CN103604877A - 一种石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱构建方法及应用 - Google Patents
一种石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种石斛生物碱类成分指纹图谱测定方法，是通过恒温水浴回流萃取技术，利用氨水浸渍石斛粉末，再经氯仿萃取，过滤浓缩干燥得石斛总生物碱粗品，粗品用甲醇溶解得储备液用于高效液相色谱分析，得到石斛生物碱类指纹图谱。本发明优点：所得色谱指纹图谱能较全面反映石斛所含生物碱类成分，体现石斛生物碱类的复杂性，能为不同品种石斛鉴别提供科学依据；所建立的HPLC指纹图谱具有较大的稳定性和重现性，该研究为石斛品种质量控制提供科学参考。
Description
技术领域
本发明涉及石斛生物碱类成分高效液相色谱指纹图谱构建方法，属于生物制品和中药制备技术领域。
背景技术
生物碱是石斛中重要的药用成分之一，也是石斛属植物中最早分离并进行结构确认的化合物。一般认为，石斛生物碱的药理作用主要表现在抗肿瘤、对心血管、胃肠道抑制作用及止痛退热强神等作用。研究表明金钗石斛主要成分石斛碱具止痛解热作用，可降低心率、血压，减缓呼吸，可产生中度的高血糖，具强壮作用并可解巴比妥中毒。然而，不同石斛品种生物碱成分的组成和含量差异较大，王宪楷等对之前生物碱方面的研究进行了总结，发现有5种石斛属植物(D.nobile，D.kildebrandii，D.friedricksianum，D.findlayanum，D.wardianum）中含石斛碱类生物碱，8种石斛属植物含其他类型且彼此无共同基核的生物碱，且石斛碱仅在(D.nobile，D.findlayanum)中发现。鉴于石斛生物碱成分研究的复杂性，急需开发一种快速高效的指纹图谱方法，用于不同石斛的鉴别和石斛药材质量评价。目前，国内外发表的文献中，仅采用显微鉴定，薄层色谱和高效液相色谱与气相色谱法及质谱对某种石斛中的某些特征成分进行研究，较缺少不同石斛生物碱类整体***地研究和比较，显然，这种质量评价方法不能准确鉴别和评价石斛生物碱成分的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种石斛生物碱类成分高效液相色谱指纹图谱的构建方法。本发明采用HPLC技术对不同石斛进行测定，建立生物碱的指纹图谱，为以后石斛生物碱类成分的科学研究提供一个快速分析和检测的方法和手段。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
一种石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱构建方法，其特点在于，所述方法包括：
（1）材料收集
收集不同产地的不同品种石斛鲜苗
（2）标准石斛样品溶液的制备：取步骤1）的各石斛鲜苗在105℃的烘箱中杀青15～20min，60℃烘箱中恒温烘干，粉碎，过60目筛，得样品粗粉，取样品粗粉0.5g，加入5ml氨水，润洗密塞30min，加入氯仿50ml称重，水浴65℃回流3h，冷却后，氯仿补足失重，得提取液；所述提取液旋转蒸发至干，加甲醇5ml溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得 滤液作为标准石斛样品溶液；
（2）色谱条件：色谱柱为C18反相色谱柱；流动相：乙腈和水梯度洗脱；体积流量：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：5-10ul；分析时间：62min；
梯度洗脱程序如下
| 时间（min） | 乙腈（%） | 水（%） |
| 0 | 20 | 80 |
| 50 | 80 | 20 |
| 52 | 20 | 80 |
| 62 | 20 | 80 |
所述流动相中加有终浓度0.005%氨水；
（3）标准指纹图谱的获得，将步骤1）所述的标准石斛样品溶液按步骤2）所述的色谱条件进行高效液相色谱分析，获得对应石斛样品的生物碱类标准指纹图谱。
指纹图谱构建方法的应用，其特点在于，所述方法包括：按如上方法构建待测石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱，将所述指纹图谱与上述所获得的对应样品的标准指纹图谱进行对比，比较待测石斛与标准石斛样品中的生物碱成分，从而快速鉴别待测石斛的品种、产地及石斛生物碱成分的质量。
本发明与现有的技术和方法相比具有的优点：（1）本发明生物碱类的提取方法生物碱提取完全，且方法简便。（2）基于Waters XTerra MS C18柱无机/有机杂化颗粒技术，以化学合成的方式将化学性质极为稳定的有机碳键（Si-C）结构嵌入无机的聚硅氧网络所形成的崭新颗粒，它集硅胶与聚合物填料的优点为一体，具有分离效率高，峰形好，柱寿命长，pH范围宽（1～12）的特点，故所建立的HPLC指纹图谱具有较大的稳定性和重现性；（3）流动相优先选择0.005%氨水不仅分离效果好，而且能延长色谱柱的使用寿命；由于氨水为挥发性的碱，故此种液相色谱方法也适用于液质联用分析。（4）石斛碱是末端吸收，从190-220nm紫外吸收逐渐降低，240nm以后基本没有紫外吸收；但190nm处溶剂背景干扰较大，故检测波长选定220nm。（5）本发明液相色谱方法适用于霍山石斛组培苗总生物碱成分分析，提供一种霍山石斛的质量评价手段。
附图说明
图1是以乙腈溶液为空白试验的高效液相色谱图。
图2是以石斛碱溶液为对照试验的高效液相色谱图。
图3是组培苗1的生物碱类高效液相色谱图。（Fe55ul）
图4是组培苗2的生物碱类高效液相色谱图。（Cu55ul）
图5是组培苗3的生物碱类高效液相色谱图。（M55ul）
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述
（1）材料收集
以铁皮石斛、铜皮石斛、霍山石斛为供试材料；对铁皮石斛、铜皮石斛、霍山石斛进行常规方法的组织培养，组培培养条件为：25℃±2℃，12h光照12h黑暗，经过5次继代培养，继代周期45d左右，培养后得组培苗1，组培苗2，组培苗3。
（2）供试品溶液的制备：取石斛的鲜苗若干，在105℃的烘箱中杀青15～20min，60℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛。取几种样品干粉0.5g，分别加入5ml氨水，润洗密塞30min，精密加入氯仿50ml称重，水浴65℃回流3h，提取液挥去部分溶剂，冷却后，氯仿补足失重。提取液旋转蒸发至干加甲醇5ml溶解样品，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。
（3）对照品溶液的制备：准确称取石斛碱对照品10mg，加乙腈溶解定容至10ml，摇匀，配成1mg/ml，备用。（购自成都曼斯特生物科技有限公司,含量大于98%）
（4）色谱条件：色谱柱：Waters XTerra MS C18柱（250*4.6mm，5μm）；流动相：乙腈和水（加有0.005%氨水）梯度洗脱；体积流量：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：5-10ul；分析时间：62min。梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
| 时间（min） | 乙腈（%） | 水（%） |
| 0 | 20 | 80 |
| 50 | 80 | 20 |
| 52 | 20 | 80 |
| 62 | 20 | 80 |
（5）方法学考察：
空白试验：吸取乙腈空白溶液10ul，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1所示。
对照试验：吸取石斛碱溶液10ul，按色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果如图2所示。
精密度试验：取同一批供试品溶液，按色谱条件连续进样5次，分别计算保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD），结果如表2所示。
表2
稳定性试验：取同一批供试品溶液，在室温下放置，按照色谱条件进行，分别在0，2，4，6，8，12，24h进样分析，分别计算保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD），结果如表3所示。
表3
（6）供试品测定：按照色谱条件，测定几种供试品HPLC色谱图，并对谱图数据进行分 析，得到石斛生物碱类高效液相色谱图（进样5ul），结果如图3-5所示，从图中可以看出，三种石斛组培苗共有10个共有峰。
本实施例所得色谱指纹图谱能较全面反映石斛所含生物碱类成分，体现石斛生物碱类的复杂性，能为不同品种石斛鉴别提供科学依据；所建立的HPLC指纹图谱具有较大的稳定性和重现性，该研究为石斛品种质量控制提供科学参考。
Claims (2)
1.一种石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱构建方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）材料收集
收集不同石斛品种，并培养组培苗
（2）标准石斛样品溶液的制备：取步骤1）的各石斛组培苗在105℃的烘箱中杀青15～20min，60℃烘箱中恒温烘干，粉碎，过60目筛，得样品粗粉，取样品粗粉0.5g，加入5ml氨水，润洗密塞30min，加入氯仿50ml称重，水浴65℃回流3h，冷却后，氯仿补足失重，得提取液；所述提取液旋转蒸发至干，加甲醇5ml溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液作为标准石斛样品溶液；
（2）色谱条件：色谱柱为C18反相色谱柱；流动相：乙腈和水梯度洗脱；体积流量：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：5-10ul；分析时间：62min；
梯度洗脱程序如下
所述流动相中加有终浓度0.005%氨水；
（3）石斛生物碱类成分指纹图谱的获得，将步骤1）所述的标准石斛样品溶液注入高效液相色谱分析仪中，按步骤2）所述的色谱条件进行测定，获得对应样品的标准指纹图谱。
2.权利要求1所述指纹图谱构建方法的应用，其特征在于：按权利要求1的方法构建待测石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱，将所述指纹图谱与权利要求1中所获得的对应样品的标准指纹图谱进行对比，比较待测石斛与标准石斛样品的中的生物碱成分，从而快速鉴别待测石斛的品种及石斛生物碱成分的质量。
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