CN105849100A - 流感病毒复制抑制剂 - Google Patents

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Abstract

化合物(1)或其药学上可接受的盐的多晶型，其中表示为如下结构式的化合物(1)，是化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A。这类多晶型用于治疗生物样品或受试者中的流感、抑制其流感病毒复制或减少其流感病毒的量。

Description

流感病毒复制抑制剂
相关申请的交叉参考
本PCT申请要求2013年11月13日提交的美国临时申请No.61/903,572的权益。该对比文件以其完整的形式并入本文参考。
技术领域
本发明涉及用于抑制患者的流感病毒复制、治疗或减轻患者的流感感染的严重性并且预防性预防或降低患者的流感感染的发病率的化合物和固体形式。
背景技术
在季节性流行病中流感在全世界传播，导致每年数十万人死亡-在大流行病年为数百万人。例如，20世纪发生了3次流感大流行，致数千万人死亡，每次大流行均起因于在人类中新病毒株的出现。通常，这些新病毒株由现有流感病毒从其它动物物种向人类的传播引起。
流感主要通过感染者咳嗽或打喷嚏时产生的载有病毒的大飞沫在人与人之间传播；然后这些大飞沫可停留在靠近(例如，约6英尺内)感染者的易感个体的上呼吸道的粘膜表面。传播也可通过与呼吸道分泌物的直接或间接接触而发生，例如触摸被流感病毒污染的表面，然后触摸眼睛、鼻子或嘴。成人可能能够在出现症状前1天或症状开始后约5天将流感传播给他人。小孩和免疫功能弱的人可能在症状发作后10天或以上具有传染性。
流感病毒是正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)的RNA病毒，其包括5个属：A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、ISA病毒和托高土病毒(Thogoto virus)。
A型流感病毒属有1个物种，A型流感病毒。野生水鸟是大量A型流感的天然宿主。有时，病毒传播至其它物种并且可接着引起家禽中的毁灭性爆发或导致人类流感大流行。3种流感类型中，A型病毒是最具毒性的人类病原体并且会造成最严重的疾病。根据对这些病毒的抗体反应，可将A型流感病毒细分为不同血清型。以已知人类大流行死亡数排序的已确认人类血清型为：H1N1(1918年引起西班牙流感)、H2N2(1957年引起亚洲流感)、H3N2(1968年引起香港流感)、H5N1(2007-2008流感季的大流行威胁)、H7N7(具有罕见的动物传染病潜能)、H1N2(在人类和猪中的地方性流行)、H9N2、H7N2、H7N3和H10N7。
B型流感病毒属有1个物种，B型流感病毒。B型流感几乎专感染人类并且与A型流感相比较不常见。其它已知易受B型流感感染的唯一动物是海豹。这种类型的流感按照比A型慢2-3倍的速率突变并且因此遗传多样性低，仅有一种B型流感血清型。由于这种抗原多样性的缺乏，通常在早年获得一定程度的B型流感免疫力。然而，B型流感突变足以使不可能持久免疫。这样降低了抗原变化率，合并其受限宿主变化(抑制跨物种抗原转变)，确保不会发生B型流感大流行。
C型流感病毒属有1个物种，C型流感病毒，其感染人类和猪并且可引起严重疾病和地方性流行病。然而，C型流感与其它类型流感相比较不常见并且通常似乎引起儿童的轻度疾病。
A、B和C型流感病毒在结构上非常相似。病毒颗粒直径为80-120nm并且通常近似球体，尽管可能出现丝状形式。对于病毒而言不同寻常的是，其基因组并非单一片段的核酸；相反，基因组含有7个或8个片段的分段负义RNA。A型流感基因组编码11种蛋白质：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1、M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2和PB2。
HA和NA是病毒颗粒外部的大分子糖蛋白。HA是介导病毒结合靶细胞和病毒基因组进入靶细胞的凝集素，而NA涉及通过裂解与成熟病毒颗粒结合的糖而从感染细胞释放子代病毒。因此，这些蛋白质已成为抗病毒药物的目标。而且，这些蛋白质是可产生抗体的抗原。根据对HA和NA的抗体反应将A型流感病毒分为亚型，形成例如H5N1中H和N区别的基础(参见上文)。
由于丧失生产力和相关医疗流感会产生直接成本以及预防措施的间接成本。在美国，流感是造成每年超过100亿美元总成本的原因，而据估计未来的大流行病可引起数千亿美元的直接和间接成本。预防成本也很高。世界各国政府已花费了数十亿美元为可能的H5N1禽流感大流行做准备和计划，成本与购买药物和疫苗以及发展灾难演练和提高边境管制的策略相关。
目前的流感治疗选择包括接种疫苗和用抗病毒药物进行化学治疗或化学预防。常常向高危群体，例如儿童和老年人，或有哮喘、糖尿病或心脏病的人推荐接种抗流感的流感疫苗。然而，可能经接种但仍得流感。每个季节重新配制一些特定流感株的疫苗，但不可能包括该季节世界上主动感染人的所有菌株。厂商用约6个月配制并生产处理季节性流行病所需的数百万份剂量；有时，新的或被忽视的菌株在这期间变得显著并感染人群，虽然这些人群已经接种疫苗(如2003-2004流感季H3N2 Fujian流感)。也可能就在接种之前被感染并恰好感染假定疫苗预防的菌株，因为疫苗需要约数周才起效。
另外，这些流感疫苗的功效可变。由于病毒的高突变率，特定流感疫苗通常赋予不超过几年的保护。由于病毒随时间快速变化，并且不同菌株成为优势，为某年配制的疫苗可能在下一年无效。
同样，由于缺乏RNA校正读码酶，流感vRNA的RNA依赖性的RNA聚合酶大约每1万个核苷酸(这是流感vRNA的近似长度)产生一个核苷酸***错误。因此，几乎每种新制流感病毒均为突变-抗原漂移。如果不止一个病毒系感染了单个细胞，则基因组分离为8个单独的vRNA片段使vRNA混合或重配。所产生的病毒遗传学上的快速变化产生抗原转变并且使病毒感染新宿主物种并迅速克服保护性免疫。
抗病毒药物也可用于治疗流感，其中神经氨酸酶抑制剂尤其有效，但病毒可对标准抗病毒药物产生抗药性。可以制备这类活性剂，以便具有各种不同的化学形式，包括化学衍生物或盐，或具有不同的物理形式。例如。它们可以为无定形的，可以具有不同的多晶型物，或可以以不同的溶剂化或水化状态存在。通过改变形式，能够改变其物理特性。这类不同的形式具有不同的特性，特别是作为口服制剂。具体地，期望鉴定显示出改善的特性的改进形式，例如增加的水溶性和稳定性、更好的药物制剂加工性或制备行性和口服施用的组合物的生物利用度增加。所讨论的这类改进的特性可以以有益于特定治疗作用的方式改变。
抗病毒剂的形式的变化可以是许多方式之一，其中调节这类抗病毒剂的物理特性在治疗流感中更有用。
发明内容
本发明一般性涉及化合物(1)或其药学上可接受的盐的多晶型、其药学上可接受的制剂、制备这类化合物的多晶型的方法和这类多晶型在抑制流感病毒复制、减少流感病毒的量和治疗流感中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及化合物(1)或其药学上可接受的盐的多晶型，其中化合物(1)表示为如下结构式：
且其中该多晶型选自：化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A；化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F；化合物(1)的HCl盐的形式D；化合物(1)的A；和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A。
在另一个实施方案中，本发明涉及药学上可接受的制剂，其包含本文公开的化合物(1)的多晶型或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及抑制体外生物样品或受试者中的流感病毒复制的方法。该方法包括对所述样品施用有效量的本文公开的化合物(1)的多晶型或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及减少体外生物样品或受试者中的流感病毒的量的方法。该方法包括对所述样品施用有效量的本文公开的化合物(1)的多晶型或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗患者的流感的方法。该方法包括对所述样品施用有效量的本文公开的化合物(1)或其药学上可接受的盐的多晶型。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的方法。该方法包括在包括水和一种或多种有机溶剂的溶剂***中混合HCl与化合物(1)，其中所述溶剂***具有0.05-0.85的水活度。化合物(1)可以是溶剂化的或非溶剂化的和/或无定形的或结晶的。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的方法。该方法包括：在包括水或包括水和一种或多种有机溶剂的溶剂***中混合HCl和化合物(1)，其中所述溶剂***具有等于或大于0.9的水活度，例如0.9-1.0；或在包括水或包括水和一种或多种有机溶剂的溶剂***中搅拌化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A，其中所述溶剂***减压等于或大于0.9的水活度，例如0.9-1.0。化合物(1)可以是溶剂化的或非溶剂化的和/或无定形的或结晶的。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备化合物(1)的HCl盐的形式D的方法。该方法包括使化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A脱水。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备化合物(1)的形式A的方法。该方法包括在包括水和乙醇的溶剂***中搅拌无定形化合物(1)或化合物(1)的溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的方法。该方法包括搅拌无定形化合物(1)或化合物(1)的溶剂合物、对-甲苯磺酸和包括乙腈的溶剂***的混合物。
本发明中还涵盖化合物(1)的2-甲基THF溶剂合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及减少体外生物样品或受试者中的流感病毒量的方法，包括对所述样品施用有效量的本文公开的化合物(1)的多晶型。
在另一个实施方案中，本发明涉及抑制体外生物样品或受试者的流感病毒复制的方法，包括对所述样品施用有效量的本文公开的化合物(1)的多晶型。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗受试者的流感的方法，包括对该受试者施用治疗有效量的本文公开的化合物(1)的多晶型。
本发明还包括本文公开的化合物(1)的多晶型在抑制受试者的流感病毒复制中的用途，在减少受试者的流感病毒量中的用途或治疗受试者的流感中的用途。本发明还包括本文公开的化合物(1)的多晶型在制备用于抑制受试者的流感病毒复制、减少受试者的流感病毒的量或治疗受试者的流感的药剂中的用途。
在另一个方面，本发明涉及化合物(1)或其药学上可接受的盐(例如化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A)的剂量方案，为100mg-1,600mg。
附图说明
图1和2分别是化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的X-射线粉末衍射(XRPD)图案和C13固态核磁共振光谱法(C13SSNMR)的光谱。
图3和4分别是化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的XRPD图案和C13SSNMR的光谱。
图5和6分别是化合物(1)的HCl盐的形式D的XRPD图案和C13SSNMR的光谱。
图7和8分别是化合物(1)的形式A的XRPD图案和C13SSNMR的光谱。
图9是化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的XRPD图案。
图10是化合物(1)的2-甲基四氢呋喃(2-MeTHF)溶剂合物的XRPD图案。
图11是化合物(1)的无定形形式的XRPD图案。
图12是化合物(1)的HCl盐的不同多晶型物间的变化中温度对水活度的相图。
图13是显示1200mg/600mg化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A剂量组在人的活的减毒流感攻击模型中的AUC病毒减少(shedding)的示意图。
发明详述
I.固体形式
表示为如下结构式的化合物(1)：
及其药学上可接受的盐可以用于抑制流感病毒复制并且还描述在WO 2010/148197中。
化合物(1)可以作为不同的多晶型形式存在。正如本领域知晓的，多态现象是化合物作为一种以上不同的结晶或"多晶型"种类结晶的能力。多晶型物是具有至少两种不同排列的化合物的固体结晶相或固态形式的化合物分子的多晶型。任意指定化合物的多晶型可以被定义为相同分子式或组成，但在化学结构方面两种不同化学化合物的结晶结构不同。一般地，可以用分析方法表征不同的多晶型物，例如X-射线粉末衍射(XRPD)图案、热重分析(TGA)和示差扫描量热法(DSC)；或根据其熔点或其它本领域已知的技术表征不同的多晶型物。本文所用的术语"多晶型"包括溶剂合物和不具有任何溶剂合物的净多晶型。
本文所用的"化合物(1)"是指化合物(1)的游离碱形式。因此，"化合物(1)的HCl盐"是指该游离碱化合物的HCl盐和"化合物(1)的甲苯磺酸盐"。注意，化合物(1)和化合物(1)的盐可以是溶剂化的或非溶剂化的，另有指定的除外。此外，注意化合物(1)和化合物(1)的盐可以是结晶的或无定形的，另有指定的除外。
在一个实施方案中，本发明涉及化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的多晶型A。该形式是化合物(1)的HCl盐的多晶型，其包括作为溶剂合物中的每个化合物(1)中半当量的水。在一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的特征在于在相当于X-射线粉末衍射图案中以度测定的10.5、5.2、7.4和18.9(±0.2度)2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐的·1/2H2O形式A的特征还在于在相当于X-射线粉末衍射图案中以度测定的25.2±0.2、16.5±0.2、18.1±0.2和23.0±0.2 2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的特征在于具有XRPD图案，其具有在如下表2中列出的位置处以2-θ±0.2表示的特征峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的特征在于具有基本上与图1中所示相同的XRPD图案。XRPD图案在室温下使用Cu Kα射线得到。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的多晶型A的特征在于在C13SSNMR光谱中的29.2、107.0、114.0和150.7(±0.3ppm)处具有一个或多个特征峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的多晶型A的特征还在于在C13SSNMR光谱中的22.1、24.6、47.7和54.8(±0.3ppm)处具有一个或多个特征峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的特征为具有表3中列出的C13SSNMR峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的特征为具有基本上与图2中所示相同的C13SSNMR光谱。
在另一个实施方案中，本发明涉及化合物(1)的HCl盐·3H2O的多晶型F。这种形式是化合物(1)的HCl盐的多晶型，其包括作为溶剂合物中每个化合物(1)3当量的水。在一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的7.1、11.9、19.2和12.4(±0.2)的2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征还在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的16.4、21.8和23.9(±0.2)2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征为具有XRPD图案，其具有以在如下表5中列出的位置处2-θ±0.2表示的特征峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征为具有基本上与图3相同的XRPD图案。XRPD图案在室温下使用CuKα射线得到。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·3H2O的多晶型F的特征在于在C13SSNMR光谱中在20.7、27.4、104.8、142.5、178.6(±0.3ppm)处的峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·3H2O的多晶型F的特征还在于相当于在C13SSNMR光谱中154.3、20.3、132.3和21.1(±0.3ppm)的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征为具有表6中列出的C13SSNMR峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征为具有基本上与图4中所示相同的C13SSNMR光谱。
在另一个实施方案中，本发明涉及化合物(1)的HCl盐的多晶型D。这种形式是化合物(1)的HCl盐的非-溶剂化形式。在一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐的形式D的特征在于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的5.8、17.1和19.5(±0.2)度2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐的形式D的特征在于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的5.3、10.5和15.9(±0.2)度2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐的形式D的特征为具有XRPD图案，其具有表7中列出的位置处以2-θ±0.2表示的特征峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐的形式D的特征为具有基本上与图5所示相同的XRPD图案。XRPD图案使用Cu Kα射线得到。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐的形式D的特征为具有C13SSNMR光谱中在29.4、53.4、113.3、135.4、177.8(±0.3ppm)处的峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐形式D的特征还在于相当于在C13SSNMR光谱中在22.9、23.9、26.0和31.6(±0.3ppm)处的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐的形式D的特征为具有表8中列出的C13SSNMR峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的HCl盐的形式D的特征为具有基本上与图6相同的C13SSNMR光谱。
在一个实施方案中，本发明涉及化合物(1)的多晶型A。这种形式是化合物(1)的游离碱的非溶剂化形式。在一个具体的实施方案中，化合物(1)的形式A的特征为相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的15.5、18.9和22.0(±0.2)2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的形式A的特征还在于相当于X-射线粉末衍射图案中以度测定的11.8、16.9、25.5和9.1(±0.2)2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的形式A的特征为具有XRPD图案，其具有在表10中列出的位置上以2-θ±0.2表示的特征峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的形式A的特征为具有基本上与图7中所示相同的XRPD图案。XRPD图案在室温下使用Cu Kα射线得到。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的形式A的特征为具有在C13SSNMR光谱中在21.0、28.5、50.4、120.8、138.5和176.2(±0.3ppm)处的峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的形式A的特征为具有在C13SSNMR光谱中在30.1、25.9、22.8和25.0(±0.3ppm)处的峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的形式A的特征为具有表11中列出的C13SSNMR峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的形式A的特征为具有基本上与图8中所示相同的C13SSNMR光谱。
在一个实施方案中，本发明涉及化合物(1)的甲苯磺酸盐的多晶型A。这种形式是化合物(1)的甲苯磺酸盐的非溶剂化形式。在一个具体的实施方案中，化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的特征为相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的7.2,9.3,13.7,14.3、14.7、16.9、18.7、26.3和26.9(±0.2)2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的特征还在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的6.0、28.0和27.5(±0.2)2-θ值的一个或多个峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的特征为具有XRPD图案，其具有在如下表14中列出的位置上以2-θ±0.2表示的特征峰。在另一个具体的实施方案中，化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的特征为具有基本上与图9相同的XRPD图案。XRPD图案使用Cu Kα射线得到。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的方法。
化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A可以通过混合(例如搅拌)氯化氢(HCl)与化合物(1)制备。化合物(1)可以是溶剂化的、非溶剂化的、无定形的或结晶的。可以将化合物(1)的溶液、淤浆或混悬液与HCl在包括水和一种或多种有机溶剂的溶剂***中混合，其中所述溶剂***具有等于或大于0.05和等于或小于0.85的水活度，即0.05-0.85。作为本领域已知的本文所用的术语"水活度"(aw)是指溶剂***中水的能力状态的测量值。将其定义为液体的蒸气压除以相同温度下的纯水的蒸气压。具体地，将其定义为其中p是水在该物质中的蒸气压，且po是纯水在相同温度下的蒸气压；或为aw＝lw×xw，其中lw是水的活度系数，且xo是水在水部分中的摩尔分数。例如，纯水具有1.0的水活度值。水活度值可以典型地使用电容湿度计或露点湿度计得到。不同类型的水活度测量仪器也可以商购得到。或者，两种或多种溶剂的混合物的水活度值可以基于溶剂的量和溶剂的已知的水活度值计算。
化合物(1)的结晶实例包括化合物(1)的形式A。化合物(1)的溶剂合物的实例包括下列溶剂的溶剂合物：2-MeTHF、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、二甲苯、丙酮、2-丁醇、乙酸甲酯、1-戊醇、2-丙醇、四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二噁烷、1-戊醇、2-甲基-1-丙醇、甲基乙基酮、3-甲基-1-丁醇、庚烷、甲酸乙酯、1-丁醇、乙酸和乙二醇。在一个具体的实施方案中，使用2-MeTHF的溶剂合物(例如化合物(1)·1(2-MeTHF))。
适合于制备化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的溶剂***可以由各种浓度的水和有机溶剂的组合组成，其中该溶剂***的水活度等于或大于0.05和等于或小于0.85(0.05-0.85)。在一个具体的实施方案中，水活度的值为0.4-0.6。适合的有机溶剂包括国际药品注册协调会议指导原则(International Conference on HarmonizationGuidelines)中列出的II类或III类有机溶剂。适合的II类有机溶剂的具体实例包括氯苯、环己烷、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二噁烷、2-乙氧基乙醇、甲酰胺、己烷、2-甲氧基乙醇、甲基丁基酮、甲基环己烷、N-甲基吡咯烷酮、硝基甲烷、吡啶、环丁砜、四氢呋喃(THF)、四氢萘、甲苯、1,1,2-三氯乙烯和二甲苯。适合的III类有机溶剂的具体实例包括：乙酸、丙酮、茴香醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、枯烯、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、2-甲基-1-丙醇、乙酸乙酯、***、甲酸乙酯、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇和乙酸丙酯。在一个具体的实施方案中，所述溶剂***的有机溶剂选自：氯苯、环己烷、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、己烷、2-甲氧基乙醇、甲基丁基酮、甲基环己烷、硝基甲烷、四氢萘、二甲苯、甲苯、1,1,2-三氯乙烷、丙酮、茴香醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、枯烯、乙醇、乙酸乙酯、***、甲酸乙酯、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-丙醇、1-戊醇、2-丙醇、乙酸丙酯、四氢呋喃和甲基四氢呋喃。在另一个具体的实施方案中，所述溶剂***的有机溶剂选自2-乙氧基乙醇、乙二醇、甲醇、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、乙醇、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇、甲基丁基酮、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、吡啶、甲苯和二甲苯。在另一个实施方案中，所述有机溶剂选自丙酮、正-丙醇、异丙醇、乙酸异丁酯和乙酸。在另一个实施方案中，所述有机溶剂选自丙酮和异丙醇。在另一个具体的实施方案中，所述溶剂***包括水和丙酮。在另一个具体的实施方案中，所述溶剂***包括水和异丙醇。
制备化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A可以在任意适合的温度下进行。典型地，在5℃-75℃的温度下进行。在一个具体的实施方案中，在15℃-75℃温度下进行。在另一个具体的实施方案中，在15℃-60℃温度下进行。在另一个具体的实施方案中，在15℃-35℃温度下进行。在另一个具体的实施方案中，该制备在5℃-75℃温度下在具有0.4-0.6水活度值的溶剂***中进行。在另一个具体的实施方案中，该制备在15℃-75℃温度下在具有0.4-0.6的水活度值的溶剂***中进行。在另一个具体的实施方案中，该制备在15℃-60℃温度下在具有0.4-0.6的水活度值的溶剂***中进行。在另一个具体的实施方案中，该制备在15℃-35℃温度下在具有0.4-0.6的水活度值的溶剂***中进行。
可以将氯化氢(HCl)作为溶液或气体导入。适合的氯化氢源的一个实例是包含占该水溶液重量30-40wt％(例如34wt％-38wt％)的氯化氢的水溶液。
化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F通过在包括水的溶剂***或包括水和一种或多种有机溶剂的溶剂***中混合HCl和化合物(1)制备，其中所述溶剂***具有等于或大于0.9(≥0.9)的水活度。该混合物可以是溶液、淤浆或混悬液。化合物(1)可以是溶剂化的、非溶剂化的、无定形的或结晶的。或者，可以通过在包括水的溶剂***或包括水和一种或多种有机溶剂的溶剂***中搅拌化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A制备，其中所述溶剂***具有等于或大于0.9的水活度。典型地，纯水具有1.0的水活度值。因此，具有0.9-1.0的水活度的溶剂***适合于制备化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F。在一个具体的实施方案中，混合或搅拌在环境温度下进行(18℃-25℃)。在另一个具体的实施方案中，混合或搅拌在15℃-30℃温度下进行。在另一个具体的实施方案中，混合或搅拌在20℃-28℃(例如25℃)温度下进行。用于形成化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的适合的有机溶剂，包括具体实例如上述对化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A所述。在另一个具体的实施方案中，所述溶剂***包括水和丙酮。在另一个具体的实施方案中，所述溶剂***包括水和异丙醇。
可以通过使化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A脱水制备化合物(1)的HCl盐形式D。脱水可以通过任意适合的方式进行，例如加热或干氮气净化或它们两者。
化合物(1)的形式A与通过下列步骤制备：(a)搅拌无定形化合物(1)或化合物(1)的溶剂合物(例如化合物(1)的2-MeTHF溶剂合物)在包括水和乙醇的溶剂***中的混合物。该混合物可以是溶液或淤浆。在一个具体的实施方案中，搅拌步骤在18℃-90℃的温度下进行。在另一个具体的实施方案中，搅拌步骤(a)在溶剂***的回流温度下进行。在另一个具体的实施方案中，所述溶剂***包括水5-15wt％。化合物(1)的溶剂合物的实例如上所述。在一个具体的实施方案中，使用2-MeTHF的溶剂合物(例如化合物(1)·1(2-MeTHF))。
在另一个实施方案中，制备化合物(1)的形式A的方法还包含：(b)在硝基甲烷中搅拌化合物(1)的无定形形式，形成化合物(1)的形式A的晶种；和(c)将化合物(1)的形式A的晶种添加到混合步骤(a)中得到的混合物中。在一个具体的实施方案中，该方法还包含：(b)在硝基甲烷中搅拌化合物(1)的无定形形式，形成化合物(1)的形式A的晶种；(c)将混合步骤(a)中得到的混合物冷却至18℃-60℃(例如50-55℃或55℃)的温度；和(d)将化合物(1)的形式A的晶种添加到得到的混合步骤(c)中。在另一个具体的实施方案中，该方法还包含添加水，然后添加化合物(1)的形式A的晶种至通过回流步骤得到的混合物中，其用量使得添加水后得到的溶剂***包括15-25wt％的水。在另一个具体的实施方案中，该非还包含将水添加到包括化合物(1)的形式A的晶种的混合物中，其用量使得在添加水后得到的溶剂***包括35-45wt％的水。在另一个具体的实施方案中，该方法还包含在添加水后，将包括化合物(1)的形式A的晶种的混合物冷却至0℃-10℃温度。
在一个具体的实施方案中，化合物(1)的形式A的晶种可以用化合物(1)的2-MeTHF溶剂合物在硝基甲烷中制备。在一个实施方案中，用于回流步骤的溶剂***包括占该溶剂相同重量5-15wt％(例如8wt％、10wt％或12wt％)的水。
化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A可以通过搅拌无定形化合物(1)或化合物(1)的溶剂合物((例如化合物(1)的2-MeTHF溶剂合物)、对-甲苯磺酸和包括乙腈的溶剂***的混合物制备。在一个具体的实施方案中，混合或搅拌步骤在环境温度下进行。在另一个具体的实施方案中，混合或搅拌步骤在15-30℃的温度下进行。在另一个具体的实施方案中，混合或搅拌步骤在20-30℃(例如25℃)的温度下进行。化合物(1)的溶剂合物的适合的实例，包括具体实例如上述对制备化合物(1)的形式A所述。
在另一个实施方案中，本发明涉及化合物(1)的2-MeTHF溶剂合物。在一个具体的实施方案中，该溶剂合物包括0.5-1.5当量的2-MeTHF/化合物(1)，例如1当量的2-MeTHF/化合物(1)。在一个具体的实施方案中，该溶剂合物包括1当量的2-MeTHF且特征为具有XRPD图案，其具有在如下8.4、9.7、16.7、16.9、17.4、21.0、22.3和25.7位置以2-θ±0.2表示的特征峰。在另一个具体的实施方案中，该溶剂合物包括1当量的2-MeTHF且特征在于具有一些表12中列出的XRPD峰或特征为具有如图10中所示的XRPD图案。
在另一个实施方案中，本发明涵盖化合物(1)及其药学上可接受的盐的无定形形式，例如化合物(1)的无定形HCl盐和无定形化合物(1)。在另一个实施方案中，本发明还涵盖化合物(1)水合物的形式B。化合物(1)水合物的形式B与化合物(1)的形式A为同晶型，显示与化合物(1)的形式A相同的XRPD峰，但在水不存在下形成，例如在具有水活度大于0.6、例如0.6-1.0、在环境温度下的***中。
本发明涵盖上述化合物(1)的多晶型，为分离形式、纯形式或在与其它物质例如化合物(I)的其它形式(即化合物(1)的无定形形式、形式A等)或任意物质混合时为固体组合物的混合物。
在一个方面，本发明提供多晶型，例如化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐的·3H2O形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A、化合物(1)水合物的形式B和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A，为分离的固体形式。在另一个方面，本发明提供化合物(1)及其药学上可接受的盐的无定形形式，例如化合物(1)的无定形HCl盐和无定形化合物(1)，为分离的固体形式。
在另一个方面，本发明提供多晶型，例如化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A、化合物(1)水合物的形式B和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A，为纯形式。这种纯的形式是指具体的多晶型占95％(w/w)以上、例如98％(w/w)以上、99％(w/w％)以上、99.5％(w/w)以上或99.9％(w/w)以上。在另一个方面，提供化合物(1)或其药学上可接受的盐的无定形所示，为纯的形式。这种纯的形式是指无定形形式占95％(w/w)以上，例如98％(w/w)以上、99％(w/w％)以上、99.5％(w/w)以上或99.9％(w/w)以上。
更具体地，本发明提供组合物形式的多晶型或多晶型与一种或多种另外的结晶、溶剂合物、无定形或其它多晶型的混合物形式的每一种或其任意的组合。例如，在一个实施方案中，所述组合物包含化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A与一种或多种化合物(1)的另外的多晶型，例如无定形形式、溶剂合物、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的形式A和/或其它形式或其任意的组合。类似地，在另一个实施方案中，所述组合物包含化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F与一种或多种化合物(1)的另外的多晶型，例如无定形形式、溶剂合物、化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A和/或其它形式或其组合。类似地，在另一个实施方案中，所述组合物包含化合物(1)的HCl盐的形式D与一种或多种化合物(1)的另外的多晶型，例如无定形形式、溶剂合物、化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的形式A和/或其它形式或其组合。在另一个实施方案中，所述组合物包含化合物(1)的形式A与一种或多种化合物(1)的另外的多晶型，例如无定形形式、水合物、溶剂合物和/或其它形式或其组合。在另一个实施方案中，所述组合物包含化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A与一种或多种化合物(1)的另外的多晶型，例如无定形形式、水合物、溶剂合物和/或其它形式或其组合。更具体地，所述组合物可以包含痕量至100％的特定的多晶型或任意量，例如0.1％-0.5％、0.1％-1％、0.1％-2％、0.1％-5％、0.1％-10％、0.1％-20％、0.1％-30％、0.1％-40％或0.1％-50％重量的特定多晶型，以组合物中化合物(1)的总量为基准。或者，所述组合物可以包含至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％重量的特定多晶型，以组合物中化合物(1)的总量为基准。
出于本发明的目的，根据第75版《物理化学手册》CAS版本的元素周期表鉴定化学元素。另外，在“Organic Chemistry”，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausolito：1999和“March’s Advanced Organic Chemistry”，第5版，编辑：Smith，M.B.和March，J.，John Wiley&Sons，New York：2001中描述了有机化学的总则，其全部内容据此通过引用并入。
除非另外注明，本文描绘的结构也意在包括结构的所有异构(例如，对映异构、非对映异构、顺-反、构象和旋转异构)形式。例如，每个非对称中心的R和S构型、(Z)和(E)双键异构体和(Z)和(E)构象异构体包括在本发明内，除非特别画出仅一个异构体。正如本领域的技术人员应了解，取代基可围绕任何可旋转键自由旋转。例如，画为的取代基也表示
因此，本发明化合物的单个立体化学异构体以及光学异构、非对映异构体、顺/反、构象和旋转异构混合物在本发明范围之内。
除非另有指示，否则本发明化合物的所有互变异构体形式均在本发明范围内。
另外，除非另外注明，本文描绘的结构也意在包括仅在存在一个或多个富含同位素的原子方面不同的化合物。例如，除用氘或氚替换氢或用富含13C-或14C-的碳替换碳以外，具有现存结构的化合物在本发明范围之内。这种化合物可用作(例如)生物检定中的分析工具或探针。这种化合物，尤其是氘(D)类似物在治疗上也有用。
本文用其化学结构和/或化学名称定义本发明的化合物。当通过化学结构和化学名称来提及化合物，并且化学结构和化学名称相冲突时，由化学结构决定化合物的特性。
本领域技术人员可以可以理解，本发明的化合物可以包含一个手性中心。由此通式化合物可以以两种不同的光学异构体存在(即(+)或(-)对映体)。所有这类对映体及其混合物包括外消旋混合物均包括在本发明范围内。可以通过本领域众所周知的方法，例如手性HPLC、酶拆分和手性助剂得到单一光学异构体或对映体。
在一个实施方案中，提供单一对映体形式的本发明的化合物，其至少95％、至少97％和至少99％无相应的对映体。
在另一个实施方案中，本发明的化合物为(+)对映体形式，其至少95％无相应的(-)对映体。
在另一个实施方案中，本发明的化合物为(+)对映体形式，其至少97％无相应的(-)对映体。
在另一个实施方案中，本发明的化合物为(+)对映体形式，其至少99％无相应的(-)对映体。
在另一个实施方案中，本发明的化合物为(-)对映体形式，其至少95％无相应的(+)对映体。
在另一个实施方案中，本发明的化合物为(-)对映体形式，其至少97％无相应的(+)对映体。
在另一个实施方案中，本发明的化合物为(-)对映体形式，其至少99％无相应的(+)对映体。
II.化合物(1)及其药学上可接受的盐的用途
本发明的一个方面一般涉及化合物(1)及其药学上可接受的盐，包括上述各种固体形式(例如化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A、化合物(1)水合物的形式B和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A)的用途，所述用途用于抑制生物样品或患者中的流感病毒复制、减少生物样品或患者中流感病毒的量(降低病毒滴度)和治疗患者的流感。除非下文中另有具体指示，否则化合物(1)及其药学上可接受的盐，包括上述各种固体形式(例如化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A、化合物(1)水合物的形式B和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A)一般称作化合物。
在一个实施方案中，本发明一般涉及本文公开的化合物(例如药学上可接受的组合物形式)在任意上述指定应用中的用途。
在又一实施方案中，本文公开的化合物可用于降低生物样品(例如，受感染的细胞培养物)或人类(例如，患者肺部的病毒滴度)中的病毒滴度。
如本文使用的术语“流感病毒接介导的病状”、“流感感染”或“流感”可交换使用以指由感染流感病毒引起的疾病。
流感是由流感病毒引起的影响鸟类和哺乳动物的传染病。流感病毒是正黏液病毒科的RNA病毒，正黏液病毒科包括5个属：A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、ISA病毒和托高土病毒。A型流感病毒属有1个种，A型流感病毒，可基于对这些病毒的抗体反应将A型流感病毒细分为不同血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3和H10N7。A型流感病毒的另一个实例包括H3N8和H7N9。B型流感病毒属有1个种，B型流感病毒。B型流感几乎专感染人类并且相比A型流感较不常见。C型流感病毒属有1个种，C型流感病毒，其感染人类和猪并且可引起严重疾病和地方性流行病。然而，C型流感相比其它类型较不常见并且通常似乎引起儿童的轻度疾病。
在本发明的一些实施方案中，流感或流感病毒与A或B型流感病毒相关。在本发明的一些实施方案中，流感或流感病毒与A型流感病毒相关。在本发明的一些特定实施方案中，A型流感病毒为H1N1、H2N2、H3N2或H5N1。在本发明的一些实施方案中，A型流感病毒是H1N1、H3N2、H3N8、H5N1和H7N9。在本发明的一些特定实施方案中，A型流感病毒为H1N1、H3N2、H3N8和H5N1。
在人类中，流感的常见症状是寒战、发烧、咽炎、肌肉痛、剧烈头痛、咳嗽、虚弱和全身不适。在更为严重的情况下，流感引起可致命的肺炎，尤其是在幼儿和老年人中。虽然常常和普通感冒混淆，但是流感是更为严重的疾病并且是由不同类型的病毒引起。特别是在儿童中，流感可引起噁心和呕吐，但是这些症状更多的特征在于无关的肠胃炎，有时称为“肠胃感冒”或“24小时流感”。
感染后1-2天，流感症状可十分突然地开始。通常首发症状是寒战或畏寒，但感染中发烧也是常见的早期症状，体温范围为38-39℃(约100-103°F)。许多人病情严重到要卧床数天，全身疼痛，背部和腿部更严重。流感症状可能包括：身体疼痛，特别是关节和咽喉，极度寒冷和发烧、疲劳、头痛、刺激性流泪，眼睛、皮肤(特别是脸部)、口、咽喉和鼻子发红、腹痛(在患B型流感的儿童中)。流感症状与许多病原体(“类流感”)非特异性并发。通常，需要实验室数据以便确诊。
术语“疾病”、“病症”和“病状”在此可交换使用以指流感病毒介导的医疗或病理状况。
如本文使用的术语“受试者”和“患者”可交换地使用。术语“受试者”和“患者”指动物(例如，鸡、鹌鹑或火鸡等鸟类或哺乳动物)，特别是包括非灵长类动物在内的“哺乳动物”(例如，牛、猪、马、羊、兔、豚鼠、大鼠、猫、狗和小鼠)和灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩和人类)，更特别的是人类。在一个实施方案中，受试者为非人类动物，例如家畜(例如，马、牛、猪或羊)或宠物(例如，狗、猫、豚鼠或兔)。在一个优选的实施方案中，受试者为“人类”。
如本文使用的术语“生物样品”包括但不限于细胞培养物或其提取物、从哺乳动物获得的活组织检查物质或其提取物、血液、唾液、尿、粪便、***、眼泪或其它体液或其提取物。
如本文使用的术语“感染复数”或“MOI”是感染物(例如，噬菌体或病毒)与感染对象(例如，细胞)之比。例如，当涉及一群接种了感染性病毒颗粒的细胞时，感染复数或MOI是由一个孔中沉淀的感染性病毒颗粒数量除以该孔中存在的靶细胞数量而确定的比例。
如本文使用的术语“抑制流感病毒的复制”包括减少病毒复制的量(例如，减少至少10％)和完全阻止病毒复制(即，100％减少病毒复制的量)。在一些实施方案中，流感病毒复制被抑制至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少90％或至少95％。
可通过本领域已知的任何适合方法测量流感病毒复制。例如，可测量在生物样品(例如感染细胞培养物)或人类(例如，患者体内的肺部病毒滴度)中的流感病毒滴度。更特别地，对于基于细胞的检测而言，在所有情况下在体外培养细胞，在试验试剂存在或不存在下将病毒加入培养物中，并且在适当时间后评估病毒依赖型终点。对于典型检测而言，可使用马-达二氏犬肾细胞(MDCK)和标准组织培养适合的流感菌株A/Puerto Rico/8/34。在本发明中可使用的第一类细胞检测依赖于感染靶细胞的死亡，这是一个称为细胞病理效应(CPE)的过程，其中病毒感染引起细胞资源耗尽和细胞最终溶解。在第一类细胞检测中，感染微量滴定板孔内的一小部分细胞(通常1/10至1/1000)，使病毒在48-72小时进行几次复制，然后使用与未感染对照相比细胞ATP的减少量测量细胞死亡数量。在本发明中可采用的第二类细胞检测依赖于病毒特异性RNA分子在感染细胞内的增殖，使用支链DNA杂交法(bDNA)直接测量RNA含量。在第二类细胞检测中，最初在微量滴定板的孔内感染少量细胞，使病毒在感染细胞内复制并传播到另外的细胞，然后溶解细胞并测量病毒RNA含量。通常在18-36小时后及早停止这个检测，而所有靶细胞仍然存活。通过与固定在检测板的孔上的特异性寡核苷酸探针杂交，然后通过与报告酶连接的另外的探针杂交而扩增信号来定量病毒RNA。
如本文使用的“病毒滴度”是病毒浓度的度量。滴度测试可采用连续稀释以从本质上仅评估为正或负的分析方法获得近似定量信息。滴度与仍产生正读数的最高稀释因子相对应；例如，在前8次连续两倍稀释中正读数转化为1∶256的滴度。具体实例为病毒滴度。为确定滴度，制备几种稀释液，例如10-1、10-2、10-3、10-4,10-5、10-6、10-7、10-8等。仍感染细胞的最低病毒浓度为病毒滴度。
如本文使用的术语“治疗”指治疗性和预防性治疗。例如，治疗性治疗包括由于施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗剂(例如本发明的化合物和组合物))减轻或改善流感病毒介导的病状的进展、严重程度和/或持续时间，或改善流感病毒介导的病状的一种或多种症状(特别地，一种或多种可辨症状)。在特定实施方案中，治疗性治疗包括改善流感病毒介导的病状的至少一个可测量物理参数。在其它实施方案中，治疗性治疗包括通过(例如)稳定可辨症状在物理上或通过(例如)稳定物理参数在生理上或二者抑制流感病毒介导的病状的进展。在其它实施方案中，治疗性治疗包括减轻或稳定流感病毒介导的感染。可在社区中使用抗病毒药物以治疗已经患流感的人以减少症状的严重程度并减少他们生病的天数。
术语“化疗”指使用药物，例如小分子药物(而不是“疫苗”)治疗病症或疾病。
如本文使用的术语“预防”、“预防性使用”和“预防性治疗”指目的在于预防，而不是治疗或治愈疾病的任何医疗或公共卫生程序。如本文使用的术语“防止”指降低获得或发展指定病状的风险，或减少或抑制复发或没有病但已经或可能靠近患病人的受试者的所述病状。术语“化学预防”指使用药物，例如小分子药物(而不是“疫苗”)防止病症或疾病。
如本文使用的预防性使用包括用于已检测到爆发的情形下以防止在许多处于严重流感并发症高风险的人近距离接触的地方(例如，在医院病房、日托中心、监狱、疗养院等)传染或传播。还包括在需要流感防护但在接种疫苗后并未获得保护(例如，由于免疫***弱)的群体中或对于他们而言疫苗不可用时，或当他们由于副作用不能接种疫苗时使用。还包括在接种疫苗后2周内使用，因为在此期间疫苗仍无效。预防性使用还可能包括治疗未患流感或未被视为处于并发症高风险的人以减少感染流感并将流感传给和他近距离接触的高危人(例如，医护人员、疗养院工作人员等)的机会。
根据US CDC，将流感“爆发”定义为在一群相互靠近的人中(例如在支援性生活设施的同一区域中、在同一家庭中等)在48-72小时内急性发烧呼吸道疾病(AFRI)突然增加超过正常本底率或当受分析的群体中任何受试者测试为流感阳性。将通过任何测试方法确定的流感病例视为爆发。
“群集”定义为在一群相互靠近的人中(例如，在支援性生活设施的同一区域、同一家庭等中)在48-72小时内发生的3个或更多个AFRI病例组合。
本文使用的“指示病例”、“原发病例”或“零号患者(patient zero)”是流行病学调查的人口抽样中的初始患者。通常在流行病学调查中用于指这种患者时，术语不大写。当在关于特定调查的报告中将术语用于指特定的人而不是那个人的姓名时，术语大写为零号患者(Patient Zero)。科学家常常寻找指示病例以确定疾病如何传播以及爆发期间何种带病源会控制疾病。注意指示病例是指示爆发存在的首个患者。可发现更早的病例，并标记为第一、第二、第三等。
在一个实施方案中，本发明的方法是对患者，特别是有由流感病毒感染引起的并发症的素因的人的预防性或“优先”措施。例如本文在优先使用、“优先地”等中使用的术语“优先”为在已确认“指示病例”或“爆发”的情形下的预防性使用，以防止感染在社区或群体的其余部分中传播。
在另一个实施方案中，本发明的方法可用作对社区或群体的成员，特别是人类的“优先”措施，以防止感染传播。
如本文使用的“有效量”指引起预期生物反应的量。在本发明中，预期生物反应是抑制流感病毒复制，减少流感病毒的量或减轻或改善流感病毒感染的严重程度、持续时间、进展或发作，防止流感病毒感染蔓延，防止流感病毒感染相关症状的复发、演变、发作或进展，或增强或提高使用的另一种抗流感感染疗法的预防或治疗作用。向受试者施用的化合物的确切量将取决于施用模式、感染的类型和严重程度和受试者的特征，例如健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当剂量。当与其它抗病毒剂联合施用时，例如与抗流感药物联合施用时，第二种试剂的“有效量”将取决于所用药物的类型。已知经核准试剂的适合剂量并且技术人员可根据受试者的病状、治疗病状的类型和使用的本文所述化合物的量进行调节。在未明确指出量的情况下，应采取有效量。例如，可按约0.01-100mg/kg体重/天的剂量范围向受试者施用本文公开的所述化合物做治疗性或预防性治疗。
通常，可根据多个因素选择剂量方案，包括治疗病症和病症的严重程度，采用的特定化合物的活性，采用的特定组合物，患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食，施用时间、施用途径和采用的特定化合物的***率，受试者的肝肾功能，采用的特殊化合物或其盐，治疗持续时间，与采用的特定化合物结合或同时使用的药物和医学上众所周知的同类因素。技术人员可易于确定并指定治疗、防止、抑制(完全或部分)或阻止疾病进展所需的本文所述化合物的有效量。
本文所述化合物的剂量范围为约0.01-100mg/kg体重/天、0.01-50mg/kg体重/天、0.1-50mg/kg体重/天或1-25mg/kg体重/天。应理解，每天的总量可按单次剂量施用或可按多次剂量施用，例如每日2次(例如，每12小时)、每日3次(例如，每8小时)或每日4次(例如，每6小时)。
在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如化合物(1)及其药学上可接受的盐，包括各种固体形式(例如化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A、化合物(1)水合物的形式B和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A))的剂量为100mg-1,600mg，例如400mg-1,600mg或400mg-1,200mg。将每种剂量每日服用1次(QD)，例如2次(例如每隔12小时(BID))或每日3次(例如q8h(TID))。注意，根据需要，可以使用QD、BID和TID的任意组合，例如在第1天时BID，随后QD。
在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如化合物(1)及其药学上可接受的盐，包括各种固体形式(例如化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D)的剂量为100mg-1,600mg，例如400mg-1,600mg或400mg-1,200mg。将每种剂量每日服用1次(QD)，例如2次(例如每隔12小时(BID))或每日3次(例如q8h(TID))。注意，根据需要，可以使用QD、BID和TID的任意组合，例如在第1天时BID，随后QD；或在第1天时使用负荷剂量，第2天时BID，然后QD。
在一个具体的实施方案中，本文所述化合物的剂量为400mg-1,600mg、400mg-1,200mg或600mg-1,200mg，每日1次。在另一个具体的实施方案中，本文所述化合物的剂量为400mg-1,600mg、400mg-1,200mg或300mg-900mg，每日2次。在另一个具体的实施方案中，本文所述化合物的剂量为400mg-1,000mg，每日1次。在另一个具体的实施方案中，本文所述化合物的剂量为600mg-1,000mg，每日1次。在另一个具体的实施方案中，本文所述化合物的剂量为600mg-800mg，每日1次。在另一个具体的实施方案中，本文所述化合物的剂量为400mg-800mg，每日2次(例如每隔12小时400mg-800mg)。在另一个具体的实施方案中，本文所述化合物的剂量为400mg-600mg，每日2次。
在一些实施方案中，使用负荷剂量方案。在一个具体的实施方案中，在第1天治疗时，使用400mg-1,600mg的负荷剂量。在另一个具体的实施方案中，在第1天治疗时，使用600mg-1,600mg的负荷剂量。在另一个具体的实施方案中，在第1天治疗时，使用800mg-1,600mg的负荷剂量。在另一个具体的实施方案中，在第1天治疗时，使用900mg-1,600mg的负荷剂量。在另一个具体的实施方案中，在第1天治疗时，使用900mg-1,200mg的负荷剂量。在另一个具体的实施方案中，在第1天治疗时，使用900mg的负荷剂量。在另一个具体的实施方案中，在第1天治疗时，使用1,000mg的负荷剂量。在另一个具体的实施方案中，在第1天治疗时，使用1,200mg的负荷剂量。
在一个具体的实施方案中，本文所述的化合物的剂量方案在第1天时使用600mg-1,600mg的负荷剂量并且在其余的治疗期间使用300mg-1,200mg的定期剂量。可以服用每种定期剂量，每日1次，每日2次或每日3次或其任意的组合。在另一个具体的实施方案中，使用900mg-1,600mg例如900mg、1,200mg或1,600mg的负荷剂量。在另一个具体的实施方案中，使用900mg-1,200mg、例如900mg或1,200mg的负荷剂量。在另一个具体的实施方案中，400mg-1,200mg例如400mg、600mg或800mg的定期剂量用于其余的治疗期限。在另一个具体的实施方案中，400mg-1,000mg的定期剂量用于其余的治疗期限。在另一个具体的实施方案中，400mg-800mg的定期剂量用于其余的治疗期限。在另一个具体的实施方案中，使用300mg-900mg的定期剂量，每日2次。在另一个具体的实施方案中，使用600mg-1,200mg的定期剂量，每日1次。在另一个具体的实施方案中，在第2天时，使用600mg的定期剂量，每日2次，然后是600mg，每日1次，用于其余的治疗期限。
对于治疗性治疗而言，例如可在症状发作(例如，鼻塞、咽喉痛、咳嗽、疼痛、疲劳、头痛和寒战/出汗)48小时内(或在40小时或少于2天或少于1.5天或24小时内)向患者施用本文所述化合物。或者，对于治疗性治疗而言，例如，可以在症状发作96小时内向患者施用本文所述的化合物。治疗性治疗可持续任何适合时间，例如3天、4天、5天、7天、10天、14天等。对于社区爆发期间的预防性治疗而言，例如可在指示病例症状发作2天内向患者施用本文所述化合物，并且可继续任何适合时间，例如7天、10天、14天、20天、28天、35天、42天等，直到整个流感季节。流感季节是每年复发的时间期限，其特征在于流感暴发流行。流感活动有时可以预期且甚至在地理上可以追踪。当在每个季节中主要的流感活动开始因地理位置的不同而改变时，在任何特定的地点，这些较少的疾病流行通常花费3-4周达到峰值并且再经过3-4周明显减弱。典型地，在美国疾病控制中心(Centers for Disease Control)(CDC)采集、搜集和分析有关流感活度年的信息并且产生自十月至五月中旬的每周报告。
在一个实施方案中，治疗性治疗持续1天至整个流感季节。在一个具体的实施方案中，治疗性治疗持续3天-14天。在另一个具体的实施方案中，治疗性治疗持续5天-14天。在另一个具体的实施方案中，治疗性治疗持续3天-10天。在另一个具体的实施方案中，治疗性治疗持续4天-10天。在另一个具体的实施方案中，治疗性治疗持续5天-10天。在另一个具体的实施方案中，治疗性治疗持续4天-7天(例如4天、5天、6天或7天)。在另一个具体的实施方案中，治疗性治疗持续5天-7天(例如5天、6天或7天)。在一个具体的实施方案中，预防性治疗持续至整个流感季节。
在一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,600mg的负荷剂量施用于患者3天-14天(例如5天-14天)，并且使用300mg-1,200mg的定期剂量用于其余的治疗期限。在另一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,200mg的负荷剂量施用于患者3天-14天(例如5天-14天)，并且使用400mg-1,000mg的定期剂量用于其余的治疗期限。在另一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,200mg的负荷剂量施用于患者3天-14天(例如5天-14天)，并且使用400mg-800mg的定期剂量用于其余的治疗期限。在另一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,200mg的负荷剂量施用于患者3天-14天(例如5天-14天)，并且使用400mg-800mg的定期剂量用于其余的治疗期限。可以服用每种剂量，每日1次，每日2次或每日3次或其任意的组合。
在一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,600mg的负荷剂量施用于患者3天-14天，并且使用600mg-1,000mg、每日1次的定期剂量用于其余的治疗期限。在另一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,200mg的负荷剂量施用于患者3天-14天，并且使用600mg-800mg(例如600mg、650mg、700mg,750mg或800mg)、每日1次的定期剂量用于其余的治疗期限。在一些实施方案中，该期限持续4天-10天、5天-10天或5天-7天。
在一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,600mg的负荷剂量施用于患者3天-14天，并且使用400mg-800mg、每日2次的定期剂量用于其余的治疗期限。在另一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,200mg的负荷剂量施用于患者3天-14天，并且使用400mg-600mg(例如400mg、450mg、500mg、550mg或600mg)、每日2次的定期剂量用于其余的治疗期限。在一些实施方案中，该期限持续4天-10天、5天-10天或5天-7天。
在一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,200mg(例如900mg或1,200mg)的负荷剂量施用于患者4天或5天，并且使用400mg-600mg(例如400mg或600mg)、每日2次的定期剂量用于其余的治疗期限(例如第2天-第4天或第2天-第5天)。在另一个具体的实施方案中，在第1天时，将本文所述的化合物使用900mg-1,200mg(例如900mg或1,200mg)的负荷剂量施用于患者4天或5天，并且使用600mg-800mg(例如600mg或800mg)、每日1次的定期剂量用于其余的治疗期限。
在本发明中可采用各种类型的施用方法，并且在以下标题为“施用方法”的部分下详细描述。
III.联合疗法
可以在单独采用单独的或与另一种适合的治疗剂例如抗病毒剂或疫苗结合的本发明的化合物(包括其药学上可接受的盐或溶剂化物(例如，水合物)的本发明方法或药物组合物中达到有效量。当采用“联合疗法”时，使用第一种量的本发明化合物和第二种量的另外的适合治疗剂(例如，抗病毒剂或疫苗)可达到有效量。
在本发明的另一实施方案中，将本发明的化合物和另外的治疗剂各以有效量(即，如果单独施用，则各以治疗上有效的量)施用。在另一实施方案中，将本发明的化合物和另外的治疗剂各以单独不会提供疗效的量(亚治疗剂量)施用。在又一实施方案中，可按有效量施用本发明的化合物，而按亚治疗剂量施用另外的治疗剂。在再一实施方案中，可按亚治疗剂量施用本发明的化合物，而按有效量施用另外的治疗剂，例如适合的癌症治疗剂。
如本文使用的术语“结合”或“联合施用”可交换使用以指使用一种以上的疗法(例如，一种或多种预防和/或治疗剂)。术语的使用并不限制向受试者施用疗法(例如，预防和/或治疗剂)的顺序。
联合施用涵盖按基本上同时的方式施用联合施用的第一种和第二种量的化合物，例如按单一药物组合物施用，例如第一种和第二种量比例固定的胶囊或片剂，或按多个单独的胶囊或片剂施用。另外，这种联合施用还涵盖按任一顺序依次使用每种化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及使用本文所述的化合物抑制生物样品或患者中流感病毒复制或治疗或防止患者流感病毒感染的联合疗法。因此，本发明的药物组合物还包括那些包含与表现出抗流感病毒活性的抗病毒化合物结合的本发明的流感病毒复制抑制剂。
本文所述的化合物和本发明的组合物的使用方法还包括结合化学疗法和本发明的化合物或组合物，或结合本发明的化合物或组合物的组合和另一抗病毒剂和接种流感疫苗。
当联合施用包括单独施用第一种量的本发明化合物和第二种量的另外的治疗剂时，在足以接近有预期疗效的时间施用化合物。例如，每次可产生预期疗效的施用的间隔时间范围可为几分钟至几小时，并且可考量每种化合物的性质，例如效力、溶解性、生物利用率、血浆半衰期和动力学特征。例如，可按任何顺序在相互间隔24小时内、相互间隔16小时内、相互间隔8小时内、相互间隔4小时内、相互间隔1小时内或相互间隔30min内施用本发明的化合物和第二种治疗剂。
更具体地，可以在对受试者施用第二种疗法(例如预防或治疗剂，例如抗癌剂)之前(例如前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、与之同时或在其之后(例如之后5分钟,15分钟,30分钟,45分钟,1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用第一种疗法(例如预防或治疗剂，例如本发明的化合物)。
应当理解，共同施用第一种用量的本发明化合物和第二种用量的另外的治疗剂的方法可以产生增强或协同治疗作用，其中联合作用大于因分开施用第一种用量的本发明化合物和第二种用量的另外的治疗剂的累加作用。
如本文使用的术语“协同”指本发明化合物和另一疗法(例如，预防或治疗剂)的组合，这比疗法的累加效应更有效。疗法的组合(例如，预防或治疗剂的组合)的协同效应可允许使用更低剂量的一种或多种疗法和/或更低频率地向受试者施用所述疗法。能够利用更低剂量的疗法(例如，预防或治疗剂)和/或更低频率地施用所述疗法可降低向受试者施用所述疗法相关的毒性，而不降低所述疗法在病症预防、管理或治疗中的功效。另外，协同效应可引起试剂在病症预防、管理或治疗中的功效提高。最后，疗法的组合(例如，预防或治疗剂的组合)的协同效应可避免或减少与单独使用任一疗法相关的有害或不良副作用。
当使用本发明的本发明化合物进行的联合疗法与流感疫苗结合时，可施用两种治疗剂以致每次施用的间隔时间可更长(例如，数天、数周或数月)。
可使用评估药物相互作用的适合方法确定协同效应的存在。适合方法包括(例如)Sigmoid-Emax公式(Holford，N.H.G.和Scheiner，L.B.，Clin.Pharmacokinet.6：429-453(1981))、Loewe相加公式(Loewe，S.和Muischnek，H.，Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114：313-326(1926))和中效公式(Chou，T.C.and Talalay，P.，Adv.Enzyme Regul.22：27-55(1984))。以上提及的每个公式可与实验数据一起应用以生成相应的图，以有助于评估药物组合的效应。以上提及的与公式相关的相应的图分别为浓度-效应曲线、等效线图曲线和组合指数曲线。
可与本文所述化合物联合施用的具体实例包括神经氨酸酶抑制剂(例如，奥司他韦和扎那米韦)、病毒性离子通道(M2蛋白)阻滞剂(例如，金刚胺和金刚乙胺和WO 2003/015798中所述的抗病毒药物，包括日本Toyama Chemical研发的T-705(也参见Ruruta等，Antiviral Reasearch，82：95-102(2009)，“T-705(flavipiravir)and related compounds：Novel broad-spectruminhibitors of RNA viral infections.”)。在一些实施方案中，本文所述化合物可与常规流感疫苗一起联合施用。
在一些实施方案中，可以将本文所述的化合物(例如化合物(1)及其药学上可及诶杀的盐，例如化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F、化合物(1)的HCl盐的形式D、化合物(1)的形式A、化合物(1)水合物的形式B和化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A)与扎那米韦共同施用。在一些实施方案中，可以将本文所述的化合物与法维拉韦(T-705)共同施用。在一些实施方案中，可以将本文所述的化合物与奥司他韦共同施用。在一些实施方案中，可以将本文所述的化合物与金刚烷胺或金刚异胺共同施用。可以按照标签中指定的剂量方胺施用奥司他韦。在一些具体的实施方案中，可以将其施用75mg，每日2次；或150mg，每日1次。
药物组合物
可将本文所述化合物配制为进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂、辅料或赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及包含以上所述本发明的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂、辅料或赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，本发明为包含有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂、辅料或赋形剂的药物组合物。药学上可接受的载体包括，例如，药物稀释剂、赋形剂或就预期施用形式适当选择的符合方便药物实践的载体。
“有效量”包括“治疗有效量”和“预防有效量”。术语“治疗有效量”指治疗和/或改善感染了流感的患者的流感病毒感染有效的量。术语“预防有效量”指防止和/或大体上减少流感病毒感染爆发的机会或范围有效的量。在以上标题为公开化合物的使用部分描述了有效量的具体实例。
药学上可接受的载体可能含有不会过度抑制化合物的生物活性的惰性成分。药学上可接受的载体应生物相容，例如无毒、非炎性、非免疫原性或一旦施用给患者无其它不良反应或副作用。可采用标准制药技术。
如本文使用的药学上可接受的载体、辅料或赋形剂包括任何全部适于所需特殊剂型的溶剂、稀释剂或其它液体赋形剂、分散或悬浮辅助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington的Pharmaceutical Sciences第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)公开了配制药学上可接受的组合物中使用的各种载体及其已知制备技术。除了任何常规载体范围内，介质与本文所述化合物不相容，例如通过产生任何非所期望的生物效应或以有害方式与药学上可接受的盐的任何其它组分相互作用，其用途被考虑到本发明的范围之内。如本文使用的短语“副作用”涵盖了疗法(例如，预防或治疗剂)的有害不利作用。副作用总是不期望的，但不期望的并非必定有害。疗法(例如，预防或治疗剂)的不利作用可能有害或不适或危险。副作用包括但不限于发烧、寒战、嗜睡、胃肠毒性(包括胃和肠溃疡和糜烂)、恶心、呕吐、神经毒性、中毒性肾损害、肾毒性(包括如同肾***坏死和慢性间质性肾炎等病状)、肝毒性(包括血清肝酶水平升高)、骨髓中毒性(包括白细胞减少、骨髓抑制、血小板减少和贫血)、口干、金属味、延长孕、虚弱、嗜眠、疼痛(包括肌肉痛、骨痛和头痛)、脱发、无力、眩晕、锥体外系症状、静座不能、心脏血管障碍和性功能障碍。
可用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如twin 80、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠或锌盐)、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段共聚物、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羊毛脂、糖类(例如乳糖、葡萄糖和蔗糖)、淀粉(例如玉米淀粉和马铃薯淀粉)、纤维素及其衍生物(例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素)、粉状黄蓍胶、麦芽、凝胶、滑石、赋形剂(例如可可油和栓剂蜡)、油(例如花生油、棉花子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、乙二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)、酯(例如油酸乙酯和月桂酸乙酯)、琼脂、缓冲剂(例如氢氧化镁和氢氧化铝)、褐藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、乙醇和磷酸盐缓冲液以及其它无毒相容性滑润剂(例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及根据配制人的判断着色剂、防粘剂、涂层剂、甜味剂和增香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
IV.施用方法
可根据受治感染的严重程度经口、直肠、肠胃外、脑池内、***内、腹膜内、局部(如同通过粉剂、药膏或滴剂)、口腔作为口或喷鼻剂等向人或其它动物施用以上所述化合物和药学上可接受的组合物。
供口服的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微型乳剂、溶液、悬浮剂、糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型可能含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉花子油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物也可包括辅料，例如湿润剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂和增香剂。
可根据已知技术使用适合的分散或湿润剂和悬浮剂配制可注射制剂，例如无菌可注射水或油悬浮剂。无菌可注射制剂也可能是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮剂或乳剂，例如1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的赋形剂和溶剂中，可采用的是水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，按照惯例采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何无味的不挥发性油，包括合成的单酸甘油脂或甘油二酯。另外，脂肪酸，例如油酸，用于制备注射剂。
例如，可通过细菌保留过滤器过滤或通过加入呈无菌固体组合物形式，使用之前可溶于或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的杀菌剂为可注射制剂灭菌。
为延长本文所述化合物的作用，常常希望减缓化合物由皮下或肌肉注射的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体悬浮液实现。然后，化合物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小和晶形。或者，通过将化合物溶解或悬浮于油赋形剂中实现延迟吸收经肠胃外施用的化合物。通过在生物可降解的聚合物例如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成化合物的微胶囊矩阵制成可注射的储存形式。根据化合物与聚合物之比和采用的特殊聚合物的性质，可控制化合物释放速率。其它生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也可通过将化合物截留在与身体组织相容的脂质体或微型乳剂中制备可注射的储存制剂。
经直肠或***施用的组合物特别是可通过混合本文所述化合物和适合的非刺激性赋形剂或载体(例如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡)制备的栓剂，所述赋形剂或载体在环境温度下为固体但在体温下为液体并因此在直肠或***腔内融化并释放活性化合物。
口服固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒。在这种固体剂型中，活性化合物混有至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填料或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，例如羧基甲基纤维素、藻酸盐、凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和***胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂--琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，例如石蜡，f)吸收加速剂，例如季铵化合物，g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，和i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在为胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可包含缓冲剂。
也可使用如乳糖或奶糖以及高分子聚乙二醇等赋形剂将相似类型的固体组合物用作软和硬凝胶胶囊中的填料。可用包衣和壳，例如肠溶衣和制药领域众所周知的其它包衣制备片剂、糖锭、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型。它们可任选含有乳浊剂并且还可具有组合物的性质，以致任选地以延迟方式仅释放活性成分，或优选地，在肠道的某一部分释放。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。也可使用乳糖或奶糖以及高分子聚乙二醇等赋形剂将相似类型的固体组合物用作软和硬凝胶胶囊中的填料。
活性化合物也可呈具有一种或多种上述赋形剂的微密封形式。可用包衣和壳，例如肠溶衣、控释包衣和制药领域中众所周知的其它包衣制备片剂、糖锭、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型。在这种固体剂型中，活性化合物可能混有至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖、乳糖或淀粉。一般地，这种剂型也可能包含除惰性稀释剂外的另外的物质，例如压片润滑剂和其它压片辅助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在为胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可包含缓冲剂。它们可任选含有乳浊剂并且还可具有组合物的性质，以致任选地以延迟方式仅释放活性成分，或优选地，在肠道的某一部分释放。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。
本文所述化合物的局部或经皮施用剂型包括药膏、软膏、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷剂、吸入剂或贴片。在无菌条件下，活性化合物与药学上可接受的载体和任何需要的防腐剂或可能需要的缓冲剂。眼科制剂、耳滴剂和眼药水也被考虑到本发明的范围之内。另外，本发明考虑到具有提供控制化合物向身体递送的附加优点的皮肤贴片的用途。可通过将化合物溶解或分散于恰当介质中制成这种剂型。吸收促进剂也可用于提高化合物通过皮肤的流量。可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中控制速率。
也可经口、肠胃外，通过吸入喷剂经局部、直肠、鼻、口腔、***或通过植入药盒施用本文所述的组合物。如本文使用的术语“肠胃外”包括但不限于皮下、静脉内、肌肉、关节内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。特别地，经口、腹膜内或静脉内施用组合物。
本文所述组合物的无菌可注射形式可为水或油悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术使用适合的分散或湿润剂和悬浮剂制备。无菌可注射制剂也可能是于无毒的可经肠胃外接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如于1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的赋形剂和溶剂中，可采用的是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，按照惯例采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何无味的不挥发性油，包括合成的单酸甘油脂或甘油二酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物用于制备注射剂，因为它们是天然药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其其呈聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液也可能含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或在配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和悬浮液)中常用的类似分散剂。其它常用表面活性剂，例如Tweens、Spans和在生产药学上可接受的固体、液体或其它剂型中常用的其它乳化剂或生物利用率增强剂也可用于配制的目的。
可以任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊、片剂、水悬浮液或溶液，口服本文所述药物组合物。在为供口服片剂的情况下，常用载体包括但不限于乳糖和玉米淀粉。典型地还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服施用于，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服应用需要水悬浮液时，活性成分与乳化剂和悬浮剂结合。若需要，还可加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。
或者，可以供直肠使用的栓剂形式施用本文所述的药物组合物。可通过混合试剂和非刺激性赋形剂制备这些药物组合物，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠内融化以释放药物。这种物质包括但不限于可可油、蜂蜡和聚乙二醇。
尤其是当治疗目标包括局部滴施易于接近的区域或器官，包括眼部、皮肤或低位肠道疾病时，还可局部施用本文所述的药物组合物。易于为这些区域或器官的每一个制备适合的局部制剂。
以直肠栓剂制剂(见上文)或适合的灌肠剂制剂可实现对低位肠道的局部滴施。也可使用局部皮肤贴片。
对于局部滴施而言，可将药物组合物配制为含有悬浮或溶于一种或多种载体中的活性组分的适合药膏。适于局部滴施本发明的化合物的载体包括但不限于矿物油、凡士林油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将药物组合物配制为含有悬浮或溶于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的适合洗剂或乳膏。适合的载体包括但不限于矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苄醇和水。
为了眼科使用，可用或不用防腐剂例如苯扎氯铵，将药物组合物配制为在等渗pH调节无菌盐水中的微粉化悬浮液，或特别是等渗pH调节无菌盐水中的溶液。或者，为了眼科使用，可将药物组合物配制为药膏，例如凡士林。
也可通过鼻用气化喷雾剂或吸入施用药物组合物。根据制药领域中众所周知的技术制备这种组合物并且采用苄醇或其它适合的防腐剂、提高生物利用率的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂制备成盐水中的溶液。
可将用所述化合物配制成单位剂型。术语“单位剂型”指适合作为受试者的单位剂量的物理分立单位，每单位含有经计算产生预期疗效的预定量的活性物质，任选地与适合的药物载体结合。单位剂型可作单次日剂量或多次日剂量(例如，每日约1-4次或更多次)的其中一次。当使用多次日剂量时，对于每次剂量的单位剂型可相同或不同。
V.具体实施方案
实施例1：XRPD、C13固态NMR、DSC测定的通用方法
热重分析(TGA)
使用TA Instruments TGA型号Q500Asset Tag V014840进行热重分析(TGA)。将固体样品置于铂样品盘上且以10℃/min从室温加热至300℃。
DSC测定
使用TA Instruments DSC Q200Asset Tag V015553进行示差扫描量热法(DSC)。将约1-2mg固体样品放入具有带针孔的波纹盖的铝的密封DSC盘。通常在氮气净化气氛中加热样品池。
SSNMR实验
使用安装Bruker-Biospin 4mm HFX探头的Bruker-Biospin 400MHz Advance III宽孔发光光度计获取固态核磁共振光谱测定(SSNMR)的光谱。将样品填充入4mm ZrO2转子(约70mg或以下，视样品可利用性而定)。典型地施加魔角自旋(Magic angle spinning)(MAS)速度为12.5kHz。将探头温度设定在275K以便将自旋过程中的摩擦生热效应减少到最低限度。使用1H MAS T1饱和恢复驰豫实验测量质子驰豫时间，以便设定13C交叉极化(CP)MAS实验的适当的再循环延迟。将13C CPMAS实验的再循环延迟调整至至少1.2倍于测量的1HT1驰豫时间，以便将碳谱信躁比最大化。将13C CPMAS实验的CP接触时间设定在2ms。使用带有线性斜坡电压(50％-100％)的CP质子脉冲。使用外部参比样品(甘氨酸)优化Hartmann-Hahn匹配。使用质子解偶的MAS设置获取氟光谱，其中再循环延迟设定在约5倍于测量的19FT1驰豫时间。使用质子解偶的19F MAS T1饱和恢复驰豫实验测定氟驰豫时间。使用SPINAL64解偶与约100kHz场强获取碳和氟光谱。将化学位移参比其设定在29.5ppm的高磁场的金刚烷外标。
Bruker D8 Discover XRPD实验细节
使用安装密封管源和Hi-Star平面检测器(Bruker AXS,Madison,WI)的BrukerD8Discover衍射计(Asset Tag V012842)在室温下以反射模式获取XRPD图案。X-射线发生器在40kV电压和35mA电流下操作。将粉末样品放入铝支持器。各自使用120s暴露时间登记两个框架。随后将数据在4.5°-39°2θ范围内与步长0.02°积分并且合并成一个连续图案。
实施例2：化合物(1)和化合物(1)的2-MeTHF溶剂合物的制备
例如，可以根据WO 2010/148197制备无定形游离碱化合物(1)，然后进行常规的手性分离和纯化：使用包括Et2NH(生成化合物(1)的Et2NH盐)的改性剂进行SCF手性色谱法，且然后进行离子交换树脂处理。其XRPD数据如图11中所示。或者，可以硅胶下列方法制备作为2-MeTHF溶剂合物的化合物(1)：
化合物2a(2-氨基-3-溴-5-氟吡啶)的制备
在14℃向2-氨基-5-氟吡啶(6kg,53.6mol)在水(24L)中的淤浆中加入48％氢溴酸(18.5kg,110mol)，历时10分钟。该反应放热，温度升至24℃。将该化合物再冷却至12℃，然后分9部分加入溴(9kg,56.3mol)，历时50分钟(放热，保持在20℃)。将该混合物在22℃搅拌过夜，通过1HNMR监测猝灭的等分试样(5滴猝灭入1ml 20％K2CO3、0.3ml 10％Na2S2O3和0.7ml DCM的混合物。蒸发有机层，测定)。将该混合物冷却至10℃，然后通过添加亚硫酸氢钠(560g,5.4mol)的水(2L)溶液猝灭，再冷却至0℃。将该混合物加入到冷的(-4℃)DCM(18L)和5.4M氢氧化钠(35L,189mol)混合物中。通过硅藻土垫过滤底部的～35L，然后形成相破裂。用DCM(10L)再萃取水层。通过3kg酸式硅酸镁垫过滤有机层，用DCM(8L)洗涤。蒸发滤液，与己烷一起研磨，过滤。
尽管在方法的测定中显示97％完成，但是来自所有4次运行的这种起始产物典型地包含～10％SM。合并它们，在50℃在己烷中研磨(2L/kg材料)，然后冷却至15℃，过滤，得到化合物2a(30.0kg,～95％纯度,149mol,67％)。对来自起始研磨和再纯化的母液进行色谱(20kg硅胶，洗脱液25-50％EtOAc的己烷溶液)，又得到化合物2a(4.7kg,～99％纯度,24.4mol,11％)。
化合物3a的制备
向惰性400-L反应器中装入化合物2a(27.5kg,96％纯度,138mol)、Pd(PPh3)4(1044g,0.90mol)和CuI(165g,0.87mol)，然后装入甲苯(90kg)。用3次真空-氮气循环给该混合物脱氧，然后加入三乙胺(19.0kg,188mol)。用一次以上真空-氮气循环给该混合物脱氧，然后加入TMS-乙炔(16.5kg,168mol)。将该混合物加热至48℃23小时(最初放热需要温度达到53℃最大值)，然后冷却至18℃。通过硅藻土垫过滤淤浆，用甲苯(80kg)洗涤。用12％Na2HPO4(75L)洗涤滤液，然后通过硅胶垫(25kg)过滤，用1：1己烷：MTBE(120L)洗涤。将该滤液蒸发至得到棕色油状物，然后溶于NMP，用于下一步。化合物3a的溶液重量-58kg,～50wt％、138mol,100％.1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.90(s,1H)；7.33-7.27(m,1H)；4.92(s,NH2),0.28(s,9H)ppm.
化合物4a的制备
向惰性400-L反应器中装入叔丁醇钾(17.5kg,156mol)和NMP(45kg)。将该混合物加热至54℃，然后加入化合物3a(29kg,138mol)在NMP(38kg)中的溶液，历时2.75小时，用NMP(6kg)冲洗(放热，维持在70-77℃)。将该反应体系在74℃搅拌2小时，然后冷却至30℃，加入甲苯磺酰氯(28.5kg,150mol)在NMP(30kg)中的溶液，历时1.5小时，用NMP(4kg)冲洗。反应放热，维持在30-43℃。将该反应体系搅拌1小时，同时冷却至20℃，然后加入水(220L)，历时35分钟(放热，维持在18-23℃)。将该混合物在20℃搅拌30分钟，然后过滤，用水(100L)洗涤。用DCM(250kg)从滤器中过滤出固体，与残留水分离，通过酸式硅酸镁(15kg,上部)和硅胶(15kg,下部)垫过滤有机层，再用DCM(280kg)洗涤。浓缩滤液至得到浓稠淤浆(～50L体积)，然后加入MTBE(30kg)，同时持续以恒定体积蒸馏(最终蒸馏物温度为51℃)。再加入MTBE(10kg)，将该淤浆冷却至15℃，过滤，用MTBE(40L)洗涤，得到化合物4a(19.13kg,95％纯度,62.6mol,45％)。部分浓缩滤液，得到第二批(2.55kg,91％纯度,8.0mol,6％)。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.28-8.27(m,1H)；8.06-8.02(m,2H)；7.77(d,J＝4.0Hz,1H)；7.54-7.50(m,1H)；7.28-7.26(m,2H)；6.56(d,J＝4.0Hz,1H)；2.37(s,3H)ppm.
化合物5a的制备
在15℃向N-溴琥珀酰亚胺(14.16kg,79.6mol)在DCM(30kg)中的淤浆中加入化合物4a(19.13kg,95％纯度和2.86kg,91％纯度,71.6mol)在DCM(115kg)中的溶液，用DCM(20kg)冲洗。将该混合物在25℃搅拌18小时，然后冷却至9℃，通过添加硫代硫酸钠溶液(400g)和50％氢氧化钠(9.1kg)水(130L)溶液猝灭。将该混合物温热至20℃，分离各层，用12％盐水(40L)洗涤有机层。依次用DCM(4×50kg)再萃取水层。合并有机层，蒸馏40L与水共沸，然后通过硅胶(15kg,底部)和酸式硬脂酸镁(15kg,上部)垫过滤该溶液，用DCM(180kg)洗涤。浓缩氯至得到浓稠淤浆(～32L体积)，然后加入己烷(15kg)。在加入己烷(15kg)，同时以恒定体积持续蒸馏(最终蒸馏物温度52℃)。将该淤浆冷却至16℃，过滤，用己烷(25kg)洗涤，得到化合物化合物5a(25.6kg,69.3mol,97％)。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.34-8.33(m,1H)；8.07(d,J＝8.2Hz,2H)；7.85(s,1H)；7.52-7.49(m,1H)；7.32-7.28(m,2H)；2.40(s,3H)ppm.
化合物6a的制备：BEFTAI反应
向惰性400-L反应器中装入化合物5a(25.6kg,69.3mol)、双(频哪醇合)二硼(19kg,74.8mol)、乙酸钾(19kg,194mol)、乙酸钯(156g,0.69mol)和三苯膦(564g,2.15mol)，然后加入二噁烷(172kg)，使用真空-氮气循环分别脱氧(x3)。搅拌该混合物，使用真空-氮气循环脱氧(x2)，然后加热至100℃15小时。将该混合物冷却至35℃，然后过滤，用30℃THF(75kg)洗涤。蒸发滤液，将残余物溶于DCM(～90L)。将该溶液与1kg碳和2kg酸式硅酸镁一起搅拌45分钟，然后通过硅胶(22kg,下部)和酸式硬脂酸镁(10kg,上部)垫过滤，用DCM(160kg)洗涤。浓缩滤液至得到浓稠淤浆(～40L体积)，然后在35℃研磨，加入己烷(26kg)。将该淤浆冷却至20℃，过滤，用DCM(5.3kg)和己烷(15kg)、然后用己烷(15kg)洗涤，在氮气气氛中在滤器上干燥，得到化合物6a(23.31kg,56.0mol,81％)，为白色固体。1H-NMR与期望的产物一致，HPLC 99.5％,钯测定2ppm。1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.25(s,1H)；8.18(s,1H)；8.09-8.02(m,2H)；7.91-7.83(m,1H)；7.30-7.23(m,2H)；2.39(s,3H)；1.38(s,12H)ppm.
化合物8a和9a的制备
化合物8a：将酸酐7a(24.6kgs,Apex)和奎宁(49.2kgs,Buchler)加入到反应器中，然后添加无水PhMe(795.1kgs)。然后将反应器冷却至-16℃，以维持内部反应器温度<-12℃的速率加入EtOH(无水,41.4kgs)。对于本实验记录的最高反应温度为-16℃。然后将该反应混合物在-16℃搅拌16h。取出样品，过滤。干燥固体，通过1H-NMR评价，其显示无酸酐保留。过滤反应器的内容物。用PhMe(无水,20kgs)洗涤反应器和随后的湿滤饼。将得到的固体在<45℃与N2吹扫下置于盘式干燥器至少48h。在本实验中，实际温度为44℃，真空为-30inHG。2.5d干燥后对物质采样，通过NMR显示3％PhMe。再经过8hrs后，分析的PhMe的amt显示存在相同的3％PhMe且干燥终止。白色固体的重量为57.7kgs,76％收率。1H-NMR显示与结构一致且手性SFC分析显示物质>99％ee。
化合物9a：向反应器中装入奎宁盐8a(57.7kgs)和PhMe(250.5kgs,Aldrich ACS级,>99.5％)，启动搅拌器。将内容物冷却至<15℃，用6N HCl处理(用21.4kgs浓HCl处理18kgs H2O)，同时保持温度<25℃。将该混合物搅拌40min，目视检查验证无固体存在。停止搅拌，使各相沉降，分离各相。再用PhMe(160kgs；典型地尽可能少地使用，计算值为43kgs)萃取水相。然而，为因小体积而有效地搅拌，再加入PhMe。合并有机相。对有机相采样，运行HPLC分析以确保存在产物；仅为了试验信息。
向冷却至<5℃(0-5℃)的有机相中加入硫酸钠(无水,53.1kgs)，搅拌8hrs(在这种情况中为12hrs)。使包含有机相的反应器的内容物通过包含硫酸钠(31kgs,无水)的滤器，并且进入清洁和干燥的反应器。用PhMe(57.4kgs)冲洗反应器，通过滤器进入反应器201。启动搅拌器，再加入一定量的PhMe(44kgs)，将该反应混合物冷却至-20℃。在该温度下，加入叔戊醇钾的PhMe溶液，历时2h，同时保持温度在-15--22℃。将该反应混合物保持在约-20℃，再经过30min，然后采样。通过取出等分试样，即刻猝灭入6N HCl进行采样。此处的目标比为96：4(反式：顺式)。
由于得到目标比，所以向反应器中装入乙酸(2.8kgs)，历时6min。温度停留在-20℃。然后将温度调整至-5℃，加入2N HCl水溶液(用15.4kgs浓HCl处理65.7kgs水)。将内容物温热至5℃+/-5℃，搅拌45min，然后温热至20℃+/-5℃，同时搅拌15min。使搅拌器停止，使各相沉降。取出水层(暂时拿着)。用水(48kgs,适合饮用的)洗涤有机相，搅拌15min，使各相沉降(至少15min)，取出水层，加入到水层中。向有机相中加入制备的1/3缓冲溶液(50L)(7.9kgsNaH2PO4、1.3kgs Na2HPO4和143.6kgs水)，搅拌至少15min。停止搅拌，使各相分离至少15min。弃去下层。另一部分缓冲溶液(50L)用于洗涤如上所述的有机层。如上所述进行第3次洗涤。
在42℃/-13.9psig开始真空蒸馏PhMe相(150L)，蒸馏至得到约20L体积油状物。在体积大量减少后，将该混合物转入较小容器以完成蒸馏。加入庚烷(13.7kgs)，将该混合物温热至40+/-5℃30min，然后将内容物冷却至0-5℃，历时1.5h。过滤固体，用约14kgs冷(0-5℃)庚烷洗涤反应器。真空干燥固体。然在<40℃后放入在室内真空气氛(-28psig)下的烘箱至LOD是<1％。15.3kgs,64％,96％HPLC纯度。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.45(br.s,1H),6.41(t,J＝7.2Hz,1H),6.25(t,J＝7.2Hz,1H),4.18(m,2H),3.27(m,1H),3.03(m,1H),2.95(m,1H),2.77(m,1H),1.68(m,1H),1.49(m,1H),1.25(t,J＝7.2Hz),1.12(m,1H).
化合物10a的制备
在氮气气氛中向安装机械搅拌器、温度探头、回流冷凝器、加液漏斗和氮气入口的3颈烧瓶中装入化合物9a(145.0g,1当量)和无水甲苯(Aldrich,目录#244511)(1408g,1655ml)。然后分次向搅拌的溶液中加入三乙胺(Aldrich,目录号#471283)(140g,193ml,2.14当量)，历时5分钟，在此过程中，观察到放热至最高温度为27℃。开始通过ReactIR获取数据。然后将该反应混合物加热至95℃，历时70分钟。然后用加液漏斗分次加入二苯基磷酰基叠氮化物(Aldrich,目录#178756)(176.2g；138.0ml,0.99当量)，历时总时间为2.25小时。
在添加二苯基磷酰基叠氮化物完成后(用少量甲苯洗涤加液漏斗)，将得到的混合物在96℃再加热50分钟。通过GC/MS分析用甲苯稀释的反应混合物样品，显示二苯基磷酰基叠氮化物耗尽。然后用加液漏斗加入苄醇(Aldrich,目录#108006)(69.9g,67.0ml,1.0当量)，历时5-10分钟。然后将得到的混合物在97℃加热过夜(约19小时)。通过GC/MS显示用稀释的反应混合物样品形成产物(m/e＝330)。然后将该反应混合物冷却至21℃，此后，分次加入水(870g,870ml)(观察到适度放热至最高温度为22℃)。通过添加500g水首先使反应混合物猝灭，机械搅拌10分钟。然后将该混合物转入包含其余370g水的分液漏斗，然后手动搅拌。在搅拌和相分离后，分离有机层和水层(在pH～10时切下水层)。然后再用部分水(870g；1×870ml)洗涤有机层。分离有机层和水层(在pH～10切下水层)。然后减压浓缩采集的有机相至干(水浴，在45-50℃)，得到215g粗化合物10a(约190ml体积)。1H NMR和GC/MS与化合物10a一致(含有残留的甲苯和苄醇)。
化合物11a的制备
乙醇制备中的HCl：在氮气气氛中向安装温度探头、氮气入口和磁搅拌器的3颈烧瓶中装入乙醇(1000ml,773g)。搅拌该溶液，用干冰/丙酮浴冷却至达到内部温度为-12℃。然后使无水HCl(～80g,2.19moles)在冷却的溶液中缓慢地起泡(观察到温度在添加观察中从-24至-6℃)，历时2小时。添加后，将该溶液转入玻璃瓶，温热至环境温度。将溶液样品进行滴定，得到2.6M浓度。然后将该溶液储存在冷室温(约5℃)内过夜。
氢化/HCl盐形成：在氮气气氛中经连接至2加仑Parr高压反应器的玻璃***物装入披钯碳(Pd/C(Aldrich,目录#330108),10％干基；(50％湿),13.11g,0.01当量，以化合物10a为基础)，用乙醇(93g；120ml)湿润。然后向玻璃***物中加入粗化合物10a(212g,1eq)在乙醇(1246g；1600ml)中的溶液(用乙醇少量冲洗以辅助转入)。将玻璃***物放入高压反应器，此后加入HCl的乙醇溶液(如上所述制备；2.6M；1.04当量，基于化合物10a；223g；259ml)。密封高压反应器，然后用氢气净化(3×20psi)。然后在氢气施加压力下(15psi)启动氢化3小时，此时，氢的压力出现恒定。通过1H NMR和GC/MS分析反应混合物的等分试样显示原料耗尽/产物形成。然后用硅藻土床(192g)过滤得到的混合物，此后，再用乙醇(3x；在洗涤过程中总计使用1176g乙醇)洗涤硅藻土床。然后减压浓缩(水浴，在45℃)滤液(绿色)至～382g(～435ml)；2.9体积，基于化合物11a的理论数据收率。然后乙酸异丙酯(1539g；1813ml(12体积，基于化合物11a的理论收率))，加入到其余部分中。使用温度逐步增加真空蒸馏得到的溶液。
停止蒸馏。此后，使其余的溶液(370g,～365ml总体积；浅棕色)在环境温度静置1个周末。过滤该混合物(乙酸异丙酯用于辅助过滤)，再用乙酸异丙酯(2x116ml；各自用约100g洗涤)洗涤采集的固体。然后在40℃真空干燥固体(最高观察到的温度为42℃)过夜，得到118g(78.1％，2步内)化合物11a。该物质的1H NMR与化合物11a的结构一致且GC/MS显示99％纯度。
化合物13a的制备
方法A：用CH2Cl2(169mL)处理5-氟-2,4-二氯嘧啶(12a,39.3g,235mmol,1.1当量)和HCl胺盐(11a,50g,214mmol)的混合物，将该混合物温热至30℃。然后通过注射器泵缓慢地用DIEA(60.8g,82mL,471mmol,2.2当量)处理该混合物，历时3h。峰值温度达到32℃。将该反应体系搅拌20h，通过HPLC判定反应混合物完全，冷却至rt。依次用水(211mL,pH＝8-9)、5％NaHSO4(211mL,pH＝1-2)、然后5％NaCl水溶液(211mL,pH＝5-6)洗涤得到的反应混合物。
然后将有机相减压蒸馏至190mL。装入PhMe(422mL)，将温度设定在70-80℃和内部温度在60-65℃，直到体积恢复至190mL。将该混合物冷却至约37℃，同时搅拌，约10min后，结晶开始发生，观察到温度增加至约41℃。在37℃平衡后，向该混悬液中加入正-庚烷(421mL)，历时3.5h，然后冷却至22℃，历时1h。将该混合物在该温度下搅拌，然后过滤。用10％PhMe的正-庚烷溶液(2x210mL)洗涤滤器上得到的固体。然后在烘箱中与N2吹扫下在50℃真空干燥固体过夜。得到的固体称重为62g(88％收率)。
方法B：在氮气气氛中向按照机械搅拌器、温度探头、回流冷凝器、氮气入口和加液漏斗的3颈烧瓶中装入化合物11a(51.2g)和化合物12a(40.2g)。加入二氯甲烷(173ml,230g)，搅拌得到的混合物，同时温热至内部温度为30℃。然后用加液漏斗缓慢地加入N,N-二异丙基乙胺(85ml,63.09g)，历时2.5-3小时，在此过程中，放热至观察到的最高温度为33.5℃。在添加完成后，将得到的溶液在30-31℃在氮气气氛中搅拌过夜(约19小时)。
用二氯甲烷将该反应混合物的100μl样品稀释至总体积为10ml，充分混合该溶液。通过GC/MS分析稀释等分试样的样品，通过GC/MS显示反应完成；观察到产物形成(m/e＝328))。将该反应混合物冷却至26℃，转入分液漏斗(用二氯甲烷辅助)。然后依次用水(211ml,211g；切下水相的pH为～8；用切下的水层转移少量切下的层(raglayer))、5％NaHSO4水溶液((使用50g一水合硫酸氢钠(Aldrich目录#233714)和950g水制备)211ml,216g；切下水层的pH为～2)、然后用(使用50g氯化钠(Aldrich目录#S9888)和950g水)制备的5％NaCl水溶液(211ml,215g；切下的水层的pH为～4-5)洗涤该混合物。然后减压浓缩采集的有机相(水浴，在35℃)至～190ml(2.7体积，基于化合物13a的理论收率，此后，加入甲苯(Aldrich目录#179418,422ml,361g)。减压浓缩得到的混合物(水浴，在55-65℃)至～190ml(2.7体积，基于化合物13a的理论收率)。在该阶段通过1H NMR分析溶液样品显示不存在二氯甲烷。将其余的混合物冷却至37℃(使用水浴，在37℃，用旋转蒸发与搅拌)。在此过程中，观察到显著的结晶。然后机械搅拌该混合物，加热至约37℃(外部热源设定至38℃)，此后，通过加液漏斗缓慢地加入正-庚烷(430ml,288g；Aldrich目录#H2198)，历时3小时。在添加后，停止加热，机械搅拌得到的淤浆，同时冷却至环境温度过夜。然后过滤得到的混合物，用10％甲苯的正-庚烷溶液(2×210ml；各自通过混合21ml(16g)甲苯和189ml(132g)正-庚烷制备洗涤液)洗涤采集的固体。施加真空，直到几乎不再观察到滤液。然后在50℃在氮气流气氛中进一步真空干燥固体至恒重(3.5小时)，得到64.7g(90％)化合物13a。通过1HNMR对固体样品进行分析显示该物质与结构一致且LC分析显示使用提供的LC方法的纯度为99.8％。
化合物14a的制备
将乙酯13a(85g,259mmol)溶于THF(340mL)，用LiOH溶液(2M,389mL,778mmol)处理，历时10min(温度从21至24℃)。将该混合物温热至45℃，同时搅拌17h，此时，通过HPLC判定反应完成(未观察到SM)。将该反应混合物冷却至rt，加入CH2Cl2(425mL)。然后缓慢地加入柠檬酸溶液(2M,400mL)，历时45min(温度达到26℃)。注意，在添加过程中，发现一些白色固体，但在搅拌下快速溶解。将该反应混合物再搅拌15min，然后使各相分离。在各相分离后，测定水相的pH为pH＝4.0。用水(255mL)洗涤有机相(15min搅拌)，使各相分离。然后将包含期望的产物的下层(有机层)储存在冷藏箱内过夜。
减压浓缩有机相(罐设定至65℃)至约150mL(est.1.76vol wrt SM)。加入IPA(510mL)，减压蒸馏(85℃冷却器温度设置)至255mL(3vol)。通过添加IPA(298mL)使溶剂水平达到约553mL(6.5vol)。然后加入水(16mL)，将该反应混合物温热至回流(77℃)，同时良好搅拌，在容器壁上沉淀的固体溶解。然后将反应混合物缓慢地冷却至65℃(历时60min)，保持-全部物质仍然在溶液中(取出样品用于残留溶剂分析)。将该反应体系再冷却至60℃，该反应混合物出现适度不透明。搅拌15min后，再冷却至55℃。尽管更多产物沉淀，但是该混合物仍然稀薄且易于搅拌。极缓慢地加入水(808mL)(2.5-3hrs)，同时维持温度约为55℃。然后将该混合物冷却至22℃，历时2h，搅拌过夜。然后过滤物质，用水：IPA的混合物(75：25,2x255mL)洗涤。在55℃在真空烘箱中干燥酸过夜。得到69g酸14a,88％收率，白色固体。通过HPLC分析的该物质>99％纯度。
化合物15a的制备：Suzuki偶合
向14a(91.4g,305mmol)、6a(158.6g,381mmol,1.25当量.)、Pd(OAc)2(0.34g,1.5mmol,0.5mol％)、X-Phos(1.45g,3.0mmol,1.0mol％)和K2CO3(168.6g,1220mmol,4当量.)中加入THF(731mL,8个体积)和水(29mL,0.32vol)。用N2吹扫该反应混合物30min，然后温热至65-70℃，搅拌5h。该反应混合物的HPLC分析显示99.3％转化率。将该反应混合物冷却至22-25℃，加入水。搅拌该混合物，使各相分离，滗析水相。向有机相中加入18wt％NaCl水溶液(半饱和NaCl水溶液)，使用2N HCl将该混合物的pH调整至6.0-6.5。使各相分离，滗析水相。浓缩有机相至小体积，加入乙腈。重复该过程1次，加入乙腈至最终体积至910mL(10vol)。将该淤浆温热至80-85℃6h，然后冷却至20-25℃。将该淤浆搅拌2h，然后过滤。用乙腈冲洗固体，得到15a(161g,89％收率)。
化合物(1)的制备：脱甲苯磺酰化步骤
向15a(25g,45.2mmol)中加入THF(125ml,5vol)，然后加入MP-TMT树脂(6.25g,25wt％)。将该混合物在20-25℃搅拌16h，过滤，用1vol THF冲洗。重复树脂处理过程和过滤。将THF溶液浓缩至5vol。在22-25℃向该混合物中加入2M LiOH水溶液(90.3mL,4当量)。将该反应混合物温热至40-45℃，搅拌5h。HPLC分析显示99.7％转化率。将该反应混合物冷却至22-25℃，加入MTBE(50mL,2vol)。发生相分离。采集下部的水相。用MTBE萃取水相。采集下部的水相。向水相中加入2-MeTHF，搅拌该混合物。将该混合物的pH调整至6.0-6.5，滗析下部水相。用pH 6.5红花草药洗涤有机相。将有机相浓缩至85mL，用2-MeTHF(150mL)稀释，浓缩至180mL最终体积。将得到的淤浆温热至70-75℃，搅拌至完全溶解，然后冷却至45-50℃，得到淤浆。将淤浆搅拌1h，然后加入庚烷(180mL)。将该淤浆冷却至20-25℃，历时1h，搅拌16h。过滤该批量，用庚烷冲洗固体。干燥固体，得到粗化合物(1)·2-MeTHF溶剂合物,79％收率。
实施例3：化合物(1)的HCl盐的多晶型物的形成
3A:化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的制备
通过在水和有机溶剂的混合物中混合化合物(1)的2-甲基四氢呋喃(2-MeTHF)溶剂合物(1当量)(化合物(1)·1(2-MeTHF))与氯化氢制备化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A，其中水和有机溶剂的混合物具有0.05-0.85的水活度。将所用的具体反应条件概括在下表1中：
表1：用于制备化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的反应条件
*2步：iPrOH/AcOH，然后在丙酮/水中再搅拌成淤浆。
或者，还通过下列方法制备化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A：方法A：将化合物(1)·2-MeTHF(953g,2.39mol)放入30L加套的反应器，用IPA(15L)和水(0.57L)处理。开启搅拌器，将该反应混合物温热至73℃，使每种物质形成溶液，然后冷却至50-55℃。在50-55℃，用新鲜制备的HCl的IPA溶液(0.83M,4.34L)通过缓慢添加处理该反应混合物，历时4h。应注意，在大约1/2处的点，混合物开始变稠。采样反应体系，以便通过XRPD检查正确的形式。添加后，使冷却器按照程序在搅拌下变速至0℃，历时480min。通过XRPD分析证实形式后，将淤浆分入两个滤器。用3L IPA洗涤反应器，用来自反应器的IPA冲洗液的～1.5L IPA洗涤每种滤饼。将滤饼使用抽真空风干过夜。然后将滤饼放入盘式干燥器，在真空与N2净化气氛中(22inHg)24h，无加热。残留溶剂和水分析显示505ppm IPA、8ppm 2-Me-THF和约2.15％H2O。从烘箱中取出物质，共研磨以打碎团快，得到805g化合物(1)的HCl盐·1/2H2O。方法B：或者，使用丙酮替代IPA，但按照与如上所述方法A中类似的方式进行，形成化合物(1)的HCl盐·1/2H2O。
化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的XRPD和C13SSNMR数据分别如图1和2中所示。将一些观察到的XRPD峰和C13SSNMR峰分别概括在表2和3中。
表2：化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的XRPD峰
XRPD峰 角(2-θ±0.2) 强度％
1 10.5 100.0
2 5.2 71.6
3 7.4 46.8
4 18.9 42.0
5 25.2 41.7
6 16.5 39.5
7 18.1 28.1
8 23.0 27.5
9 24.1 25.3
10 20.2 21.6
11 26.4 21.3
12 15.8 19.8
13 21.8 18.3
14 13.8 17.6
15 27.4 17.3
16 29.0 16.7
17 14.8 15.0
18 32.0 15.0
19 25.7 13.8
20 28.6 13.4
21 33.8 13.0
22 12.8 12.0
23 30.8 11.7
24 32.4 11.6
25 24.5 11.5
26 23.4 11.1
27 21.0 10.4
表3：化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的C13SSNMR峰
峰# 化学位移[±3ppm] 强度[rel]
1 180.1 50.4
2 157.9 9.1
3 154.6 26.4
4 150.7 25.3
5 144.9 31.0
6 140.1 6.7
7 132.4 36.3
8 131.2 30.0
9 129.0 21.0
10 117.5 33.6
11 114.0 38.0
12 107.0 34.4
13 54.8 42.0
14 47.7 52.7
15 29.2 100.0
16 24.6 74.0
17 22.1 83.6
发现制备的化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A在如下溶剂***中是稳定的(但不限于)：氯苯、环己烷、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、己烷,2-甲氧基乙醇、甲基丁基酮、甲基环己烷,硝基甲烷、四氢萘、二甲苯、甲苯、1,1,2-三氯乙烷、丙酮、茴香醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、枯烯、乙醇、乙酸乙酯、***、甲酸乙酯、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-丙醇、1-戊醇、2-丙醇、乙酸丙酯、四氢呋喃、甲基四氢呋喃。
具体地，为了化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的溶解度和稳定性试验，使化合物的样品与500μl溶剂载入2mL HPLC小瓶。将该混合物在环境温度搅拌2周，然后通过离心过滤，通过XRPD分析得到的固体，通过定量NMR对氢醌标准品分析溶液的溶解度。将结果概括在表4中。
表4：化合物(1)的HCl盐的形式A的形式和溶解度数据概述
通过将样品放入铂样品盘并且通过以10℃/min从室温加热至300℃得到热分析图数据(数据未显示)。热分析图数据显示30°-170℃重量减轻为2.1％，与半水合物理论值(2.0％)一致。
通过10℃/min将样品从室温加热至300℃得到DSC热分析图数据(数据未显示)。DSC热分析图数据显示50-100℃的脱水启动温度，然后是200-260℃的开始熔化/分解温度。
3B:化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的制备
通过将化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A在异-丙醇和水或丙酮和水或水(具有等于或大于0.9的水活度)中搅拌成淤浆制备化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F。
例如，将100mg化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A在5mL水活度为0.9的异-丙醇/水或丙酮/水中的淤浆在环境温度搅拌过夜。滗析上清液，将得到的固体物质适度风干，得到化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F固体物质。
化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的XRPD和C13SSNMR数据分别如图3和4中所示。将一些观察到的XRPD峰和C13SSNMR峰分别概括在表5和6中。
表5：化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式的F的XRPD峰
表6：化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的C13SSNMR峰
通过将样品以2℃/min从-20℃加热至350℃得到MDSC热分析图数据(数据未显示)并且每隔60秒调节±1℃。MDSC热分析图数据显示低于150℃脱水，熔化并且在150℃-200℃重结晶，且高于250℃降解。
还对该形式进行热重分析(TGA)。热分析图显示至多125℃重量减轻12％，接近三水合物理论值(11％)。通过TGA-MS显示第二步低于200℃的重量减轻，为HCl的损耗。熔化/分解开启在约270-290℃。
3C:化合物(1)HCl盐的形式D的制备
一般通过使化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A脱水制备化合物(1)的HCl盐的无水形式D。脱水可以通过加热或干氮气净化或两者的组合进行。例如，用热板加热2mg化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A，在约85℃生成期望的无水形式D。
化合物(1)的HCl盐的无水形式D的XRPD和C13SSNMR数据分别如图5和6中所示。将一些观察到的XRPD峰和C13SSNMR峰分别概括在表7和8中。
表7：化合物(1)的无水HCl盐的形式D的XRPD峰
XRPD峰 角(2-θ±0.2) 强度％
1 5.3 100.0
2 10.5 56.0
3 15.9 49.2
4 25.9 30.5
5 21.0 24.6
6 26.5 24.1
7 5.8 22.6
8 7.4 21.7
9 19.0 17.4
10 16.6 17.2
11 25.3 16.1
12 24.7 16.0
13 29.4 15.5
14 13.8 14.6
15 20.3 14.5
16 32.0 14.4
17 19.5 12.4
18 28.6 12.4
19 17.1 11.5
20 30.3 11.4
21 27.5 11.0
22 27.0 10.7
23 23.7 10.4
24 28.0 10.2
25 21.6 10.1
表8：化合物(1)的无水HCl盐的形式D的C13SSNMR峰
3D:水活度试验
用水活度为0.0-0.8的异丙醇/水的化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F种晶的化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的竞争性淤浆研究显示，在环境条件下搅拌约2周后，在化合物(1)的无水HCl盐的形式D、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F和化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A中，形式A为最稳定形式。在IPA/水活度为0.9时，化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A被转化成化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F。将来自这些研究的结果概括在下表9中。
表9：对在IPA/水混合物中的化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的水活度试验
无水HCl盐化合物(1)的形式D("形式D")、化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F("形式F)和化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A("形式A")之间的变化中温度对水活度的相图如图12中所示。
3F:化合物(1)的无定形的HCl盐
通过在水和2-MeTHF中用1.05eq.NaOH处理化合物(1)的Me2NEt盐(1.985g)形成化合物(1)的无定形的HCl盐，然后用HCl处理以除去胺并且从水层(pH 2-3)中析出。浓缩得到的淤浆以除去任何有机物，然后过滤。用小部分水冲洗得到的固体，干燥。根据WO 2010/148197制备化合物(1)的Me2NEt盐，然后进行常规的手性分离和纯化：SCF手性色谱法，使用包括Me2NEt的改性剂(生成化合物(1)的Me2NEt盐)。
实施例4：游离碱化合物(1)的多晶型物的形成
4A:游离碱化合物(1)的形式A的制备
通过下列方法生产游离碱化合物(1)的形式A(即化合物(1)的形式A)：将粗无定形游离碱化合物(1)(约135g)转入4L加套的反应器，向反应器中装入乙醇(2.67L)和水(0.325L)(10％水溶液)。将该混合物加热至回流。向步骤2)得到的混合物中加入水(300mL)，制成20％水溶液。然后将得到的混合物冷却至55℃(速率＝-1℃/min)，随后保持30分钟。然后将化合物(1)游离碱的形式A的晶种(1.5g,3.756mmol)加入冷却的混合物，将得到的混合物保持30分钟，同时产物沉淀。通过将无定形游离碱化合物(1)(20mg)在硝基甲烷(0.5mL)中搅拌成淤浆生产化合物(1)游离碱的形式A的晶种。通过将无定形游离碱化合物(1)(900mg)在乙腈(10mL)中与使用硝基甲烷得到的晶种一起搅拌成淤浆生产另外的化合物(1)游离碱的形式A的晶种物质。向包含化合物(1)游离碱的形式A晶种的混合物中缓慢地加入水(795.0mL)，制成40％水溶液。将得到的混合物冷却缓慢地冷却至0℃(～-10℃/小时)，随后保持2小时。然后过滤固体物质，风干，然后在60℃在烘箱中再风干18小时。
或者，使用游离碱化合物(1)的2-甲基THF溶剂合物替代无定形游离碱化合物(1)，按照如上所述的类似方式也得到游离碱化合物(1)的形式A。
发现制备的化合物(1)的形式A在如下溶剂***中是稳定的(但不限于)：乙腈、氯苯、氯仿、环己烷、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、乙二醇、甲酰胺、己烷、甲基丁基酮、甲基环己烷、N-甲基吡咯烷酮、硝基甲烷、四氢萘、甲苯、1,1,2-三氯乙烷、乙酸、茴香醚、1-丁醇、乙酸丁酯、枯烯、乙酸乙酯、***、甲酸乙酯、庚烷、乙酸异丁酯,乙酸异丙酯、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、戊烷、乙酸丙酯、水、水-异-丙醇(1:3体积/体积)和水-乙腈(1:1体积/体积；1:3体积/体积)。
化合物(1)的形式A的XRPD和C13SSNMR数据分别如图7和8中所示。分别将一些观察到的XRPD峰和C13SSNMR峰概括在表10和11中。
表10：化合物(1)的形式A的XRPD峰
表11：化合物(1)的形式A的C13SSNMR峰
使用TA Instruments TGA型号Q500对产物化合物(1)的形式A进行热重分析(数据在本文中未显示)，通过将其样品置于铂样品盘上且随后以10℃/min将该盘从室温加热至300℃来进行。热分析图显示分解开始在约293℃。
化合物(1)的形式A的DSC热分析图也使用TA Instruments DSC Q200得到。将该形式的样品以10℃/min加热至350℃。DSC热分析图显示熔化温度约为278℃。
4B:游离碱化合物(1)的水合物的形式B的制备
游离碱化合物(1)的水化形式显示与游离碱化合物(1)的形式A为同晶型。当暴露于高湿度时，游离碱化合物(1)的形式A可以自由地转化成水化形式B，当湿度降低时，恢复。根据使用DSC实验测定的相变(数据未显示)，转变温度接近环境温度并且随水活度的不同而改变。例如，在环境温度下，观察到水化形式，其中水活度大于0.6，例如0.6-1.0。
4C:无定形游离碱化合物(1)的制备
Suzuki偶合通过将氯嘧啶、化合物13a、硼酸酯化合物6a、催化剂Pd(OAc)2和配体(X-Phos)溶于10vol 2-MeTHF进行偶合。将该混合物加热至65℃，以维持反应混合物在65℃的速率加入2vol 50％K3PO4水溶液。两个反应完全转化，然后冷却至20℃，通过硅藻土过滤。分离水层，弃去，用5％NaCl水溶液洗涤有机层，然或浓缩至干，各自得到约3.5kg深绿色糊状物。将粗油状物分成4个等份，与400g SiO2和500g Florisil一起搅拌成淤浆，通过2.3kgSiO2柱与庚烷/EtOAc(5：1-3：1,2L级分)洗脱，合并包含全部产物的级分。将这些级分浓缩至干，得到约2.9kg化合物21a。
将化合物21a溶于10vol(25L)CH3CN，用4eq.HCl(4.31L4N HCl的1,4-二噁烷溶液)在70℃处理15h。通过HPLC判定反应100％完成。将稀薄淤浆冷却至20℃，历时1h。以0.5L/min加入TBME(28L,11vol)，在添加结束时淤浆变成极为浓稠(凝胶状)。在4-5h搅拌后，该淤浆变成非常稀薄。通过抽滤采集得到的固体，用3×5L TBME洗涤，得到低密度滤饼，在N2流气氛中干燥3天，得到1.71kg(86％收率,98.9％AUC纯度)的化合物22a·HCl。
在20℃将NaOH溶液(55.60mL 2M,111.2mmol)加入到化合物22a·HCl(10g,22.23mmol)在2-MeTHF(100.00mL)中的混悬液中。将该反应混合物在60℃搅拌5h，然后再在67℃搅拌。约22小时搅拌后，将100mL(10vol)2-MeTHF加入到得到的混合物中。然后将该批量冷却至0℃。向得到的混合物中加入HCl以便将pH调整至pH6.6，产生粗游离碱化合物(1)。将在60mL(6vol)2-Me-THF中的粗物质加热至50℃。将50mL(5vol)正-庚烷加入到得到的混合物中，历时1小时。然后将该批量冷却至20℃。过滤固体产物，再通过柱色谱法(EtOAc/庚烷2：1-4：1)纯化固体产物。其XRPD数据显示无定形游离碱化合物(1)。
或者，在游离碱化合物(1)的形式A和选自2-乙氧基乙醇、2-甲氧基乙醇、叔丁基甲基醚、甲酸或甲基乙基酮的溶剂混合物中观察到无定形游离碱化合物(1)(例如，参见下表13)，在环境温度下搅拌。
4D:游离碱化合物(1)的2-MeTHF溶剂合物的制备
如上述实施例2中所述制备化合物(1)·1(2-MeTHF)。其XRPD数据如图10所示。将其XRPD数据概括在表12中。
表12：化合物(1)·1(2-MeTHF)的XRPD峰
XRPD峰 角(2-θ±0.2) 强度％
1 6.4 9.78
2 8.4 38.07
3 9.7 43.96
4 12.9 15.57
5 16.7 100
6 16.9 46.55
7 17.4 18.67
8 19.4 16.54
9 20.0 14.62
10 21.0 20.4
11 21.3 13.58
12 22.3 37.59
13 24.3 15.36
14 25.7 16.34
15 25.9 10.06
4F:游离碱化合物(1)的形式A和无定形化合物(1)在不同溶剂***中的溶解度和稳定性数据
在环境温度下按照与如上所述用于化合物(1)的HCl盐的形式A类似的方式测试游离碱化合物(1)形式A("形式A")和无定形化合物(1)("无定形")在不同溶剂***中的溶解度和稳定性。将得到的数据概括在表13中。
表13：游离碱化合物(1)的形式A("形式A")和无定形化合物(1)("无定形")的溶解度和稳定性数据
实施例5:化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的制备
化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A通过将无定形游离碱化合物(1)(500mg)和对-甲苯磺酸在乙腈(20ml)中搅拌成淤浆制备。将样品搅拌过夜。其XRPD数据如图9中所示。将一些观察到的该化合物的XRPD峰概括在表14中。
或者，可以按照与如上所述类似的方式，使用游离碱化合物(1)的2-甲基THF溶剂合物替代无定形游离碱化合物(1)以制备化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A。
表14：化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的XRPD峰
实施例6：化合物(1)的制剂
A.化合物(1)的片剂
组合物
化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A(下文简称为实施例6的化合物(1))用于片剂形成。全部赋形剂符合欧洲药典(European Pharmacopoeia)和USP/NF的最新专著标准并且购自经批准的供应商。
用于预制粒配混物和制粒粘合剂溶液的制剂组成和批量大小如表15A中所示。粘合剂溶液的批量大小包括100％过量用于泵校准和启动溶液管线。理论压制配混物组成也如表15A中所示。基于干燥颗粒的收率计算用于该批量的实际用量。薄膜包衣混悬液的组成和近似批量大小如表15B中所示且包括100％过量用于泵校准和启动混悬液管线。薄膜包衣层的目标用量占片剂重量的3.0％w/w。
表15A：化合物(1)的片剂的组成
表15B：薄膜衣混悬液组成和近似批量大小
粘合剂溶液制备
粘合剂溶液由聚维酮和水组成。基于最终颗粒中40％的含水量制备该溶液。因此，固体在溶液中的总量(聚维酮)为3.6％(w/w)。制备100％过量用于启动管线等。基于颗粒试验启动的视觉检查，制备最终颗粒中+/-2％(38-42％)水的另外的储备溶液。典型地，称重87.00g聚维酮K30和2320.00g纯(DI)水，在恒定搅拌下，将聚维酮K30加入包含DI水的容器。添加后，密封容器以便将蒸发减至最少，将该溶液搅拌至存在的全部固体完全溶解。
湿制粒法流程
通过下述方法进行湿法制粒：将过量(10％)的化合物(1)、Avicel PH-101、Fastflo乳糖和交联羧甲基纤维素钠称重(参见表15A)。将它们使用20目硬筛或安装813μm搓碎筛目的锥形磨(U5Quadro Co-mill)以1000rpm过筛。将过筛的物质放入单个的袋子或容器。然后将这些物质转入搅拌机，典型地以15rpm配混15分钟。使用带有4mm方孔筛的U5Quadro锥形磨以1000rpm研磨配混的物质。再次配混研磨的物质，重复配混步骤。然后将再配混的物质进料入双螺杆制粒机。使用重量损耗进料器(K-tron或类似物)将批量湿颗粒进料入制粒机。然后将得到的物质制粒。使用蠕动泵将粘合剂流体(参见表15A)注入双螺杆制粒机。溶液进料速率与粉末进料速率之比为0.4095。例如，如果粉末进料速率为15.00g/min，则溶液进料速率为0.4095*15.00＝6.14g/min，其中含水量为40％(基于干质量)。将颗粒子批量采集入预先配衡的干燥盘。将采集的物质均匀地喷在盘上，用烘箱干燥该物质，形成干燥颗粒。将干燥颗粒放入K-tron以连续研磨方式进料入锥形磨，随后研磨。
颗粒外配混和压制过程
通过下列方法进行颗粒外配混和压制过程：称重基于压制配混物组成的颗粒外赋形剂的量。使用带有32C筛和圆形棒叶轮的U5Comil以1000rpm将称重的赋形剂过筛。首先将研磨的化合物(1)颗粒加入到包含过筛的Avicel PH-102和Ac-Di-Sol的搅拌机中。将它们配混以16RPM8分钟。将硬脂酰钠(SSF)通过50目硬筛过筛入适合的容器。将约等于SSF质量的10倍的部分颗粒外配混物与SSF放入容器，袋配混30秒，然后将该混合物加入箱式搅拌机。然后将全部物质以16rpm配混2分钟。然后根据预备的片剂压制加工参数压制最终配混物。
薄膜包衣法
在Vector VPC 1355平底包衣锅中将薄膜包衣层作为15％w/w欧巴代II白#33G水性混悬液施加于片芯上。目标包衣层为具有2.5％-3.5％可接受范围的3.0％w/w片芯重。为了达到这一目标，喷雾相当于3.2％重量增加的包衣混悬液的量，得到3.0％包衣层，推定包衣效率为95％。
B.化合物(1)的静脉内(IV)制剂
将化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A(下文简称为实施例6的化合物(1))作为用于静脉内(IV)施用的2mg/mL溶液提供。将该溶液的组成与质量参比和每种成分的功能提供在表16A和16B中。
表16A：溶液赋形剂的组成a.
a用NaOH或HCl调整溶液的pH
表16B：化合物(1)静脉内溶液的组成a.
a用NaOH或HCl调整溶液的pH。溶液密度为1.000g/cm3。
b药物物质为半水合物HCl盐。基于活性无水游离碱当量计算药物物质的量，其中游离碱与半水合物HCl盐的转化因子为1.11。
实施例7：化合物(1)与或不与奥司他韦组合的体内测定
用赋形剂或增强剂量水平的化合物(1)的HCl盐·1/2H2O形式A与临床相关剂量的奥司他韦组合治疗感染小鼠，从48小时A型流感攻击后或B型流感攻击前2小时开始。
方法：在这些研究中，用包含0.5％(w/v)MC(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)的赋形剂配制化合物(1)的HCl盐半水合物的形式A(下文简称为实施例7的化合物(1))，得到均匀混悬液，且化合物剂量基于化合物(1)的HCl盐半水合物。蒸馏的去离子水配制奥司他韦，得到均匀混悬液。用包含0.5％(w/v)MC的赋形剂配制化合物(1)与奥司他韦的组合。在每次研究开始时制备组合制剂并且储存在4℃下至多10天，同时在暗处搅拌。将全部制剂和赋形剂通过口腔管饲法以10mL/kg的施用体积施用于小鼠。
用致死剂量的小鼠适应的流感病毒A/PR/8/34或B/Mass/3/66通过鼻内滴注麻醉和接种雄性Balb/c小鼠(5-7周，17-19克)。每个研究组登记8只小鼠。治疗在A型流感接种后+48小时或B型流感接种前2小时开始。在A型流感研究中，单独地或与10mg/kg奥司他韦组合地施用赋形剂(10mL/kg)和0.1-10mg/kg剂量的化合物(1)，口服(PO)，每日2次(BID)，持续10天。在B型流感研究中，单独地或与10mg/kg奥司他韦组合地施用赋形剂(10mL/kg)和1-10mg/kg剂量的化合物(1)，口服(PO)，每日2次(BID)，持续10天。给小鼠称重并且每日观察感染后21天的病态征候。此外，通过无限制的WBP(Buxco,Troy,NY)监测肺功能。
A型流感/PR/8/34(VR-1469)和B型流感/Mass/3/66(VR-523)得自ATCC(Manassas,VA)。通过本领域已知的标准方法制备储备溶液。简言之，使病毒以低感染复数在Madin-Darby犬肾细胞(MDCK细胞,CCL-34,ATCC)中传代，约48小时后收获上清液，并且以650xg离心10分钟。将病毒储备溶液冷冻在-80℃下至使用为止。在顺序稀释病毒样品、感染MDCK培养物和测定致细胞病变效应(CPE)复制后，基于96小时时ATP的含量通过Spearman-Karger方法计算病毒滴度(TCID50/ml)(CellTiter-Glo,Promega,Madison WI)。
使用两种方式ANOVA和Bonferroni事后检验分析体重数据以比较各组。将小于0.05的P-值视为具有显著性。
在感染后每日称重小鼠，持续21天。流感感染后每日观察小鼠，持续21天。认为评分为如下6种观察结果(>35％BW减轻、有褶饰边的皮毛、姿式弯成弓形、呼吸性窘迫、活动性减少或体温过低)的4种阳性的任意小鼠是垂死的，然后实施安乐死并且根据VertexInstitutional Animal Care和Use Committee建立的指导原则评分为死亡。使用KaplanMeier方法分析存活率数据。
对小鼠进行无限制WBP(Buxco,Troy,NY)。将肺功能表示为增强的停顿(Penh)，即反映出肺阻力的无单位计算值。该值衍生自作为动物呼吸型改变结果浮动的保持储存压力改变。动物气道的支气管收缩影响气流和由此的保持储存压力。在呼气(PEP)和吸气(PIP)过程中追踪压力的改变。根据公式Penh＝停顿x PEP/PIP计算Penh值，其中"停顿"反映出定时的呼气。使小鼠适应体积描记术室15分钟，然后在1分钟间隔采集数据，求10分钟内的平均值并且表示为绝对Penh值。使用两种方式ANOVA和Bonferroni事后检验分析数据以比较各组。将小于0.05的P-值视为具有显著性。
结果：评价化合物(1)与奥司他韦组合在流感肺部感染鼠模型中与单独的化合物(1)或奥司他韦相比在预防死亡率和发病率、减少BW减轻和预防和/或恢复肺功能中的能力。该组合显示与每种单独施用的药物相比对每种药物的效能没有有害影响。此外，联合治疗显示作为每种单独的化合物的失败剂量(分别为0.3和10mg/kg的化合物(1)和奥司他韦(Oselatamivir))在A型流感治疗中显示协同作用，此时合并增加的存活率从0达到100％。化合物(1)在体内对B型流感几乎没有活性(正如根据可得到的体外数据所预期的)且不干扰奥司他韦的有效性。
A型流感小鼠模型：全部赋形剂-治疗的对照组截至到第9或10天仍患病。当感染后+48小时施用时，与赋形剂对照组相比，以1、3和10mg/kg单独的化合物(1)BID治疗提供完全预防死亡，减少了BW减轻并且恢复了肺功能(表17)。当A型流感感染后+48小时开始治疗时，以单独施用的0.1和0.3mg/kg化合物(1)和10mg/kg奥司他韦治疗无法防止死亡、减少BW减轻或恢复肺功能。有意义地，A型流感感染后+48小时共同施用的0.3mg/kg化合物(1)和奥司他韦提供了完全防止死亡、减少BW减轻和恢复肺功能。
表17：A型流感感染后+48小时施用的化合物(1)与或不与奥司他韦的体内效能数据
B型流感小鼠模型：全部赋形剂-治疗的对照组截至到第7或8天时仍然患病。施用1、3或10mg/kg单独的化合物(1)-B型流感感染前2h和持续BID 10天与对照组相比没有提供对发病率、BW减轻或肺功能丧失的显著预防作用。以10mg/kg施用单独的奥司他韦或与1、3或10mg/kg化合物(1)组合-B型流感感染前2h提供了对死亡的完全预防、减少了BW减轻和恢复了肺功能(表18)。
表18：B型流感感染后+48小时施用的化合物(1)与或不与奥司他韦的体内效能数据
实施例8：化合物(1)与奥司他韦组合的体内测定
从使用5x103TCID50A/PR/8/34的A型流感攻击前24小时开始，用赋形剂或增强剂量水平的化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A(下文简称为实施例8的化合物(1))与扎那米韦的组合治疗感染小鼠。按照与如所述实施例7中所述类似的方式制备A型流感攻击和化合物(1)混悬液。在IN攻击与5x103TCID50A/PR/8/34前24小时以0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg IN(鼻内)扎那米韦治疗受攻击的小鼠，并且在使用5x103TCID50A/PR/8/34攻击前2小时开始，以0.1mg/kg、0.3mg/kg或1mg/kg BID 10天化合物(1)治疗受攻击的小鼠。
将结果概括在下表19A和19B中。如下表18A中所示，使用化合物(1)和扎那米韦联合疗法提供了额外的存活有益性(表19A)。将效能商数、存活率复合测量值、体重减轻和肺功能(％存活率/(在第8天时的％体重减轻)*(在第6天时的Penh))概括在表19B中。
表19A：存活率：化合物(1)与扎那米韦的联合疗法
表19B：效能商数：化合物(1)与扎那米韦的联合疗法
实施例9：化合物(1)在小鼠A型流感感染模型中的预防和感染后效能
材料和方法
动物：雌性18-20g BALB/c小鼠得自Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)用于抗病毒实验。将动物维持在标准啮齿动物食物上并且可随意饮自来水。在使用前将它们隔离48小时。
病毒：小鼠适应的A型流感/California/04/2009(pndH1N1)病毒得自ElenaGovorkova博士(St.Jude Children’s Research Hospital,Memphis,TN)。将病毒储备溶液在MDCK细胞中扩增，然后在BALB/c小鼠中进行致死率滴定。A型流感/Victoria/3/75(H3N2)病毒得自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas,VA)。使该病毒在小鼠中传代7次以使小鼠适应它，然后在MDCK细胞中传代1次。在BALB/c小鼠中进一步滴定该病毒的致死率，得到适当的致死攻击剂量。A型流感/Vietnam/1203/2004(H5N1)病毒得自疾病控制中心(Centers for Disease Control)的Jackie Katz博士(Atlanta,GA)。使小鼠暴露于致死剂量的病毒(5MLD50,5PFU/小鼠)，在该剂量下，其先在6-13天导致死亡，截至到第10天时死亡率为90-100％。
化合物：奥司他韦(作为)得自当地药房。在体内代谢时，每粒Tamiflu胶囊包含75mg活性成分奥司他韦羧酸盐。奥司他韦剂量基于这一测量值。化合物(1)的HCl盐半水合物的形式A(下文简称为实施例9的化合物(1))用于本研究，且该化合物的剂量基于化合物(1)的HCl盐半水合物。用0.5％甲基纤维素(Sigma,St.Louis,MO)制备化合物(1)和奥司他韦用于口腔管饲法(p.o.)施用于小鼠。
实验设计：通过腹膜内注射***/赛拉嗪(50/5mg/kg)麻醉小鼠并且经鼻内使动物感染90-μl流感病毒混悬液。病毒攻击约为4个50％小鼠致死感染剂量。如指示的，从病毒攻击前2小时或攻击后48小时开始给予治疗，每日2次(间隔12小时)，持续10天。用于评价感染的参数是存活率、平均死亡天数、体重改变和肺感染参数(出血评分、重量和病毒滴度)。在感染的隔天至第21天各自称重动物。认为在治疗期的前6天期间死亡的小鼠死于非流感病毒感染的原因且从总统计数中排除。
为了评价肺感染参数，收获来自处死动物的肺(开始为该目的分开设定的每个组5只动物)。通过目视检查从粉红色到李子色的颜色改变评价肺出血评分。这种情况发生在肺的局部区域，而不是整个肺逐步改变成较深的颜色。出血评分为0(正常)至4(显示李子色的完整肺)且由此是非参数测量值。称重肺且然后冷冻在-80℃。随后，将融化的肺在1ml细胞培养基中均化，将上清液流体离心以除去颗粒物质，并且将液体样品再冷冻在-80℃下。在准备96-孔MDCK细胞平板后，融化样品，以10-倍稀释递增顺序稀释，并且通过终点稀释法在平板(1)中滴定，使用4微孔/稀释。将病毒滴度计算为log10 50％细胞培养感染剂量/克肺组织(log10CCID50/g)。
统计学分析：通过Mantel-Cox时序检验分析用于多组比较的Kaplan-Meir图，以便确定统计学显著性。随后，通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验进行配对比较。基于进行治疗对比的数量将相对实验显著性调整至Bonferroni校准的显著性阈值。通过克-瓦二氏检验、然后通过Dunn多重比较检验分析死亡的平均天数和平均肺出血评分。通过ANOVA评估平均体重、肺重量和log10肺病毒滴度，推定等同的变异性和正态分布。在ANOVA后，通过Tukey-Kramer多重比较检验比较各个处理值。使用软件(GraphPad Software,SanDiego,CA)进行分析。
结果和讨论
在小鼠A型流感模型中研究化合物(1)的预防剂量响应。在感染前2h开始施用赋形剂或化合物(1)，并且每日2次持续10天。将结果概括在表20和21中。接受单独的赋形剂的全部小鼠截至到研究的第9天仍然患病，且平均失去～32％的体重(BW)。以1、3或10mg/kg BID施用的化合物(1)提供了完全的存活和BW减轻的剂量依赖性减少。以0.3mg/kg BID单独施用的化合物(1)提供了一些存活有益性(2/8只小鼠)，不过，小鼠存在显著的BW减轻。在相同实验中，给小鼠施用10mg/kg BID奥司他韦，为临床相当的人体剂量(基于AUC)。全部施用奥司他韦的小鼠均存活，且与施用1mg/kg BID化合物(1)的小鼠相比存在类似的体重减轻分布。
化合物(1)在感染后48小时施用时，连续BID给药10天，在这种使用A型流感/Vietnam/1203/2004(H5N1)攻击的模型中仍然提供有效性(表22)。以10mg/kg给予化合物(1)提供了如表20中所示的完全保护作用。
表20：使用化合物(1)和奥司他韦在BALB/c小鼠中对A型流感/California/04/2009(pndH1N1)病毒感染的预防作用(预防)
表21：化合物(1)和奥司他韦对BALB/c小鼠中A型流感/Victoria/3/75(H3N2)病毒感染的作用(预防)
表22：(+48h)使用化合物(1)和奥司他韦治疗在BALB/c小鼠中对A型流感/Vietnam/1203/2004(H5N1)病毒感染的作用
实施例10：化合物(1)对A型谱的流感株的体外效能
细胞和病毒.Madine Darby犬肾(MDCK)细胞最初得自美国模式培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)并且使用标准实验室技术传代，然后用于感染测定。将细胞维持在37℃在补充了10％胎牛血清(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素(Invitrogen)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM；Invitrogen,Carlsbad,CA)中。流感病毒得自ATCC、Virus Surveillance and DiagnosisBranch of the Influenza Division of the Centers for Disease Control andPrevention (CDC；Atlanta,GA)或Influenza Reagent Resource,Influenza Division,WHO Collaborating Center for Surveillance,Epidemiology and Control ofInfluenza,CDC。为了生成病毒储备溶液，使MDCK细胞在补充了2mM L-谷氨酰胺、10mMHEPES、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和1μg/mL甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)-处理的胰蛋白酶(USB Corp.；Santa Clara,CA)的DMEM中感染低感染复数(MOI)。将细胞在37℃与5％CO2温育48h，此后，通过使用Beckman GS-6R离心机以900xg离心10min收获上清液。将病毒储备溶液等分并且冷冻在-80℃下。
化合物.将化合物(1)的游离碱或HCl盐(例如无定形的化合物(1)HCl盐，化合物(1)的HCl盐半水合物的形式A，无定形游离碱化合物(1))(下文简称为实施例10的化合物(1))溶于100％二甲亚砜(DMSO)，制成10mM浓度的溶液。
抗病毒活性.在MDCK细胞中使用CellTiter-Glo(Promega；Madison,WI)如ATP水平所确定的评价化合物(1)的抗病毒活性。将MDCK细胞在黑色澄清底部384-孔平板中的50μLVGM上铺板至密度为2x104细胞孔。将细胞在37℃、5％CO2、在标准湿度下温育至细胞粘附并且形成单层。5h后，取出40μL培养基，并且加入15μL MOI为0.005的病毒。将化合物作为在具有补体的DMEM中25μL的10点、3-倍稀释液加入(最终DMSO浓度为0.5％)。内部对照组由仅包含细胞和未处理的感染病毒的细胞的孔组成。72h温育后，将20μLCellTiter-Glo加入到每个孔中并且在室温温育10min。使用EnVision Multilabel读出器(PerkinElmer；Waltham,MA)测定发光。通过使用4-参数曲线拟合法、应用Levenburg Marquardt算法(Condoseo软件；Genedata,Basel,Switzerland)拟合化合物剂量与响应数据计算EC50值(确保未感染的对照组中50％细胞存活率的化合物浓度)。在Southern Research Institute在BSL-3防范下进行hpaiH5N1的体外测试。
如下表23中所示，化合物(1)显示对全部测试A型流感株的有效活性，包括来自1934-2009的H1N1和H3N2参照株和大范围流行的2009H1N1株A/California/07/2009、A/Texas/48/2009和高致病性禽H5N1株A/VN/1203/2004。化合物(1)对所有株同样有效，包括对金刚烷胺和神经氨酸酶抑制剂具有抗性的那些。其显示对B型流感病毒有限的活性。
表23：化合物(1)对一组流感株的效能
实施例11：化合物(1)和奥司他韦、扎那米韦或法维拉韦的体外联合实验
在与神经氨酸酶抑制剂奥司他韦羧酸盐和扎那米韦或聚合酶抑制剂T-705的联合实验中，在感染MOI为0.01的A/Puerto Rico/8/34的3日MDCK细胞基于CPE的测定中测试化合物(1)(类似地在实施例10中的化合物(1)的游离碱或HCl盐)在100％二甲亚砜(DMSO)中的溶液。将奥司他韦羧酸盐和T-705溶于100％二甲亚砜(DMSO)；将扎那米韦以10mM的浓度溶于Dulbecco改进的eagle培养基(DMEM)并且储存在-20℃下。本研究使用Bliss独立性方法(Macsynergy)(例如Prichard,M.N.和C.Shipman,Jr.,Antiviral Res,1990.14(4-5)：p.181-205)或Loewe加和性/中间效应方法(例如Chou,T.C.和P.Talalay,Adv EnzymeRegul,1984.22：p.27-55)。Bliss独立性方法包括以棋盘方式测试不同浓度的抑制剂组合，而Loewe独立性方法包括以不同的固定比例的稀释液测试固定比例的抑制剂组合。还使用化合物(1)自身作为对照进行实验，从而证实了加和性。使用CellTiter-Glo测定细胞存活力。
Bliss独立性方法导致奥司他韦羧酸盐和扎那米韦的协同作用体积分别为312和268；且对于法维拉韦得到协同作用体积为317。协同作用体积大于100一般被视为强协同作用，且50-100的体积被视为中度协同作用。Loewe加和性方法对于奥司他韦、扎那米韦和T-705在50％效应水平下分别产生0.58、0.64和0.89C.I.(联合指数)值。小于0.8的C.I.值被视为强协同作用，而0.8-1.0的值被视为累加至适度协同作用。如表24中所示的这些数据共同启示化合物(1)与测试的神经氨酸酶抑制剂和聚合酶抑制剂具有协同作用。
表24：体外协同作用和拮抗作用实验概述
实施例12：小鼠A型流感感染模型中的效能
在小鼠A型流感模型中研究化合物(1)(化合物(1)HCl盐的半水合物的无定形或形式A(本实施例下文中简称为化合物(1))的预防剂量响应。在感染前2h开始施用赋形剂或化合物(1)并且每日2次持续10天。接受单独的赋形剂的全部小鼠截止到研究第9天时仍然被感染，且平均失去了～32％的其体重(BW)。以1、3或10mg/kg BID施用的化合物(1)提供完全的存活和剂量依赖性BW减轻减少。以0.3mg/kg BID施用的化合物(1)提供了一些存活有益性(2/8只小鼠)，不过，小鼠存在显著的BW减轻。在相同实验中，给小鼠施用10mg/kg BID奥司他韦，为临床相当的人体剂量(基于AUC)。全部施用奥司他韦的小鼠均存活，且与施用1mg/kg BID化合物(1)的小鼠相比存在类似的体重减轻分布。
通过用A型流感病毒攻击小鼠并且在感染后24、48、72、96或120h时开始施用赋形剂、奥司他韦或化合物(1)持续BID施用10天研究可以推迟化合物(1)施用且在该模型中仍然提供有效性的程度(表25)。全部赋形剂对照组在截至到第8或9天时仍然患病。与赋形剂对照组对比，以1、3或10mg/kg BID施用的化合物(1)在感染后达72h开始施用时完全防止了死亡，并且减少了BW减轻。仅以10mg/kg BID施用奥司他韦在感染后24h或以下开始施用时提供了完全的预防作用。当再推迟开始施用化合物时，3或10mg/kg BID的化合物(1)在感染后96h时提供完全的存活并且在感染后推迟120h开始施用时提供了部分保护作用。
研究化合物(1)在降低肺病毒滴度中的有效性。使小鼠感染A型流感，并且在24h后，施用赋形剂、奥司他韦(10mg/kg BID)或化合物(1)(3、10、30mg/kg BID)，直到收集肺并且在第6天时测定病毒负荷(表26)。全部化合物(1)-施用组显示与奥司他韦-和赋形剂-施用的动物相比强烈的具有统计学显著性的肺病毒滴度降低。
为了建立PK/PD模型，使小鼠感染流感病毒24h，且然后再施用化合物(1)24h。将剂量分成单剂量、2个剂量或4个剂量，分别在每隔12h或6h施用。采集肺和血浆用于测定肺病毒载量和化合物(1)浓度。将来自这些施用方案(q6h、q12h和q24h)的各个肺滴度数据对各Cmax、Cmin或AUC值绘图(数据未显示)。尽管在肺滴度降低与Cmin之间存在明显的相关性，但是与Cmax几乎没有相关性，且与AUC仅有弱的相关性。当将血浆中测定的化合物(1)浓度与测定的肺滴度绘图时，与Cmin存在强烈相关性。肺滴度的半数最大降低(2-3log)出现在接近血清转换的EC99(100ng/mL)。在肺滴度与测定的肺中化合物(1)浓度之间发现了类似的相关性(数据未显示)。
表25：A型流感小鼠模型中存活率百分比和体重减轻百分比的概述
a数据来自独立的实验。
b数据来自相同的实验。
cND，未测定。
表26：A型流感小鼠模型中的肺病毒滴度和Log10降低的概述
a动物治疗在感染后24小时开始，持续5天。
b在研究第6天时测定肺病毒滴度。
cND，未测定。
2种方式ANOVA与Bonferroni Post测验，***P<0.001。
实施例13：理念验证的流感攻击
活的减毒流感攻击模型之前被用于预测流感抗病毒药在人体的天然感染中的有效性(Calfee,D.P.,Peng,A.W.,Hussey,E.K.,Lobo,M.&Hayden F.G.Safety and efficacyof once daily intranasal zanamivir in preventing experimental human influenzaA infection.Antivir Ther.4,143-149(1999)；Hayden,F.G.等人Use of the oralneuraminidase inhibitor oseltamivir in experimental human influenza.JAMA282,1240-1246(1999)。在接种了活的A型流感/Wisconsin/67/2005(H3N2)攻击株病毒的健康志愿者中进行化合物(1)的HCl盐半水合物的形式A(在本实施例的下文中简称为化合物(1))的随机化、双盲、安慰剂-对照的单中心研究。受试者接受5个每日剂量的安慰剂(N＝33)或化合物(1)，每日1次(QD)(由净化合物(1)组成的胶囊形式)：在第1天时，100mg(N＝16)、400mg(N＝19)或900mg，随后600mg 2-5天(N＝20)；或在第1天时，1200mg，随后600mg 2-5天(N＝18)。受试者接受每日3次的鼻拭子，并且保持每日3次有关临床症状的评分卡片，1-7天，且在第8天时从设施中离开，基本上在第28天时进行安全性随访。测定(初步分析)和通过qRT-PCR(二次分析)测定鼻拭子在细胞培养物中的流感病毒。
对完全分析(FA)组进行效能分析，将所述完全分析(FA)组定义为接受至少一种剂量的研究药物(化合物(1)或安慰剂)剂量的所有随机化受试者，其病毒浓度高于或等于在接种后48h内的任意时间点时的TCID50细胞培养物的定量下限，或在接种期后其血细胞凝集抑制反应滴度从基线升高4-倍或以上(第1天)(N＝74)。安全性组包括在第0天时接种流感并且接受至少一种剂量的安慰剂或化合物(1)的所有受试者(N＝104)。
效能评价
本研究的主要措施在于显示在研究第1天(第1天药物施用)至第7天之间病毒减少的AUC的剂量响应趋势，正如在FA组中细胞培养测定中的TCID50所确定的。在鼻拭子中平均AUC病毒减少中观察到具有统计学限制性的剂量响应趋势(P＝0.036,Jonckheere-Terpstra趋势检验)。此外，在汇集的安慰剂组与各化合物(1)剂量组之间进行平均AUC病毒减少、平均减少期限和峰值病毒减少的平均量级的配对比(表27)。对于1200/600mg剂量组观察到AUC病毒减少的具统计学显著性的减少(P＝0.010,威尔科克森秩和检验)，且对于1200/600mg剂量组、400mg剂量组和汇集的化合物(1)剂量组，观察到峰值减少的显著性减少(图13)。进行额外的FA组分析(数据未显示)。
还通过qRT-PCR定量鼻部流感减少并且结果与使用细胞培养物观察到的类似。在化合物(1)剂量组与安慰剂之间的血清转化率方面无差异，正如抗流感滴度从预先接种基线开始增加4-倍或以上所确定的，这启示在流感接种后24h施用的化合物(1)不影响流感感染获取率且无法消除随后对感染的体液免疫应答(表28)。
受试者每日3次在日记中记录临床症状。计算第1天至第7天的临床AUC和流感样症状评分。与安慰剂对比，化合物(1)的1200/600mg剂量组显示在复杂临床症状平均期限(P＝0.001)、流感样症状的平均AUC(P＝0.040)和流感样症状的平均期限方面具有统计学显著性减少(P<0.001)(表28)。
表28：平均AUC病毒减少、平均减少期限和平均峰值病毒减少量级
AUC：数值与时间曲线下的面积；CI：置信区间；NA：不适用；qRT-PCR：定量逆转录聚合酶链反应；SD：标准偏差；TCID50：50％组织培养感染量。
注意：统计学显著性P值(P<0.05)用粗字体表示。
aP＝0.036，对于来自Jonckheere-Terpstra趋势检验的AUC的剂量响应趋势。
bP值根据威尔科克森秩和检验计算。
cP值根据ANOVA计算。
dP值根据时序检验计算。
eP＝0.031，对于来自Jonckherre-Terpstra趋势检验的AUC的剂量响应趋势。
f血清-转化率定义为在与极限比较的随访时抗流感抗体滴度≥4-倍增加。P值使用Fisher确切检验计算。
表28：复杂临床症状和流感样症状的平均AUC、平均期限和峰值平均量级
AUC：数值与时间曲线下的面积；CI：置信区间；NA：不适用。
注意：统计学显著性P值(P<0.05)用粗体字表示。
bP值根据威尔科克森秩和检验计算。
cP值根据ANOVA计算。
dP值根据时序检验计算。
安全性评价
化合物(1)是充分耐受的且不存在因化合物(1)-相关不良反应(AE)导致的中断，也没有任何严重的不良反应。呈现了在任意治疗组中≥10％的受试者中发生不良反应的列表(表29)。流感样疾病是最频繁报道的不良反应且由安慰剂和化合物(1)组中接近等比例的受试者报告。化合物(1)组与安慰剂接受者之间发生≥10％的发生率差异的不良反应为：血磷水平降低(18.1％，化合物(1)；0％，安慰剂)、鼻漏(化合物(1)，4.2％；18.8％，安慰剂)和鼻充血(1.4％，化合物(1)；15.6％，安慰剂)。此外，在安慰剂和化合物(1)接受者中观察到丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高。在单剂量达到1600mg且多剂量达到每日800mg 10天的化合物(1)的首次人体内剂量按比例上升研究中，既没有观察到肝功能异常，也没有观察到血清磷酸盐下降；在先使用上呼吸道病毒感染报道了ALT升高和血清磷酸盐降低。
表29：在任意治疗组中≥10％的受试者中发生不良反应列表
注意：一旦处于AE中，则统计具有多种不良反应的受试者。受试者可能出现多个类型。
a第1天时的900mg单一负荷剂量和第2-5天时的600mg qd。
b第1天时的1200mg单一负荷剂量和第2-5天时的600mg qd。
c流感样疾病，如效能分析中所确定的，基于文本中列出的参数评价。流感样疾病的AE由临床医师确定。
讨论
在健康志愿者中进行的流感攻击研究中，化合物(1)通过TCID50细胞培养和qRT-PCR显示鼻拭子中的AUC病毒滴度的剂量响应趋势，且评价的最高剂量的化合物(1)导致AUC病毒滴度和AUC和流感症状期限显著下降。尽管在第二最高剂量组900/600mg(表27)中未观察到超过安慰剂的类似改善量级，但是该剂量确实显示与1200/600mg剂量在复杂临床症状和流感样症状终点的平均AUC方面(表28)类似的结果；这种偏差的原因尚未得到完全的理解。尽管在POC试验中未遇到明确的安全性趋势，但是观察到的磷酸盐降低和ALT升高启示两种参数的适当监测需要用于未来的研究。
总之，流感攻击模型的局限在于用于本研究的流感病毒是特别选择的株，以便不产生流感病毒感染的最严重临床症状。此外，施用的病毒接种物可能大于天然流感暴露。暴露后24h定时施用化合物(1)对于启动社区开始的疗法可能并非是现实的期限，其中患者通常不会寻求诊断或治疗，直到他们发生显著性症状为止，可能是在暴露后24h以上。然而，由于天然感染的受试者最初接种远低的病毒滴度，所以时间尺度并非直接是可相比较的。
概括地，化合物(1)是有效的A型流感PB2抑制剂，其代表了卓越的和新的类型的抗病毒剂。如前期临床和临床数据所述的这种抑制剂的特性表明化合物(1)是进一步评价的令人鼓舞的候选物，其中的几个潜在优点超过了用于治疗流感感染的目前的抗病毒剂。
本文提供的所有参考通过引用全部并入本文。如本文使用的所有缩写、符号和惯例与当代科学文献中使用那些一致。见，例如，Janet S.Dodd等，The ACS Style Guide：AManual for Authors和Editors，第2版，Washington，D.C.：American Chemical Society，1997。
实施例14:富含氘的化合物(1).
根据如下方案1合成富含氘的化合物(1)：
方案1：
试剂和条件：(步骤14a)马来酸酐,CHCl3；(步骤14b)
β-奎宁,乙醇,甲苯；(步骤14c)DPPA,Et3N,90℃,BnOH；(步骤14d)H2,Pd/C,MeOH；(步骤14e)胺14-5,iPr2NEt,THF,70℃；(步骤14f)HCl,二噁烷,MeCN,80℃；(步骤14g)NaOH,THF,MeOH.
14A:化合物(14-1)
将叔丁醇钾(9.663g,86.11mmol)溶于DMSO-d6(30.00mL)，放入氮气气氛中。加入环己-1,4-二烯(6g,74.88mmol)在戊烷(60.00mL)中的溶液，将该化合物在氮气气氛中搅拌2.5hrs。取出DMSO-d6层，加入新鲜30mL DMSO-d6与叔丁醇钾(9.663g,86.11mmol)。持续搅拌过夜。分离各层，用D2O(50mL)洗涤戊烷层，用Na2SO4干燥，生成1,2,3,4,5,5,6,6-八氘代环己-1,3-二烯(14-1)，作为溶液用于下一步。该反应生成1,3-和1,4-二烯异构体的混合物。仅1,3-二烯参与随后的反应步骤。
14b:3a,4,7,7a-四氢-4,7-桥亚乙基异苯并呋喃-1,3-二酮-4,5,6,7,8,8,9,9-d8(14-2)
用氯仿(50mL)稀释1,2,3,4,5,5,6,6-八氘代环己-1,3-二烯(14-1)(6.5g,74.0mmol)的戊烷溶液，用马来酸酐(8.0g,81.4mmol)处理。将该反应混合物在室温搅拌过夜。减压蒸发溶剂，用MeOH处理得到的半固体残余物。搅拌10分钟后，将MeOH淤浆冷却至约20℃。通过过滤采集得到的沉淀，用3小部分(5mL)冷甲醇洗涤，得到产物(14-2)，为白色固体：1H NMR分析(CDCl3)3.15(s,2H)显示净产物和95％氘掺入。
14c:(+/-)-反式-3-(乙氧羰基)双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧-1,4,5,6,7,7,8,8-d8酸(14-3)
在氮气气氛中向3-颈RBF连接加液漏斗和内部温度探头。向烧瓶中装入3a,4,7,7a-四氢-4,7-桥亚乙基异苯并呋喃-1,3-二酮-4,5,6,7,8,8,9,9-d8(14-2)(2.68g,14.39mmol)、β-奎宁(5.24g,15.83mmol)和无水甲苯(40mL)。磁搅拌该反应体系，冷却至-25℃(冷指冷却)。加入无水乙醇(8.40mL,143.90mmol)在无水甲苯(13.4mL)中的溶液，历时25分钟，维持内部温度低于-25℃。将该反应混合物在约-20℃搅拌过夜。通过过滤采集沉淀的凝胶样固体，用甲苯(3×30mL)洗涤，溶于1N HCl/EtOAc水溶液(300mL 1:1混合物)。搅拌双相混合物，直到全部沉淀溶解。分离各层，用水(2×100mL)、盐水(100mL)洗涤有机层，用Na2SO4干燥，过滤，用旋转蒸发器低温浓缩，得到800mg期望的产物(14-3)，不经进一步纯化使用。
14d:(+/-)-反式-乙基-3-(((苄氧基)羰基)氨基)双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸酯-1,4,5,6,7,7,8,8-d8(14-4)
向(+/-)-反式-3-(乙氧羰基)双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧-1,4,5,6,7,7,8,8-d8酸(14-3)(0.60g,2.58mmol)在甲苯(4.5mL)中的溶液中加入二苯基磷酰基叠氮化物(0.81g,0.63mL,2.84mmol)，然后加入三乙胺(0.40mL,2.84mmol)。将该反应混合物加热至90℃2小时。向该混合物中加入苄醇(0.35mL,3.34mmol)，在90℃加热过夜。将该反应混合物冷却至室温，分配入EtOAc和饱和NaHCO3水溶液。分离各层，用饱和NH4Cl水溶液、盐水洗涤有机相，用Na2SO4干燥，过滤，蒸发至干。通过硅胶色谱法纯化粗残余物(0-35-100％EtOAc/己烷–用CAMA染色)。1H NMR显示期望的产物(14-4)，且仍然存在苄醇杂质。将物质不经进一步纯化用于下一步。
14e:(+/-)-反式-乙基-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸酯-1,4,5,5,6,6,7,8-d8(14-5)
将钯(0.052g,0.049mmol)装入氢化容器(在氮气气氛中)，用约5mL甲醇湿润。向该混悬液中加入(+/-)-反式-(2S,3S)-3-(((苄氧基)羰基)-氨基)双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸乙酯-1,4,5,6,7,7,8,8-d8(14-4)(0.521g,1.547mmol)在甲醇(20mL)中的溶液。将该反应混合物进行氢化(44PSI)过夜。排空压力，过滤出催化剂。真空除去全部挥发性物质。将粗产物(14-5)不经进一步纯化使用。
14f:(+/-)-反式-乙基-3-((5-氟-2-(5-氟-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基)氨基)双环[2.2.2]辛烷-2-甲酸酯-1,4,5,5,6,6,7,8-d8(14-7)
向(+/-)-反式-(2S,3S)-3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸乙酯-1,4,5,5,6,6,7,8-d8(14-5)(0.317g,1.547mmol)和5-氟-3-(5-氟-4-甲基亚磺酰基-嘧啶-2-基)-1-(对-甲苯基磺酰基)吡咯并[2,3-b]吡啶(14-6)(0.694g,1.547mmol)在THF(10mL)中的混悬液中加入N,N-二异丙基乙胺(0.808mL,4.641mmol)，将该反应混合物加热至70℃过夜。用EtOAc和水稀释该反应混合物。分离各层，用盐水洗涤有机相，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗产物(14-7)(0-100％EtOAc/己烷)，得到期望的产物。
14g:(+/-)-反式-乙基-3-((5-氟-2-(5-氟-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基)氨基)双环[2.2.2]辛烷-2-甲酸酯-1,4,5,5,6,6,7,8-d8(14-8)
向(+/-)-反式-(2S,3S)-3-((5-氟-2-(5-氟-1-甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基)氨基)双环[2.2.2]辛烷-2-甲酸乙酯-1,4,5,5,6,6,7,8-d8(14-7)(373mg,0.6325mmol)在乙腈(6mL)中的溶液中加入HCl(800μL 4M的二噁烷溶液,3.200mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2小时。然后将该反应混合物加热至80℃ 6hrs，然后冷却至室温，搅拌过夜。LC/MS分析显示反应未完成。再向该混合物中加入6ml CH3CN和800μl 4N HCl/二噁烷溶液。将该反应混合物加热至80℃ 4小时。减压除去全部挥发性物质。用EtOAc、饱和NaHCO3水溶液稀释残余物。分离各层，用盐水洗涤有机相，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗残余物(0-100％EtOAc/己烷)，得到期望的产物(14-8):1H NMR(300MHz,d6-DMSO)δ12.28(s,1H),8.50(dd,J＝9.8,2.8Hz,1H),8.23(ddd,J＝12.6,6.2,2.7Hz,2H),7.60(d,J＝6.9Hz,1H),4.73(t,J＝6.5Hz,1H),4.30–3.85(m,2H),2.89(d,J＝6.8Hz,1H),1.59–0.96(m,4H).
14h:(+/-)-反式-乙基-3-((5-氟-2-(5-氟-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基)氨基)双环[2.2.2]辛烷-2-甲-1,4,5,5,6,6,7,8-d8酸(1)
向(+/-)-反式-乙基-3-((5-氟-2-(5-氟-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)嘧啶-4-基)氨基)双环[2.2.2]辛烷-2-甲酸酯-1,4,5,5,6,6,7,8-d8(14-8)(0.165g,0.379mmol)溶于THF(3.0mL)和甲醇(1mL)中的溶液中加入NaOH(1mL 2M溶液,2.000mmol)，将该反应混合物在室温搅拌3小时。LC/MS分析显示反应未完成。将该反应混合物温热至45℃ 2小时，然后温热至55℃ 30分钟。将该反应混合物稀释入饱和NH4Cl水溶液。加入几滴1N HCl以将pH调整至约6.5。用EtOAc萃取产物。用MgSO4干燥有机相，过滤，真空浓缩，得到期望的产物(1)(通过NMR、LC/MS和HPLC测定97.5％纯度)：1H NMR(300MHz,d6-DMSO)δ12.30(d,J＝14.2Hz,2H),8.79-7.94(m,4H),7.58(s,1H),4.68(s,1H),2.84(s,1H),1.85(d,J＝85.0Hz,1H),1.58-1.05(m,2H).
实施例15：富含氘的化合物(1).
或者，可以根据如下方案2合成富含氘的化合物(1)：
方案2：
其它实施方案
应了解，虽然已经连同其详细说明描述了本发明，但上述说明旨在说明并不限制本发明的范围，而是由所附权利要求的范围限制。其它方面、优点和修改在以下权利要求的范围之内。

Claims (82)

1.化合物(1)或其药学上可接受的盐的多晶型，其中化合物(1)由如下结构式表示：
且其中该多晶型选自：
化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A；
化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F；
化合物(1)的HCl盐的形式D；
化合物(1)的形式A；和
化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A。
2.权利要求1的多晶型，其中该多晶型是化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A。
3.权利要求2的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的特征在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的10.5±0.2、5.2±0.2、7.4±0.2和18.9±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
4.权利要求3的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的特征还在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的25.2±0.2、16.5±0.2、18.1±0.2和23.0±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
5.权利要求2-4任一项的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的特征在于相当于在C13SSNMR光谱中的29.2±0.3ppm、107.0±0.3ppm、114.0±0.3ppm和150.7±0.3ppm的一个或多个峰。
6.权利要求5的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的特征还在于相当于在C13SSNMR光谱中的22.1±0.3ppm、24.6±0.3ppm、47.7±0.3ppm和54.8±0.3ppm的一个或多个峰。
7.权利要求1的多晶型，其中该多晶型是化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F。
8.权利要求7的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的7.1±0.2、11.9±0.2、19.2±0.2和12.4±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
9.权利要求8的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征还在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的16.4±0.2、21.8±0.2和23.9±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
10.权利要求7-9任一项的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征在于相当于在C13SSNMR光谱中的20.7±0.3ppm、27.4±0.3ppm、104.8±0.3ppm、142.5±0.3ppm和178.6±0.3ppm的一个或多个峰。
11.权利要求10的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的特征还在于相当于在C13SSNMR光谱中的154.3±0.3ppm、20.3±0.3ppm、132.3±0.3ppm和21.1±0.3ppm的一个或多个峰。
12.权利要求1的多晶型，其中该多晶型是化合物(1)的HCl盐的形式D。
13.权利要求12的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐的形式D的特征在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的5.8±0.2、19.5±0.2和17.1±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
14.权利要求13的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐的形式D的特征还在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的5.3±0.2、10.5±0.2和15.9±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
15.权利要求12-14任一项的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐的形式D的特征在于相当于在C13SSNMR光谱中的29.4±0.3ppm、53.4±0.3ppm、113.3±0.3ppm、135.4±0.3ppm和177.8±0.3ppm的一个或多个峰。
16.权利要求15的多晶型，其中化合物(1)的HCl盐的形式D的特征还在于相当于在C13SSNMR光谱中的22.9±0.3ppm、23.9±0.3ppm、26.0±0.3ppm和31.6±0.3ppm的一个或多个峰。
17.权利要求1的多晶型，其中该多晶型是化合物(1)的形式A。
18.权利要求17的多晶型，其中化合物(1)的形式A的特征在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的15.5±0.2、18.9±0.2和22.0±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
19.权利要求18的多晶型，其中化合物(1)的形式A的特征还在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的11.8±0.2、16.9±0.2、25.5±0.2和9.1±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
20.权利要求17-19任一项的多晶型，其中化合物(1)的形式A的特征在于相当于在C13SSNMR光谱中的21.0±0.3ppm、28.5±0.3ppm、50.4±0.3ppm、120.8±0.3ppm、138.5±0.3ppm和176.2±0.3ppm的一个或多个峰。
21.权利要求20的多晶型，其中化合物(1)的形式A的特征还在于相当于在C13SSNMR光谱中的30.1±0.3ppm、25.9±0.3ppm、22.8±0.3ppm和25.0±0.3ppm的一个或多个峰。
22.权利要求1的多晶型，其中该多晶型是化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A。
23.权利要求22的多晶型，其中化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的特征在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的7.2±0.2、9.3±0.2、13.7±0.2、14.3±0.2、14.7±0.2、16.9±0.2、18.7±0.2、26.3±0.2和26.9±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
24.权利要求23的多晶型，其中化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的特征还在于相当于在X-射线粉末衍射图案中以度测定的6.0±0.2、28.0±0.2和27.5±0.2的2-θ值的一个或多个峰。
25.药物组合物，包含权利要求1的多晶型和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
26.权利要求25的药物组合物，其中所述多晶型是化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A。
27.权利要求25的药物组合物，其中所述多晶型是化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F。
28.权利要求25的药物组合物，其中所述多晶型是化合物(1)的HCl盐的形式D。
29.权利要求25的药物组合物，其中所述多晶型是化合物(1)的形式A。
30.权利要求25的药物组合物，其中所述多晶型是化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A。
31.减少体外生物样品中或受试者中流感病毒的量的方法，包括对所述样品施用有效量的权利要求1-24任一项的化合物(1)的多晶型。
32.抑制体外生物样品中或受试者中流感病毒复制的方法，包括对所述样品施用有效量的权利要求1-24任一项的化合物(1)的多晶型。
33.治疗受试者的流感的方法，包括对该受试者施用治疗有效量的权利要求1-24任一项的化合物(1)的多晶型。
34.权利要求31-33任一项的方法，还包括对所述受试者共同施用一种或多种另外的治疗剂。
35.权利要求34的方法，其中所述另外的治疗剂包括抗病毒药物。
36.权利要求35的方法，其中所述抗病毒药物是神经氨酸酶抑制剂。
37.权利要求36的方法，其中所述神经氨酸酶抑制剂是奥司他韦或扎那米韦。
38.权利要求35的方法，其中所述抗病毒药物是聚合酶抑制剂。
39.权利要求38的方法，其中所述聚合酶抑制剂是法维拉韦(flavipiravir)。
40.权利要求31-39任一项的方法，其中所述流感病毒是A型流感病毒。
41.制备化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A的方法，其中化合物(1)由如下结构式表示：
该方法包括：
在包含水和一种或多种有机溶剂的溶剂***中混合HCl与化合物(1)，其中所述溶剂***具有0.05-0.85的水活度。
42.权利要求41的方法，其中所述溶剂***包含一种或多种有机溶剂，其选自氯苯、环己烷、1,2-二氯乙烯、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二噁烷、2-乙氧基乙醇、甲酰胺、己烷、2-甲氧基乙醇、甲基丁基酮、甲基环己烷、N-甲基吡咯烷酮、硝基甲烷、吡啶、环丁砜、四氢呋喃(THF)、四氢萘、甲苯、1,1,2-三氯乙烯和二甲苯,乙酸、丙酮、茴香醚、1-丁醇,2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、枯烯,庚烷,乙酸异丁酯、乙酸异丙酯,乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇,甲基乙基酮、甲基异丁基酮、2-甲基-1-丙醇、乙酸乙酯、***、甲酸乙酯、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇、乙酸丙酯或其任意的组合。
43.权利要求42的方法，其中所述溶剂***包含一种或多种有机溶剂，其选自氯苯、环己烷、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、甲酰胺、己烷、2-甲氧基乙醇、甲基丁基酮、甲基环己烷、硝基甲烷、四氢萘、二甲苯、甲苯、1,1,2-三氯乙烷、丙酮、茴香醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、枯烯、乙醇、乙酸乙酯、***、甲酸乙酯、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-丙醇、1-戊醇、2-丙醇、乙酸丙酯、四氢呋喃、甲基四氢呋喃或其任意的组合。
44.权利要求42的方法，其中所述溶剂***包含一种或多种有机溶剂，其选自2-乙氧基乙醇、乙二醇、甲醇、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、乙醇、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇、甲基丁基酮、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、吡啶、甲苯、二甲苯或其任意的组合。
45.权利要求42的方法，其中所述溶剂***包含一种或多种有机溶剂，其选自丙酮、正-丙醇、异丙醇、乙酸异丁酯、乙酸或其任意的组合。
46.权利要求42的方法，其中所述溶剂***包含一种或多种有机溶剂，其选自丙酮或异丙醇。
47.权利要求41-46任一项的方法，其中所述溶剂***具有0.4-0.6的水活度值。
48.权利要求41-47任一项的方法，其中在5℃-75℃范围内的温度下进行所述混合。
49.权利要求41-48任一项的方法，其中将HCl以具有占水溶液重量的30wt％-40wt％HCl的水溶液的形式导入。
50.制备化合物(1)的HCl盐·3H2O的形式F的方法，其中化合物1由如下结构式表示：
该方法包括：
(a)在包含水的溶剂***中混合HCl和化合物(1)，其中所述溶剂***具有等于或大于0.9的水活度；或
(b)在包含水的溶剂***中搅拌化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A，其中所述溶剂***具有等于或大于0.9的水活度。
51.权利要求50的方法，其中所述溶剂***还包含一种或多种有机溶剂，其选自氯苯、环己烷、1,2-二氯乙烯、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二噁烷、2-乙氧基乙醇、甲酰胺、己烷、2-甲氧基乙醇、甲基丁基酮、甲基环己烷、N-甲基吡咯烷酮、硝基甲烷、吡啶、环丁砜、四氢呋喃(THF)、四氢萘、甲苯、1,1,2-三氯乙烯和二甲苯、乙酸、丙酮、茴香醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、枯烯、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、2-甲基-1-丙醇、乙酸乙酯、***、甲酸乙酯、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇、乙酸丙酯或其任意的组合。
52.权利要求51的方法，其中所述溶剂***还包含一种或多种有机溶剂，其选自氯苯、环己烷、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、1,2-二甲氧基乙烷、甲酰胺、己烷、2-甲氧基乙醇、甲基丁基酮、甲基环己烷、硝基甲烷、四氢萘、二甲苯、甲苯、1,1,2-三氯乙烷、丙酮、茴香醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、枯烯、乙醇、乙酸乙酯、***、甲酸乙酯、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-丙醇、1-戊醇、2-丙醇、乙酸丙酯、四氢呋喃或甲基四氢呋喃。
53.权利要求51的方法，其中所述溶剂***还包含一种或多种有机溶剂，其选自2-乙氧基乙醇、乙二醇、甲醇、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、乙醇、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇、甲基丁基酮、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、吡啶、甲苯、二甲苯或其任意的组合。
54.权利要求51的方法，其中所述溶剂***还包含一种或多种有机溶剂，其选自异-丙醇、丙酮或其任意的组合。
55.制备化合物(1)的HCl盐的形式D的方法，其中化合物(1)由如下结构式表示：
该方法包括：
使化合物(1)的HCl盐·1/2H2O的形式A脱水。
56.制备化合物(1)的形式A的方法，其中化合物(1)由如下结构式表示：
该方法包括：
(a)在包含水和乙醇的溶剂***中搅拌无定形的化合物(1)或者化合物(1)的溶剂合物。
57.权利要求56的方法，其中搅拌步骤在18℃-90℃范围内的温度下进行。
58.权利要求56或57任一项的方法，其中所述溶剂***包含占该溶剂***重量的5wt％-15wt％的水。
59.权利要求56-58任一项的方法，还包括：
(b)在硝基甲烷中搅拌化合物(1)的无定形形式，形成化合物(1)的形式A的晶种；和
(c)将化合物(1)的形式A的晶种添加到混合步骤(a)得到的混合物中。
60.权利要求56-59任一项的方法，其中搅拌步骤(a)在所述溶剂***的回流温度下进行。
61.权利要求56-58任一项的方法，还包括：
(b)在硝基甲烷中搅拌化合物(1)的无定形形式，形成化合物(1)的形式A的晶种；和
(c)将混合步骤(a)得到的混合物冷却至在18℃-60℃范围内的温度；和
(d)将化合物(1)的形式A的晶种添加到步骤(c)得到的混合物中。
62.权利要求61的方法，还包括在添加化合物(1)的形式A的晶种前，将水加入到经过回流步骤得到的混合物中，其添加量足以在添加水后使得到的溶剂***具有15wt％-25wt％的水。
63.权利要求61的方法，还包括将水加入到包括化合物(1)的形式A的晶种的混合物中，其添加量足以在添加水后使得到的溶剂***具有35wt％-45wt％的水。
64.权利要求61的方法，还包括在添加水后，将包括化合物(1)的形式A的晶种的混合物冷却至0℃-10℃的温度。
65.制备化合物(1)的甲苯磺酸盐的形式A的方法，其中化合物(1)由如下结构式表示：
该方法包括：
搅拌如下物质的混合物：无定形化合物(1)或化合物(1)的溶剂合物、对-甲苯磺酸和包含乙腈的溶剂***。
66.化合物(1)的2-甲基四氢呋喃溶剂合物，其中化合物(1)由如下结构式表示：
67.剂量方案，包含对受试者施用剂量为100mg-1,600mg的权利要求1-24任一项的化合物(1)或其药学上可接受的盐的多晶型，其中将所述剂量每日施用1次、2次或3次。
68.权利要求67的剂量方案，其中所述剂量为300mg-1,600mg。
69.权利要求68的剂量方案，其中所述剂量为600mg-1,200mg。
70.权利要求69的剂量方案，其中将所述剂量每日施用1次。
71.权利要求70的剂量方案，其中所述剂量为600mg或800mg。
72.权利要求68的剂量方案，其中所述剂量为300mg-900mg。
73.权利要求72的剂量方案，其中将所述剂量每日施用2次。
74.权利要求68的剂量方案，其中所述剂量为400mg或600mg。
75.权利要求67-74任一项的剂量方案，其中将化合物(1)或其药学上可接受的盐的多晶型施用1天至整个流感季节的治疗期限。
76.权利要求75的剂量方案，其中所述治疗期限为3天-14天。
77.权利要求76的剂量方案，其中所述治疗期限为3天、4天或5天。
78.权利要求67-77任一项的剂量方案，其中在第1天时对受试者施用600mg-1,600mg的负荷剂量，并且在其余治疗期限对受试者施用400mg-1,200mg的剂量。
79.权利要求78的剂量方案，其中在第1天时对受试者施用900mg-1,600mg的负荷剂量，并且在其余治疗期限对受试者施用400mg-1,200mg的剂量。
80.权利要求79的剂量方案，其中在第1天时对受试者施用900mg或1,200mg的负荷剂量，并且在其余治疗期限对受试者施用600mg-800mg的剂量。
81.权利要求80的剂量方案，其中在第1天时对受试者施用900mg的负荷剂量，并且在其余治疗期限对受试者施用600mg的剂量，每日1次。
82.权利要求80的剂量方案，其中在第1天时对受试者施用1,200mg的负荷剂量，并且在其余治疗期限对受试者施用600mg的剂量，每日1次。
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