equivalentes às formas não solvatadas e são abrangidas dentro do escopo da presente invenção. Certos compostos da presente invenção podem existir nas formas múltiplas cristalinas ou amorfas. No geral, todas as formas físicas são equivalentes para os usos considerados pela presente invenção e são intencionados a estarem dentro do escopo da presente invenção.

[0098] Certos compostos da presente invenção possuem átomos de carbono assimétricos (centros ópticos) ou ligações duplas; os racematos, diastereômeros, tautômeros, isômeros geométricos e isômeros individuais são abrangidos dentro do escopo da presente invenção. Os compostos da presente invenção não incluem aqueles que são conhecidos na técnica como sendo muito instáveis para sintetizar e/ou isolar.

[0099] Os compostos da presente invenção também podem conter proporções não naturais de isótopos atômicos em um ou mais dos átomos que constituem tais compostos. Por exemplo, os compostos podem ser radiorrotulados com isótopos radioativos, tais como por exemplo trítio (3H), iodo 125 (125I) ou carbono 14 (14C). Todas as variações isotópicas dos compostos da presente invenção, sejam radioativos ou não, são abrangidas dentro do escopo da presente invenção.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[00100] Figura 1. Novas moléculas pequenas sintéticas dramaticamente aumentam a sobrevivência de hESC depois da dissociação de célula única sem comprometer a sua auto-renovação de longa duração e potencial desenvolvimental completo. (a) Estruturas químicas de Tiazovivin/Tzv e Pirintegrina/Ptn como indicados. (b) tingimento ALP de colônias de hESC que cresceram a partir de células únicas dissociadas semeadas em densidade baixa e tratadas como indicado. (c) Razão de colônias positivas em ALP vs. células totais inicialmente semeadas. (d) Imunotingimento de hESCs de longa duração mantidas em meio contendo Ptn ou Tzv como indicado. (e) Seções de 5 semanas de teratomas formados a partir de hESCs expandidas de longa duração mantidas em meio contendo Tzv (i, ii) ou Ptn (iii, iv). Neuroepitélio (ectoderma), cartilagem (mesoderma), e epitélio simples (endoderma) (i); neuroepitélio (ectoderma), epitélio simples e epitélio tipo hepático (endoderma) (ii); neuroepitélio (ectoderma), cartilagem (mesoderma) e epitélio tubular (endoderma) (iii); neuroepitélio (ectoderma), músculo esqueletal (mesoderma), e epitélio tubular (endoderma) (iv). (f) Análise de faixa G de hESCs depois de mais do que 20 passagens, propagada na presença de compostos Ptn ou Tzv. Se não especificados, todas as hESCs acima foram cultivadas no meio quimicamente definido e isento de mecanismo de alimentação nas placas revestidas de Matrigel.

[00101] Figura 2. Tzv estabiliza E-caderinas depois da dissociação celular para proteger as hESCs da morte em cultura em suspensão. (a) Análise da morte de célula de hESCs dissociadas cultivadas em Matrigel ou em suspensão tratada com ou sem Ptn ou Tzv. (b) Imagens de contraste de fase de hESCs cultivadas nas placas não revestidas tratadas com as moléculas indicadas. (c) Análise de Western blot de E-caderinas em hESCs que foram transfectadas com o siRNAs específico contra E-caderina ou GFP. (d) Análise da morte de célula pelo tingimento TUNEL de e (e) tingimento de ALP de hESCs dissociadas que foram transfectadas com os siRNAs específicos contra E-caderina ou GFP na presença de Tzv. (f) Análise de Western blot de E- caderinas de tamanho natural em hESCs antes e depois da tripsina. (g) Uma análise de Western blot da expressão de E-caderina de tamanho natural em hESCs depois da dissociação e tratamento com tripsina com DMSO, Tzv, ou Ptn durante o tempo indicado. (h) Análise de citometria de fluxo do nível de superfície de E-caderina em hESCs depois do tratamento com tripsina na presença de Tzv. DMSO foi usado como um controle. (i) RT-PCR semi- quantitativa de E-caderina em hESCs tratadas com ou sem Tzv. (j) Análise de endocitose de E-caderina na ausência ou presença de Tzv. (k) Análise de sobrevivência de célula de hESCs cultivadas em BSA ou concentrações diferentes das placas revestidas com a quimera E-cad-Fc.

[00102] Figura 3. Ptn e Tzv protegem hESCs da morte celular em cultura aderente depois da dissociação pela manutenção e re-ativação da atividad da integrina. (a) Curva de crescimento de hESCs cultivadas em Matrigel com cursos de tempo diferentes de tratamento com Ptn e Tzv. Grupo 1, tratamento com Ptn apenas durante as primeiras 24 horas; Grupo 2, tratamento contínuo com Ptn durante o período de cultura inteiro; Grupo 3, tratamento com Tzv durante apenas as primeiras 24 horas; Grupo 4, tratamento contínuo com Tzv durante a cultura; Para cada condição, 10 x 104 células dissociadas foram plaqueadas por reservatório de uma placa de 6 reservatórios. (b) imagens de contraste de fase de hESCs 12 horas depois de semear nas matrizes diferentes e tratadas com os compostos indicados. (c) hESCs dissociadas foram plaqueadas em placas revestidas com Matrigel e deixadas aderir por 3 horas na presença de compostos ou junto com anticorpo bloqueador da integrina β1 como indicado. A porcentagem de adesão foi calculada como descrito nos Materiais e Métodos. (d) análise de Western blot de integrin β1 expressada pelas hESCs antes e depois do tratamento com tripsina. (e) Uma análise de western blot no curso de tempo da expressão de integrina em hESCs depois da dissociação e tratamento com tripsina com DMSO, Tzv, ou Ptn pelo tempo indicado. (f, g) Citometria de fluxo (f), e imunotingimento (g) análise das integrinas β1 na conformação ativa nas hESCs dissociadas com tripsina depois do tratamento com Tzv ou Ptn. (h, i) Adesão de célula (h) e tingimento com ALP (i) de hESCs tratadas com ou sem anticorpo ativador de β1, TS2/16. (j) Adesão de célula de hESCs tratada com Tzv ou Ptn em combinação com ou sem um inibidor de PKC. (k) Imunotingimento de integrinas β1 na conformação ativa em hESCs tratadas com ou sem PMA (10 nM). (l, m) Adesão de célula (l) e tingimento com ALP (m) de hESCs tratadas com os compostos indicados.

[00103] Figura 4. PI-3 K e ERK mediados pelos receptores de fatores de crescimento são a principal sinalização de sobrevivência e anti- diferenciação gerada a partir do nicho hESC, respectivamente. (a) Análise da morte de célula de hESCs dissociadas plaqueadas em Matrigel e tratadas como indicado. (b) Western blot mostrando a situação da fosforilação de receptores do fator de crescimento diferentes em hESCs tratadas com Ptn por 2 h. DMSO foi usado como um controle. (c) Análise da morte de célula de hESCs dissociadas em suspensão tratada com as condições indicadas. (d) Imunoprecipitação mostrando a interação de E-caderinas com EGFR1 e Erb2. (e) Western blot mostrando a situação da fosforilação de AKT em hESCs tratada com Ptn para os períodos de tempo indicados. (f) Western blot mostrando a situação da fosforilação de AKT e ERK na presença de Ptn ou junto com anticorpo bloqueador da integrina β1. (g) Western blot mostrando a situação da fosforilação de AKT em hESCs tratadas com Ptn ou junto com os inibidores de receptor indicados. (h) Análise da morte de célula de hESCs tratadas com Ptn ou junto com inibidor de PI-3 K, ou inibidor de MEK por 24 h. (i) Porcentagem de células negativas em SSEA4 depois do tratamento com inibidor de MEK.

[00104] As Figuras 5A e 5B mostram compostos da presente invenção, incluindo tiazovivin e seus derivados.

[00105] As Figuras 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F, 6G, 6H, 61, 6J, 6K, 6L, 6M, 6N, 60, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6U, 6V, 6W, 6X, 6Y, 6Z, 6AA, 6AB e 6AC mostram compostos da presente invenção, incluindo pirintegrina e seus derivados.

DESCRIÇÃO DETALHADA I.Introdução

[00106] A presente invenção fornece novos compostos assim como métodos para o seu uso. Duas classes de compostos químicos de molécula pequena são fornecidos que impedem a diferenciação de células e promovem a sobrevivência da célula, incluindo mas não limitadas a, quando as células são isoladas ou estão de outro modo fora do seu meio normal ou ambiente tecidual. Os compostos funcionam por mecanismos um pouco diferentes mas ambos são úteis como compostos profiláticos e terapêuticos para várias indicações de doença diferentes, incluindo mas não limitado a, câncer, dano a tecido, e acidente vascular cerebral. II.Compostos que promovem a sobrevivência da célula e/ou anti-diferenciação

[00107] Em um aspecto, os compostos que promovem a sobrevivência da célula e/ou anti-diferenciação são fornecidos. Em algumas formas de realização, o composto tem a fórmula:

[00108] Na Fórmula (I), o anel A é um cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído. O anel B é um heterocicloalquila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[00109] L1 é -C(O)-NR2- ou -NR2-C(O)-. L2 é uma ligação, alquileno substituído ou não substituído ou heteroalquileno substituído ou não substituído.

[00110] Rl e R2 são independentemente hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[00111] Em algumas formas de realização, o anel A é um arila substituído ou não substituído. O anel A também pode ser um fenila substituído ou não substituído.

[00112] Em outras formas de realização, o anel B é um heterocicloalquila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído. O anel B também pode ser um heteroarila substituído ou não substituído. Ainda em outras formas de realização, o anel B é um pirazolila substituído ou não substituído, furanila substituído ou não substituído, imidazolila substituído ou não substituído, isoxazolila substituído ou não substituído, oxadiazolila substituído ou não substituído, oxazolila substituído ou não substituído, pirrolila substituído ou não substituído, piridila substituído ou não substituído, pirimidila substituído ou não substituído, piridazinila substituído ou não substituído, tiazolila substituído ou não substituído, triazolila substituído ou não substituído, tienila substituído ou não substituído, diidrotieno-pirazolila substituído ou não substituído, tianaftenila substituído ou não substituído, carbazolila substituído ou não substituído, benzotienila substituído ou não substituído, benzofuranila substituído ou não substituído, indolila substituído ou não substituído, quinolinila substituído ou não substituído, benzotriazolila substituído ou não substituído, benzotiazolila substituído ou não substituído, benzooxazolila substituído ou não substituído, benzimidazolila substituído ou não substituído, isoquinolinila substituído ou não substituído, isoindolila substituído ou não substituído, acridinila substituído ou não substituído, benzoisazolila substituído ou não substituído, ou dimetilidantoína substituído ou não substituído.

[00113] L2 pode ser alquila C1-C10 substituído ou não substituído. Em algumas formas de realização, L2 é alquila C1-C10 não substituído. L2 também pode ser metileno substituído ou não substituído (por exemplo metileno não substituído).

[00114] R2 pode ser hidrogênio. R1 pode ser hidrogênio ou alquila C1 C10 não substituído. Em algumas formas de realização, R1 é simplesmente hidrogênio.

[00115] Em algumas formas de realização da Fórmula (I), o anel A é arila substituído ou não substituído, o anel B é heteroarila substituído ou não substituído, R1 é hidrogênio, e L2 é alquila C1-C10 não substituído.

[00116] Em uma outra forma de realização, o composto que promove a sobrevivência da célula e/ou a anti-diferenciação tem a fórmula:

[00117] Na Fórmula (II), y é um número inteiro de 0 a 3 e z é um número inteiro de 0 a 5. X é -N=, -CH= ou -CR5=. R1 e L2 são como definidos acima nas definições da Fórmula (I).

[00118] R3, R4 e R5 são independentemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, - 9 10 11 12 13 14 15 16 17 C(O)R , -NR -C(O)R , NR -C(O)-OR , -C(O)NR R , -NR S(O)2R , - OR18, -S(O)2NR19, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído, em que n é um número inteiro de 0 a 2, em que se z é maior do que 1, duas porções de R3 são opcionalmente unidas entre si para formar um cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído. 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 R, R, R, R, R , R , R , R , R , R , R , R , R e R

[00119] são independentemente hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[00120] Em algumas formas de realização, L2 é alquila C1-C10 substituído ou não substituído. L2 também pode ser alquila C1-C10 não substituído. Alternativamente, L2 é metileno substituído ou não substituído (por exemplo metileno não substituído).

[00121] Em outras formas de realização, X é -N= ou -CH=. O símbolo z pode ser 2. Ainda em outras formas de realização, duas porções de R3 em vértices adjacentes são unidos entre si para formar um heterocicloalquila substituído ou não substituído. O símbolo z também pode ser 1. O símbolo y pode ser 0 ou 1. R3 pode ser -OR18. R18 pode ser hidrogênio ou alquila C1-C10 não substituído.

[00122] Em algumas formas de realização, L2 é metileno substituído ou não substituído (por exemplo metileno substituído), X é -N= ou -CH=, R1 é hidrogênio, e y e z são 0.

[00123] Em outras formas de realização, o compostos tem as fórmulas:

[00124] Ainda em outras formas de realização, os compostos da fórmula I são aqueles onde o anel A é cicloalquila, heterocicloalquila, arila, ou heteroarila, cada um opcionalmente substituído com 1 a 5 grupos R3; o anel B é heterocicloalquila ou heteroarila, cada um opcionalmente substituído com 1 a 5 grupos R4; L1 é -C(O)-NR2- ou -NR2-C(O)-; L2 é uma ligação, alquileno C1-10 ou heteroalquileno C1-10; Rl e R2 são independentemente hidrogênio, alquila C1-10, heteroalquila C1-10, cicloalquila C3-8, heterocicloalquila C3-8, arila, ou heteroarila; cada R3 e R4 é independentemente 6 7 8 9 10 11 12 13 -CN, -S(O)nR , -NR R , -C(O)R , -NR -C(O)R , -NR -C(O)-OR , - C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquila C1-10, heteroalquila C1-10, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, ou heteroarila, em que n é um número inteiro de 0 a 2, em que duas porções de R3 são opcionalmente unidas entre si para formar um cicloalquila, heterocicloalquila, arila, ou heteroarila; e 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R e R são cada um independentemente hidrogênio, alquila C1-10, heteroalquila C1-10, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, ou heteroarila. Ainda em outras formas de realização, os compostos da fórmula I são outros que não Tiazovivin.

[00125] Em outras formas de realização, o composto que promove a sobrevivência da célula e/ou anti-diferenciação tem a fórmula:

[00126] Na Fórmula (III), o anel D é arila substituído ou não substituído ou heteroarila substituído ou não substituído. L3 é -C(O)NH- ou - S(O)2NH-.

[00127] R29 é alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído. R21 é NR22R23 ou - OR24.

[00128] R22 e R23 são independentemente hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, heteroarila substituído ou não substituído, ou unidos entre si para formar um heterocicloalquila substituído ou não substituído ou heteroarila substituído ou não substituído.

[00129] R24 é alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, heteroarila substituído ou não substituído, ou unidos entre si para formar um cicloalquila substituído ou não substituído de heterocicloalquila substituído ou não substituído.

[00130] Em outras formas de realização, L3 é uma ligação, -O-, - C(O)NH- ou -S(O)2NH-, R20 é hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído, e o Anel D e R21 são como definidos acima. Em algumas outras formas de realização, L3 é uma ligação, -O- ou -S(O)2NH-, e o Anel D, R20 e R21 são como definidos acima, tal que quando L3 é -S(O)2NH-, R20 é hidrogênio. Ainda em outras formas de realização, L3 é uma ligação ou -O-, e o Anel D, R20 e R21 são como definidos acima.

[00131] Em algumas formas de realização, o anel D é fenila substituído ou não substituído.

[00132] Em outras formas de realização, R20 é alquila substituído ou não substituído ou cicloalquila substituído ou não substituído. R20 pode ser alquila C1-C10 substituído ou não substituído ou cicloalquila de 3 a 7 membros substituído ou não substituído. R20 também pode ser alquila C1-C5 substituído ou não substituído ou cicloalquila de 3 a 6 membros substituído ou não substituído. Em algumas formas de realização, R20 é alquila C1-C5 não substituído ou cicloalquila de 3 a 6 membros não substituído.

[00133] Ainda em outras formas de realização, R22 é hidrogênio, e R23 é cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído. Alternativamente, R22 é hidrogênio; e R23 é arila substituído ou não substituído. Ou R22 e R23 são unidos entre si para formar um heterocicloalquila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído. R22 e R23 também pode ser unido entre si para formar um pirrolila substituído ou não substituído, isoindolinila substituído ou não substituído, piperidinila substituído ou não substituído, ou tetraidroquinolinila substituído ou não substituído.

[00134] Em algumas formas de realização, o composto tem a fórmula:

[00135] Na Fórmula (IV), w é um número inteiro de 0 a 1 e q é um número inteiro de 0 a 7. R20 é como definido acima na definição do composto da Fórmula (III). R25, R26, R27 e R28 são independentemente -CN, -NR29R30, - 31 32 33 34 35 36 37 38 39 C(O)R , -NR -C(O)R , -NR -C(O)-OR , -C(O)NR R , -NR S(O)2R , - OR40, -S(O)2NR41, -S(O)vR42, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído, em que v é um número inteiro de 0 a 2. 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

[00136] R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R , R e R são independentemente hidrogênio, alquila substituído ou não substituído, heteroalquila substituído ou não substituído, cicloalquila não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído. R25 e R26, ou R26 e R27, podem ser unidos para formar um cicloalquila substituído ou não substituído, heterocicloalquila substituído ou não substituído, arila substituído ou não substituído, ou heteroarila substituído ou não substituído.

[00137] Em algumas formas de realização, R28 é -OR40. R40 é hidrogênio ou alquila C1-C10 não substituído. R40 também pode ser hidrogênio ou alquila C1 a C5 não substituído. O composto também pode ter a fórmula:

[00138] Na Fórmula (V), R20, R28, e q são como definidos acima nas definições da Fórmula (IV). Em algumas formas de realização, R20 é alquila C1 a C10 não substituído. R28 pode ser -OR40. R40 é hidrogênio ou alquila C1 a C10 não substituído, ou alquila C1 a C10 substituído com cicloalquila C3 a C6 substituído ou não substituído. O símbolo q pode ser 1. Em uma outra forma de realização, o composto tem a fórmula:

[00139] Na fórmula (VI), R20, R28, e q são como definidos acima nas definições da Fórmula (IV) ou Fórmula (VI).

[00140] Em uma outra forma de realização, o composto tem as fórmulas:

[00141] Em outras formas de realização, os compostos da fórmula III são aqueles onde o Anel D é arila ou heteroarila, cada um opcionalmente substituído com 1 a 5 grupos R; L3 é -C(O)NH- ou -S(O)2NH-; R20 é alquila C1-10, heteroalquila C1-10, cicloalquila, heterocicloalquila, arila ou heteroarila, cada um opcionalmente substituído com 1 a 5 grupos R; R21 é -NR22R23 ou - OR24; R22 e R23 são independentemente hidrogênio, alquila C1-10, heteroalquila C1-10 heteroalquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila ou são unidos juntos para formar um heterocicloalquila ou heteroarila, cada um opcionalmente substituído com 1 a 5 grupos R; R24 é alquila C1-10, heteroalquila C1-10, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila, cada um opcionalmente substituído com 1 a 5 grupos R; e cada grupo R é independentemente selecionado do grupo que consiste de alquila C1-10, heteroalquila C1-10, -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, -NR’R”, -SR’, -halógeno, - SiR’R”R”’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, - NR”C(O)R’, -NR’-C(O)NR”R”’, -NR”C(O)2R’, NR-C(NR’R”R’”) =NR””, - NR-C(NR’R”)=NR”’, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R”, -NRSO2R’, -CN, - NO2, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, e heteroarila, em que cada R’, R”, R”’ e R”” é independentemente selecionado do grupo que consiste dos grupos hidrogênio, alquila C1-10, heteroalquila C1-10, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, e arilalquila.

[00142] Em algumas formas de realização, cada grupo substituído descrito acima nos compostos das Fórmulas (I) a (VI) é substituído com pelo menos um grupo substituinte. Mais especificamente, em algumas formas de realização, cada alquila substituído, heteroalquila substituído, cicloalquila substituído, heterocicloalquila substituído, arila substituído, heteroarila substituído, alquileno substituído, e/ou heteroalquileno substituído descritos acima nos compostos das Fórmulas (I) a (VI) são substituídos com pelo menos um grupo substituinte. Em outras formas de realização, pelo menos um ou todos destes grupos são substituídos com pelo menos um grupo substituinte limitado no tamanho. Alternativamente, pelo menos um ou todos destes grupos são substituídos com pelo menos um grupo substituinte inferior.

[00143] Em outras formas de realização dos compostos das Fórmulas (I) a (VI), cada alquila substituído ou não substituído é um alquila C1-C20 substituído ou não substituído, cada heteroalquila substituído ou não substituído é um heteroalquila de 2 a 20 membros substituído ou não substituído, cada cicloalquila substituído ou não substituído é um cicloalquila C3-C8 substituído ou não substituído, cada heterocicloalquila substituído ou não substituído é um heterocicloalquila de 3 a 8 membros substituído ou não substituído, cada alquileno substituído ou não substituído é um alquileno C1C20 substituído ou não substituído, e/ou cada heteroalquileno substituído ou não substituído é um heteroalquileno de 2 a 20 membros substituído ou não substituído.

[00144] Em algumas formas de realização, cada alquila substituído ou não substituído é um alquila C1-C8 substituído ou não substituído, cada heteroalquila substituído ou não substituído é um heteroalquila de 2 a 8 membros substituído ou não substituído, cada cicloalquila substituído ou não substituído é um cicloalquila C5-C7 substituído ou não substituído, cada heterocicloalquila substituído ou não substituído é um heterocicloalquila de 5 a 7 membros substituído ou não substituído, e/ou cada alquileno substituído ou não substituído é um alquileno C1-C8 substituído ou não substituído, e/ou cada heteroalquileno substituído ou não substituído é um heteroalquileno de 2 a 8 membros substituído ou não substituído.

[00145] Em algumas outras formas de realização, os compostos das fórmulas (I) a (VI) podem ser substituídos com alquila C1-10, heteroalquila C110, -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, -NR’R”, -SR’, -halógeno, SiR’R”R”’, - OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, -NR”C(O)R’, NR’- C(O)NR”R”’, -NR”C(O)2R’, -NR-C(NR’R”R’”)=NR””, -NR- C(NR’R”)=NR”’, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R”, -NRSO2R’, -CN, -NO2, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, ou heteroarila, em que cada R’, R”, R”’ e R”” grupos hidrogênio, alquila C1-10, heteroalquila C1-10, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, ou arilalquila. III.Métodos de uso

[00146] Os compostos da presente invenção são úteis para uma ampla variedade de propósitos. Por exemplo, os compostos promovem a sobrevivência em situações (por exemplo, para as células isoladas) onde as células de outro modo iriam através da apoptose ou de outro modo mprrem. Em algumas formas de realização, as células são estabilizadas por pelo menos um período particular de tempo, por exemplo, 10 minutos, 30 minutos, ou 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, ou 96 horas. Além disso, os compostos são úteis na manutenção do estado corrente de diferenciação de células em condições onde as células de outro modo diferenciar-se-iam ou de outro modo mudariam a sua programação. Estes efeitos levam a um grande número de usos para os compostos in vitro ou in vivo. A.Usos In Vivo

[00147] Os compostos da invenção são úteis para reduzir o dano a tecido e assim podem ser administrados para tratar, melhorar, ou prevenir dano a tecido. Em algumas formas de realização, um composto da invenção é administrado a um indivíduo tendo, ou em risco de ter dano a tecido em um órgão interno. Os órgãos internos incluem, mas não são limitados a, cérebro, pâncreas, fígado, intestino, pulmão, rim, ou coração, ferimento, por exemplo, por queimadura ou corte. Por exemplo, em algumas formas de realização, os compostos da invenção são eficazes na redução do tamanho da infartação na reperfusão a seguir da isquemia. Assim, um composto da invenção pode ser administrado aos indivíduos em risco de ter, tendo, ou que tenham tido, um acidente vascular cerebral. Similarmente, um composto da invenção pode ser administrado aos indivíduos em risco de ter, tendo, ou que tenham tido, um ataque cardíaco ou dano cardíaco.

[00148] Os inventores descobriram que os compostos da invenção podem prevenir a morte celular, por exemplo em células epiteliais. Por exemplo, os inventores dispersaram ilhotas/células beta pancreáticas humanas primárias plaqueadas como células únicas em uma placa de cultura de tecido que foi revestida com matrigel ou laminina. Em meio de cultura de célula regular para as células beta sem Tzv resultou na morte celular substancial. Entretanto, quando Tzv foi adicionado ao meio (1 a 2 mM), a morte celular foi inibida. O mesmo efeito foi observado para outras células primárias epiteliais, tais como células neurais. Consequentemente, em algumas formas de realização, um composto da presente invenção é administrado a um indivíduo em necessidade de células beta e/ou ilhotas pancreáticas, em que a administração do composto resulta em um aumento no número de células beta ou ilhotas no indivíduo.

[00149] Além disso, os compostos da invenção (por exemplo, aqueles das Fórmulas I ou III) são eficazes em aumentar o fluxo sanguíneo e inibir as respostas inflamatórias. Por exemplo, os compostos da Fórmula I realçam a adesão e migração de monócitos através das monocamadas de células endoteliais e podem assim aliviar respostas inflamatórias (dados não mostrados). Assim, em algumas formas de realização, um composto da invenção é administrado a um indivíduo (por exemplo, tendo isquemia cerebral) em necessidade de fluxo sabguínio aumentado e/ou inflamação diminuída. Aqueles em necessidade de inflamação reduzida incluem indivíduos com doença inflamatória ou com uma doença mediada por uma condição inflamatória. As doenças inflamatórias exemplares incluem, mas não são limitados a, doença pulmonar obstrutiva crônica, osteoartrite, tendinite ou bursite, artrite gotosa, polimialgia reumática, fibromialgia, doença inflamatória pélvica e artrite, incluindo artrite reumatóide.

[00150] Em algumas formas de realização, os compostos da presente invenção são usados para tratar ou melhorar o câncer. Em alguns casos, um composto da presente invenção é administrado para tratar câncer, por exemplo, carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas, câncer de mama, câncer ovariano, câncer cervical, glioblastoma, leucemia, linfoma, câncer da próstata, e linfoma de Burkitt, câncer de cabeça e pescoço, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer pulmonar de célula pequena, câncer do esôfago, câncer do estômago, câncer pancreático, câncer hepatobiliar, câncer da vesícula biliar, câncer do intestino delgado, câncer retal, câncer renal, câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer peniano, câncer uretral, câncer testicular, câncer cervical, câncer vaginal, câncer uterino, câncer ovariano, câncer da tireóide, câncer da paratireóide, câncer adrenal, câncer endócrino pancreático, câncer carcinóide, câncer ósseo, câncer de pele, retinoblastomas, linfomna de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin (ver, CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V. T. et al. eds 1997) para canceres adicionais).

[00151] A metástase de célula cancerosa é tipicamente um processo que envolve a transição de epitelial para mesenquimatoso/EMT (por exemplo das células tipo epitelial para as células tipo fibroblasto). Os inventores descobriram que os compostos da invenção (isto é, Tvz e Ptn) podem induzir MET (o reverso de EMT) e inibem EMT, indicando que os compostos são eficazes na redução ou prevenção da metástase do câncer. Consequentemente, em algumas formas de realização, um composto da presente invenção é administrado a um indivíduo tendo ou em risco de ter metástase de câncer. Por exemplo, os inventores descobriram que os compostos da fórmula I e III inibem a metástase de canceres epiteliais incluindo mas não limitado a câncer de mama e carcinoma hepatocelular.

[00152] Em algumas formas de realização, um composto da presente invenção é administrado a um indivíduo tendo, ou em risco de ter, hipertensão e/ou aterosclerose.

[00153] Os compostos das fórmulas I e III (isto é, Tvz e Ptn) são eficazes na promoção da regeneração axonal e recuperação funcional no sistema nervoso central lesionado. Por exemplo, os inventores descobriram que Tvz pode promover o crescimento de neurite a partir de células neuronais primárias de camundongos. Tzv (3 μM) foi testado nos explantes de P1 cortical de camundongo, com o crescimento de axônio como uma leitura de resultado. Tzv foi adicinado ao meio 20 minutos depois de plaquear, com DMSO como um controle. Os explantes foram observados por 4 dias em cultura. Tzv mostrou um efeito dramático na promoção do crescimento de axônio, que foi notável de l div. Consequentemente, em algumas formas de realização, um composto da presente invenção é administrado a um indivíduo tendo uma lesão no sistema nervoso central ou que está em necessidade ou de outro modo beneficiar-se-ia da regeneração axonal.

[00154] Em algumas formas de realização, um composto da presente invenção é administrado a um indivíduo tendo diabete, resistência à insulina, ou de outro modo em necessidade de promoção da sobrevivência da célula beta, ou em risco de ter perda da função de célula beta.

[00155] Os compostos da invenção também encontram uso na melhora de sintomas negativos de, ou de outro modo melhorando, órgão, célula, ou transplante de tecido. Como aqui explicado, os compostos da invenção são eficazes na estabilização e manutenção da programação contextual de células. Assim, em algumas formas de realização, um composto da invenção é administrado durante e depois do transplante de células, tecido ou um órgão a um indivíduo. Os exemplos de transplante incluem, mas não são limitados a, transplante de medula óssea, sangue do cordão umbilical, células tronco/progenitoras hematopoiéticas purificadas, células cardíacas, células neurais, células beta pancreáticas, e células hepáticas. B.Usos In Vitro

[00156] Os compostos da presente invenção são eficazes na estabilização de células expostas a uma ampla variedade de condições. Muitas células de animal, quando isoladas (em suspensão ou alternativamente, quando aderentes) perdem a viabilidade, passam pela apoptose, e/ou mudam a programação (por exemplo, células tronco quando isoladas, frequentemente morrerão ou diferenciar-se-ão). Os compostos da presente invenção, quando misturados com tais células, são eficazes na prevenção de tais respostas celulares nas mudanças ambientais. Em algumas formas de realização, as células são isoladas de um animal e contatadas com um composto da invenção em uma quantidade suficiente para prevenir a perda da viabilidade celular e/ou mudanças na programação celular. Em algumas formas de realização, tais células isoladas são úteis para diagnósticos de como as células isoladas retêm fenótipos que de outro modo seriam perdidos devido à resposta da célula ao processo de isolação e à própria isolação. Os fenótipos retidos exemplares podem incluir, por exemplo, padrões de expressão de gene, responsividade de célula a um estímulo, ligando, ou medicamento, viabilidade celular.

[00157] A estabilidade de uma população de célula pode ser monitorada, por exemplo, monitorando-se a expressão de produtos de gene. Por exemplo, certos produtos de gene são específicos do tipo de tecido ou tipo de célula e podem ser monitorados antes e depois de uma mudança na condição ou ambiente (por exemplo, mudança do meio da célula, descongelamento de célula, isolação de célula de outras células, etc.) para determinar se a mudança afeta a programação celular. Em algumas formas de realização, as células perto de serem submetidas a uma mudança de condição ou ambiente, ou relativamente logo depois (por exemplo, dentro de 1 minuto, 5 minutos, uma hora, etc., dependendo das circunstâncias) da mudança, são contatadas com um composto da invenção em uma quantidade suficiente tal que um ou mais marcadores da expressão celular permanecem substancialmente as mesmas. “Substancialmente as mesmas” dependerá do contexto e será entendido na técnica. Em algumas formas de realização, “substancialmente a mesma” significa que a expressão de um produto de gene associado com um tipo de célula específico não muda em mais do que cerca de 10 %, 20 % ou 30 % a seguir de um tratamento particular para a célula (por exemplo, comparada com a expressão antes do tratamento).

[00158] Em algumas formas de realização, a invenção fornece métodos de promover a sobrevivência e anti-diferenciação em células tronco ex vivo. Por exemplo, os inventores descobriram que os compostos das Fórmulas I ou III (isto é, Tzv e Ptn) são eficazes na promoção da sobrevivência e anti- diferenciação em uma célula tronco embrionária humana, célula tronco embrionária de camundongo, células tronco neurais múltiplas, células tronco da pele, células tronco mesenquimatosa, células tronco hematopoiéticas, células tronco estrômicas e células tronco epiteliais contatando-se as células com um composto da Fórmula I ou III imediatamente depois da isolação das células.

[00159] Consequentemente, a presente invenção fornece populações de células e/ou tecidos em contato com uma quantidade suficiente de um composto da invenção (por exemplo, um composto da Fórmula I ou III) para estabilizar as células, por exemplo, para impedir ou reduzir as respostas celulares às mudanças nas condições (por exemplo, isolação de um tecido, descongelamento das células, etc.). Em algumas formas de realização, por exemplo, as células ou tecidos em contato com um composto da invenção estão em um estado congelado ou líquido. Em algumas formas de realização, as células/tecidos são descongelados de um estado congelado enquanto em contato com uma quantidade suficiente de um composto da invenção para prevenir ou reduzir o dano ou diferenciação celulares.

[00160] Em algumas formas de realização, um composto da invenção é contatado com uma população de células tronco, células progenitoras ou células diferenciadas. As células tronco exemplares incluem células tronco pluripotentes, células tronco embrionárias, células tronco induzidas (células iPS). As células tronco exemplares também incluem células tronco embrionárias humanas, células tronco embrionárias de camundongo, células tronco neurais múltiplas, células tronco da pele, células tronco mesenquimatosas, células tronco hematopoiéticas, células tronco estrômicas, e células tronco epiteliais. Qualquer tipo de células progenitoras pode ser usado, incluindo mas não limitado a, células progenitoras endodérmicas, células progenitoras mesodérmicas (por exemplo, células progenitoras musculares, células progenitoras ósseas, células progenitoras sanguíneas), e células progenitoras ectodérmicas (por exemplo, células progenitoras de tecido epidérmico e células progenitoras neurais). Existe uma ampla variedade de células diferenciadas conhecidas. As células diferenciadas incluem, mas não são limitados a, fibroblastos, células cardíacas, células neurais, células beta pancreáticas, células hepáticas, células epiteliais, e células intestinais. As células aqui descritas podem ser células human ou células non-human. Em algumas formas de realização, as células são células humanas. Em algumas formas de realização, as células são células de camundongo, cão, vaca, porco, rato ou primata não humano.

[00161] A capacidade para manter a viabilidade celular e a programação celular possibilita quanto a métodos melhorados de triagem e diagnósticos de medicamento. Por exemplo, em algumas formas de realização, uma célula é triada quanto a uma resposta na presença de pelo menos um composto da invenção (por exemplo, um composto da fórmula I ou III), mantendo deste modo a viabilidade da célula, e contactada ainda com pelo menos um de uma pluralidade de agentes (por exemplo, uma biblioteca química) e depois monitorado quanto a uma resposta. Uma ampla faixa de métodos de triagem é conhecida. Este método encontra benefício particular para o uso com células que de outro modo teriam uma viabilidade insatisfatória nas condições do método de triagem (por exemplo, onde é conveniente usar as células isoladas, células em suspensão, células adesivas, etc.). As células podem ser, por exemplo, células tronco, células progenitoras ou células diferenciadas, como aqui descrito. A resposta celular pode ser qualquer resposta desejada. Algumas respostas nos ensaios de triagem com base em célula incluem, mas não são limitados a, expressão de um gene (por exemplo, com base na expressão de um gene repórter ou quantificado pela PCR ou outra tecnologia de detecção), a viabilidade celular ou a perda da mesma, indução de apoptose, etc.

[00162] Os agentes usados nos métodos de triagem podem ser, por exemplo, compostos orgânicos pequenos (por exemplo, peso molecular menor do que 10.000 daltons, por exemplo, menos do que 8000, 6000, 4000, 2000 daltons), lipídeos, açúcares, polipeptídeos, anticorpos, ácidos nucléicos (por exemplo, oligonucleotídeos, DNA, RNA, ribozimas, RNA inibidor curto (siRNA), micro RNA (miRNA), etc.).

[00163] Em algumas formas de realização, os ensaios são planejados para triar bibliotecas combinatórias grandes pela automação das etapas de ensaio e fornecendo compostos de qualquer fonte conveniente aos ensaios, que são tipicamente conduzidos em paralelo (por exemplo, em formatos de microtitulação ou em placas de microrreservatório em ensaios robóticos). As bibliotecas combinatórias podem ser completamente aleatórias, ou compreendem membros que contêm uma estrutura de núcelo com base em um ou mais compostos líderes promissores. As bibliotecas combinatórias podem ser completamente sintéticas ou podem incluir alguns ou todos os membros que são derivados de fontes que ocorrem naturalmente, incluindo, por exemplo, bactérias, fungos, plantas, insetos e vertebrados (por exemplo, Xenopus (sapo) ou Anguilla (enguia)) e animais não vertebrados (por exemplo, Strongilocentrotus (ouriço do mar) ou moluscos). Ver também, Boldi, Combinatorial Synthesis of Natural Product Based Libraries, 2006, CRC Press.

[00164] Em uma forma de realização, métodos de triagem de alto desempenho envolvem fornecer uma biblioteca combinatória química ou de peptídeo contendo um grande número de compostos terapêuticos potenciais (compostos moduladores ou ligandos potenciais). Tais “bibliotecas químicas combinatórias” ou “bibliotecas de ligando” são depois triadas em um ou mais ensaios, como aqui descritos, para identificar aqueles membros da biblioteca (particular espécies químicas ou subclasses) que demonstram uma atividade característica desejada. Os compostos assim identificados podem servir como “compostos líderes” convencionais ou podem eles próprios serem usados como produtos terapêuticos potenciais ou reais.

[00165] Uma biblioteca química combinatória é uma coleção de compostos químicos diversos gerados pela síntese química ou síntese biológica, combinando-se vários “blocos de construção” químicos tais como reagentes. Por exemplo, uma biblioteca química combinatória linear tal como uma biblioteca de polipeptídeo é formada combinando-se um conjunto de blocos de construção químicos (aminoácidos) em cada modo possível para um dado comprimento de composto (isto é, o número de aminoácidos em um composto de polipeptide). Milhões de compostos químicos podem ser sintetizados através de tal mistura combinatória de blocos de construção química.

[00166] A preparação e triagem de bibliotecas químicas combinatórias é bem conhecida por aqueles de habilidade na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.663.046, 5.958.792, 6.185.506, 6.541.211, 6.721.665, as divulgações das quais são por meio deste aqui incorporadas por referência. Tais bibliotecas químicas combinatórias incluem, mas não são limitadas a, bibliotecas de peptídeo (ver, por exemplo, a Pat. U.S. No 5.010.175; Furka, Mt. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991); Houghton, et al., Nature 354: 8488 (1991); e Combinatorial Peptide Library Protocols, Cabilly, ed., 1997, Humana Press. Outras químicas para gerar bibliotecas de diversidade química também podem ser usadas. Tais químicas incluem, mas não são limitadas a: peptóides (por exemplo, Publicação PCT No WO 91/19735), peptídeos codificados (por exemplo, Publicação PCT WO 93/20242), bio-oligômeros aleatórios (por exemplo, Publicação PCT No WO 92/00091), benzodiazepinas (por exemplo, Pat. U.S. No 5.288.514), diversômeros tais como hidantoínas, benzo-diazepinas e dipeptídeos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)), polipeptídeos vinílogos (Hagihara et al, J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), peptidomiméticos não peptídicos com armação de glicose (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)), síntese orgânica análoga de bibliotecas de composto pequeno (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994); Combinatorial Libraries: Synthesis, Screening and Application Potential, Cortese, ed., 1995, Walter De Gruyter Inc; e Obrecht e Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, 1998, Elsevier Science Ltd), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261: 1303 (1993)), e/ou peptidil fosfonatos (Campbell et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)), bibliotecas de ácido nucléico (ver Ausubel, infra, Sambrook e Russell, infra e Patentes U.S. Nos 6.955.879, 6.841.347, 6.830.890, 6.828.098, 6.573.098, e 6.399.334), bibliotecas de ácido nucléico peptídico (ver, por exemplo, Pat. U.S. Nos 5.539.083, 5.864.010 e 6.756.199), bibliotecas de anticorpo (ver, por exemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3): 309-314 (1996) e PCT/US96/10287), bibliotecas de carboidrato (ver, por exemplo, Liang et al., Science, 274: 1520-1522 (1996); Pat. U.S. No 5.593.853; e Solid Support Oligosaccharide Synthesis and Combinatorial Carbohydrate Libraries, Seeberger, ed., 2004, John Wiley & Sons (E-book)), bibliotecas de molécula orgânica pequena (ver, por exemplo, benzodiazepines, Baum C&EN, 18 de janeiro, página 33 (1993) e Pat. U.S. No 5.288.514; isoprenóides, Pat. U.S. No 5.569.588; tiazolidinonas e metatiazanonas, Pat. U.S. No 5.549.974; pirrolidinas, Pat. U.S. Nos 5.525.735 e 5.519.134; compostos de morfolino, Pat. U.S. No 5.506.337, e outros). Ver também, Combinatorial Library Design and Evaluation: Principles, Software Tools, and Applications in Drug Discovery, Ghose, et al., eds., 2001, Marcel Dekker; Molecular Diversity and Combinatorial Chemistry: Libraries and Drug Discovery, Chaiken e Janda, eds., 1996, Oxford Univ Pr.; e Combinatorial Library Methods and Protocols, English, ed., 2002, Humana Press.

[00167] Os dispositivos para a preparação de bibliotecas combinatórias são comercialmente disponíveis (ver, por exemplo, Advanced Chem Tech, Louisville KY., Symphony, Rainin, Woburn, MA., Applied Biosystems, Foster City, CA., Millipore, Bedford, MA e Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).

[00168] Em algumas formas de realização, os ensaios de triagem podem ser convenientemente realizados em placas de multirreservatórios (por exemplo, 96 reservatórios, 384 reservatórios, etc.) em que cada agente a ser triado é individualmente testado em um único reservatório. Em algumas formas de realização, dois ou mais agentes candidatos são testados em uma única mistura de reação. C.Alvos alternativos para a obtenção de efeitos similares

[00169] Como descrito em detalhes nos exemplos abaixo, os inventores aprenderam a cerca do papel de vários produtos de gene na resposta celular aos compostos da invenção e isto levou à descoberta de que as células também podem ser estabilizadas pela manipulação dos produtos de gene como explicado abaixo. 1. E-caderina

[00170] Os inventores descobriram que aumentar a expressão de E- caderina realça a sobrevivência da célula tronco. Assim, a presente invenção fornece métodos de estabilizar e/ou aumentar a expressão de E-caderina em uma célula, estabilizando deste modo a célula de uma mudança de condições que de outro modo seria nocivo para a viabilidade da célula. A estabilização com E-caderina pode incluir, por exemplo, contatar as células com um composto que aumenta a expressão de E-caderina ou de algum modo protege a E-caderina da clivagem proteolítica.

[00171] Em algumas formas de realização, a invenção fornece métodos de cultivar células tronco (incluindo mas não limitado a, células tronco embrionárias humanas ou de camundongo) em um recipiente tendo uma superfície revestida com uma proteína compreende pelo menos um ectodomínio de E-caderina, opcionalmente ligado a um outro componente tal como uma proteína de fusão, estabilizando deste modo as células (por exemplo, mantendo ou aumentando a viabilidade das células e/ou mantendo a programação celular). Um ectodomínio é a parte de uma proteína de membrana que se estende no espaço extracelular (o espaço fora de uma célula). Em algumas formas de realização, os ectodomínios são a parte de uma proteína que inicia o contato com a superfície que leva à transdução de sinal. O ectodomínio de E-caderina é descrito, por exemplo, em Ito et al., Oncogene 18(50): 7080-90 (1999) Em algumas formas de realização, pelo menos o ectodomínio de E-caderina é fundido a uma sequência de polipeptídeo dimerizante, permitindo deste modo dímeros estabilizados do ectodomínio. Mm “polipeptídeo dimerizante” refere-se a uma sequência de aminoácido que formas homo-dímeros, permitindo deste modo que dois polipeptídeos dímerizem. Os polipeptídeos dimerizantes exemplares incluem, mas não são limitados a, um fragmento Fc de IgG. Em algumas formas de realização, em algumas formas de realização, células tronco (incluindo mas não limitadas às células tronco embrionárias de ser humano ou camundongo, células tronco pluripotentes, células iPS) são dissociadas umas das outras e cultivadas em um recipiente tendo uma superfície revestida com uma proteína compreendida de pelo menos um ectodomínio de E-caderina, opcionalmente ligado a um outro componente tal como uma proteína de fusão, estabilizando deste modo as células na melhora da taxa de sobrevivência das células comparadas com a taxa de sobrevivência de células similarmente tratadas cultivadas em um recipiente que carece do revestimento de polipeptídeo. 2. Cinase C de Proteína

[00172] A presente invenção também fornece a estabilização das células contatando-se as células com um ativador da cinase C de proteína. Como aqui explicado, o tratamento de hESCs dissociadas com um ativador da cinase C de proteína cultivada na presença de uma matriz de matrigel resultou na adesão de célula e formação de colônia significantemente melhorada, melhorando deste modo a viabilidade celular. Consequentemente, a invenção fornece a melhora da viabilidade celular cultivando-se as células na presença de um ativador da cinase C de proteína, melhorando deste modo a viabilidade, cultivo, e/ou adesão celulares. Em algumas formas de realização, um ativador da cinase C de proteína é contatado com uma população de células tronco, células progenitoras ou células diferenciadas em uma quantidade suficiente para melhorar a viabilidade e/ou sobrevivência e/ou adesão celulares. As células tronco exemplares incluem células tronco pluripotentes, células tronco embrionárias, células tronco induzidas (células iPS) ou como de outro modo aqui descrito. Os ativadores da cinase C de proteína exemplares incluem, mas não são limitados a, ésteres de forbol (por exemplo, forbol 12-miristato 13- acetato (PMA) ou ésteres de forbol como descrito na Publicação de Patente US No 20080226589) ou agonistas de peptídeo (por exemplo, como descrito na Patente US No 6.165.977). 3. Integrina pt

[00173] A presente invenção também fornece a estabilização de células pelo contato das células com um ativador da integrina β1. Como explicado aqui, o tratamento de hESCs dissociadas com um ativador de integrina β1, onde as células são cultivadas em lamina resultou em adesão de célula e formação de colônia significantemente melhoradas, melhorando deste modo a viabilidade celular. Consequentemente, a invenção fornece quanto a melhora da viabilidade celular pelo cultivo de células na presença de um ativador da integrina β1, melhorando deste modo a viabilidade, crescimento, e/ou adesão celulares. Em algumas formas de realização, um ativador da integrina β1 é contatado com uma população de células tronco, células progenitoras ou células diferenciadas em uma quantidade suficiente para melhorar a viabilidade e/ou sobrevivência e/ou adesão celulares. As células tronco exemplares incluem células tronco pluripotentes, células tronco embrionárias, células tronco induzidas (células iPS) ou como de outro modo aqui descrito. Ativadores da integrina β1 exemplares incluem, mas não são limitados a, um anticorpo que ativa a integrina β1 tal como, por exemplo, TS2/16 (comercialmente disponível, por exemplo, da Thermo Scientific, Rockfield, Ill.). IV . Populações de Célula

[00174] Como aqui debatido, a presente invenção fornece células em uma mistura (por exemplo, uma cultura de célula) com um ou mais composto como aqui descritos (por exemplo, um composto da fórmula I ou III - incluindo mas não limitado a Tzv e Pt - ou um ativador da cinase C de proteína ou um ativador da integrina β1). Em algumas formas de realização, o composto está na mistura em uma concentração suficiente para manter a viabilidade ou programação celulares em resposta a uma mudança do ambiente ou condição celulares (por exemplo, descongelamento). Por exemplo, em algumas formas de realização, os compostos estão em uma concentração de pelo menos 0,1 nM, por exemplo, pelo menos 1, 10, 100, 1000, 10000, ou 100000 nM, por exemplo, entre 0,1 nM e 100000 nM, por exemplo, entre 1 nM e 10000 nM, por exemplo, entre 10 nM e 10000 nM, por exemplo, entre 1 a 10 μM. Em algumas formas de realização, as misturas estão em um vaso sintético (por exemplo, um tubo de teste, placa de Petri, etc.). Assim, em algumas formas de realização, as células são as células isoladas (não parte de um animal). Em algumas formas de realização, as células são células aderente ou células em suspensão. Em algumas formas de realização, as células são isoladas ou dissociadas de uma amostra de tecido (por exemplo, uma biópsia) de um animal (humano ou não humano), colocados em um vaso, e contatados com um ou mais compostos como aqui descrito (por exemplo, um composto da Fórmula I ou III). As células podem ser subsequentemente cultivadas e opcionalmente, inseridas de volta no mesmo ou em um animal diferente, opcionalmente depois que as células foram estimuladas para diferenciar em um tipo de célula ou linhagem particulares, ou a seguir da introdução de um cassete de expressão recombinante nas células. V . Cultivo de células

[00175] As células podem ser cultivadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica. As células podem ser cultivadas em suspensão ou como células aderentes como apropriado.

[00176] Em algumas formas de realização, as células (por exemplo, células tronco) são cultivadas em contato com células alimentadoras. As células alimentadoras exemplares incluem, mas não são limitados a células de fibroblasto, por exemplo, células de fibroblasto embrionário de camundongo (MEF). Os métodos de cultivar células nas células alimentadoras são conhecidos na técnica.

[00177] Em algumas formas de realização, as células são cultivadas na ausência de células alimentadoras. As células, por exemplo, podem ser ligadas diretamente a uma superfície de cultura sólida (por exemplo, uma placa de cultura), por exemplo, via uma âncora molecular. As âncoras moleculares exemplares incluem, mas não são limitados a, matrigel, uma matriz extracelular (ECM), análogos de ECM, laminina, fibronectina, ou colágeno. Aqueles de habilidade na técnica entretanto reconhecerá que isto é uma lista não limitante e que outras moléculas podem ser usadas para ligar as células a uma superfície sólida. Métodos para a ligação inicial das âncoras à superfície sólida são conhecidos na técnica. VI .Fórmulações e Métodos de Administração

[00178] As formulações (por exemplo, compreendem um composto da presente invenção, incluindo mas não limitado a adequado para a administração incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotônicas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, e solutos que tornam a formulação isotônica, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores, e conservantes. Na prática desta invenção, as composições podem ser administradas, por exemplo, oral, nasal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, ou intratecalmente. As formulações dos compostos podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou dose múltipla, tais como ampolas e frascos. Soluções e suspensões podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos, e tabletes do tipo anteriormente descrito. Os moduladores também podem ser administrados como parte de um alimento ou medicamento preparados.

[00179] A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para induzir uma resposta benéfica no paciente com o tempo. O nível de dose ótima para qualquer paciente dependerá de uma variedade de fatores incluindo a eficácia do modulador específico utilizado, da idade, peso corporal, atividade física, e dieta do paciente, em uma combinação possível com outros medicamentos, e da severidade da doença ou condição em questão. O tamanho da dose também será determinada pela existência, natureza, e grau de quaisquer efeitos colaterais adversos que acompanhem a administração de um composto ou vetor particular em um paciente particular.

[00180] Na determinação da quantidade eficaz de um ingrediente ativo a ser administrado um médico pode avaliar os níveis plasmnáticos circulantes do composto ou agente, toxicidade do composto ou agente, e a produção de anticorpos anti- composto ou agente. No geral, a dose equivalente de um composto ou agente é de cerca de 1 ng/kg a 10 mg/kg para um indivíduo típico. VII .Exemplos

[00181] Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada. Exemplo 1:

[00182] Para melhorar as condições de meio quimicamente definido e revelar o mecanismo molecular da morte de hESC depois da dissociação de célula única, nós realizamos uma triagem fenotípica de alto rendimento de 50.000 compostos sintéticos para identificar moléculas pequenas que promovem a sobrevivência de hESC depois da dissociação de tripsina. A partir da triagem, duas classes químicas foram identificadas que significantemente aumentou a sobrevivência da célula depois da dissociação e também mainteve a morfologia de calônia de hESC e expressão de fosfatase alcalina (ALP). Outras otimizações químicas e a análise de atividade resultou na descoberta de duas moléculas mais importantes, um tiazol 2,4- dissubstituído (chamado como Tiazovivin/Tzv) e uma pirimidina 2,4- dissubstituída (chamada como Pirintegin/Ptn) (Fig. l a), para caracterizações funcionais e mecanísticas adicionais. Tabela 1. Dados de Atividade

1 Razão de colônias positivas em ALP vs. células totais inicialmente semeadas.

[00183] Os Compostos Tzv ou Ptn realçam a sobrevivência de hESCs únicas mais do que 20 vezes em placa revestida com Matrigel depois da dissociação enzimática (Fig. 1b, c). hESCs foram passadas em série em meio quimicamente definido contendo Tzv ou Ptn por mais do que 20 gerações. Sob tais condições, as células homogeneamente mantiveram a morfologia característica das hESCs, a expressão de marcadores de pluripotência típica, e cariótipo normal (Fig. 1d, e). Quando estas células foram injetadas em camundongos nus, eles geraram teratomas complexos que consistem de todos os três tecidos de camada germinativa primária (Fig. 1f). Estes resultados, confirmaram com várias linhagens de hESC independentes, coletivamente e de maneira convincente demonstraram que ambos os compostos puderam promover substancialmente a sobrevivência de hESC sem comprometer a auto-renovação e potência desenvolvimental completo.

[00184] As hESCs são conhecidas ser difíceis na formação de corpos embrionários (EBs) na cultura de suspensão depois da dissociação de célula única devido à morte celular extensiva. Assim, nós também testamos se Tzv ou Ptn poderia promover a sobrevivência de hESCs dissociadas em suspensão. De maneira interessante, Tzv enormemente melhorou a sobrevivência de hESCs tanto nas culturas aderente quanto em suspensão. Ao contrário, Ptn apenas promoveu a sobrevivência das hESCs em cultura aderente (por exemplo em placa revestida com Matrigel), mas não teve nenhum efeito sobre a cultura em suspensão (Fig. 2a). Estas observações sugerem que pelo menos dois mecanismos distintos estão envolvidos nestes dois tipos de morte celular sob condições de ECM/Matrigel ou suspensão, e que Tzv e Ptn funcionam de modo diferente. As hESCs formaram agregados de célula satisfatórios quando cultivadas em suspensão e na presença de Tzv (Fig. 2b), e podem diferenciar em várias linhagens (dados não mostrados). Porque a agregação de célula é mais frequentemente mediada através das adesões de célula-célula e E-caderina é a molécula de adesão de célula-célula primária, assim como altamente expressada nas hESCs (Eastham, A. M. et al., Cancer Res 67 (23): 11254-11262 (2007)), nós testamos o efeito de um anticorpo bloqueador de E-caderina específico na formação do agregado multicelular. Quando as células foram cultivadas na presença do anticorpo, a sobrevivência da célula e a formação de agregados grandes, compactos induzidas pelo tratamento com Tzv foi severamente inibida, indicando que a sobrevivência da célula e a montagem de agregados multicelulares induzidas pelo Tzv envolve a E-caderina funcional (Fig. 2b). Além disso, o silenciamento de E-caderina pelos siRNAs específicos nas hESCs dramaticamente reduziu a sobrevivência da célula induzida pelo tratamento com Tzv, e significantemente diminuiu o número de colônias positivas em ALP (Fig. 2c, d, e). Estes resultados sugerem que Tzv realça a sobrevivência de hESC em suspensão, presumivelmente atuando através da adesão de célula-célula mediada pela E-caderina.

[00185] Nós depois examinamos a expressão de E-caderina em hESCs depois da dissociação com tripsina. Nós descobrimos que a maior parte da E- caderina de tamanho natural foi clivada depois da dissociação com tripsina (Fig. 2f). Esta observação foi compatível com o relato de que a região extracelular de E-caderina tem um sítio de clivagem endoproteolítica próximo ao domínio de transmembrana (Damsky, C. H. et al., Cell 34 (2): 455-466 (1983)). Em células não tratadas com Tzv, a E-caderina de tamanho natural recém sintetizada apareceu 1 h depois do tratamento com enzima e desapareceu depois de 4 h, sugerindo que as E-caderinas recém sintetizadas em hESCs dissociadas não foram estáveis. Entretanto, nas células tratadas com Tzv, a expressão de E-caderina foi significantemente aumentada (Fig. 2g). Além disso, a análise da citometria de fluxo revelou que as E-caderinas da superfície da célula nas hESCs foram significantemente aumentadas pelo Tzv (Fig. 2h). Portanto, Tzv é provável de afetar a adesão de célula pela modulação do nível de superfície celular de E-caderinas. A RT-PCR semiquantitativa revelou quantidades comparáveis de transcritos de E- caderina em controles simulados e células tratadas com Tzv (Fig. 2i), sugerindo que a diferença nos níveis de proteína de E-caderina não foi devido aos níveis de transcrição alterados. É provável que Tzv exerça o seu efeito através da estabilização de E-caderina na superfície da célula. Finalmente, o ensaio de endocitose revelou que a internalização de E-caderinas foi significantemente bloqueada pelo Tzv. Estes resultados indicam que Tzv regula as atividades de E-caderina através da inibição da endocitose de E- caderinas (Fig. 2j).

[00186] A dissociação de célula-célula pela tripsina leva à clivagem rápida e desestabilização subsequente de E-caderinas. Nós levantamos a hipótese de que a estabilidade da E-caderina também seria mediada pela sua interação homofílica entre as células. Assim a ligação homofílica de E- caderinas com ligandos recombinantes pode estabilizar E-caderinas e afetar a sobrevivência de hESC. Para testar esta hipótese, nós revestimos as placas com uma proteína dimérica da quimera E-caderina-Fc contendo o ectodomínio de E-caderina fundido ao fragmento Fc da IgG (Ecad-Fc). Extraordinariamente, as hESCs dissociadas ligaram-se à superfície revestida e a sua taxa de sobrevivência foi significantemente aumentada em uma maneira dependente da dose (Fig. 2k), confirmando que a adesão de célula-célula mediada pela E-caderina é um regulador importante para a sobrevivência de hESC.

[00187] Tanto Tzv quanto Ptn têm efeito dramático sobre a sobrevivência das hESCs cultivadas em placas revestidas com Matrigel. Tal efeito promotor da sobrevivência parece improvável devido à influência sobre o crescimento da célula e pode ser amplamente atribuído ao aumento na capacidade de adesão de célula a seguir da dissociação de célula e processos de semeadura (Fig. 3a,b). De fato, as hESCs dissociadas que foram tratadas com Tzv ou Ptn demonstraram uma adesão dramaticamente aumentada ao Matrigel ou laminina. Ao contrário, a adesão das hESCs à gelatina ou poli- lisina (Fig. 3b e dados não mostrados), que não envolve integrinas, não foi afetada pelo tratamento com Ptn ou Tzv. O componente principal de Matrigel é a laminina, e foi relatado que a integrina β1 do receptor de laminina é altamente expressada em hESCs (Xu, C. et al., Nat Biotechnol 19 (10): 971974 (2001)). Para testar se Ptn ou Tzv atua através da integrina β1, nós pré- tratamos as células com um anticorpo bloqueador contra integrina β1, e observamos que a ligação de célula aumentada induzida pelo tratamento com composto foi completamente abolido. Isto sugere que Tzv e Ptn medeia a adesão de célula aos substratos de ECM através da integrina β1 (Fig. 3c).

[00188] Para adquirir conhecimento sobre o mecanismo de regulagem da integrina β1 pelo Tzv e Ptn, nós investigamos se o efeito dos compostos é devido às mudanças da expressão da integrina. Ao contrário da E-caderina, a integrina β1 não foi clivada pela tripsina. A análise de Western blot revelou que o efeito dos compostos foi improvável devido às expressões aumentadas da integrina β1. Assim, Tzv e Ptn são prováveis de afetar a adesão de célula pela modulação da atividade da integrina (Fig. 3 d, e). Para examinar os efeitos do tratamento com o composto sobre a atividade de β1 integrina, nós usamos o anticorpo monoclonal HUTS-21, que especificamente se liga à forma ativada da integrina β1 (Luque, A. et al., J Biol Chem 271 (19): 1106711075 (1996)). Notavelmente, o tratamento com os compostos aumentou o nível de ligação de HUTS-21 (Fig. 3f, g). Estes resultados coletivamente sugerem que Tzv e Ptn aumentam a adesão de célula pela modulação às avessas da atividade da integrina.

[00189] Se ambos os produtos químicos realçaram a adesão de célula pela conversão das integrinas em uma conformação ativa, o tratamento de células com o anticorpo que ativa integrina, que bloqueia as integrinas em uma conformação ativa, deve ter um efeito similar como os compostos. De fato, quando as hESCs dissociadas foram plaqueadas em laminina na presença de TS2/16, um anticorpo de ativação para a integrina β1 (van de Wiel-van Kemenade, E. et al., J Cell Biol 117 (2): 461-470 (1992)), a adesão de célula foi significantemente aumentada e as células formaram um número aumentado de colônia quando comparado ao controle (Fig. 3h, i). Estes resultados sugerem que a adesão aumentada, que ocorre quando as células são tratadas com estes compostos, envolve um mecanismo que induz a ativação de integrina.

[00190] Para dissecar ainda mais o mecanismo molecular pelo qual Tzv e Ptn regulam a atividade da integrina, nós examinamos os efeitos de vários inibidores do caminho. Nós descobrimos que a bisindolilmaleimida I, um inibidor específico de PKC, poderia antagonizar a adesão de célula aumentada induzida pelo Ptn, mas não teve nenhum efeito sobre a adesão de célula induzida pelo Tzv. Isto sugere que PKC pode mediar a ação de Ptn mas não a de Tzv (Fig. 3j). Para confirmar ainda mais o papel de PKC sobre a sobrevivência de hESC, hESCs dissociadas foram tratadas com o agonista de PKC forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). O tratamento do PMA causou a ativação da integrina, assim como um aumento substancial na adesão de célula e formação de colônia (Fig. 3k, l, m).

[00191] O destino da célula tronco é influenciado pelo seu nicho celular, que consiste de fatores de crescimento, interação de célula-ECM, e interação de célula-célula. O fato de que a sobrevivência de hESC é altamente dependente da interação de célula-célula e/ou interação de célula-ECM, revelou a importância de tal nicho in vitro não reconhecido anteriormente para as hESCs. De maneira mais importante, as expressões de proteína intrínsecas de célula (por exemplo E-caderinas e integrinas) e mecanismos reguladores (por exemplo, a estabilização e ativação de proteína), não apenas respondem, mas também são componentes de nicho essenciais, sugerindo que as células tronco possuem capacidade intrínsica para construir o seu próprio nicho na ausência de outros fatores extrínsecos ou tipos de célula, que entretanto podem participar e realçar o mecanismo de nicho auto-regulador das células.

[00192] A interação entre o ambiente físico/estrutural e o fator de crescimento desempenha um papel muito importante na regulagem do destino da célula (Comoglio, P. M., Boccaccio, C., & Trusolino, L., Curr Opin Cell Biol 15 (5): 565-571 (2003)). Para examinar se os fatores de crescimento estão envolvido na sobrevivência de hESC mediada pela integrina, nós tratamos as hESCs dissociadas com Tzv ou Ptn junto com inibidores do receptor de fator de crescimento altamente específico individual. Nós descobrimos que a inibição química de FGFR, IGFR, EGFR1 ou Erb2 diminuiram enormemente a sobrevivência que promovem o efeito induzido pelo tratamento com Tzv ou Ptn (Fig. 4a). Além disso, Ptn significantemente aumentou a fosforilação do receptor do fator de crescimento, sugerindo que o entrosamento de receptores do fator de crescimento é requerido para a sobrevivência de célula mediada pela integrina (Fig. 4b). Similarmente a inibição de FGFR, IGFR, EGFR1 ou Erb2 também enormemente aboliu a sobrevivência de hESC induzida pelo Tzv em cultura em suspensão. Além disso, Tzv induziu a ligação de E-caderinas ao EGFR1 e ERB2, indicando o papel importante de receptores do fator de crescimento na sobrevivência da célula mediada pela E-caderina (Fig. 4c, d).

[00193] A sinalização de fosfatidilinositol-3-cinase (PI-3K) e MAPK/ERK são reguladores principais para a auto-renovação de hESC (Armstrong, L. et al., Hum Mol Genet 15 (11): 1894-1913 (2006); Paling, N. R. et al., J Biol Chem 279 (46): 48063-48070 (2004); Pile, A. D., Lock, L. F., & Donovan, P. J., Nat Biotechnol 24 (3): 344-350 (2006); Li, J. et al., Differentiation 75 (4): 299-307 (2007)). A fosforilação de ERK e AKT, um efetor a jusante de PI-3K, foi aumentada no tratamento de hESCs dissociadas com Ptn, e este aumento foi abolido pelo anticorpo bloqueador de integrina (Fig. 4e, f). Além disso, a ativação de AKT e ERK pelo Ptn foi bloqueada pelos inibidores de FGFR, IGFR, EGFR ou Erb2 (Fig. 4g e dados não mostrados). A inibição química da ação de PI-3K significantemente antagonizou o efeito de sobrevivência induzido por Ptn (Fig. 4h). A inibição de ERK não teve um efeito dramático sobre a sobrevivência induzida pelo Ptn mas induziu a diferenciação de hESC (Fig. 4i). Estes resultados demonstraram que a ativação de PI-3K é uma sinalização da sobrevivência principal e a ativação de ERK é uma sinalização anti-diferenciação gerada pelo nicho através da ativação de receptores do fator de crescimento.

[00194] Em resumo, nós identificamos duas novas moléculas pequenas sintéticas com mecanismos distintos de ação de uma triagem fenotípica de alto rendimento que enormemente realça a sobrevivência de hESC depois da dissociação de célula única. Tais ferramentas químicas e as ferramentas biológicas recém identificadas através das caracterizações mecanísticas (por exemplo Ecad-Fc recombinante definido para a ligação de hESC em cultura aderente; anticorpos ativadores para a sobrevivência e ligação da célula realçada) possibilitaria cultura de hESC mais robusta e significantemente facilitaria aplicações de hESCs tais como no alvejamento de gene ou descoberta de medicamentos. De maneira mais importante, as caracterizações mecanísticas totalmente desenvolvidas revelaram mecanismos de nicho anteriormente não reconhecidos que são requeridos para sustentar a sobrevivência e proliferação de hESC. Tal nicho consiste da interação mediada pela E-caderina entre as próprias hESC, interação de célula-ECM mediada pela integrina, e fatores de crescimento. Estudos iniciais salientaram um papel importante dos fatores de crescimento sobre a auto-renovação de hESC. Entretanto, a ativação completa da sinalização do fator de crescimento requer não apenas a presença dos fatores de crescimento e receptores mas também uma interação com um microambiente particular. Quando este ambiente físico/estrutural é destruído, os fatores de crescimento sozinhos não são suficientes para a auto-renovação das ESCs.

[00195] Recentemente, foi relatado que fibroblastos diferenciados gerados a partir das hESCs em cultura de auto-renovação criaram um nicho in vitro para as hESCs (Bendall, S. C. et al., Nature 448 (7157): 1015-1021 (2007)). Sob as nossas condições de meio quimicamente definidas e nas de outros, nós muito raramente observamos tais células diferenciadas em cultura de longa duração, sugerindo que tal nicho artificial seria criado devido às diferenças de meio. Não obstante, nossos estudos revelam mecanimos únicos de nicho autônomo em célula (isto é, interação de célula-célula) e não autônomo em célula (isto é, célula-ECM e -fator de crescimento) para a sobrevivência e auto-renovação de hESC, que provavelmente pode desempenhar papéis importantes no controle do destino de célula tronco adulta in vivo.

[00196] A dissociação de célula-célula pela tripsina levou não apenas à desestabilização de E-caderinas mas também à inativação das integrinas, indicando que a sinalização que mantém a atividade da integrina é sensível ao tratamento enzimático. Meio condicionador de célula alimentadora (com soro rico em fator de crescimento) não forneceu muita proteção contra a morte celular depois da dissociação de célula única. Além disso, o fato de que a semeadura de célula em alta densidade também induz um aumento na adesão/sobrevivência de célula sugere que a sinalização requerida para manter a atividade da integrina pode não vir de fatores secretados mas ao invés de interações de célula-célula físicas. O Tzv inibe a endocitose de E-caderina, e assim protege as células da morte em suspensão. Similarmente, pela inibição da endocitose, Tzv pode manter a atividade da integrina pela estabilização da sinalização da superfície celular. Por outro lado, Ptn pode imitar a sinalização a jusante da interação de célula-célula física para ativar PKC. A identificação de alvo futura de Ptn pode apresentar uma nova perspectiva sobre o mecanismo pelo qual a adesão de célula-célula regula a interação de célula- ECM. Nossa pesquisa também exemplificou a praticabilidade e avanço da triagem química de alto rendimento nos estudos de célula tronco. Além disso, o desenvolvimento e aplicação de tal método químico nas células tronco indubitavelmente levará à identificação de novas moléculas pequenas adicionais e entendimento mecanístico para controlar com precisão o destino da célula in vitro e in vivo. Métodos de Cultura de Célula

[00197] As linhagens de ESC humanas H1, HUES7 e HUES9 foram cultivadas em células alimentadoras MEF irradiadas em DMEM-F12 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 1x aminoácidos não essenciais, 20 % de reposição de soro (Invitrogen) e 10 ng/ml de fator de crescimento de fibroblasto básico (Invitrogen). A cultura de hESC quimicamente definida e isenta de alimentador foi descrita anteriormente (Yao, S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 103 (18): 6907-6912 (2006)). Em resumo, as hESCs foram cultivadas em placas de cultura de tecido revestidas com Matrigel em N2B27- CDM (DMEM-F12 suplementado com 1x suplementos N2, 1x suplementos B27, 2 mM de L-glutamina, 0,11 mM de 2-mercaptoetanol, 1x aminoácidos não essenciais, e 0,5 mg/ml de BSA (fração V)) e 20 ng/ml de bFGF. As ESCs humanas foram passadas a cada 5 a 6 dias com 0,05 % de tripsina.

[00198] Para os ensaios de sobrevivência clonal, hESCs únicas foram diluídas para a densidade clonal e plaqueadas em placa de 96 reservatórios revestida com Matrigel. Para os ensaios de sobrevivência de baixa densidade, 500 células foram plaqueadas em placa de 96 reservatórios revestida com Matrigel. Para visualizar as colônias de hESC, as culturas foram fixadas em 4 % de paraformaldeído em PBS por 5 min, lavadas uma vez em PBS, depois tingidas quanto a atividade de fosfatase alcalina como descrito nas instruções do fabricante. As colônias positivas em ALP foram contadas em um microscópio invertido. Reagentes

[00199] O kit de detecção de ALP e anticorpos de integrina foram da Chemicon. AG825 (inibidores de Erb2), AG1478 (inibidor de EGFR), PPP (inibidor de IGFR1) foram adquiridos da Calbiochem. Os anticorpos incitados contra a cauda intracitoplasmática de E-caderinas (Transduction Laboratories, Lexington, KY) foram usados para a imunoprecipitação. O anticorpo TS2/16 foi da Pierce. Os anticorpos para o domínio extracelular da molécula de E- caderina foram da Zymed (Carlsbad). Os anticorpos contra a cinase regulada por sinal extracelular/ MAPK, EGFR1, ERB2, GADPH e a forma fosforilada de AKT foram da Cell Signaling. A anti-fosfotirosina monoclonal de camundongo (clone 4G-10) foi da Upstate Biotechnology. Ptn e Tzv foram adicionados ao meio de cultura a 2 μM. Triagem química de alto desempenho.

[00200] As linhagens de hESC tripsináveis HUES7 ou HUES9 foram usadas para a triagem. hESCs foram cultivadas em meio quimicamente definido na placa revestida com Matrigel como descrito acima. Depois as células foram colhidas pela tripsina. hESCs foram plaqueadas a 4.000 células por reservatório nas placas de 384 reservatórios revestidas com Matrigel. Depois de 1 h quando as células sedimentaram, os compostos de uma biblioteca de 50.000 heterociclos discretas foram adicionados a cada reservatório (2 μM de concentração final). Depois de um adicional de 6 dias de incubação, em que o meio e os compostos foram mudados no dia 3, as células foram tingidas quanto a expressão de ALP e examinadas quanto a morfologia de colônia compacta. Análise de Imunotingimento.

[00201] O imunotingimento foi realizado como descrito anteriormente (Yao, S. et al., Proc Natl Acad Sci USA 103 (18): 6907-6912 (2006)). Em resumo, as células foram fixadas com 4 % de paraformaldeído na temperatura ambiente (RT) por 15 min. As células foram depois incubadas na temperatura ambiente em tampão bloqueador por 1 hora. A incubação do anticorpo primário foi realizada durante a noite a 4° C. Os seguintes anticorpos comercialmente disponíveis foram usados em uma concentração de 1:100 em tampão bloqueador:anti-SSEA4, anti-Oct4 (Chemicon??) anti-Nanog (Chemicon). O tingimento foi visualizado usando anticorpos secundários conjugados a FITC, cy3 ou cy5 (Jackson ImmunoResearch). Formação de teratoma e cariotipagem.

[00202] Experimentos de formação de teratoma foram realizados injetando-se 3 a 5 milhões de hESCs (mantidas na presença dos compostos Tvz ou Ptn) sob a cápsula renal de camundongos nus. Depois de 4 a 5 semanas, todos os camundongos desenvolveram teratomas, que foram removidos e depois imunoistologicamente analisados pelo The Scripps Research Institute Research Histology Service and Animal Resources. As células tratadas com compostos foram cariotipadas pela G-banding padrão no Children’s Hospital Oakland, Cytogenetics Laboratory. Nenhuma anormalidade cromossômica foi encontrada nos 10 núcleos escolhidos aleatoriamente. Ensaio de TUNEL

[00203] As hESCs sob tratamentos diferentes foram dissociadas pela tripsina e fixadas em 4 % de paraformaldeído. E o tingimento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (MBL Laboratories, Watertown, MA). Depois do tingimento, as amostras foram analisadas pela citometria de fluxo usando um citômetro de fluxo FACS Calibur (BD). Análise de citometria de fluxo

[00204] Para avaliar a expression de E-caderina, integrina ativada e SSEA4, as células dissociadas (3 x 105) foram lavadas com PBS e recolocadas em suspensão em PBS contendo 2 % de soro de cabra. As células foram depois incubadas com o anticorpo apropriado por 1 h a 4° C, lavadas com a solução bloqueadora, e rotuladas com anticorpo secundário conjugado a FITC por 30 min a 4° C. As células foram depois lavadas e analisadas em um citômetro de fluxo FACS Calibur. Ensaio de Adesão de Célula

[00205] Os ensaios de adesão de célula foram realizados em placas de microtitulação de 96 reservatórios revestidas com Matrigel. Depois da tripsina, as hESCs foram recolocadas em suspensão no meio quimicamente definido contendo os compostos desejados. As células foram depois adicionadas aos reservatórios de microtitulação e incubadas por 3 h a 37° C. As células não ligadas e frouxamente ligadas foram removidas por agitação e lavagem, e as células remanescentes foram depois imediatamente fixadas. Os reservatórios foram lavados 3 vezes com 200 μl de H2O, e as células ligadas foram tingidas com Violeta Cristal (Sigma). A absorbância de cada reservatório a 570 nm foi depois medida. Para os experimentos com anticorpos bloqueadores, as células foram pré-incubadas com anticorpos em gelo por 30 min, e os ensaios de adesão foram realizados na presença de anticorpos. Cada amostra foi ensaiada independentemente por três vezes. Ensaio de Endocitose

[00206] As hESCs foram incubadas com 1,5 mg/ml de sulfossuccinimidila 2-(biotinamido) etil-ditioproprionato (sulfo-NHS-SS- biotina) (Pierce Chemical Co.) em gelo, seguido pela lavagem e extinção. A endocitose de E-caderina foi iniciada pelo esgotamento de Ca2+ e incubação a 37° C. As células foram depois incubadas em duas lavagens de 20 min de solução de glutationa (60 mM de glutationa, 0,83 M de NaCl, com 0,83 M de NaOH e 1 % de BSA adicionados antes do uso) a 0° C que removeram todos os grupos de biotina da superfície da célula. As proteínas biotiniladas remanescentes foram sequestradas para dentro das células pela endocitose e foram portanto protegidas do despojamento com glutationa. As proteínas biotiniladas foram recuperadas nas pérolas de estreptavidina e analisadas pela SDS-PAGE. As E-caderinas foram detectadas pelo imunomanchamento. O nível total da E-caderina de superfície antes da endocitose foi usado como referência. Exemplo 2: Síntese de N-benzil-2-(pirimidin-4-ilamino)tiazol-4-carboxamida (Tiazovivin) Síntese Química

[00207] Usando os exemplos de síntese química apresentados abaixo e os métodos de síntese química no geral conhecidos na técnica, uma pessoa de habilidade é capaz de fabricar os compostos aqui divulgados (por exemplo os compostos das Fórmulas (I) a (VI)).

[00208] Todos os produtos químicos obtidos comercialmente foram usados sem outra purificação. Os espectros de RMN foram registrados em um instrumento Bruker (400 MHz). As mudanças químicas (b) foram medidas em ppm e as constantes de ligação (J) são relatadas em Hz. A LCMS foi realizada pela cromatografia líquida de fase reversa-espectrômetro de massa sistema de LCMS Agilent 1100 com fonte de ionização API-ES. A cromatografia líquida de alta pressão foi realizada com coluna C18 com um gradiente linear de 10 % de solvente A (acetonitrila com 0,035 % de ácido trifluoroacético) em solvent B (água com 0,05 % de ácido trifluoroacético) a 90 % de A in sete minutos e meio, seguido pela elução de dois minutos e meio com 90 % de A. Síntese de N-benzil-2-(pirimidin-4-ilamino)tiazol-4-carboxamida (Tiazovivin)

[00209] Benzil amina foi carregada à resina de poliestireno funcionalizada com 4-formil-3,5-dimetoxifenoximetila (PAL) via aminação redutiva para dar a resina de PAL-benzil amina. Ver, Ding, S.; Grey, N. S. Wu, X.; Ding, Q.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1594-1596. Um frasco de reação contendo a resina de PAL-benzil amina (200 mg, 0,2 mmol), ácido 2-bromotiazol-4-carboxílico (83 mg, 0,4 mmol), cloreto de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (BOP-C1) (153 mg, 0,6 mmol) e diisopropiletilamina (0,17 ml, 1 mmol) em DMF (3 ml) foi agitado por 24 horas na temperatura ambiente. A resina foi lavada com metanol, diclorometano e secada a vácuo para dar resina PAL-N-benzil-2-bromotiazol- 4-carboxamida, que foi depois adicionada a um frasco de reação secado em chama, seguido por 4-aminopirimidina (95 mg, 1 mmol), Pd2(dba)3 (46 mg, 0,05 mmol), Xantphos (87 mg, 0,15 mmol) e NaOtBu (192 mg, 2 mmol). O frasco foi garantidamente tampado com segurança e desgaseificado, depois carregado com argônio e dioxano anidro (1,5 ml). A reação foi agitada por 24 horas a 90° C. A resina foi lavada com solução de dietilditiocarbamato de sódio (0,05 M em DMF), metanol e diclorometano e secado a vácuo. A resina foi subsequentemente clivada com coquetel de clivagem de TFA:CH2Cl2:H2O (45:55:5) (2 ml) por 2 horas. A resina foi filtrada, o filtrado foi coletado e evaporado a vácuo para dar o bruto que foi depois purificado pela HPLC para dar o composto do título (30 mg, 48 %).

N-Benzil-2-(pirimidin-4-ilamino)tiazol-4-carboxamida

[00210] Massa exata calculada para C15H13N5OS: 311,1, encontrado LCMS m/z = 334,1 (M + Na+). 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 4,49 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 5,76 (s, 1H), 7,21 - 7,27 (m, 2H), 7,30 - 7,34 (m, 4H), 7,85 (s, 1H), 8,45 (t, J = 6,3 Hz, 1H), 8,51 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 8,94 (s, 1H). Exemplo 3: Síntese de Derivados de Tiazovivin

[00211] As aminas apropriadas R1NH2 foram pré-carregadas à resina de poliestireno funcionalizada com 4-formil-3,5-dimetoxifenoximetila (PAL) via aminação redutiva para dar a resina PAL-benzil amina. Uma mistura da resina PAL-benzil amina (200 mg, 0,2 mmol, 1,0 eq.), ácido 2-bromotiazol carboxílico 1 (0,4 mmol, 2,0 eq.), cloreto de bis(2-oxo-3- oxazolidinil)fosfínico (BOP-Cl) (0,6 mmol, 3,0 eq.) e diisopropiletil-amina (1 mmol, 5,0 eq.) em DMF anidro (3 ml) foram agitados por 24 horas na temperatura ambiente. A resina foi lavada com metanol, diclorometano e secada a vácuo, que foi depois adicionado a um frasco de reação secado por chama, seguido pelo R2NH2 correspondente (1 mmol, 5,0 eq.), Pd2(dba)3 (0,05 mmol), Xantphos (0,15 mmol) e NaOtBu (2 mmol, 10,0 eq.). O frasco foi garantidamente tampado com segurança e desgaseificado, depois carregado com argônio e dioxano anidro (1,5 ml). A reação foi agitada por 24 horas a 90° C. A resina foi lavada com solução de dietilditiocarbamato de sódio (0,05 M em DMF), metanol e diclorometano e secado a vácuo. A resina foi subsequentemente clivada com coquetel de clivagem: TFA: CH2Cl2:H2O = 45:55:5 (2 ml) por 2 horas. A resina foi filtrada e o filtrado foi coletado e evaporado a vácuo para dar o bruto que foi depois purificado pela HPLC para dar o composto do título desejado 3.

Exemplo 4: Síntese de N-(ciclopropilmetil)-4-(4-(6-hidróxi-3,4- diidroquinolin-1(2H)-il)pirimidin-2-ilamino)benzenossulfonamida (Pirintegrina)

[00212] O frasco de reação contendo 2,4-dicloropirimidina (372 mg, 2,5 mmol), 6-metóxi-1,2,3,4-tetraidroquinolina (489 mg, 3 mmol) e diisopropiletilamina (0,52 ml, 3 mmol) em n-butanol (10 ml) foi aquecido a 40° C durante a noite. O solvente foi evaporado, e o resíduo foi purificado pela cromatografia em coluna cintilante para dar 2-Cloro-4-(6-metóxi-3,4- diidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (551 mg, 80 %). Este intermediário (250 mg, 0,91 mmol) foi depois dissolvido em diclorometano e tratado com BBr3 (1 M em diclorometano) (1 ml, 1 mmol) a -78° C. A mistura de reação foi lentamente aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 1 hora, vertida em água, extraída com diclorometano. Os orgânicos combinados foram secados em Na2SO4 anidro e concentrados. O resíduo foi purificado pela cromatografia em coluna cintilante para dar 2-Cloro-4-(6-hidróxi-3,4- diidroquinolina-1(2H)-il)pirimidina (154 mg, 65 %). A uma solução agitada de 2-cloro-4-(6-hidróxi-3,4-diidroquinolin-1(2H)-il)pirimidina (29 mg, 0,11 mmol) e 4-amino-N-(ciclopropilmetil)benzenossulfonamida (27 mg, 0,12 mmol) em DMF (0,5 ml) foi adicionado ácido p-toluenossulfônico (2 M em dioxano) (55 μl, 0,11 mmol). A mistura de reação foi agitada a 90° C durante a noite, depois purificada pela HPLC para dar o composto do título (27 mg, 56 %).

N-(Ciclopropilmetil)-4-(4-(6-hidróxi-3,4-diidroquinolin-1(2H)-il)-pirimidin- 2-ilamino)benzenossulfonamida

[00213] Massa exata calculada para C23H25N5O3S: 451,2, encontrado LCMS m/z = 452,3 (M+H+).

[00214] 1H RMN (400 MHz, d6-DMSO) 0,05 - 0,09 (m, 2H), 0,32 - 0,36 (m, 2H), 0,75 - 0,81 (m, 1H), 1,90 - 1,95 (m, 2H), 2,64 (t, J = 6,4 Hz, 4H), 3,93 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 6,59 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 6,66 - 6,70 (m, 2H), 7,25 - 7,28 (m, 1H), 7,64 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,82 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 8,01 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 10,79 (s, 1H). Exemplo 5: Síntese de Derivados de Pirintegrina

[00215] A uma mistura de 2,4-dicloropirimidina 4 (1,0 eq.), R1NH2 (1,2 eq.) e diisopropiletilamina (1,2 eq.) em n-butanol foi aquecida a 80 °C durante a noite. O solvente foi evaporado, e o resíduo foi purificado pela cromatografia em coluna cintilante ao intermediário 10 em excelente rendimento (> 80 %), que foi depois tratado com R2NH2 (1,2 eq.) em DMF foi adicionado ácido p-toluenossulfônico (2 M em dioxano) (1,2 eq.). A mistura de reação foi agitada a 90° C durante a noite, e depois purificada diretamente pela HPLC preparativa para dar derivados de Pirintegrina 11 em excelentes rendimentos.

[00216] É entendido que os exemplos e formas de realização aqui descrito são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças considerando os mesmos serão sugeridas pelas pessoas habilitadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente aqui citados são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser da fórmula:

em que, L2 é um alquileno C1-C6 não substituído; y é um inteiro de 0 a 1; z é um inteiro de 0 a 2; X é -N=, ou -CH=; R1 é hidrogênio, ou alquila C1-C6 não substituído; R3 é -C(O)NR14R15, -OR18, ou alquila C1-C6 substituído ou não substituído, em que o alquila C1-C6 substituído é substituído por halogênio; R4 é -OR18; e R14, R15e R18 são independentemente hidrogênio ou alquila C1C6 não substituído; ou um racemato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que L2 é metileno.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1 é hidrogênio.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: L2 é metileno; X é -N= ou -CH=; R1 é hidrogênio; e y e z são 0.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser da fórmula:

7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser da fórmula:

8. Composto, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

ou um racemato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

9. Método para estabilizar uma célula animal isolada IN VITRO, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma célula animal com uma quantidade suficiente de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para estabilizar a célula.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda alterar as condições ou o ambiente da célula na presença do composto, em que a etapa de alteração na ausência do composto resultaria em uma mudança na programação celular da célula.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de mudança compreende pelo menos um de descongelamento da célula ou dissociação da célula de outras células.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a célula é: (a) em culturas aderentes; (b) em culturas em suspensão; (c) uma única célula dissociada; ou (d) uma célula agregada.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda determinar um fenótipo da célula.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o método compreende o isolamento da célula de um animal.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o animal é humano ou não humano.

16. Método IN VITRO para manter a sobrevivência da célula, caracterizado pelo fato de que compreende gerar células tronco isoladas e induzir a estabilização de E-caderina nas células isoladas pelo contato da célula tronco isolada com um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 assim melhorando a sobrevivência de células tronco isoladas em pelo menos duas vezes em comparação à ausência do composto, assim mantendo a sobrevivência da célula.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a etapa de indução compreende a cultura das células isoladas em uma superfície, em que uma molécula que compreende um ectodomínio de caderina E é anexada à superfície.

18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de células isoladas e um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a presença do composto melhora a sobrevivência das células isoladas em pelo menos 2 vezes em comparação à ausência do composto.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que as células são selecionadas do grupo que consiste de células tronco, células tronco induzidas, células tronco pluripotentes, células progenitoras, células diferenciadas, células beta e fibroblastos.