CN113215086A - 一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法 - Google Patents
一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113215086A CN113215086A CN202110579003.5A CN202110579003A CN113215086A CN 113215086 A CN113215086 A CN 113215086A CN 202110579003 A CN202110579003 A CN 202110579003A CN 113215086 A CN113215086 A CN 113215086A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- final concentration
- stage
- culture medium
- stem cells
- differentiation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 78
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 59
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 34
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 claims abstract 12
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 claims abstract 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 25
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 5
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 18
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 16
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 16
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 9
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 9
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 7
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 3
- -1 SCF Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 102100037399 Alanine-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 208000018240 Bone Marrow Failure disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000879354 Homo sapiens Alanine-tRNA ligase, cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Abstract
本发明公开了一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；所述第一阶段培养基包括E8完全培养基、BMP4、rhG‑CSF、CHIR99021、PDGF、IGF‑Ⅰ；所述第二阶段培养基包括E6基础培养基、SB4315424、VEGF、SCF、TPO、IL‑3、CSF；所述第三阶段培养基包括StemlineⅡ基础培养基、VEGF、SCF、HGH、IL‑3、Flt3L、EPO、EGF；本发明通过使用纯细胞因子法配制培养基，避免了血清的使用，降低了污染源从而避免污染；本发明避免了一些其他细胞系作为饲养诱导条件，使分化出的细胞更为安全，降低未知风险。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法。
背景技术
造血干细胞(HSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，它是第一个成功用于治疗和治愈患者的成体干细胞。
造血干细胞是成功治疗白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等多种血液疾病和恶性肿瘤的关键。骨髓细胞减少症可以通过输注HSC进行选择性的治疗，起到稳定状态和调节造血功能的作用。HSC可以改善衰老相关的免疫缺陷，及时补充HSC可以增强老年人的免疫功能，全球每年进行超过68000例造血干细胞移植，无论是自体移植还是异体移植，造血干细胞越来越多地被应用到临床上来治疗血液***恶性肿瘤、实体瘤、骨髓衰竭性疾病以及一些先天性疾病等，同时在儿科的血液病、遗传病、肿瘤的治疗中也表现出一定的应用发展前景。
临床上常用的移植HSC源有骨髓,动员的外周血及脐带血.但是,由于这些组织中HSC含量很少,及组织相容性抗原特异的供者稀缺等问题,导致许多病人无法获得足够量的组织相容性匹配的HSC.然而,HSC数量不足仍然是制约HSC移植临床应用的主要瓶颈。如何通过体外培养获得满足临床需要的HSC已成为近年来学者们研究的热点问题。
人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC),包括人胚胎干细胞(humanembryonic stem cell,hESC)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotentstemcell,hiPSC),人多能干细胞在体外可以无限制生长而保持非分化状态并且具有自我复制并分化为人体各种功能细胞的潜能，hPSC细胞无限的复制能力可以为替代治疗提供充足的移植物来源，目前已成为成为HSC移植的重要来源。
传统方法中的人多能干细胞诱导分化培养基中通常添加有血清以促进细胞增殖，并将多能干细胞与不同的基质细胞共培养，如OP9细胞等，直接定向诱导分化为造血细胞；然而此传统方法中使用血清增加了污染源，并且使用OP9细胞具有未知风险，安全性低。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种安全的多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；
所述第一阶段培养基包括E8完全培养基、BMP4、rhG-CSF、CHIR99021、PDGF、IGF-Ⅰ，所述第一阶段培养基中BMP4、rhG-CSF、CHIR99021、PDGF、IGF-Ⅰ的终浓度比为(1.0-2.0)∶(1.0-2.0)∶(0.25-0.5)∶(1.0-2.0)∶(1.0-2.0)；
所述第二阶段培养基包括E6基础培养基、SB4315424、VEGF、SCF、TPO、IL-3、CSF，所述第二阶段培养基中SB4315424、VEGF、SCF、TPO、IL-3、CSF的终浓度比为(0.25-1.0)∶(1.0-2.0)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)；
所述第三阶段培养基包括StemlineⅡ基础培养基、VEGF、SCF、HGH、IL-3、Flt3L、EPO、EGF，所述第三阶段培养基中VEGF、SCF、HGH、IL-3、Flt3L、EPO、EGF的终浓度比为(0.2-2.0)：(0.5-2.0)∶(0.2-0.4)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)∶(1.0-2.0)∶(1.0-2.0)。
可选的，所述第一阶段培养基中BMP4的终浓度为50-100ng/mL、rhG-CSF的终浓度为50-100ng/mL、CHIR99021的终浓度为10-50mM/mL、PDGF的终浓度为50-100ng/mL、IGF-Ⅰ的终浓度为50-100ng/mL；所述第二阶段培养基中SB4315424的终浓度为1-5uM/mL、VEGF的终浓度为50-100ng/mL、SCF的终浓度为20-80ng/mL、TPO的终浓度为20-80ng/mL、IL-3的终浓度为20-80ng/mL、CSF的终浓度为20-80ng/mL；所述第三阶段培养基中VEGF的终浓度为10-60ng/mL、SCF的终浓度为20-80ng/mL、HGH的终浓度为10-100nM、IL-3的终浓度为20-80ng/mL、Flt3L的终浓度为20-80ng/mL、EPO的终浓度为20-80ng/mL、EGF的终浓度为20-80ng/mL。
可选的，所述第一阶段培养基中BMP4、rhG-CSF、CHIR99021、PDGF、IGF-Ⅰ的终浓度比为1.0∶1.0∶0.25∶1.0∶1.0；所述第二阶段培养基中SB431542、VEGF、SCF、TPO、IL-3、CSF的终浓度比为0.25∶1.0∶0.625∶0.625∶0.625∶0.625；所述第三阶段培养基中VEGF、SCF、HGH、IL-3、Flt3L、EPO、EGF的终浓度比为1.0∶1.25∶0.25∶1.25∶0.5∶1.0∶1.0。
可选的，所述第一阶段培养基中BMP4的终浓度为80ng/mL、rhG-CSF的终浓度为80ng/mL、CHIR99021的终浓度为4μM、PDGF的终浓度为80ng/mL、IGF-Ⅰ的终浓度为80ng/mL；所述第二阶段培养基中SB4315424的终浓度为2μM、VEGF的终浓度为80ng/mL、SCF的终浓度为50ng/mL、TPO的终浓度为50ng/mL、IL-3的终浓度为50ng/mL、CSF的终浓度为50ng/mL；所述第三阶段培养基中VEGF的终浓度为40ng/mL、SCF的终浓度为50ng/mL、HGH的终浓度为10ng/mL、IL-3的终浓度为50ng/mL、Flt3L的终浓度为20ng/mL、EPO的终浓度为40ng/mL、EGF的终浓度为40ng/mL。
本发明还公开了一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的方法，包括以下步骤：
S1：将多能干细胞置于Aggrewell板中，并于上述任一项所述的第一阶段培养基中进行第一阶段的诱导分化成为拟胚体；
S2：将拟胚体置于上述任一项所述的第二阶段培养基中进行第二阶段的诱导分化；
S3：将S2诱导分化后的细胞混合物置于上述任一项所述的第三阶段培养基中进行第三阶段的诱导分化。
可选的，将多能干细胞接种于Aggrewell板进行拟胚体分化的第一阶段培养记为第0天，所述第一阶段的诱导分化自第0天开始至第4天结束，所述第二阶段的诱导分化自第4天开始至第8天结束，所述第三阶段的诱导分化自第8天开始至第14天结束。
可选的，所述第一阶段的诱导分化的第0天至第4天，接种时期使用第一阶段分化培养基，期间不换液；所述第二阶段的诱导分化的第4天将拟胚体转移至T75培养瓶中培养至第8天，转移时期加第二阶段分化培养基，期间不换液；所述第三阶段的诱导分化的第8天将T75培养瓶中的培养基更换新鲜第三阶段培养基，自所述第三阶段的诱导分化起第8天开始，隔3天半量更换为新鲜的第三阶段培养基。第三阶段培养期间，隔3天半量更换为新鲜的第三阶段培养基，为细胞分化提供足够的细胞因子和营养，促进细胞快速分化，及时换液可以大大提高造血干细胞的产量。
可选的，所述Aggrewell板中多能干细胞的接种数量为每孔接种30万个细胞。
可选的，所述多能干细胞包括诱导多能干细胞、胚胎干细胞中的一种或两种。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过采用上述三种特定成分和浓度将多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，依次对多能干细胞诱导分化，提高了多能干细胞向造血干细胞分化的效率；
2.通过使用纯细胞因子法配制培养基，避免了血清的使用，降低了污染源从而避免污染；本发明避免了一些其他细胞系作为饲养诱导条件，使分化出的细胞更为安全，降低未知风险。
附图说明
图1是流式检测实施例1及其对比组的CD34+阳性率的结果图。
图2是流式检测实施例2及其对比组的CD34+阳性率的结果。
图3是流式检测阴性组的CD34+阳性率的结果图。
图4是实施例1及其对比组、实施例2及其对比组的阳性率柱状图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
本发明采用的细胞购于北京北纳创联生物技术研究院。
一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法，采用细胞因子法诱导多能干细胞进行分化，所述多能干细胞包括诱导多能干细胞、胚胎干细胞中的一种或两种。
实施例1
本实施例提供细胞因子法诱导胚胎干细胞(ES)分化成造血干细胞的培养基及方法。
其中，本实施例采用的培养基包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；
第一阶段培养基中，BMP4、rhG-CSF、CHIR99021、PDGF、IGF-Ⅰ的终浓度比为1.0∶1.0∶0.25∶1.0∶1.0，具体配方为：E8完全培养基中加入终浓度为80ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为80ng/mL的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、终浓度为4μM的CHIR99021、终浓度为80ng/mL的PDGF、终浓度为80ng/mL的IGF-Ⅰ。
第二阶段培养基中SB4315424、VEGF、SCF、TPO、IL-3、CSF的终浓度比为0.25∶1.0∶0.625∶0.625∶0.625∶0.625，具体配方为：E6基础培养基中加入终浓度为2μM的SB4315424、终浓度为80ng/mL的VEGF、终浓度为50ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为50ng/mL的TPO、终浓度为50ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为50ng/mL的CSF。
第三阶段培养基中VEGF、SCF、HGH、IL-3、Flt3L、EPO、EGF的终浓度比为1.0∶1.25∶0.25∶1.25∶0.5∶1.0∶1.0，具体配方为：StemlineⅡ基础培养基中加入终浓度为40ng/mL的VEGF、终浓度为50ng/mL的干细胞因子(stem cell factor，SCF)、终浓度为10ng/mL的HGH、终浓度为50ng/mL的白细胞介素-3(IL-3)、终浓度为20ng/mL的Flt3、终浓度为40ng/mL的EPO、终浓度为40ng/mL的EGF。
本实施例采用的细胞因子法诱导胚胎干细胞(ES)分化成造血干细胞的方法包括：
(1)用AARS处理Aggrewell 24孔板使Aggrewell板适宜接种胚胎干细胞且确保不会贴壁并形成拟胚体；
(2)步骤(1)接种培养基使用第一阶段分化培养基，接种数量为每孔30万个细胞；
(3)接种当天记为第0天，在37℃、5％CO2培养箱中培养4天，第4天在体视显微镜下挑选出成熟且状态较好的拟胚体，按照每150个拟胚体接种入T75培养瓶中，培养基使用第二阶段分化培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养4天。第8天开始换液，将第二阶段分化培养基吸弃并添加第三阶段分化培养基，此后隔3天半量换液以提高分化效率，第三阶段分化周期为7-20天，本实施中在第14天收取造血干细胞。
为了做比较，本实施例还设置了对比组，对比组与本实施例的区别仅在于，仅采用如下配方的培养基进行第一次诱导分化：E8完全培养基中加入终浓度为40ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为40ng/mL的rhG-CSF、终浓度为2μM的CHIR99021、终浓度为40ng/mL的PDGF、终浓度为40ng/mL的IGF-Ⅰ。
实施例2
本实施例是实施例1的变化例，变化之处仅在于多能干细胞的种类选用诱导多能干细胞(iPS)。
为了做比较，本实施例还设置了对比组，对比组与本实施例的区别仅在于，仅采用如下配方的培养基进行第一次诱导分化：E8完全培养基中加入终浓度为40ng/mL的骨形态发生蛋白4(BMP4)、终浓度为40ng/mL的rhG-CSF、终浓度为2μM的CHIR99021、终浓度为40ng/mL的PDGF、终浓度为40ng/mL的IGF-Ⅰ。
实施例1-2的结果测试
CD34+阳性率的检测：取实施例1、实施2及其对比组最终所得细胞，收集细胞到50mL离心管中1000r/min离心5min，弃上清后用1mL含2％(v/v)血清的PBS重悬，加入抗体CD34-PE-Cy7，4℃孵育30min后用含2％血清的PBS洗一遍。然后以5×106/ml的密度重悬细胞，使用Agilent NovoCyte流式仪细胞仪检测并分析其分化效率。在检测过程中，以普通ES细胞为阴性组，即未进行造血诱导分化的细胞或者是虽进行分化实验但是并未用流式抗体染色的细胞。
结果实施例1及其对比组测试结果如图1、图4所示，流式细胞分析发现实施例1的CD34+阳性率上升到89.69％(其对比组为75.48％)，表明实施例1相较于其对比组的分化效率明显上升；实施例2及其对比组的测试结果如图2、图4所示，CD34+阳性率上升到88.06％(其对比组为64.54％)，表明实施例2相较于其对比组的分化效率明显上升。阴性对比组见图3。
对比例1
本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于：仅采用第三阶段培养基培养14天。
结果：本对比例测得的CD34+阳性率为21.62％。
对比例2
本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于：仅采用第一阶段培养基培养14天。
结果：本对比例测得的CD34+阳性率为15.54％。
对比例3
本对比例是实施例1的对比例，对比之处仅在于：仅采用第二阶段培养基培养D14天。
结果：本对比例测得的CD34+阳性率为26.42％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，其特征在于：包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；
所述第一阶段培养基包括E8完全培养基、BMP4、rhG-CSF、CHIR99021、PDGF、IGF-Ⅰ，所述第一阶段培养基中BMP4、rhG-CSF、CHIR99021、PDGF、IGF-Ⅰ的终浓度比为(1.0-2.0)∶(1.0-2.0)∶(0.25-0.5)∶(1.0-2.0)∶(1.0-2.0)；
所述第二阶段培养基包括E6基础培养基、SB4315424、VEGF、SCF、TPO、IL-3、CSF，所述第二阶段培养基中SB4315424、VEGF、SCF、TPO、IL-3、CSF的终浓度比为(0.25-1.0)∶(1.0-2.0)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)；
所述第三阶段培养基包括StemlineⅡ基础培养基、VEGF、SCF、HGH、IL-3、Flt3L、EPO、EGF，所述第三阶段培养基中VEGF、SCF、HGH、IL-3、Flt3L、EPO、EGF的终浓度比为(0.2-2.0)：(0.5-2.0)∶(0.2-0.4)∶(0.5-2.0)∶(0.5-2.0)∶(1.0-2.0)∶(1.0-2.0)。
2.根据权利要求1所述的一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，其特征在于，所述第一阶段培养基中BMP4的终浓度为50-100ng/mL、rhG-CSF的终浓度为50-100ng/mL、CHIR99021的终浓度为10-50mM/mL、PDGF的终浓度为50-100ng/mL、IGF-Ⅰ的终浓度为50-100ng/mL；所述第二阶段培养基中SB4315424的终浓度为1-5uM/mL、VEGF的终浓度为50-100ng/mL、SCF的终浓度为20-80ng/mL、TPO的终浓度为20-80ng/mL、IL-3的终浓度为20-80ng/mL、CSF的终浓度为20-80ng/mL；所述第三阶段培养基中VEGF的终浓度为10-60ng/mL、SCF的终浓度为20-80ng/mL、HGH的终浓度为10-100nM、IL-3的终浓度为20-80ng/mL、Flt3L的终浓度为20-80ng/mL、EPO的终浓度为20-80ng/mL、EGF的终浓度为20-80ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，其特征在于，所述第一阶段培养基中BMP4、rhG-CSF、CHIR99021、PDGF、IGF-Ⅰ的终浓度比为1.0∶1.0∶0.25∶1.0∶1.0；所述第二阶段培养基中SB431542、VEGF、SCF、TPO、IL-3、CSF的终浓度比为0.25∶1.0∶0.625∶0.625∶0.625∶0.625；所述第三阶段培养基中VEGF、SCF、HGH、IL-3、Flt3L、EPO、EGF的终浓度比为1.0∶1.25∶0.25∶1.25∶0.5∶1.0∶1.0。
4.根据权利要求1所述的一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基，其特征在于，所述第一阶段培养基中BMP4的终浓度为80ng/mL、rhG-CSF的终浓度为80ng/mL、CHIR99021的终浓度为4μM、PDGF的终浓度为80ng/mL、IGF-Ⅰ的终浓度为80ng/mL；所述第二阶段培养基中SB4315424的终浓度为2μM、VEGF的终浓度为80ng/mL、SCF的终浓度为50ng/mL、TPO的终浓度为50ng/mL、IL-3的终浓度为50ng/mL、CSF的终浓度为50ng/mL；所述第三阶段培养基中VEGF的终浓度为40ng/mL、SCF的终浓度为50ng/mL、HGH的终浓度为10ng/mL、IL-3的终浓度为50ng/mL、Flt3L的终浓度为20ng/mL、EPO的终浓度为40ng/mL、EGF的终浓度为40ng/mL。
5.一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将多能干细胞置于Aggrewell板中，并于权利要求1-4任一项所述的第一阶段培养基中进行第一阶段的诱导分化成为拟胚体；
S2：将拟胚体置于权利要求1-4任一项所述的第二阶段培养基中进行第二阶段的诱导分化；
S3：将S2诱导分化后的细胞混合物置于权利要求1-4任一项所述的第三阶段培养基中进行第三阶段的诱导分化。
6.根据权利要求5所述的一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的方法，其特征在于，将多能干细胞接种于Aggrewell板进行拟胚体分化的第一阶段培养记为第0天，所述第一阶段的诱导分化自第0天开始至第4天结束，所述第二阶段的诱导分化自第4天开始至第8天结束，所述第三阶段的诱导分化自第8天开始至第14天结束。
7.根据权利要求5所述的一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的方法，其特征在于，所述第一阶段的诱导分化的第0天至第4天，接种时期使用第一阶段分化培养基，期间不换液；所述第二阶段的诱导分化的第4天将拟胚体转移至T75培养瓶中培养至第8天，转移时期加第二阶段分化培养基，期间不换液；所述第三阶段的诱导分化的第8天将T75培养瓶中的培养基更换新鲜第三阶段培养基，自所述第三阶段的诱导分化起第8天开始，隔3天半量更换为新鲜的第三阶段培养基。
8.根据权利要求5所述的一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的方法，其特征在于，所述Aggrewell板中多能干细胞的接种数量为每孔接种30万个细胞。
9.根据权利要求5所述的一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的方法，其特征在于，所述多能干细胞包括诱导多能干细胞、胚胎干细胞中的一种或两种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110579003.5A CN113215086A (zh) | 2021-05-26 | 2021-05-26 | 一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110579003.5A CN113215086A (zh) | 2021-05-26 | 2021-05-26 | 一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113215086A true CN113215086A (zh) | 2021-08-06 |
Family
ID=77098705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110579003.5A Pending CN113215086A (zh) | 2021-05-26 | 2021-05-26 | 一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113215086A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012070731A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-04-12 | Chiba Univ | ヒト多能性幹細胞からの造血幹細胞の効率的な誘導方法 |
| CN105316293A (zh) * | 2015-09-23 | 2016-02-10 | 广东颐养抗衰老研究院 | 一种体外获得造血干/祖细胞的方法 |
| CN107429230A (zh) * | 2015-01-26 | 2017-12-01 | 菲特治疗公司 | 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物 |
| US20200080059A1 (en) * | 2018-09-07 | 2020-03-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of hematopoietic progenitor cells from human pluripotent stem cells |
| CN111607566A (zh) * | 2019-02-22 | 2020-09-01 | 安徽中盛溯源生物科技有限公司 | 从人多能干细胞分化为造血祖细胞的方法及其应用 |
-
2021
- 2021-05-26 CN CN202110579003.5A patent/CN113215086A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012070731A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-04-12 | Chiba Univ | ヒト多能性幹細胞からの造血幹細胞の効率的な誘導方法 |
| CN107429230A (zh) * | 2015-01-26 | 2017-12-01 | 菲特治疗公司 | 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物 |
| CN105316293A (zh) * | 2015-09-23 | 2016-02-10 | 广东颐养抗衰老研究院 | 一种体外获得造血干/祖细胞的方法 |
| US20200080059A1 (en) * | 2018-09-07 | 2020-03-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of hematopoietic progenitor cells from human pluripotent stem cells |
| CN111607566A (zh) * | 2019-02-22 | 2020-09-01 | 安徽中盛溯源生物科技有限公司 | 从人多能干细胞分化为造血祖细胞的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| AKIRA NIWA等: "A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors", 《PLOS ONE》 * |
| EMMANUEL N. OLIVIER等: "High-Efficiency Serum-Free Feeder-Free Erythroid Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Using Small Molecules", 《STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE》 * |
| SELAMI DEMIRCI等: "Definitive hematopoietic stem/progenitor", 《STEM CELL RES THER.》 * |
| SO-JUNG KIM等: "Generation of hematopoietic stem cells from human embryonic stem cells using a defined, stepwise, serum-free, and serum replacement-free monolayer culture method", 《BLOOD RES.》 * |
| 张庆云等: "体外产生可移植的人造血干细胞的研究进展", 《中国实验血液学杂志》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6339998B2 (ja) | 幹細胞よりナチュラルキラー細胞を発生させる方法 | |
| CN111607566B (zh) | 从人多能干细胞分化为造血祖细胞的方法及其应用 | |
| WO2023240763A1 (zh) | 一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞的方法及其应用 | |
| CN110938590B (zh) | 一种间充质干细胞无血清培养基及其用途 | |
| CN111826348B (zh) | 一种人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞体外高效制备方法和应用 | |
| CN107418930B (zh) | 一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法 | |
| CN111808812B (zh) | 一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法 | |
| CN114540298A (zh) | 一种干细胞无血清培养基及其制备方法 | |
| CN116426472A (zh) | 一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化体系及其应用 | |
| CN112080469B (zh) | T1肽在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用 | |
| CN105296428A (zh) | 一种提高诱导多能干细胞的体外分化造血效率的方法 | |
| WO2023125971A1 (zh) | 共培养诱导干细胞分化为造血祖细胞的方法 | |
| CN115896019B (zh) | 一种诱导性多能干细胞诱导分化为nk细胞的方法 | |
| WO2023143006A1 (zh) | 一种将ips细胞诱导成nk细胞的试剂盒及其应用方法 | |
| CN113215086A (zh) | 一种多能干细胞诱导分化成造血干细胞的培养基及方法 | |
| CN108588024B (zh) | 诱导多能干细胞分化成造血干细胞的培养基及方法 | |
| CN110592007B (zh) | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN110106143B (zh) | Bcl-2小分子抑制剂在制备成熟红细胞中的用途 | |
| CN113373114A (zh) | 一种提高多能干细胞分化成造血干细胞的效率的培养基及方法 | |
| WO2013123607A1 (zh) | 用于成体干细胞的体外无血清培养的方法和培养基 | |
| CN113373115A (zh) | 一种低成本多能干细胞分化造血干细胞的培养基及培养方法 | |
| CN115992094B (zh) | 一种低密度单层诱导造血干细胞的方法和应用 | |
| CN110093314B (zh) | 红细胞脱核培养基及试剂盒 | |
| WO2023125972A1 (zh) | 干细胞诱导分化为造血祖细胞的方法 | |
| TWI573873B (zh) | 體外無血清成體幹細胞放大培養技術 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210806 |