CN104713979A - 一种铁皮石斛的薄层鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛的薄层鉴别方法,属于中药技术领域。本发明对铁皮石斛及其药材薄层鉴别方法进行了提高、完善,与现有方法相比,增加了专属性的指标性成分。鉴别方法是以夏佛塔苷(schaftoside)、佛来心苷(violanthin)、异佛来心苷(isoviolanthin)、铁皮石斛对照药材为对照,采用薄层色谱法进行定性鉴别,专属性强、操作简单、重现性好、成本低廉,能够定性鉴别铁皮石斛及其药材。
Description
技术领域
本发明涉及一种铁皮石斛的薄层鉴别方法,属于中药材质量控制技术领域。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是一种珍稀名贵的中药材,其滋阴效果被历代医家所推崇,被尊为“中华九大仙草”之首,具有滋阴清热、益胃生精的功效,在我国已经有2000多年的药用历史。《中华人民共和国药典》(2010年版一部)规定铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥茎。由于野生资源极度有限,栽培铁皮石斛投入成本高,铁皮石斛及其加工品铁皮枫斗价格昂贵,因此市场上出现了多种其他石斛属药材混为铁皮石斛使用。目前最常见的有紫皮石斛(Dendrobium devonianum Paxt.)等。这给铁皮石斛市场带来了极大的用药安全隐患。
铁皮石斛的伪品与正品的性状十分相似,性状鉴别真伪难度大,需要丰富的实践经验积累。2010年版《中华人民共和国药典》(一部)铁皮石斛项下记载了以铁皮石斛对照药材为参照的薄层鉴别项,其具体内容是:取本品粉末1g,加甲醇50m1,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml使溶解,用石油醚(60~90℃)洗涤2次,每次20ml,弃去石油醚液,水液用乙酸乙酯洗涤2次,每次20ml,弃去洗液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取铁皮石斛对照药材1g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述两种溶液各2~5μl,分别点于同一聚酰胺薄膜上,使成条状,以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水(15:15:5:85)为展开剂,展开,取出,烘干,喷以三氯化铝试液,在105℃烘约3分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点【图1】(注:A:对照药材1-3:铁皮石斛)。但是,该薄层鉴别方法缺乏专属性的指标性成分,且样品制备方法较为复杂,在应用时具有一定的局限性。
石斛属植物种类丰富,化学成分结构类型多样,主要含有联苄类、菲类、黄酮类、生物碱类、多糖类等。
发明内容
针对以上的问题,本发明旨在提供一种专属性强且操作简便的铁皮石斛及其药材的薄层鉴别方法。
本发明所述的铁皮石斛及其药材的薄层鉴别方法是以夏佛塔苷(schaftoside)、佛来 心苷(violanthin)、异佛来心苷(isoviolanthin)、铁皮石斛对照药材为对照,采用薄层色谱法进行定性鉴别和分析。
本发明所述的铁皮石斛及其药材的薄层鉴别方法由以下步骤组成:以夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷、铁皮石斛对照药材为对照,采用薄层色谱法进行定性鉴别,包括以下步骤:
a、供试品溶液和对照药材溶液的制备:取本品粉末1g,加甲醇45~55ml,超声处理25~35分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水15~20ml使溶解,用乙酸乙酯洗涤2次,每次25~35ml,弃去洗液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20~25ml,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取对照药材1g,同法制成对照药材溶液。
b、对照品溶液制备:取夏佛塔苷(Schaftoside)、佛来心苷(Violanthin)、异佛来心苷(Isoviolanthin)对照品,分别加甲醇制成每1ml含有0.1mg的溶液,作为对照品溶液。
c、薄层色谱法鉴别:取上述供试品溶液3-7μl、对照药材溶液3-7μl,对照品溶液1μl,分别点于同一高效硅胶G薄层板(HSGF254)上,使成条状,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5~4:4~3:0.8~1.2:0.8~1.2)为展开剂,展开,取出,烘干,喷以三氯化铝试液,在105℃烘2~3分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
其中步骤a与b没有先后顺序。
铁皮石斛及其药材薄层色谱鉴别研究
供试品溶液的制备:考察了提取溶剂,如甲醇、90%甲醇、80%甲醇、95%乙醇和无水乙醇,表明甲醇提取较好。考察了提取方法,如超声处理(15分钟、30分钟、45分钟)、回流(1小时、2小时、3小时),发现超声处理30分钟处理较好。
考察了甲醇提取后直接点样、甲醇提取后乙酸乙酯萃取再点样和石油醚、乙酸乙酯两步萃取后点样,表明甲醇提取后直接点样虽操作简便并能达到鉴别效果,但所含杂质较多,对背景干扰大,且样品稳定性较差。而直接用乙酸乙酯萃取除杂,不仅能达到良好的分离效果且样品的稳定性较好。本发明与药典方法比较,省去了石油醚(60~90℃)洗涤的步骤,简化了样品制备方法。
对照药材:铁皮石斛对照药材购于浙江省食品药品检验所。
对照品:夏佛塔苷购于成都曼思特生物科技有限公司,批号为MΜST-13022701。佛來心苷和异佛来心苷为我们从铁皮石斛茎中提取分离得到,结构经过光谱法和色谱法鉴定并与文献比对,纯度≥98%。
本领域技术人员知道,就薄层色谱而言,化学物质、固定相和展开剂是相互作用的,不同的化学成分物质群需要发现合适的固定相和展开剂分离鉴定。与本发明不同的是,2010年版《中华人民共和国药典》(一部)铁皮石斛项使用聚酰胺薄膜作为固定相,展开剂是乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水(15:15:5:85),该条件对铁皮石斛的分离效果和重复性较差,与本发明的固定相和展开剂完全不相同。另外,药典铁皮石斛含量项检测的是多糖和甘露糖,而不是本发明所涉及铁皮石斛的黄酮类成分,这从另一个层面表明本发明首次以黄酮类成分为对照对铁皮石斛进行薄层定性鉴别具有创造性。为此,本发明研究了适合铁皮石斛黄酮类成分薄层色谱分离的特定的固定相和展开剂。考察了不同的薄层板,如国产预制板(烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂、烟台市化学工业研究所)和进口预制板(德国MN、德国Merck公司),均能检测到。为达到较好的重现性、分离度,选用性价比较好的国产高效硅胶预制板HSGF254(烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂)。
点样和展开:点样量,对照品溶液试用了1μl,供试品溶液考察了1、3、5、7、9、11μl。展开剂考察了多种不同的溶剂***,氯仿-甲醇-水-冰醋酸、甲苯-乙酸乙酯-甲酸、乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水等***。薄层板在具展开剂的展开缸中,考察了预饱和15分钟、30分钟和45分钟。上行展开,展距6-7cm。表明样品点样量3-7μl,展开剂选用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5-4:4-3:0.8-1.2:0.8-1.2)***,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(4:3:1:1)***为最佳。预饱和15分钟时,斑点的分离度、比移值(Rf值)均较好。
显色:夏佛塔苷、佛來心苷、异佛来心苷均为黄酮苷类化合物,喷以三氯化铝试液,以电吹风吹或在105℃的烘箱显色适当,在紫外灯光(366nm)下观察,供试品色谱中,与对照品及对照药材相应位置处显示相同颜色的斑点。
温度和湿度影响:考察了不同的温度条件(4℃、35℃),相对湿度条件(32%、47%、58%、65%、72%、88%),表明温度和影响不大,相对湿度条件在32%~72%的环境较理想。
采用以上技术方案,与现有标准及参考文献中铁皮石斛及其药材薄层鉴别方法相比,本发明所述的铁皮石斛及其药材的薄层鉴别方法不仅准确性高,而且专属性强、重现性好、分离度好、操作简便、成本低廉、所用试剂毒性低、用量少,提升了现有铁皮石斛及其药材的薄层鉴别方法。
附图说明
图1铁皮石斛薄层色谱图(依据中国药典2010版一部方法)
图2不同展开剂考察
图3不同薄层板考察
图4不同温度考察
图5不同湿度考察
图6不同点样量考察
图7不同产地铁皮石斛薄层色谱图
图8不同产地铁皮石斛和紫皮石斛薄层色谱图
图9不同基源石斛薄层色谱图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。
实施例1:
取本品粉末1g,加甲醇50ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml使溶解,用乙酸乙酯洗涤2次,每次30ml,弃去洗液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取对照药材1g,同法制成对照药材溶液。取夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷对照品,分别加甲醇制成每1ml含有0.1mg的溶液,作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验。用全自动点样仪(Automatic TLC Sampler-4)带状点样,分别取供试品溶液5μl、对照药材溶液5μl,对照品溶液1μl,点于同一国产高效HSGF254硅胶薄层板上。以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(4:3:1:1)为展开剂,上行展开至7cm,取出,挥干溶剂。将薄层板均匀喷以1%三氯化铝试液,放入105℃的烘箱中加热3分钟,置于紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点,即为铁皮石斛及其药材。
实施例2:
取本品粉末1g,加甲醇50ml,超声处理30分钟,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取对照药材1g,同法制成对照药材溶液。取夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷对照品,分别加甲醇制成每1ml含有0.1mg的溶液,作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验。用点样毛细管分别取供试品溶液3μl、对照药材溶液3μl和对照品溶液1μl,点于同一MN高效HSGF254硅胶薄层板上。以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(4:3:1:1)为展开剂,上行展开至6cm,取出,挥干溶剂。将薄层板均匀喷以1%三氯化铝试液,放入105℃的烘箱中加热3分钟,置于紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点,即为铁皮石斛。
实施例3:
取铁皮石斛干燥粉末1g,加甲醇50ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残 渣加水15ml使溶解,用乙酸乙酯洗涤2次,每次30ml,弃去洗液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取对照药材1g,同法制成对照药材溶液。取夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷对照品,分别加甲醇制成每1ml含有0.1mg的溶液,作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验。用全自动点样仪(Aμtomatic TLC Sampler-4)带状点样,分别取供试品溶液7μl、对照药材溶液7μl和对照品溶液1μl,点于同一Merck高效HSGF254硅胶薄层板上。以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:4:1:1)为展开剂,上行展开至7cm,取出,挥干溶剂。将薄层板均匀喷以5%三氯化铝试液,放入105℃的烘箱中加热3分钟,置于紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点,即为铁皮石斛。
实施例4:
取样品(铁皮石斛、紫皮石斛)粉末1g,加甲醇50ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml使溶解,用乙酸乙酯洗涤2次,每次30ml,弃去洗液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。取佛来心苷对照品,分别加甲醇制成每1ml含有0.1mg的溶液,作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验。用全自动点样仪(Aμtomatic TLC Sampler-4)带状点样,分别取供试品溶液5μl和对照品溶液1μl,点于同一国产高效HSGF254硅胶薄层板上。以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(4:3:1:1)为展开剂,上行展开至7cm,取出,挥干溶剂。将薄层板均匀喷以1%三氯化铝试液,放入105℃的烘箱中加热3分钟,置于紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色斑点,即为铁皮石斛,没有斑点的即为紫皮石斛药材。
实施例5:
取样品铁皮石斛对照药材、紫皮石斛、串珠石斛(Dendrobiμm faiconeri)、金钗石斛(Dendrobiμm nobile)、鼓槌石斛(Dendrobiμm chrysotoxμm)、叠鞘石斛(Dendrobiμm aμrantiacμm)、束花石斛(Dendrobiμm chrysanthμm)、兜唇石斛(Dendrobiμm aphyllμm)粉末各1g,加甲醇50ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加水15ml使溶解,用乙酸乙酯洗涤2次,每次30ml,弃去洗液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取对照药材1g,同法制成对照药材溶液。取夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷对照品,分别加甲醇制成每1ml含有0.1mg的溶液,作为对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验。用全自动点样仪(Aμtomatic TLC Sampler-4)带状点样,分别取供试品溶液4μl、对照药 材溶液和对照品溶液1μl,点于同一MN高效HSGF254硅胶薄层板上。以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(4:3:1:1)为展开剂,上行展开至6cm,取出,挥干溶剂。将薄层板均匀喷以1%三氯化铝试液,放入105℃的烘箱中加热3分钟,置于紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品及对照药材色谱相应位置上,显相同颜色斑点,即为铁皮石斛没有斑点或有不同颜色斑点或不同时具备三种斑点的即为铁皮石斛伪品。
以上实施例中,各种试剂均为分析纯,夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷纯度均≥98%。
实施例6
不同展开剂考察,见图2
1:铁皮石斛,2:齿瓣石斛,3:紫皮枫斗
A:氯仿:甲醇:水:冰醋酸,
B:乙酸乙酯:甲醇:甲酸:水,
C:乙酸乙酯:丁酮:甲酸:水(5:4:1.2:0.5),
D:乙酸乙酯:丁酮:甲酸:水(5:3:1:1),
E:乙酸乙酯:丁酮:甲酸:水(6:5:1:1),
F:乙酸乙酯:丁酮:甲酸:水(4:3:1:1),
实施例7
不同薄层板考察,见图3
A1-A4:不同产地铁皮石斛,
1:高效硅胶预制薄层板F254(德国Merck),
2:国产高效硅胶预制薄层板F254(烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂),
3:高效硅胶预制薄层板(德国MN),
4:国产高效硅胶预制薄层板(烟台市化学工业研究所),
5:硅胶预制薄层板F254(德国Merck),
6:硅胶预制薄层板(德国MN),
7:硅胶预制薄层板F254(德国MN),
8:硅胶预制薄层板F254(烟台市化学工业研究所)
实施例8
不同温度考察,见图4
A1-A4:不同产地铁皮石斛
1:35℃2:4℃
实施例9
不同湿度考察,见图5
实施例10
不同点样量考察,见图6
1:1μl,2:3μl,3:5μl,4:7μl,5:9μl,6:11μl
实施例11
不同产地铁皮石斛薄层色谱图,见图7
R:对照品(自下而上:夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷),
1:对照药材,2:云南芒市(引种浙江),3:云南芒市(引种浙江),4:云南芒市(英茂),5:云南芒市(引种四川),6:福建连城,7:福建连城,8:福建连城,9:浙江,10:云南临沧,11:浙江,12:云南红河绿春县,13:云南红河绿春县,14:云南西双版纳,15:云南西双版纳
实施例12
不同产地铁皮石斛和紫皮石斛薄层色谱图,见图8
R1:夏佛塔苷,R2:佛来心苷,R3:异佛来心苷
1:铁皮石斛对照药材,2-9:铁皮石斛,10-17:紫皮石斛
实施例13
8种不同石斛的薄层色谱图,见图9
R:对照品(自下而上:夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷)
1-2:铁皮石斛(Dendrobium officinale),对照药材3-4:紫皮石斛(Dendrobium devonianum),5-6:串珠石斛(Dendrobium faiconeri),7-8:金钗石斛(Dendrobium nobile),9-10:鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum),11-12:叠鞘石斛(Dendrobium aurantiacum),13-14:束花石斛(Dendrobium chrysanthum),15-16:兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)。
Claims (5)
1.一种铁皮石斛的薄层鉴别方法,其特征在于:
以夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷为对照品,采用薄层色谱法进行定性鉴别,包括以下步骤:
a、供试品溶液和对照药材溶液的制备:取本品粉末1g,加甲醇45~55ml,超声处理25~35分,滤过,滤液蒸干,残渣加水15~20ml使溶解,用乙酸乙酯洗涤2次,每次25~35ml,弃去洗液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次20~25ml,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取对照药材1g,制成对照药材溶液。
b、对照品溶液制备:取夏佛塔苷(Schaftoside)、佛来心苷(violanthin)、异佛来心苷(isoviolanthin)对照品,分别加甲醇制成每1ml含有0.1mg的溶液,作为对照品溶液。
c、薄层色谱法鉴别:取上述供试品溶液3-7μl、对照品溶液1μl,分别点于同一高效硅胶G薄层板(HSGF254)上,使成条状,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5~4:4~3:0.8~1.2:0.8~1.2)为展开剂,展开,取出,烘干,喷以三氯化铝试液,在105℃烘2~3分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
其中步骤a与b没有先后顺序。
2.如权利要求1所述的一种铁皮石斛药材的鉴别方法,其特征在于:所述对照品夏佛塔苷、佛来心苷、异佛来心苷可以一起使用,或两两组合使用,或佛来心苷、异佛来心苷分别单独使用,或上述分别加上铁皮石斛对照药材为参照用于铁皮石斛与其他石斛属药材的鉴别。
3.如权利要求书1所述的一种铁皮石斛药材的鉴别方法,其特征在于:所述展开剂乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水的体积比为:5~4:4~3:0.8~1.2:0.8~1.2。
4.如权利要求书1所述的一种铁皮石斛药材的鉴别方法,其特征在于:所述三氯化铝试液的浓度为1%~5%。
5.如权利要求书1所述的一种铁皮石斛药材的鉴别方法,其特征在于:所述薄层板的加热温度为102~108℃。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108303490A (zh) * | 2018-01-09 | 2018-07-20 | 上海中医药大学 | 一种紫皮石斛的薄层鉴别方法 |
CN114814068A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-07-29 | 中山市中智药业集团有限公司 | 一种鸡骨草与毛鸡骨草高效薄层鉴别方法 |
CN114814068B (zh) * | 2022-05-13 | 2023-11-17 | 中山市中智药业集团有限公司 | 一种鸡骨草与毛鸡骨草高效薄层鉴别方法 |
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CN104713979B (zh) | 2016-08-31 |
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