CN102488819B

CN102488819B - 萱草花提取物的制备方法

Info

Publication number: CN102488819B
Application number: CN201110410822.3A
Authority: CN
Inventors: 倪健; 邹忆怀; 朱陵群
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2031-12-12
Also published as: CN102488819A

Abstract

本发明公开了萱草花提取物的制备方法，该方法包括萱草花乙醇低温提取、乙醇提取液过大孔树脂柱、回收乙醇得萱草花提取物等步骤，本发明方法成本低、效率高，适于大生产。

Description

萱草花提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药的提取物及其制备方法，特别涉及萱草花提取物及其制备方法。

背景技术

萱草花，即黄花菜(Hemerocallis citrina Baroni)，又名“金针菜”、“一日百合”，俗称“忘忧草”，属百合科萱草属多年生草本植物植物，在我国各地多有种植，明代李时珍在《本草纲目》中称其有安神醒脑、增智宽胸、美容养血、解热消毒、除烦通乳之功效。现代研究萱草花具有补脑健智、化瘀止血、通络止痛、抗菌消炎等功效，它具有增强免疫力、活血化瘀、保肝抗炎、抗菌抗病毒、抑制肿瘤、清除氧自由基和抑菌作用等多种功能。其具有丰富的营养成份，主要化学成分有蛋白质、脂肪、碳水化合物，还有多种维生素、生物碱、苷、黄酮类、胡萝卜素、挥发油、鞣质以及无机矿物钙、磷，以黄酮类化合物为主要成分，可以药食两用，鉴于黄酮类化合物具有保肝抗炎、镇定补脑、延缓衰老抗抑郁等多种生理活性功效，黄酮类化合物的研究日益引起人们的关注。为进一步开发和利用萱草花这种药食两用的植物，萱草花的总黄酮的提取工艺是值得研究和开发的。

发明内容

本发明的目的在于公开一种萱草花提取物制备方法；

本发明的另一个目的在于公开萱草花提取物的指纹图谱检测方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明所述萱草花提取物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：萱草花乙醇60℃以下提取；

步骤2：乙醇提取液过大孔树脂柱；

步骤3：回收乙醇得萱草花提取物。

所述步骤1中优选萱草花乙醇30℃以下提取；

所述步骤1中萱草花乙醇提取为：30℃以下浸提或渗漉；

优选的，步骤1浸提加入乙醇的量为药材的6-12体积倍，乙醇为60％-95％乙醇；最优选为70％乙醇；

优选的，步骤1浸提时间为18-48小时；

优选的，步骤1乙醇浸提，滤过，滤渣再加入乙醇，浸泡，滤过；合并滤液；

步骤1进一步优选为：将萱草花中加入8体积倍的70％乙醇，30℃以下浸泡24小时，滤过，滤液备用，滤渣再加入8体积倍的70％乙醇，30℃以下浸泡24小时，滤过，合并滤液；

所述步骤1：渗漉的方法为：用70％乙醇作溶剂，30℃以下浸渍24小时，30℃以下以每分钟1-3ml的速度渗漉，收集渗漉液。

步骤2优选的，乙醇提取液液过大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用20％-95％乙醇洗脱2-6倍柱体积；

步骤2优选的，大孔树脂柱为AB-8大孔树脂柱；乙醇洗脱液的浓度为：55％-65％。

步骤2优选的，乙醇冷浸液过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇。

本发明还包括用所述萱草花提取物作为药物活性成分制成的任何一种药物制剂。可以按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂等制剂。

本发明进一步提供萱草花提取物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

步骤1：萱草花乙醇在60℃以下提取，得乙醇提取液；

步骤2：乙醇提取液过大孔树脂柱；

步骤3：回收乙醇得萱草花提取物。

步骤4：萱草花提取物HPLC指纹图谱检测。

所述步骤1中优选萱草花乙醇30℃以下提取；

所述步骤1：萱草花乙醇提取为：30℃以下浸提或渗漉；

优选的，步骤1浸提时间为18-48小时；

本发明还提供萱草花提取物的HPLC指纹图谱检测方法：

色谱条件：C18色谱柱，流动相甲醇-水(0.5％冰醋酸)梯度洗，0.5-1.5mL/min^-1，检测波长200-300nm，柱温20-30℃；所述甲醇-水(0.5％冰醋酸)梯度洗脱的条件为：第0-20min：甲醇为20％，0.5％的冰醋酸水溶液为80％；第20-30min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第30-70min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第70min到最后：甲醇为80％，0.5％的冰醋酸水溶液为20％；

对照品溶液的制备：称取芦丁，加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花提取物粉末，加甲醇超声提取，静置，取上清液滤过，取滤液，即得。

检测方法：吸取对照品、供试品溶液，进样检测。

对照品溶液的制备方法优选为：称取芦丁，加甲醇制成每1mL含0.2176mg的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备方法优选为：精密称取样品粉末2g，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声处理30分钟，甲醇补足损失的重量，静置放冷，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

所述指纹图谱包括12个共有特征峰，以3号为芦丁为参照峰，相对保留时间及相对峰面积分别为：1号峰相对保留时间为0.232，相对峰面积为：0.051～0.278；2号峰相对保留时间为0.936，相对峰面积为：0.020-0.212；4号峰相对保留时间为1.039，相对峰面积为：0.023-0.041；5号峰相对保留时间为1.079，相对峰面积为：0.008-0.178；，6号峰相对保留时间为1.095，相对峰面积为：0.005-0.029；7号峰相对保留时间为1.115，相对峰面积为：0.045-0.367；8号峰相对保留时间为1.135，相对峰面积为：0.049-0.269；9号峰相对保留时间为1.159，相对峰面积为：0.004-0.023；10号峰相对保留时间为1.171，相对峰面积为：0.003-0.014；11号峰相对保留时间为1.218，相对峰面积为：0.012-0.062；12号峰相对保留时间为1.326，相对峰面积为：0.002-0.313。

现有技术采用乙醇回流法提取浓缩的药材溶液在D101柱分离之前会有大量脂溶性杂质析出，粘稠难以上柱。本发明萱草花提取物制备方法中发现采用乙醇冷浸，杂质少，特别是水溶性杂质较少，大生产时浸渍药液不会因放置产生沉淀而堵塞大孔树脂柱子，极大的减少了对树脂的污染，利于树脂的再生利用，经济适用，并且突破以往冷浸比加热提取有效成分会减少的认识，提取效率高，不仅经济并有高效率，适于大生产。

本发明所提供的萱草花的指纹图谱检测方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到，分析方法稳定可靠有效，为萱草花的鉴别和质量评价与控制提供了依据。

实验例1紫外分光光度法检测总黄酮含量

1测定波长的选择

芦丁标准溶液和萱草提取液分别按实验方法显色后，在波长400～600nm范围内扫描，结果芦丁标准溶液显色后在510nm处有最大吸收，萱草提取液显色在此波长下也有吸收，实验选用510nm为测定波长。

2供试品溶液的制备

精密称取制剂(由实施例1制备)20mg，置10mL量瓶中，加30％乙醇至刻度，超声处理10min，即得。

3对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，摇匀，即得。

4标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.5ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，在510nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝13.65X+0.0128，r＝0.9997，结果表明芦丁浓度在0.004026～0.048312mg/ml与吸光度具有良好的线性关系。

5测定方法

取供试品溶液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的浓度，计算，即得。

6方法学考察结果

6.1精密度试验

按样品测定项下的方法对批号为20110530的药材处理得供试液，UV法进行测定，一份样品连续测定6次，结果见表1，RSD为0.16％。

表1精密度试验结果

6.2稳定性试验

取同一样品溶液，每隔10分钟测定一次吸光度，样品在1小时内稳定性良好，结果见表2。

表2稳定性试验结果

结果显示，样品在1小时内稳定性良好，RSD值为1.20％。

6.3重现性试验，

按样品测定项下的方法对批号20110530的样品进行测定，共测定6份，结果见表3。

表3重现性试验结果

结果含量平均值为0.6111，RSD值为2.90％。

6.4加样回收率试验

精密称取样品(批号为20110530，总黄酮含量0.61％)1g，共称定6份，分别置25mL量瓶中，加入0.9250mg/ml的芦丁对照品溶液0.4mL，按上述方法制备供试品溶液，测定含量，计算加样回收率，结果见表4。

表4萱草中芦丁加样回收率

结果显示加样回收率平均值为101.28％，RSD值为1.10％。

7样品测定

精密称取三批样品，分别按供试品溶液的制备方法制备，按上述紫外分光光度法测定，结果见下表5：

表5制剂的含量测定

8结论

本发明药物所采用的紫外分光光度法含量测定方法其在0.004026～0.048312mg/ml范围内，r＝0.9997，平均回收率为101.28％，RSD值为1.10％，线性关系良好，稳定性、精密度、重现性等均良好，能够有效控制药物制剂质量。

实验例2乙醇加热提取方法样品的总黄酮的含量测定

乙醇加热提取方法：

将9900g干萱草花切成2-3厘米长的小段，95％乙醇浸泡过夜。95％乙醇加热提取3次，从沸腾开始计时，时间分别为40min，30min，30min，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏A。残渣用60％乙醇加热提取2次，每次40min，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏B。将浸膏A用蒸馏水稀释后过滤，通过已处理好的AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇，得到样1。同法处理浸膏B，得样2。样1为64.3101g，样2为60.9338g。

测定方法：精密称取减压干燥至恒重的芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号100080-200707)0.0101g，甲醇定容于50ml容量瓶中摇匀，准确量取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml于25ml容量瓶中，加5％NaNO₂6ml，混匀，放置6min，加入10％Al(NO₃)₃0.6ml，混匀，放置6min，加4％NaOH溶液5ml，用60％乙醇稀释至刻度，放置15min，按药典分光光度法，以第一管为空白，在500nm波长处测吸收度。以吸收度为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

表6

回归方程为y＝12.401x-0.0021 r＝0.9990

准确称取样1和2各0.0025g，置于50ml容量瓶中，同法测定吸收度分别为0.11867和0.12219，由标准曲线计算浓度分别为0.009739和0.010022mg/ml。总黄酮含量分别为19.478％和20.044％。

实验例3制备方法工艺研究

1仪器和材料

1.1仪器：水浴锅(国华电器有限公司，数显恒温水浴锅)；TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；分析天平(北京普析通用有限公司)；KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2材料和药品：甲醇(北京化工分析纯)；水(娃哈哈纯净水，去离子水)；95％医用酒精；其他试剂均为分析纯。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号100080-200707)。萱草花，购自北京康仁堂药业有限公司、河北保定市农贸市场、广东产地药材。

2方法

2.1.1试验方法：

2.1.1.1分光光度测定方法：取样品液2ml，置于25ml容量瓶中，加水至6ml，加5％NaNO₂溶液1ml，使混匀，放置6min，加10％Al(NO₃)₃1ml摇匀，放置6min，加4％NaOH10ml，再加水到刻度，摇匀，放置15min，在510nm测A。

2.1.1.2标准曲线的绘制：

精密称量芦丁标准品11.30mg(瓶上写UV按92.5％计)，合芦丁10.4525mg，用甲醇完全溶解至50ml容量瓶中，水定容为0.2091mg/ml的标准品储备液，备用。

精密量取对照品溶液0、1、、2、3、4、5、6ml分别置于25ml容量瓶中，各加水至6ml，照2.1.1.1项下方法进行测定。以A为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为y＝0.0067+0.0118x R＝0.9990。

2.1.1.3加样回收率试验：取样品粉末，精密称取5份，分别加入混合标准溶液1ml，按2.2.1项下优选方法提取、测定，测得平均回收率为98.11％。

2.1.1.4精密度测定：取一份样品溶液，重复测定5次，记录吸光度，计算RSD分别为1.91％，表明精密度良好。

3.水煮法：用药材8倍量的水，煎煮两次，每次1h。水煮提总黄酮为5.35mg/g。因为水煮法处理的样品液上柱，水溶性杂质提取的量大，对树脂的污染严重，不利于树脂的再生利用，所以此法放弃。

4.冷浸法：

用30％乙醇浸渍、50％乙醇浸渍、70％乙醇浸渍。

方法：将30g萱草花药材(广东产地)置三角瓶中，加入8倍体积相应浓度乙醇，浸泡24h，滤过；滤渣再加入8倍量乙醇，浸泡24h，滤过；滤渣再加入8倍量乙醇，浸泡24h，滤过。重复操作至浸渍4天；测定每次滤液的总黄酮量。结果见表7。

表7浸渍液的总黄酮含量测定

	30％乙醇	50％乙醇	70％乙醇
				浸渍24小时	0.32％	0.37％	0.38％
浸渍48小时	0.15％	0.14％	0.17％
				浸渍72小时	0.04％	0.04％	0.06％
浸渍96小时	0.01％	0.02％	0.03％
				合计提取的药材含量	0.52％	0.57％	0.62％

据上表可知，随乙醇浓度的增加总黄酮的提取量逐渐增大，70％乙醇对总黄酮的提取量最高。故继续考察80％、95％乙醇浸渍对总黄酮提取量的影响。结果见表8。

表8浸渍液总黄酮的含量测定2

	70％	80％	95％
				24小时浸渍液	0.38％	0.34％	0.26％

结果显示，70％乙醇的浸渍效果最好，浸泡两天总黄酮达到5.3mg/g，即可达到提取率近90％，综合考虑经济因素和提取效率，确定用70％乙醇浸泡2次，每次24小时。

乙醇冷浸法提出杂质明显少于热回流法，大生产时浸渍药液不会因放置产生沉淀而堵塞大孔树脂柱子，且总黄酮提取率近90％，故最终提取方案定为：将70％乙醇8倍量室温浸渍两次，每次24小时，合并两次浸渍液，80℃以下减压回收乙醇。

实验例4HPLC指纹图谱实验

1仪器与材料

SD-20高效液相色谱仪(日本岛津公司)；LC-20ATVP四元泵(日本岛津)；芦丁对照品(批号100080-200707，中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯(Fisher公司)；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯，试验10批样品来源见表9。

表9萱草花药材来源

试验10批药材按实施例1方法制备样品。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Agilent(规格C18，4.6*250mm，5μm)流动相甲醇一水(0.5％冰醋酸)梯度洗脱，条件见表10，流速1mL/min-1，检测波长254nm，柱温25℃。

表10梯度洗脱条件

2.2对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2176mg的溶液，摇匀，即得。

2.3供试品溶液的制备：精密称取样品粉末2g，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声处理30分钟，甲醇补足损失的重量，静置放冷，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验：精密吸取同一供试品溶液10μl，连续进样6针，测定其RP-HPLC图谱，以芦丁为参照峰(3号峰)，计算各共有峰相对保留时间的RSD值为0.02-2.75，表明方法精密度良好。

2.4.2重现性试验：取同一批萱草花药材6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，分别进样，测得各共有峰相对保留时间的RSD值为0.02-5.94，表明方法重现性良好。

2.4.3.稳定性试验：精密吸取供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8小时进样，测得各共有峰相对保留时间的RSD值为0.03-2.61，表明此方法8小时内稳定。

2.5样品指纹图谱的测定：

按上述液相色谱条件检测10个省的萱草花药材的指纹图谱，分别将10批药材的指纹图谱输入国家药典委员会制定的《中药指纹图谱相似度评价***研究版(2004A)》中，进行共有峰匹配，最后得到12个共有特征峰，见图1。

2.6相似度评价

2.6.1根据相似度评价软件，选择芦丁做参照峰，各峰相对保留时间、相对峰面积结果，见下表11：

表11 10批萱草花药材的HPLC指纹图谱分析结果

2.6.2将10批药材指纹图谱的AIA数据导入《中药指纹图谱相似度评价***研究版(2004A)》中，计算各指纹图谱与对照图谱的相似度，结果见下表12：

表12 10批样品的指纹图谱的相似度结果

3结论

不同省份的10批药材在本实验液相条件下，共12个共有特征峰，该分析方法稳定可靠，为萱草花药材的鉴别和质量评价与控制提供了依据。

附图说明

图1***生成的萱草花对照图谱(3号为芦丁)；

图2不同省份萱草花药材提取物样品的指纹图谱。

具体实施方式

实施例1：

将萱草花中加入8体积倍的70％乙醇，20℃浸提24小时，滤过，滤液备用，滤渣再加入8体积倍的70％乙醇，冷浸24小时，滤过，合并滤液；滤液过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇，得萱草花提取物。

实施例2：

将萱草花中加入8体积倍的70％乙醇，10℃浸提22小时，滤过，滤液备用，滤渣再加入8体积倍的70％乙醇，冷浸24小时，滤过，合并滤液；滤液过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱4倍柱体积，回收乙醇，得萱草花提取物。

实施例3：片剂制备

将萱草花中加入8体积倍的70％乙醇，15℃浸提24小时，滤过，滤液备用，滤渣再加入8体积倍的70％乙醇，冷浸24小时，滤过，合并滤液；滤液过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇，得萱草花提取物；萱草花提取物加入淀粉、乳糖、糊精经常规工艺制成颗粒后，按常规加入润滑剂，压制成片剂。

实施例4：萱草花提取物胶囊剂的制备

将萱草花中加入8体积倍的70％乙醇，53℃浸提24小时，滤过，滤液备用，滤渣再加入8体积倍的70％乙醇，冷浸24小时，滤过，合并滤液；滤液过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇，得萱草花提取物；萱草花提取物按1∶1-5加入乳糖(或淀粉、或糊精)，混合均匀，干燥，制成颗粒或直接罐装于胶囊中即得胶囊剂。

实施例5：实施例1萱草花提取物HPLC指纹图谱

色谱条件：色谱柱为Agilent(规格C18，4.6*250mm，5μm)流动相甲醇一水(0.5％冰醋酸)梯度洗脱，条件见表流速1mL/min-1，检测波长254nm，柱温25℃。

梯度洗脱条件

对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2176mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：精密称取样品粉末2g，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声处理30分钟，甲醇补足损失的重量，静置放冷，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

实施例6：

将萱草花粗碎后加入8体积倍的70％乙醇，20℃浸泡24小时，20℃下以每分钟1-3ml的速度渗漉，收集初滤液约20倍量药材体积；渗漉液过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇，得萱草花提取物。采用实验例1的紫外检测方法，总黄酮的含量30％，芦丁含量20％。

实施例7：

将萱草花粗碎后加入9体积倍的70％乙醇，10℃浸泡28小时，20℃下以每分钟1-3ml的速度渗漉，收集初滤液约20倍量药材体积；渗漉液过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇，得萱草花提取物。采用实验例1的紫外检测方法，总黄酮的含量29％，芦丁含量20％。

实施例8：

将萱草花粗碎后加入9体积倍的70％乙醇，5℃浸泡28小时，10℃下以每分钟1-3ml的速度渗漉，收集初滤液约20倍量药材体积；渗漉液过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇，得萱草花提取物。采用实验例1的紫外检测方法，总黄酮的含量30％，芦丁含量21％。

Claims

1.萱草花提取物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

步骤1：萱草花用70％乙醇在30℃以下浸提或以每分钟1-3ml的速度渗漉提取，得乙醇提取液；

步骤2：乙醇提取液过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用55％-65％乙醇洗脱2-6倍柱体积，得乙醇洗脱液；

步骤3：乙醇洗脱液回收乙醇得萱草花提取物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于该方法包括步骤4：萱草花提取物HPLC指纹图谱检测；

其中，萱草花提取物HPLC指纹图谱检测方法包括如下步骤：

色谱条件：C18色谱柱，流动相甲醇-0.5％冰醋酸的水溶液梯度洗，0.5-1.5mL/min^-1，检测波长200-300nm，柱温20-30℃；所述甲醇-0.5％冰醋酸的水溶液梯度洗脱的条件为：第0-20min：甲醇为20％，0.5％的冰醋酸水溶液为80％；第20-30min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第30-70min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第70min到最后：甲醇为80％，0.5％的冰醋酸水溶液为20％；

对照品溶液的制备：称取芦丁，加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花提取物粉末，加甲醇超声提取，静置，取上清液滤过，取滤液，即得；

检测方法：吸取对照品、供试品溶液，进样检测。