CN102854258B

CN102854258B - 用于检测醌类、二苯乙烯类、黄酮类及生物碱类组合物的化学特征分析

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Publication number: CN102854258B
Application number: CN201110278881.XA
Authority: CN
Inventors: 张芳荣; 吴东颖; 吴永昌
Original assignee: Kaohsiung Medical University
Current assignee: Kaohsiung Medical University
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2031-09-20
Also published as: CN102854258A; TW201300776A; US20130000389A1; TWI426266B; US9341605B2

Abstract

本发明公开一种分析产品中的化合物的化学特征的方法，化合物包括醌类化合物、二苯乙烯类化合物、黄酮类化合物及/或生物碱类化合物，醌类包括大黄酸、番泻苷A、芦荟大黄素，二苯乙烯类包括白藜芦醇苷，黄酮类包括黄芩苷，生物碱类包括小檗碱及黄藤素。该分析方法是(a)以高效液相色谱法对该产品及对应该化合物的标准品进行色谱分析；(b)比较该产品及该标准品的高效液相色谱图谱；以及(c)根据比较结果来分析该产品的该化学特征。

Description

用于检测醌类、二苯乙烯类、黄酮类及生物碱类组合物的化学特征分析

技术领域

本发明是关于一种生物活性物质的化学特征(chemicalprofile)分析，尤其是关于一种用于检测醌类、二苯乙烯类、黄酮类及生物碱类组合物的化学特征分析。

背景技术

大黄(Rheumpalmatum)属于寥科大黄属多年生草本植物，在中医上常被用作通便泻火药物，其根茎含有蒽醌类化合物，例如大黄素、大黄酸等，而被用作减肥瘦身的药物成分。大黄的叶部则包含番泻叶甙。大黄中的活性化合物包括番泻苷B、番泻苷A、芦荟大黄素、大黄苷、大黄素、大黄根酚等。

黄芩(Scutellariabaicalensis)属于唇形科黄芩属多年生草本植物。其根部在中医药理上具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，亦可用于治疗上呼吸道感染及肠胃炎。黄芩的活性化合物包括黄芩苷、木蝴蝶素A-葡萄糖苷酸、黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸、黄芩苷元、黄芩素、木蝴蝶素A(oroxylinA)等。

黄连(Coptidisrhizomd)属于毛莨科多年生草本植物，可用于胃肠暑湿、泻痢呕吐，其根茎部具有小檗碱(berberine)，小檗碱的盐酸盐形式已被用于治疗细菌性痢疾及肠胃炎，黄连中还被萃取出棕榈碱，用于治疗黄疸、痢疾、高血压、发炎及肝脏疾病等。黄连的活性化合物则包括小檗碱、非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱及黄藤素等。

包含大黄、黄芩及黄连的中药复方最著名的是三黄泻心汤，其具有苦寒泻火、清泄三焦功能，主治心气不足、吐血衂血等症。此外亦具有抗发炎、高血压、抗癌、抗病毒及肠道保护的功效。但由于三黄泻心汤为中药复方，内容成分复杂，不易管控其质量。再者，目前市面上也尚未出现能够鉴定宣称含有大黄、黄芩及/或黄连的中药复方、中药单方或保健食品的技术。因此，能够快速、有效地分析、鉴定前述中药产品，并获得中药产品的化学特征将成为检测的利器。

本发明申请人鉴于现有技术中的不足，经过悉心试验与研究，并一本锲而不舍的精神，终构思出本发明，能够克服现有技术的不足，以下为本发明的简要说明。

发明内容

本发明选择四类化合物(亦称生物活性物质)，包括醌类、二苯乙烯类、黄酮类及生物碱类化合物，作为检测中药复方、中药单方、食品、保健食品等产品的品管标准。尤其，本发明以醌类化合物中的大黄酸(rhein，4，5-二羟基-9，10-二氧代蒽-2-甲酸，式I)、番泻苷A(sennosideA，(9R)-9-[(9R)-2-羧基-4-羟基-10-氧代-5-[(2S，3R，4S，5S，6R)-3，4，5-三羟基-6-(羟基甲基)噁烷-2-基]氧基-9H-蒽-9-基]-4-羟基-10-氧代-5-[(2S，3R，4S，5S，6R)-3，4，5-三羟基-6-(羟基甲基)噁烷-2-yl]氧基-9H-蒽-2-甲酸，式II)以及芦荟大黄素(aloe-emodin，1，8-二羟基-3-(羟基甲基)蒽-9，10-二酮，式III)，二苯乙烯类化合物中的白藜芦醇苷(resveratroloside，(2R，3S，4R，5R，6S，E)-2-(4-(3，5-二羟基苯乙烯基)苯氧基)-6-(羟基甲基)-四氢-2H-吡喃-3，4，5-三醇，式IV)，黄酮类化合物中的黄芩苷(baicalin，2S，3S，4S，5R，6S)-6-(5，6-二羟基-4-氧代-2-苯基-4H-色烯-7-基氧基)-3，4，5-三羟基-四氢-2H-吡喃-2-甲酸，式V)，以及生物碱类化合物中的小檗碱(berberine，9，10-二甲氧基-5，6-二氢[1，3]二氧杂环戊烯并[4，5-g]异喹啉并[3，2-a]异喹啉-7-鎓盐，式VI)及黄藤素(palmatine，2，3，9，10-四甲氧基-5，6-二氢异喹啉并[2，1-b]异喹啉-7-鎓盐，式VII)，作为检测物。以下为式I至式VII的化学结构式。

本发明的检测技术可用以检测含有大黄、黄芩、黄连的复方药物、含有大黄、黄芩或黄连的单方药物，或其他中草药样品中是否存在至少一种前述的四类化合物或是存在至少一种前述的七种特定化合物。进一步，再检测这些化合物类别或特定化合物在复方药物、单方药物或样品中的比例。

因此，本发明提供一种由一种产品分析化合物的化学特征的方法，该化合物包含至少一种成份，包括大黄酸、番泻苷A、芦荟大黄素、白藜芦醇苷、黄芩苷、小檗碱及/或黄藤素，该分析方法包括步骤：(a)对该产品的甲醇萃取物及对应该化合物的标准品进行色谱分析；(b)比较该甲醇萃取物及该标准品的高效液相色谱(HPLC)图谱；(c)当该甲醇萃取物的HPLC图谱出现大黄酸、番泻苷A、芦荟大黄素及/或白藜芦醇苷的吸收峰时，表示该产品包含大黄；(d)当出现黄芩苷的吸收峰时，表示该产品包含黄芩；以及(e)当出现小檗碱及/或黄藤素的吸收峰时，表示该产品包含黄连。

本发明另外提供一种由产品分析化合物的化学特征的方法，该化合物包括醌类化合物、二苯乙烯类化合物、黄酮类化合物及/或生物碱类化合物，该方法包括步骤：(a)以HPLC分别对该产品的甲醇萃取物及对应该化合物的标准品进行色谱分析；(b)比较该甲醇萃取物及该标准品的HPLC图谱；以及(c)根据比较结果来分析该产品的该化学特征。

根据上述构想，该方法还包括步骤：(a0)以甲醇溶液萃取该产品获得甲醇萃取物，其中甲醇溶液的浓度介于50％至100％之间，该产品与甲醇溶液的重量/体积比为1∶1。

根据上述构想，步骤(b)还包括：比对甲醇萃取物的高效液相色谱图谱的吸收峰与标准品的高效液相色谱图谱的吸收峰。

根据上述构想，步骤(b)还包括：比对甲醇萃取物的高效液相色谱图谱的保留时间与标准品的高效液相色谱图谱的保留时间。

根据上述构想，该产品包含大黄、黄芩及/或黄连。而该产品包含1～3重量份的大黄、0.5～1.5重量份的黄芩及0.5～1.5重量份的黄连，或者，大黄、黄芩及黄连的重量份比例为2∶1∶1。此外，该产品使用大黄及黄连的干燥根茎，及黄芩的干燥根。

具体实施方式

本申请所提出的发明将可由以下的实施例说明而得到充分了解，使得本领域的技术人员可以据此完成，然而本发明的实施并非可由下列实施例而被限制其实施形式，本领域的技术人员仍可依据除已经揭露的实施例的精神推演出其他实施例，这些实施例皆应属于本发明的范围。

一、三黄泻心汤在动物模型的安全性

三黄泻心汤临床上最常见的副作用为腹泻，若长期服用需考虑其安全性。本实验研究服用不同三黄泻心汤配方的小鼠是否发生腹泻，以评估长期服用三黄泻心汤的可行性。实验小鼠为约30g的C57BL/6小鼠，首先记录其体重。第1周喂食剂量为9mg/30g体重/天的三黄泻心汤给小鼠，并记录每日体重，控制组小鼠并未喂食三黄泻心汤。请参阅表1，在第1周后喂食三号配方(三黄泻心汤3)的小鼠的粪便***以固态为主，小鼠体重并未显著下降。第2周则喂食双倍剂量(18mg/30g体重/天)的三黄泻心汤给小鼠，并记录每日体重。同样地，并未发现小鼠体重显著地下降，而且并未发现明显的软便或水状腹泻。因此，不同配方的三黄泻心汤经长期服用并未导致体重下降，也不会造成泻痢等副作用，可成为具有安全性的中药复方。

表1

二、制备三黄泻心汤的甲醇萃取物

本实验使用包含大黄、黄芩、黄连的三黄泻心汤粉末为材料，进行萃取获得三黄泻心汤萃取物，大黄、黄芩、黄连的干药材重量比为2∶1∶1。首先，将20g干燥的三黄泻心汤粉末以1∶1比例(重量/体积)置于50％甲醇溶液中，并以超声波震荡30分钟。以滤纸过滤该混合液并收集过滤后的上清液，再以3,000rpm离心该上清液15分钟以去除沉淀物，将离心后的上清液浓缩干燥并储存于-4℃，此即为三黄泻心汤甲醇萃取物。

若以其他具有大黄、黄芩或黄连的中药单方或中药复方作为材料，亦是前述类似方法进行甲醇萃取物的制备。此外，大黄使用的是干燥根茎，黄芩使用的是干燥根，黄连使用的是干燥根茎。大黄、黄芩、黄连的重量份介于1-3∶0.5-1.5∶0.5-1.5，甲醇溶液的浓度较佳的范围介于50％至100％之间。本领域的技术人员可依实验需要调整重量份比例及甲醇溶液浓度以调制出三黄泻心汤粉末。

三、三黄泻心汤的高效液相色谱(HPLC)

本实验所使用的高效液相色谱仪包括下列装置：***控制器为LC-10AVPHPLC***(Shimadzu，Kyoto，Japan)；配有四元泵(LC-10AT)；溶媒除气装置为在线除气装置(DGU-14A)；自动注射器为SIL-10AD；检测器为光电二极管数组检测器(SPD-M10A)；色谱柱为安捷伦Poroshell120SB-C18HPLC柱(5μm，150mm×4.6mmI.D.，AgilentTechnologies，Inc.，U.S.A.)；样品注射体积为10μl。

移动相由乙腈(溶剂A)及4mM醋酸铵(溶剂B，利用甲酸调整pH值至3.5)配制而成。管柱流速为0.6ml/min，管柱温度为室温，检测波长为254nm。将各个独立吸收峰的保留时间与标准品进行比对并且将其作为三黄泻心汤化学成分的鉴定依据。洗脱梯度为：0.01～3分钟为22％A～24％A；3～9分钟为24％A～25％A；9～10分钟为25％A～26％A；10～14分钟为26％A～50％A；14～21分钟为50％A～51％A；21～25分钟为51％A～52.5％A；25～30分钟为52.5％A～60％A。本领域的技术人员亦依实验需要，将洗脱梯度的时间及对应的溶剂A浓度作调整。

7种标准品(式I至式VII)首先分别进行定性分析，确定每种化合物的保留时间，之后再对三黄泻心汤甲醇萃取物进行高效液相色谱，以确定三黄泻心汤每个独立吸收峰的保留时间。藉由与标准品的比对，得到图1的三黄泻心汤甲醇萃取物与7种标准品的高效液相色谱图谱以及表2的三黄泻心汤甲醇萃取物7种化合物的保留时间。

表2、三黄泻心汤甲醇萃取物7种化合物的保留时间

化合物	化学式	保留时间(分)
			白藜芦醇苷	式IV	4.5
番泻苷A	式II	5.2
			黄芩苷	式V	9.2
黄藤素	式VII	20.4
			小檗碱	式VI	22.1
大黄酸	式I	25.3
			芦荟大黄素	式III	25.9

三、大黄、黄芩、黄连的高效液相色谱

根据前述萃取方法及高效液相色谱法，分别针对三黄泻心汤的单方成分，即大黄、黄芩及黄连，制备出大黄甲醇萃取物、黄芩甲醇萃取物及黄连甲醇萃取物，将前述三种甲醇萃取物分别进行高效液相色谱，确定前述三种甲醇萃取物的吸收峰的保留时间，将吸收峰与上述7种标准品的吸收峰进行比对，或者将保留时间与上述7种标准品的保留时间进行比对，得知前述三种甲醇萃取物是否含有标准品。请参阅图2，大黄甲醇萃取物的HPLC图谱依序出现式III、式II、式I及式IV的吸收峰，可知该大黄甲醇萃取物含芦荟大黄素、番泻苷A、大黄酸及白藜芦醇苷。请参阅图3，同理，黄芩甲醇萃取物的HPLC图谱出现式V的吸收峰，可知该黄芩甲醇萃取物含黄芩苷。由图4可知黄连甲醇萃取物含小檗碱及黄藤素。

此外，由于7种标准品分别具有特定的吸收峰，因此，可将大黄酸、番泻苷A及芦荟大黄素的标准品混合成为醌类化合物(或称为醌类标准品)，将白藜芦醇苷的标准品定义为二苯乙烯类化合物(或称二苯乙烯类标准品)，将黄芩苷的标准品定义为黄酮类化合物(或称黄酮类标准品)，将小檗碱及黄藤素的标准品混合成为生物碱类化合物(或称生物碱类标准品)。将三黄泻心汤复方、大黄单方、黄芩单方、黄连单方或复方进行甲醇萃取，将萃取物与醌类标准品、二苯乙烯类标准品、黄酮类标准品或生物碱类标准品进行HPLC色谱分析，并比较吸收峰及保留时间，以鉴定三黄泻心汤、单方或复方中的各成份，以完成化学特征分析。

因此，本发明使用高效液相色谱技术结合光电二极管数组检测器，以检测中药单方、复方等产品是否含醌类、二苯乙烯类、黄酮类或生物碱类组合物等生物活性物质，以建立这些产品的化学特征。

本发明实属难能的创新发明，深具产业价值，据此依法提出申请。此外，本发明可以由本领域技术人员做任何修改，但不脱离如所附权利要求所要保护的范围。

附图说明

图1为三黄泻心汤与7种化合物(式I至式VII)比较的高效液相色谱图谱，其呈现7种化合物(式I至式VII)。

图2为大黄单方的高效液相色谱图谱，其呈现大黄酸(式I)、番泻苷A(式II)、芦荟大黄素(式III)及白藜芦醇苷(式IV)的吸收峰。

图3为黄芩单方的高效液相色谱图谱，其呈现黄芩苷(式V)的吸收峰。

图4为黄连单方的高效液相色谱图谱，其呈现小檗碱(式VI)及黄藤素(式VII)的吸收峰。

Claims

1.一种分析产品中化合物的化学特征的方法，该产品为仅含有大黄、黄芩及/或黄连的药物或仅含有大黄、黄芩及/或黄连的保健食品，该化合物为大黄酸、番泻苷A、芦荟大黄素、白藜芦醇苷、黄芩苷、小檗碱、黄藤素中的一种或多种，该方法包括步骤：

(a)对该产品的甲醇萃取物及对应该化合物的标准品进行色谱分析；

(b)比较该甲醇萃取物及该标准品的高效液相色谱图谱，所述高效液相色谱的移动相由水相溶剂和有机相溶剂配制而成，其中所述有机相溶剂为乙腈，所述水相溶剂为醋酸铵水溶液，且pH值为3.5，所述高效液相色谱的洗脱梯度依序为：0.01～3分钟为22％乙腈～24％乙腈、3～9分钟为24％乙腈～25％乙腈、9～10分钟为25％乙腈～26％乙腈、10～14分钟为26％乙腈～50％乙腈、14～21分钟为50％乙腈～51％乙腈、21～25分钟为51％乙腈～52.5％乙腈以及25～30分钟为52.5％乙腈～60％乙腈；

(c)当该甲醇萃取物的高效液相色谱图谱出现该大黄酸、该番泻苷A、该芦荟大黄素及该白藜芦醇苷至少其中之一的吸收峰时，表示该产品包含大黄；

(d)当该甲醇萃取物的高效液相色谱图谱出现该黄芩苷的吸收峰时，表示该产品包含黄芩；

(e)当该甲醇萃取物的高效液相色谱图谱出现该小檗碱及该黄藤素至少其中之一的吸收峰时，表示该产品包含黄连；以及

(f)当该大黄酸、该番泻苷A、该芦荟大黄素、该白藜芦醇苷、该黄芩苷、该小檗碱及该黄藤素的吸收峰均出现在该甲醇萃取物的高效液相色谱图谱时，证实该产品仅含有大黄、黄芩及黄连。

2.如权利要求1所述的方法，其中该大黄酸、该番泻苷A及该芦荟大黄素属于醌类化合物，该白藜芦醇苷属于二苯乙烯类化合物，该黄芩苷属于黄酮类化合物，以及该小檗碱及该黄藤素属于生物碱类化合物。

3.一种分析产品中化合物的化学特征的方法，该产品为仅含有大黄、黄芩及/或黄连的药物或仅含有大黄、黄芩及/或黄连的保健食品，该化合物是选自由醌类化合物、二苯乙烯类化合物、黄酮类化合物、生物碱类化合物及其组合所组成的群组其中之一，该醌类化合物为大黄酸、番泻苷A、芦荟大黄素中的一种或多种，该二苯乙烯类化合物为白藜芦醇苷，该黄酮类化合物为黄芩苷，以及该生物碱类化合物为小檗碱及黄藤素中的一种或两种，该方法包括步骤：

(a)以高效液相色谱法分别对该产品的甲醇萃取物及对应该化合物的标准品进行色谱分析，所述高效液相色谱法的移动相由水相溶剂和有机相溶剂配制而成，其中所述有机相溶剂为乙腈，所述水相为醋酸铵的水溶液，且pH值为3.5，所述高效液相色谱的洗脱梯度依序为：0.01～3分钟为22％乙腈～24％乙腈、3～9分钟为24％乙腈～25％乙腈、9～10分钟为25％乙腈～26％乙腈、10～14分钟为26％乙腈～50％乙腈、14～21分钟为50％乙腈～51％乙腈、21～25分钟为51％乙腈～52.5％乙腈以及25～30分钟为52.5％乙腈～60％乙腈；

(b)比较该甲醇萃取物及该标准品的高效液相色谱图谱；

(c)当该甲醇萃取物的高效液相色谱图谱出现白藜芦醇苷的吸收峰时，表示该产品包含大黄；以及

(d)根据比较结果来分析该产品的该化学特征。

4.如权利要求3所述的方法，其中该产品包含1～3重量份的大黄、0.5～1.5重量份的黄芩及0.5～1.5重量份的黄连。

5.如权利要求3所述的方法，其中该大黄及该黄连使用干燥根茎，以及该黄芩使用干燥根。

6.如权利要求3所述的方法，其中该步骤(b)还包括：比对该甲醇萃取物的高效液相色谱图谱的吸收峰与该标准品的高效液相色谱图谱的吸收峰。

7.如权利要求3所述的方法，其中该步骤(b)还包括：比对该甲醇萃取物的高效液相色谱图谱的保留时间与该标准品的高效液相色谱图谱的保留时间。