CN101780189B - 一种龙血竭药材的检测方法 - Google Patents
一种龙血竭药材的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种龙血竭药材的质量控制方法,该方法可以采用以下四种质量控制方法的任意一种或几种:(1)对总酚进行含量测定;(2)对7,4′-二羟基黄酮进行含量测定;(3)对龙血素B进行含量测定;(4)高效液相色谱指纹图谱检测。本发明提供的质量控制方法,准确,精密,稳定性好,能够有效地控制龙血竭药材的质量。
Description
技术领域
本发明属于中药分析领域,涉及一种中药材的质量控制方法,特别涉及一种龙血竭药材的质量控制方法。
技术背景
龙血竭为百合科剑叶龙血树Dranaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含脂木材经提取得到的树脂。主产于广西、云南。据《本草纲目》记载,性温、平,味甘、咸,无毒,入血分,归肺、脾、肾三经,具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血,软坚散结、生肌敛疮等显著功效。现代医学研究证实,龙血竭具有改善机体微循环、调整机体新陈代谢、改善机体免疫功能等作用。
《国家药品监督管理局国家标准》【WS3-082(Z-016)-99(Z)】项下收载了对龙血竭药材的性状、薄层鉴别、龙血素B的含量测定等检测方法,国家标准中未收载对总酚和7,4′-二羟基黄酮的含量测定项;此外,经检索,200510010851.1号专利提供了一种检测龙血竭药材中龙血素A和龙血素B含量的质量控制方法,但是该方法也没有对龙血竭药材中的总酚的含量、7,4′-二羟基黄酮的含量进行检测,本发明不仅提供了对龙血竭药材中的总酚与7,4′-二羟基黄酮含量的测定方法,而且还提供了不同于以往方法的另外一种测定龙血素B的方法,不仅如此,本发明还提供了龙血竭药材的标准指纹图谱与该图谱的应用方法。
发明内容
本发明的目的提供了一种对龙血竭药材中总酚、7,4′-二羟基黄酮、龙血素B三种指标成分进行含量测定的方法,以及龙血竭药材的指纹图谱的检测方法。
本发明的目的是通过下列方式实现的:
龙血竭药材的质量控制方法,可以采用以下方法中的任意一种或几种:
(1)采用紫外-可见分光光度法检测,龙血竭药材中含总酚以7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计不得少于30.0%;
(2)采用高效液相色谱法检测,龙血竭药材中含7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)不得少于0.20%;
(3)采用高效液相色谱法检测,龙血竭药材中含龙血素B(C18H20O5)不得少于0.40%;
(4)采用高效液相色谱指纹图谱测定,其标准指纹图谱有9个共有峰,相对保留时间分别为1号峰0.40~0.60,2 号峰0.45~0.65,3号峰0.55~0.75,4号峰0.60~0.80,5号峰0.70~0.90,6号峰0.71~0.95,7号峰0.90~1.10,S号峰1.00,8号峰1.01~1.25,其中S号峰为龙血素B的色谱峰。
所述龙血竭药材中总酚的含量测定方法为:
a.对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮,加无水乙醇制成对照品溶液;
b.标准曲线的制备:量取不同剂量的对照品溶液,加无水乙醇,加十二烷基磺酸钠溶液,铁***溶液,三氯化铁溶液,摇匀,再加盐酸;照紫外-可见分光光度法,测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
c.供试品溶液制备与测定法:取龙血竭药材,加无水乙醇溶解;取聚酰胺,加入上述溶液10ml,挥干乙醇,装入层析柱,用10~30%的乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇洗脱,收集洗脱液并定容;量取该溶液置棕色量瓶中,加无水乙醇至刻度,量取该溶液置棕色量瓶中,加十二烷基磺酸钠溶液,铁***溶液,三氯化铁溶液,再加盐酸定容,摇匀,得供试品溶液;照紫外-可见分光光度法,测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得。
上述总酚的含量测定方法的优选为:
a.对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮适量,加无水乙醇制成1ml中含20~40μg的溶液,即得;
b.标准曲线的制备:量取对照品溶液0ml,1.0ml,1.5ml,2.0ml,2.5ml,3.0ml,分别置25ml量瓶中,加无水乙醇至5ml,加十二烷基磺酸钠溶液2ml,铁***溶液1ml,三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置,以第一份为空白;照紫外-可见分光光度法,在750~800nm处测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
c.供试品溶液制备与测定法:取龙血竭药材,研细,约取10~30mg,置25ml量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀;取聚酰胺1~3g,置蒸发皿中,加入上述溶液10ml,拌匀,置热水浴上挥干乙醇,装入层析柱,用10~30%的乙醇40~60ml洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇80~120ml洗脱,收集洗脱液并定容至100ml,摇匀,量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀,量取该溶液5ml,置25ml棕色量瓶中,加十二烷基磺酸钠溶液2ml,铁***溶液1ml,三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置,得供试品溶液;照 紫外-可见分光光度法,在750~800nm处测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得。
上述总酚含量测定方法的优选为:
a.对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮适量,精密称定,置棕色量瓶中,加无水乙醇制成每1ml中含32μg的溶液,即得;
b.标准曲线的制备:精密量取对照品溶液0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml,分别置25ml量瓶中,加无水乙醇至5ml,加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.6%的铁***溶液1ml,0.9%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置5min,再加0.1M的盐酸定容,摇匀,置避光处放置35分钟,以第一份为空白;照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法,在780nm处测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
c.供试品溶液制备与测定法:取龙血竭药材,研细,取约20mg,精密称定,置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释,摇匀;取80~100目的聚酰胺2g,置蒸发皿中,精密加入上述溶液10ml,拌匀,置70℃水浴上挥干乙醇,装入内径为1.5cm层析柱,用20%的乙醇50ml洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇100ml洗脱,收集洗脱液并定容至100ml,摇匀,精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀;精密量取供试品溶液5ml,置25ml棕色量瓶中,加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.6%的铁***溶液1ml,0.9%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置5min,再加0.1M的盐酸定容,摇匀,置避光处放置35分钟,即得供试品溶液;照紫外-可见分光光度法,测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得;
本发明中0.3%的十二烷基磺酸钠溶液的制备方法为:取0.3g十二烷基磺酸钠,置100ml容量瓶中,加50%乙醇溶液微热使溶解,放冷,加50%乙醇溶液定容至刻度,即得。
d.测定结果:龙血竭药材中含总酚以7,4′-二羟基黄酮计不得少于30.0%。
所述龙血竭药材中7,4′-二羟基黄酮的含量测定方法为:
采用高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸溶液为流动相;
b.对照品溶液制备:称取7,4′-二羟基黄酮对照品适量,加甲醇制成对照品溶液;
c.供试品溶液制备:取龙血竭药材,研细,称定,置量瓶中,加甲醇稀释至刻度,吸取该甲醇溶液,在硅胶G薄层板上,点供试样 品溶液和对照品溶液,以氯仿-甲醇溶液为展开剂展开,展距,取出,晾干,置紫外灯下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑;按标记刮取色斑,置量瓶中,加入甲醇,称定重量,超声提取,放冷,加甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,弃去初滤液,收集续滤液,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液,注入液相色谱仪,测定,即得;
上述7,4′-二羟基黄酮的含量测定方法优选为:
采用高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸溶液的比例为20~30∶75~85为流动相,流速0.5~1.5ml/min,检测波长为310~350nm,理论塔板数按7,4′-二羟基黄酮峰计,应不低于2000;
b.对照品溶液制备:称取干燥至恒重的7,4′-二羟基黄酮对照品适量,加甲醇制成1ml含5μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品溶液制备:取龙血竭药材,研细,取约0.10~0.20g,称定,置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,吸取该甲醇溶液2ml,在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,点供试样品溶液和对照品溶液,以氯仿-甲醇的比例为15~25∶0.5~1.5为展开剂展开,展距,取出,晾干,置紫外灯下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑,按标记刮取色斑,置10ml量瓶中,加入甲醇10ml,称定重量,超声提取,放冷至室温,加甲醇补足减失重量,摇匀,用微孔滤膜滤过,弃去初滤液,收集续滤液,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5~20μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
上述7,4′-二羟基黄酮的含量测定方法优选为:
采用高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸溶液的比例为24∶76为流动相,流速1ml/min,检测波长为330nm,理论塔板数按7,4′-二羟基黄酮峰计,应不低于3000;
b.对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的7,4′-二羟基黄酮对照品适量,加甲醇制成每1ml含5μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.15g,精密称定,置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,精密吸取该甲醇溶液2ml,在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,于左边距1cm,底边距、右边距2cm处呈条状点样,于右边距1cm处点5μl对照品 溶液,以氯仿-甲醇比例为20∶1为展开剂展开,展距16cm,取出,晾干,置365nm紫外灯下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑;按标记刮取色斑,置10ml量瓶中,精密加入甲醇10ml,称定重量,250w,40KHz超声提取5分钟,放冷至室温,加甲醇补足减失重量,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,弃去初滤液,收集续滤液,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材中含7,4′-二羟基黄酮不得少于0.20%。
所述龙血素B的含量测定方法为:
采用高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液;
b.对照品溶液的制备:称取龙血素B对照品,加甲醇制成对照品溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,称定,置烧瓶中,加***,加热回流,滤过,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容,摇匀,再精密吸取少量至量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液,注入液相色谱仪,测定,即得;
上述龙血素B的含量测定方法的优选为:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液比例为30~50∶50~70为流动相,流速0.5~1.5ml/min,检测波长为250~300nm;
b.对照品溶液的制备:称取干燥的龙血素B对照品适量,加甲醇制成1ml含40μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.3~0.8g,称定,置烧瓶中,加***,置水浴锅表面,加热回流,滤过,用***清洗容器和滤器,滤液和洗液合并,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,再精密吸取1ml至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5~20μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
上述龙血素B的含量测定方法的优选为:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液比例为40∶60为流动相,流速1.0ml/min,检测 波长为278nm,理论塔板数按龙血素B峰计,应不低于10000;
b.对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量,加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.5g,精密称 定,置50ml圆底烧瓶中,加30ml***,置60℃水浴锅表面,加热回流60分钟,滤过,用少量***清洗容器和滤器,滤液和洗液合并,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,再精密吸取1ml至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材中含龙血素B不得少于0.40%。
所述龙血竭药材指纹图谱测定方法为:
高效液相色谱法测定:
a.色谱条件与***适应性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈,梯度洗脱;
b.参照物溶液的制备:取龙血素B对照品,加甲醇制成参照物溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,加入甲醇,超声处理,滤过,取续滤液,滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液,分别注入液相色谱仪,测定,即得;
上述龙血竭药材指纹图谱测定方法的优选为:
采用高效液相色谱法测定:
a.色谱条件与***适应性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈,梯度洗脱,洗脱顺序为:0~50 min时,流动相A从70%线性下降至20%,流动相B从30%线性上升至80%,50~60min时,流动相A保持在20%,流动相B保持在80%;流速为0.4~1.0ml/min,检测波长为250~300nm;
b.参照物溶液的制备:取龙血素B对照品适量,精密称定,加甲醇制成1ml含50μg的溶液,即得参照物溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.3~0.8g,置锥形瓶中,加入甲醇,超声处理,滤过,取续滤液用微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5~20μl,分别注入液相色谱仪,测定,即得;
上述龙血竭药材指纹图谱测定方法的优选为:
参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法,结合指纹图谱的要求进行测定:
a.色谱条件与***适应性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈,梯度洗脱,洗脱顺序为:0~50 min时,流动相A从70%线性下降至20%,流动相B从30%线性上升至80%,50~60min时,流动相A保持在20%,流动相B保持在80%;流速为0.7ml/min,检测波长为280nm,理论板数按参照物龙血素B峰计算,不低于6000;
b.参照物溶液的制备:取龙血素B对照品适量,精密称定,加50%甲醇制成每1ml含50μg的溶液,即得参照物溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.5g,置锥形瓶中,精密加入50%甲醇25ml,250W、40KHz超声处理30min,滤过,取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算,相似度应大于0.80。
对本发明提供的质量控制方法的研究与说明:
一、对总酚含量测定方法的研究与说明
1、测定条件的考察:
(1)仪器与试药:紫外分光光度计,7,4′-二羟基黄酮(纯度为98.23%);水(超纯水),其余试剂均为分析纯;
(2)供试品制备与含量测定:取龙血竭药材,研细,取约20mg,精密称定,置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀;取80~100目的聚酰胺2g,置蒸发皿中,精密加入上述溶液10ml,拌匀,置70℃水浴上挥干乙醇,装入内径为1.5cm层析柱,用20%的乙醇50ml洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇100ml洗脱,收集洗脱液并定容至100ml,摇匀,精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀;精密量取供试品溶液5ml,置25ml棕色量瓶中,加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.6%的铁***溶液1ml,0.9%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置5min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置35分钟,即得供试品溶液;照紫外-可见分光光度法,测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得。
2、7,4 ′-二羟基黄酮线性关系和回归方程:
(1)对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮适量,精密称定, 置棕色量瓶中,加无水乙醇制成每1ml中含32.5μg的溶液,即得;
(2)标准曲线的制备:精密量取对照品溶液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml,分别置25ml量瓶中,加无水乙醇至5ml,加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.6%的铁***溶液1ml,0.9%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置5min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置35分钟,以第一份为空白;照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB),在780nm处测定吸收度,以吸收度为纵坐标(y),浓度为横坐标(x),绘制标准曲线;测定结果见表1,标准曲线见附图1,结果表明线性关系良好;
回归方程:y=0.1065x-0.0131
其中x为浓度(μg/ml),A为吸收度;相关系数:r=0.9996
表1 7,4′-二羟基黄酮标准曲线
3、精密度试验
取龙血竭药材,按本发明提供的方法制备成供试品溶液,在6分钟内,连续测定6次,结果表明精密度良好,结果见表2;
表2精密度试验结果
4、稳定性试验
取龙血竭药材,按本发明提供的方法制成供试品溶液,分别在不同时间测定其吸收度,结果表明,供试品溶液在0~6分钟吸收度保持相对稳定,所以样品测定应在6分钟之内完成,试验结果见表3;
表3样品稳定性考察数据
5、重复性试验
取龙血竭药材样品6份,按本发明提供的方法测定,结果表明样品测定重现性好,试验结果见表4;
表4重复性试验结果
6、加样回收试验
取同一批号已知含量的龙血竭药材6份,每份约10mg,精密称 定,置25ml棕色容量瓶中,分别加入7,4′-二羟基黄酮对照品4mg,按本发明提供的方法测定,计算总酚的含量和加样回收率,结果见表5:
表5加样回收试验结果
7、十批药材含量测定
取十批龙血竭药材,按本发明提供的方法测定,结果见表6;
表6十批龙血竭药材
根据样品测定结果,规定本品按干燥品计算,含总酚以7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计,不得少于30.0%。
二、7,4′-二羟基黄酮含量测定方法的研究与说明
1、***适应性研究与检测方法
(1)测定成分和测定方法的选择:龙血竭有效成分为黄酮类化合物,其中7,4′-二羟基黄酮为主要有效成分,为了更好地控制有效成分的含量,因此选择7,4′-二羟基黄酮作为含量测定的成分。
龙血竭所含的有效成分黄酮类化合物种类较多,分离较困难。根据发明人多年对龙血竭化学成分研究的经验,采用高效液相色谱法可将其有效成分进行较好分离,易于测定,所以选择高效液相色谱法进行测定;
(2)仪器与试药:高效液相色谱仪;紫外检测器;乙腈(色谱纯),水(超纯水),7,4′-二羟基黄酮对照品,纯度为98.23%;
(3)色谱条件:色谱柱:C18柱;流动相:乙腈-1%冰醋酸溶液比例为24∶76;流速:1ml/min;检测波长:330nm;
(4)***适应性试验:经紫外扫描,7,4′-二羟基黄酮的紫外最大吸收波长为330nm;柱温:30℃;
(5)理论塔板数(n):按上述条件测得理论塔板数以7,4′-二羟基黄酮计为3750符合药典规定;
(6)7,4′-二羟基黄酮对照品的标定:精密称取60℃减压干燥至恒重的7,4′-二羟基黄酮10mg,置10ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度;精密吸取该溶液20μl,注入液相色谱仪中,测定峰面积,按面积归一化法计算含量;测得对照品含量为98.23%;
(7)含量测定:对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的7,4′-二羟基黄酮对照品适量,加甲醇制成每1ml含5μg的溶液,作为对照品溶液;
供试品溶液的制备:取本品110mg,加甲醇溶解于25ml量瓶中,精密吸取该甲醇溶液2ml,在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(20×20cm)上,于左边距1cm,底边距、右边距2cm处呈条状点样,于右边距1cm处点5μl对照品溶液,以氯仿-甲醇比例为20∶1为展开剂展开,展距16cm,取出,晾干,置紫外灯(365nm)下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑;按标记刮取色斑,置10ml量瓶中,加甲醇8ml,超声5分钟,冷却至室温,加甲醇至刻度,用0.5μm滤膜滤过,作为供试品溶液;
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
2、7,4′-二羟基黄酮标准曲线的制作
对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的7,4′-二羟基黄酮11.5mg置10ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,精密吸取该溶液1ml,置50ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,作为对照品溶液;精密吸取对照品溶液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml,置10ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得;分别进样10μl,测定峰面积,见表7,以峰面积为纵坐标(Y),进样浓度为横坐标(X),作图,得标准曲线,见表7与附图2;
线性关系和回归方程:
回归方程为Y=60.024X-6.7217;
r=1;线性范围为:2.3~23μg/ml;
结果表明,线性关系良好;
表7 7,4′-二羟基黄酮标准曲线
3、精密度试验
精密吸取对照品(4.6μg/ml)溶液10μl,重复进样6次,测得峰面积积分值,计算RSD=0.28%,结果见表8,表明精密度良好:
表8精密度试验结果
4、稳定性试验
取样品,按供试品溶液的制备方法制备,分别在配置后不同时间测定,结果见表9,结果表明供试品在15小时内稳定;
表9样品稳定性考察数据
5、重复性试验
精密称取同一批号样品5份,按本发明提供的方法测定,结果见表10,结果表明方法重复性较好;
表10重复性试验结果
6、加样回收试验
精密称取同一批号已知含量的样品(含7,4′-二羟基黄酮为3.38mg/g)约55mg五份,分别精密加入浓度为820.4μg/ml的7,4′-二羟基黄酮对照品溶液1.0ml,按龙血竭药材供试品溶液制备方法制备,测定,结果平均加样回收率为98.94%,RSD=1.55%,结果见表11:
表11加样回收试验结果
7、十批样品含量测定
取十批龙血竭药材,按本发明提供的方法测定,结果见表12;
表12十批样品含量
限度确定:根据龙血竭药材10批20个数据的含测结果,规定本品按干燥品计算,7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)含量不得少于0.20%。
三、龙血素B含量测定方法的研究与说明
1、***适应性研究与检测方法
(1)仪器与试药:高效液相色谱仪,紫外检测器,龙血素B对照品(中国药品生物制品检定所),乙腈(色谱纯),水(超纯水);
(2)色谱条件:流动相的选择:通过对多个流动相***进行了考察,结果表明乙腈-1%冰醋酸(HAC)比例为40∶60***作为流动相,供试品色谱图中龙血素B与其它峰能够达到很好的分离;所以,选择乙腈-1%HAC比例为40∶60***作为流动相;
(3)测定波长的选择:通过实验验证,在278nm处,供试品色谱中龙血素B与其它峰能够达到很好的分离,阴性样品无干扰;将测定波长定为278nm;
(4)柱温:30℃;
(5)理论塔板数:经研究确定,在***实验中龙血素B的理论塔板数不得低于4000;
(6)含量测定:供试品溶液制备:发明人考察了龙血竭提取溶剂、提取方式、提取时间、对龙血竭药材中龙血素B含量测定结果的影响,确定供试品制备方法为:精密称取龙血竭药材粉末0.5g,置50ml圆底烧瓶中,加30ml***,置60℃水浴锅表面,加热回流60分钟,滤过,用少量***清洗容器和滤器,滤液和洗液合并,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,再精密吸取1ml至10ml量瓶中并用甲醇定容到刻度,摇匀,滤过,即得供试品溶液;
(7)对照品溶液制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量,加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液,作为对照品溶液;
2、线性关系考察
精密称取龙血素B对照品10.05mg,置100ml量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀;得浓度为100.5μg/ml的标准品储备液,分别精密吸取上述溶液0.4ml,1.0ml,2.0ml,4.0ml,6.0ml,置10ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得;分别进样10μl,以进样浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线;结果表明龙血素B在4.02μg/ml~100.5μg/ml范围内呈良好线性关系,回归方 程为Y=35.206X-17.105,r=0.9999;结果见表13与附图3:
表13标准曲线的测定
3、精密度试验
精密吸取对照品(20.1μg/ml)溶液10μl,重复进样6次,测得峰面积积分值,计算RSD=0.16%,结果见表14,表明精密度良好:
表14精密度试验
4、稳定性试验
密称取龙血竭药材粉末0.5g,置50ml圆底烧瓶中,加30ml***,置60℃水浴锅表面,加热回流60分钟,滤过,用少量***清洗容器和滤器,滤液和洗液合并,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,再精密吸取1ml至10ml量瓶中并用甲醇定容到刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液;精密吸取供试品溶液10μl,分别于不同时间进样,共进样6次,测得峰面积积分值,计算RSD=1.06%,结果表明龙血素B峰面积在15小时内基本稳定,结果见表15:
表15稳定性试验
5、重复性试验
取龙血竭药材粗粉,按龙血竭药材供试品溶液制备方法制备,平行试验5份,测定,结果龙血素B平均含量为4.59mg/g,RSD=1.36%,结果见表16:
表16重复性试验
6、加样回收率试验
取同一批号已知含量的龙血竭药材(含量:4.59mg/g)约0.25g五份,分别精密加入浓度为210.0μg/ml的龙血素B对照品溶液10.0ml,按龙血竭药材供试品溶液制备方法制备,测定,结果平均加样回收率为99.81%,RSD=1.29%;结果见表17:
表17加样回收率试验
7、样品测定
依本发明提供的方法对十批龙血竭药材进行测定,结果见表18:
表18 10批龙血竭中龙血素B含量测定
限度确定:根据龙血竭药材10批20个数据的含测结果,规定本品含龙血素B(C18H20O5)不得少于0.40%。
四、指纹图谱测定方法的研究与说明:
(一)概述
为了更全面、有效的控制龙血竭药材质量,提高质量控制水平,发明人参照中药注射剂指纹图谱的要求,对龙血竭药材指纹图谱进行了研究,经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器,色谱柱、流动相、检测波长等条件进行***的优选,建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察,在对多批龙血竭药材指纹图谱检测结果的基础上,逐渐积累数据,制定了龙血竭药材的标准指纹图谱,从而达到能够更全面、有效地控制药材质量的目的。
通过对所测得的指纹图谱的辨认,采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价***,使用中药色谱指纹图谱相似度评价***评价指纹图谱的相似度,操作方便、快捷,以其得出的相似度结果,对药材指纹图谱进行评价,结论较为客观、准确。所以,采用该软件做为龙血竭药材指纹图谱相似度计算软件。
(二)标准指纹图谱的研究说明
1、参照物:
根据对龙血竭的成分的分析,所以选择龙血素B作为参照物;
2、供试品溶液制备:
经过试验考察,50%甲醇提取所得供试品溶液能够较全面的反映成品中的主要成分,且重复性较好,所以确定50%甲醇做为提取溶剂,又对提取方法进行了考察,发现回流提取与超声提取对供试品的指纹图谱影响不大,最终确定龙血竭药材指纹图谱测定供试品制备方法为:取龙血竭药材粉末,研细,取约0.5g,精密称定,置锥形瓶中, 精密加50%甲醇25ml,超声处理(250W、40KHz)30min,滤过,取续滤液做为供试品溶液;
3、检测方法
(1)仪器和试剂:
仪器:高效液相色谱仪;多波长紫外-可见检测器,全自动进样器,流动相为A:0.1%磷酸与B:甲醇,梯度洗脱,洗脱顺序为:
时间(min) A%(0.1%磷酸) B%(乙腈)
0 70 30
50 20 80
60 20 80
流速为0.7ml/min,检测波长为280nm,理论板数按参照物(龙血素B)峰计算,应不低于6000;
试剂:甲醇为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯;
(2)色谱柱:
经试验考察,发现Waters Xterra C18色谱柱对制剂中各成分分离效果最好,因此选择用该类型色谱柱作为龙血竭药材指纹图谱测定色谱柱;
(3)测定波长:发明人检测了五个波长下的指纹图谱,经比较分析,确定280nm为龙血竭药材指纹图谱的检测波长,在该波长下的指纹图谱中,除已知成分龙血素B能够较好的检测出外,其它成分指纹峰也能被较好地体现,且各峰分离度好,基线较平稳、重复性好;
4、稳定性试验
取龙血竭药材,按本发明提供的供试品溶液制备方法制备供试品溶液,每隔3小时测定一次其指纹图谱,共测6次,结果见表19,以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度,相似度结果均不小于0.99,表明供试品溶液15小时内成分是稳定的,符合指纹图谱的技术要求;
表19稳定性分析结果
时间 | 数据文件 | 相似度(参照) | 相似度(对照) |
对照图谱 | 龙血竭药材对照图谱.Scp | 1.000 | 0.942 |
0小时 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
3小时 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
6小时 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
9小时 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
12小时 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
15小时 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
5、精密度试验
取龙血竭药材,按本发明供试品溶液的制备方法制备供试品溶液,连续进样6次进行测定;测定结果见表20、21、22;结果表明, 供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5%以上)的峰面积基本一致(RSD<3%),又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度,结果相似度结果均不小于0.99,均符合指纹图谱的技术要求,表明该方法精密度良好;
表20精密度考察结果
(占总峰面积5%以上主要峰的保留时间)
表21精密度考察结果
(占总峰面积5%以上的主要峰的峰面积)
表22精密度分析结果
(参照文件名为:龙血竭药材对照图谱.Scp)
次数 | 数据文件 | 相似度(参照) | 相似度(对照) |
对照图谱 | 龙血竭药材对照图谱.Scp | 1.000 | 0.942 |
1 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
2 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
3 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
4 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
5 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
6 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.998 |
6、重复性试验
取龙血竭药材,按本发明提供的供试品溶液的制备方法制备供试 品溶液,同法制备供试品溶液5份,依法测定,结果见表23,计算相似度,相似度结果均不小于0.95,符合指纹图谱的技术要求;
表23重复性分析结果
(参照文件名为:龙血竭药材对照图谱.Scp)
次数 | 数据文件 | 相似度(参照) | 相似度(对照) |
对照图谱 | 龙血竭药材对照图谱.Scp | 1.000 | 0.951 |
1 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.995 |
2 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.995 |
3 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.995 |
4 | SIGNAL01.cdf | 0.918 | 0.995 |
5 | SIGNAL01.cdf | 0.916 | 0.961 |
根据方法学考察结果,表明该方法测定龙血竭药材的指纹图谱,精密度、重复性、稳定性均较好,能够准确测定该制剂的指纹图谱;
7、十批药材的测定及标准指纹图谱的获得
十批成品按本发明提供的供试品溶液制备方法制备供试品溶液,依法测定,结果见表24,结果计算相似度,在相似度软件中以这十批供试品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为标准指纹图谱,见附图4,并规定龙血竭药材指纹图谱与标准指纹图谱经相似度软件计算,相似度应大于0.80。
表24龙血竭药材指纹图谱-十批分析结果
(参照文件名为:龙血竭药材对照图谱.Scp)
批号 | 数据文件 | 相似度(参照) | 相似度(对照) |
030512 | SIGNAL01.cdf | 0.967 | 0.959 |
030517 | SIGNAL01.cdf | 0.951 | 0.951 |
030526 | SIGNAL01.cdf | 0.964 | 0.958 |
030603 | SIGNAL01.cdf | 0.975 | 0.971 |
030610 | SIGNAL01.cdf | 0.909 | 0.921 |
030625 | SIGNAL01.cdf | 0.929 | 0.936 |
030719 | SIGNAL01.cdf | 0.883 | 0.896 |
030706 | SIGNAL01.cdf | 0.909 | 0.921 |
030723 | SIGNAL01.cdf | 0.903 | 0.912 |
对照图谱 | 龙血竭药材对照图谱.Scp | 1.000 | 0.999 |
030801 | SIGNAL01.cdf | 0.906 | 0.921 |
本发明的有益效果:
1、本发明提供了对龙血竭药材中总酚、7,4′-二羟基黄酮和龙血素B三种成分含量测定的方法,这些方法在原有的质量标准中都没有,对这三种成分的含量进行检测,可以更加真实地反应龙血竭药材的质量;
2、本发明还提供了一种龙血竭药材的指纹图谱检测方法,这种指纹图谱的检测方法可以全面地反应龙血竭药材的质量,对控制龙血竭药材的质量大有帮助;
3、本发明的提供的方法具有良好准确性、稳定性和重复性,可 以应用于大工业生产中,是非常好的质量控制方法。
附图说明
附图1:总酚含量测定中的7,4′-二羟基黄酮标准曲线
附图2:7,4′-二羟基黄酮含量测定中的7,4′-二羟基黄酮标准曲线
附图3:龙血竭药材龙血素B含测标准曲线
附图4:龙血竭药材标准指纹图谱
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明,下述实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例1:总酚的含量测定方法
a.对照品来源:7,4′-二羟基黄酮,供含量测定用,纯度为98.23%
对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮适量,精密称定,置棕色量瓶中,加无水乙醇制成每1ml中含28μg的溶液,即得;
b.标准曲线的制备:精密量取对照品溶液0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml,分别置25ml量瓶中,加无水乙醇至5ml,加0.2%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.5%的铁***溶液1ml,0.8%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置4min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置30分钟,以第一份为空白;照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法,在750nm处测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
其中0.2%的十二烷基磺酸钠溶液的制备方法为:取0.2g十二烷基磺酸钠,置100ml量瓶中,加50%乙醇溶液微热使溶解,放冷,加50%乙醇溶液定容至刻度,即得;
c.供试品来源:龙血竭药材,西双版纳药业有限责任公司,批号:070618
供试品溶液制备与测定法:取龙血竭药材,研细,取19.95mg,精密称定,置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀;取80目的聚酰胺1g,置蒸发皿中,精密加入上述溶液10ml,拌匀,置65℃水浴上挥干乙醇,装入内径为1.5cm层析柱,用15%的乙醇40ml洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇80ml洗脱,收集洗脱液并定容至100ml,摇匀,精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀;精密量取供试品溶液5ml,置25ml棕色量瓶中,加0.2%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.5%的铁***溶液1ml,0.8%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置4min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置40分钟,即得供试品溶液; 照紫外-可见分光光度法,测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得;
d.测定结果:龙血竭药材按干燥品计算,含总酚以7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计,为6.98mg,不少于30.0%,符合要求。
实施例2:总酚的含量测定方法
a.对照品来源:7,4′-二羟基黄酮,供含量测定用,纯度为98.23%
对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮适量,精密称定,置棕色量瓶中,加无水乙醇制成每1ml中含32μg的溶液,即得;
b.标准曲线的制备:精密量取对照品溶液0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml,分别置25ml量瓶中,加无水乙醇至5ml,加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.6%的铁***溶液1ml,0.9%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置5min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置35分钟,以第一份为空白;照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法,在780nm处测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
其中0.3%的十二烷基磺酸钠溶液的制备方法为:取0.3g十二烷基磺酸钠,置100ml量瓶中,加50%乙醇溶液微热使溶解,放冷,加50%乙醇溶液定容至刻度,即得;
c.供试品来源:广西中医学院制药厂,批号:070702
供试品溶液制备与测定法:取龙血竭药材,研细,取20.05mg,精密称定,置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀;取90目的聚酰胺2g,置蒸发皿中,精密加入上述溶液10ml,拌匀,置70℃水浴上挥干乙醇,装入内径为1.5cm层析柱,用20%的乙醇50ml洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇100ml洗脱,收集洗脱液并定容至100ml,摇匀,精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀;精密量取供试品溶液5ml,置25ml棕色量瓶中,加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.6%的铁***溶液1ml,0.9%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置5min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置35分钟,即得供试品溶液;照紫外-可见分光光度法,测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得;
d.测定结果:龙血竭药材按干燥品计算,含总酚以7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计,为7.62mg,不少于30.0%,符合要求。
实施例3:总酚的含量测定方法
a.对照品来源:7,4′-二羟基黄酮,供含量测定用,纯度为98.23 %
对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮适量,精密称定,置棕色量瓶中,加无水乙醇制成每1ml中含35μg的溶液,即得;
b.标准曲线的制备:精密量取对照品溶液0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml,分别置25ml量瓶中,加无水乙醇至5ml,加0.4%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.7%的铁***溶液1ml,1.0%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置10min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置40分钟,以第一份为空白;照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法,在800nm处测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
其中0.4%的十二烷基磺酸钠溶液的制备方法为:取0.4g十二烷基磺酸钠,置100ml量瓶中,加50%乙醇溶液微热使溶解,放冷,加50%乙醇溶液定容至刻度,即得;
c.供试品来源:云南云河药业有限责任公司,批号:070407
供试品溶液制备与测定法:取龙血竭药材,研细,取20.10mg,精密称定,置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀;取100目的聚酰胺2g,置蒸发皿中,精密加入上述溶液10ml,拌匀,置75℃水浴上挥干乙醇,装入内径为1.5cm层析柱,用25%的乙醇60ml洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇110ml洗脱,收集洗脱液并定容至100ml,摇匀,精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀;精密量取供试品溶液5ml,置25ml棕色量瓶中,加0.4%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.7%的铁***溶液1ml,1.0%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置10min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置40分钟,即得供试品溶液;照紫外-可见分光光度法,测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得;
供试品来源:
d.测定结果:龙血竭药材按干燥品计算,含总酚以7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计,为7.64mg,不少于30.0%,符合要求。
实施例4:7,4′-二羟基黄酮的含量测定方法:
照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸溶液的比例为20∶75为流动相,流0.8ml/min,检测波长为320nm,理论塔板数按7,4′-二羟基黄酮峰计,应不低于2500;
b.对照品来源:7,4′-二羟基黄酮,供含量测定用,纯度为98.23%;
对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的7,4′-二羟 基黄酮对照品适量,加甲醇制成每1ml含5μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品来源:西双版纳药业有限责任公司,批号:070618
供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取0.12g,精密称定,置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,精密吸取该甲醇溶液2ml,在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(20×20cm)上,于左边距1cm,底边距、右边距2cm处呈条状点样,于右边距1cm处点5μl对照品溶液,以氯仿-甲醇比例为18∶0.8为展开剂展开,展距15cm,取出,晾干,置360nm紫外灯下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑;按标记刮取色斑,置10ml量瓶中,精密加入甲醇10ml,称定重量,250w,40KHz超声提取4分钟,放冷至室温,加甲醇补足减失重量,摇匀,用微孔滤膜滤过,弃去初滤液,收集续滤液,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材含7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)为0.30mg,不低于0.2%,符合要求。
实施例5:7,4′-二羟基黄酮的含量测定方法:
照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸溶液的比例为24∶76为流动相,流速1ml/min,检测波长为330nm,理论塔板数按7,4′-二羟基黄酮峰计,应不低于3000;
b.对照品来源:7,4′-二羟基黄酮,供含量测定用,纯度为98.23%;
对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的7,4′-二羟基黄酮对照品适量,加甲醇制成每1ml含5μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品来源:广西中医学院制药厂,批号:070702
供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取0.15g,精密称定,置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,精密吸取该甲醇溶液2ml,在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(20×20cm)上,于左边距1cm,底边距、右边距2cm处呈条状点样,于右边距1cm处点5μl对照品溶液,以氯仿-甲醇比例为20∶1为展开剂展开,展距16cm,取出,晾干,置365nm紫外灯下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑;按标记刮取色斑,置10ml量瓶中,精密加入甲醇10ml,称定重量,250w,40KHz超声提取5分钟,放冷至室温,加甲醇补足减失重量,摇匀,用0.45μm的微孔滤 膜滤过,弃去初滤液,收集续滤液,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材含7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)为0.42mg,不低于0.2%,符合要求。
实施例6:7,4′-二羟基黄酮的含量测定方法:
照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸溶液的比例为28∶86为流动相,流速1.2ml/min,检测波长为335nm,理论塔板数按7,4′-二羟基黄酮峰计,应不低于3000;
b.对照品来源:7,4′-二羟基黄酮,供含量测定用,纯度为98.23%;
对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的7,4′-二羟基黄酮对照品适量,加甲醇制成每1ml含5μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品来源:云南云河药业有限责任公司,批号:070407
供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取0.18g,精密称定,置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,精密吸取该甲醇溶液2ml,在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(20×20cm)上,于左边距1cm,底边距、右边距2cm处呈条状点样,于右边距1cm处点5μl对照品溶液,以氯仿-甲醇比例为22∶1.2为展开剂展开,展距18cm,取出,晾干,置370nm紫外灯下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑;按标记刮取色斑,置10ml量瓶中,精密加入甲醇10ml,称定重量,250w,40KHz超声提取8分钟,放冷至室温,加甲醇补足减失重量,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,弃去初滤液,收集续滤液,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材含7,4′-二羟基黄酮(C15H10O4)为0.54mg,不低于0.2%,符合要求。
实施例7:龙血素B的含量测定方法:
照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液比例为35∶55为流动相,流速0.8ml/min,检测波长为270nm,理论塔板数按龙血素B峰计,应不低于10000;
b.对照品来源:龙血素B对照品,中国药品生物制品检定所, 供含量测定用;
对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量,加45%甲醇制成每1ml含40μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品来源:西双版纳药业有限责任公司,批号:070618
供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取0.45g,精密称定,置50ml圆底烧瓶中,加25ml***,置55℃水浴锅表面,加热回流50分钟,滤过,用少量***清洗容器和滤器,滤液和洗液合并,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,再精密吸取1ml至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材含龙血素B(C18H20O5)为1.94mg,不低于0.4%,符合要求。
实施例8:龙血素B的含量测定方法:
照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液比例为40∶60为流动相,流速1.0ml/min,检测波长为278nm,理论塔板数按龙血素B峰计,应不低于10000;
b.对照品来源:龙血素B对照品,中国药品生物制品检定所,供含量测定用;
对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量,加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品来源:广西中医学院制药厂,批号:070702
供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取0.50g,精密称定,置50ml圆底烧瓶中,加30ml***,置60℃水浴锅表面,加热回流60分钟,滤过,用少量***清洗容器和滤器,滤液和洗液合并,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,再精密吸取1ml至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材含龙血素B(C18H20O5)为2.40mg,不低于0.4%,符合要求。
实施例9:龙血素B的含量测定方法:
照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液比例为45∶65为流动相,流速1.2ml/min,检测波长为280nm,理论塔板数按龙血素B峰计,应不低于10000;
b.对照品来源:龙血素B对照品,中国药品生物制品检定所,供含量测定用;
对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量,加55%甲醇制成每1ml含40μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品来源:云南云河药业有限责任公司,批号:070407;
供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取0.55g,精密称定,置50ml圆底烧瓶中,加30ml***,置65℃水浴锅表面,加热回流65分钟,滤过,用少量***清洗容器和滤器,滤液和洗液合并,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,再精密吸取1ml至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材含龙血素B(C18H20O5)为2.75mg,不低于0.4%,符合要求。
实施例10:指纹图谱测定
参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法,结合指纹图谱的要求进行测定:
a.色谱条件与***适应性:Agilent 1100液相色谱仪,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱为Waters Xterra C184.6×250mm,5μm,流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈,梯度洗脱,洗脱顺序为:0~50min时,流动相A从70%线性下降至20%,流动相B从30%线性上升至80%,50~60min时,流动相A保持在20%,流动相B保持在80%;流速为0.5ml/min,检测波长为275nm,理论板数按参照物龙血素B峰计算,不低于6000;
b.参照物来源:龙血素B,由中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用;
参照物溶液的制备:取龙血素B对照品适量,精密称定,加50%甲醇制成每1ml含50μg的溶液,即得参照物溶液;
c.供试品来源:广西中医学院制药厂,批号:070702
供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取0.45g,置锥形瓶 中,精密加入45%甲醇25ml,250W、40KHz超声处理25min,滤过,取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:供试品指纹图谱有9个共有峰,各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.42,2号峰0.49,3号峰0.60,4号峰0.65,5号峰0.72,6号峰0.77,7号峰0.95,S号峰1.00,8号峰1.08,其中S号峰为龙血素B的色谱峰;指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算,相似度为0.83,大于0.80,符合要求。
实施例11:指纹图谱测定
参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法,结合指纹图谱的要求进行测定:
a.色谱条件与***适应性:Agilent 1100液相色谱仪,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱为Waters Xterra C18 4.6×250mm,5μm,流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈,梯度洗脱,洗脱顺序为:0~50min时,流动相A从70%线性下降至20%,流动相B从30%线性上升至80%,50~60min时,流动相A保持在20%,流动相B保持在80%;流速为0.7ml/min,检测波长为280nm,理论板数按参照物龙血素B峰计算,不低于6000;
b.参照物来源:龙血素B,由中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用;
参照物溶液的制备:取龙血素B对照品适量,精密称定,加50%甲醇制成每1ml含50μg的溶液,即得参照物溶液;
c.供试品来源:广西中医学院制药厂,批号:070606
供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取0.50g,置锥形瓶中,精密加入50%甲醇25ml,250W、40KHz超声处理30min,滤过,取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:供试品指纹图谱有9个共有峰,各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.50,2号峰0.55,3号峰0.65,4号峰0.70,5号峰0.80,6号峰0.83,7号峰0.97,S号峰1.00,8号峰1.13,其中S号峰为龙血素B的色谱峰。
指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算,相似度为0.85,大于0.80,符合要求。
实施例12:指纹图谱测定
参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法,结合指纹图谱的要求进行测定:
a.色谱条件与***适应性:Agilent 1100液相色谱仪,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱为Waters Xterra C184.6×250mm,5μm,流动相为A:0.1%的磷酸与流动相B:乙腈,梯度洗脱,洗脱顺序为:0~50min时,流动相A从70%线性下降至20%,流动相B从30%线性上升至80%,50~60min时,流动相A保持在20%,流动相B保持在80%;流速为0.8ml/min,检测波长为285nm,理论板数按参照物龙血素B峰计算,不低于6000;
b.参照物来源:龙血素B,由中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用;
参照物溶液的制备:取龙血素B对照品适量,精密称定,加55%甲醇制成每1ml含50μg的溶液,即得参照物溶液;
c.供试品来源:云南云河药业有限责任公司,批号:070407
供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取0.55g,置锥形瓶中,精密加入55%甲醇25ml,250W、40KHz超声处理35min,滤过,取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:供试品指纹图谱有9个共有峰,各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.55,2号峰0.60,3号峰0.65,4号峰0.75,5号峰0.85,6号峰0.92,7号峰0.98,S号峰1.00,8号峰1.11,其中S号峰为龙血素B的色谱峰;指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算,相似度为0.88,大于0.80,符合要求。
Claims (9)
1.一种龙血竭药材的质量检测方法,其特征在于采用以下方法中的任意一种或几种:
(1)采用紫外-可见分光光度法检测,龙血竭药材中含总酚以7,4′-二羟基黄酮计不得少于30.0%,检测步骤如下:
a.对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮,加无水乙醇制成对照品溶液;
b.标准曲线的制备:量取不同剂量的对照品溶液,加无水乙醇,加十二烷基磺酸钠溶液,铁***溶液,三氯化铁溶液,摇匀,再加盐酸定容;照紫外-可见分光光度法,测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
c.供试品溶液制备与测定法:取龙血竭药材,加无水乙醇溶解;取聚酰胺,加入上述溶液10ml,挥干乙醇,装入层析柱,用10~30%的乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇洗脱,收集洗脱液并定容;量取该溶液置棕色量瓶中,加无水乙醇定容,量取该溶液置棕色量瓶中,加十二烷基磺酸钠溶液,铁***溶液,三氯化铁溶液,再加盐酸定容,摇匀,得供试品溶液;照紫外-可见分光光度法,测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得;
(2)采用高效液相色谱法检测,龙血竭药材中含7,4′-二羟基黄酮不得少于0.20%,检测步骤如下:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸溶液为流动相;
b.对照品溶液制备:称取7,4′-二羟基黄酮对照品适量,加甲醇制成对照品溶液;
c.供试品溶液制备:取龙血竭药材,研细,称定,置量瓶中,加甲醇稀释至刻度,吸取该甲醇溶液,在硅胶G薄层板上,点供试样品溶液和对照品溶液,以氯仿-甲醇溶液为展开剂展开,取出,晾干,置紫外灯下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑;按标记刮取色斑,置量瓶中,加入甲醇,称定重量,超声提取,放冷,加甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,弃去初滤液,收集续滤液,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液,注入液相色谱仪,测定,即得;
(3)采用高效液相色谱法检测,龙血竭药材中含龙血素B不得少于0.40%,检测步骤如下:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液;
b.对照品溶液的制备:称取龙血素B对照品,加甲醇制成对照品溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,称定,置烧瓶中,加***,加热回流,滤过,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容,摇匀,再精密吸取少量至量瓶中,用甲醇稀释定容,摇匀,滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液,注入液相色谱仪,测定,即得;
(4)采用高效液相色谱指纹图谱检测,其标准指纹图谱有9个共有峰,各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.40~0.60,2号峰0.45~0.65,3号峰0.55~0.75,4号峰0.60~0.80,5号峰0.70~0.90,6号峰0.71~0.95,7号峰0.90~1.10,S号峰1.00,8号峰1.01~1.25,其中S号峰为龙血素B的色谱峰,检测步骤如下:
a.色谱条件与***适应性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈,梯度洗脱;
b.参照物溶液的制备:取龙血素B对照品,加甲醇制成参照物溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,加入甲醇,超声处理,滤过,取续滤液,滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液,分别注入液相色谱仪,测定,即得。
2.如权利要求1所述总酚的含量测定方法,其特征在于:
a.对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮适量,加无水乙醇制成1ml中含20~40μg的溶液,即得;
b.标准曲线的制备:量取对照品溶液0ml,1.0ml,1.5ml,2.0ml,2.5ml,3.0ml,分别置25ml量瓶中,加无水乙醇至5ml,加十二烷基磺酸钠溶液2ml,铁***溶液1ml,三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置,以第一份为空白;照紫外-可见分光光度法,在750~800nm处测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
c.供试品溶液制备与测定法:取龙血竭药材,研细,约取10~30mg,置25ml量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀;取聚酰胺1~3g,置蒸发皿中,加入上述溶液10ml,拌匀,置热水浴上挥干乙醇,装入层析柱,用10~30%的乙醇40~60ml洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇80~120ml洗脱,收集洗脱液并定容至100ml,摇匀,量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀,量取该溶液5ml,置25ml棕色量瓶中,加十二烷基磺酸钠溶液2ml,铁***溶液1ml,三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置,得供试品溶液;照紫外-可见分光光度法,在750~800nm处测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得。
3.如权利要求2所述含量测定方法,其特征在于:
a.对照品溶液的制备:取7,4′-二羟基黄酮适量,精密称定,置棕色量瓶中,加无水乙醇制成每1ml中含32μg的溶液,即得;
b.标准曲线的制备:精密量取对照品溶液0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml,分别置25ml量瓶中,加无水乙醇至5ml,加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.6%的铁***溶液1ml,0.9%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置5min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置35分钟,以第一份为空白;照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法,在780nm处测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
c.供试品溶液制备与测定法:取龙血竭药材,研细,取约20mg,精密称定,置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀;取80~100目的聚酰胺2g,置蒸发皿中,精密加入上述溶液10ml,拌匀,置70℃水浴上挥干乙醇,装入内径为1.5em层析柱,用20%的乙醇50ml洗脱,弃去洗脱液,再用无水乙醇100ml洗脱,收集洗脱液并定容至100ml,摇匀,精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀;精密量取供试品溶液5ml,置25ml棕色量瓶中,加0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2ml,0.6%的铁***溶液1ml,0.9%三氯化铁溶液1ml,摇匀,置避光处放置5min,再加0.1M的盐酸定容至刻度,摇匀,置避光处放置35分钟,即得供试品溶液;照紫外-可见分光光度法,测定吸光度,从标准曲线上读取含量,计算,即得;
d.测定结果:龙血竭药材中含总酚以7,4′-二羟基黄酮计不得少于30.0%。
4.如权利要求1所述7,4′-二羟基黄酮的含量测定方法,其特征在于采用高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸溶液的比例为20~30∶75~85为流动相,流速0.5~1.5ml/min,检测波长为310~350nm;
b.对照品溶液制备:称取干燥至恒重的7,4′-二羟基黄酮对照品适量,加甲醇制成1ml含5μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品溶液制备:取龙血竭药材,研细,取约0.10~0.20g,称定,置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,吸取该甲醇溶液2ml,在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,点供试样品溶液和对照品溶液,以氯仿-甲醇的比例为15~25∶0.5~1.5为展开剂展开,展距,取出,晾干,置紫外灯下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑,按标记刮取色斑,置10ml量瓶中,加入甲醇10ml,称定重量,超声提取,放冷至室温,加甲醇补足减失重量,摇匀,用微孔滤膜滤过,弃去初滤液,收集续滤液,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5~20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
5.如权利要求4所述的含量测定方法,其特征在于:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸溶液的比例为24∶76为流动相,流速1ml/min,检测波长为330nm,理论塔板数按7,4′-二羟基黄酮峰计,应不低于3000;
b.对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的7,4′-二羟基黄酮对照品适量,加甲醇制成每1ml含5μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.15g,精密称定,置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,精密吸取该甲醇溶液2ml,在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,于左边距1cm,底边距、右边距2cm处呈条状点样,于右边距1cm处点5μl对照品溶液,以氯仿-甲醇比例为20∶1为展开剂展开,展距16cm,取出,晾干,置365nm紫外灯下观察荧光,并与对照品荧光斑点对照,标记供试品与对照品相应位置的色斑;按标记刮取色斑,置10ml量瓶中,精密加入甲醇10ml,称定重量,250w,40KHz超声提取5分钟,放冷至室温,加甲醇补足减失重量,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,弃去初滤液,收集续滤液,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材中含7,4′-二羟基黄酮不得少于0.20%。
6.如权利要求1所述龙血素B的含量测定方法,其特征在于采用高效液相色谱法测定:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液比例为30~50∶50~70为流动相,流速0.5~1.5ml/min,检测波长为250~300nm;
b.对照品溶液的制备:称取干燥的龙血素B对照品适量,加甲醇制成1ml含40μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.3~0.8g,称定,置烧瓶中,加***,置水浴锅表面,加热回流,滤过,用***清洗容器和滤器,滤液和洗液合并,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,再精密吸取1ml至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5~20μl注入液相色谱仪,测定,即得。
7.如权利要求6所述的含量测定方法,其特征在于:
a.色谱条件和***适用性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-1%冰醋酸水溶液比例为40∶60为流动相,流速1.0ml/min,检测波长为278nm,理论塔板数按龙血素B峰计,应不低于10000;
b.对照品溶液的制备:精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量,加50%甲醇制成每1ml含40μg的溶液,作为对照品溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.5g,精密称定,置50ml圆底烧瓶中,加30ml***,置60℃水浴锅表面,加热回流60分钟,滤过,用少量***清洗容器和滤器,滤液和洗液合并,挥干***,残渣加甲醇溶解并定容至25ml,摇匀,再精密吸取1ml至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:龙血竭药材中含龙血素B不得少于0.40%。
8.如权利要求1所述指纹图谱测定方法,其特征在于高效液相色谱法测定:
a.色谱条件与***适应性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈,梯度洗脱,洗脱顺序为:0~50min时,流动相A从70%线性下降至20%,流动相B从30%线性上升至80%,50~60min时,流动相A保持在20%,流动相B保持在80%;流速为0.4~1.0ml/min,检测波长为250~300nm;
b.参照物溶液的制备:取龙血素B对照品适量,精密称定,加甲醇制成1ml含50μg的溶液,即得参照物溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.3~0.8g,置锥形瓶中,加入甲醇,超声处理,滤过,取续滤液用微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5~20μl,分别注入液相色谱仪,测定,即得。
9.如权利要求8所述的指纹图谱的应用,其特征为:
参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法,结合指纹图谱的要求进行测定:
a.色谱条件与***适应性:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相为A:0.1%的磷酸与B:乙腈,梯度洗脱,洗脱顺序为:0~50min时,流动相A从70%线性下降至20%,流动相B从30%线性上升至80%,50~60min时,流动相A保持在20%,流动相B保持在80%;流速为0.7ml/min,检测波长为280nm,理论板数按参照物龙血素B峰计算,不低于6000;
b.参照物溶液的制备:取龙血素B对照品适量,精密称定,加50%甲醇制成每1ml含50μg的溶液,即得参照物溶液;
c.供试品溶液的制备:取龙血竭药材,研细,取约0.5g,置锥形瓶中,精密加入50%甲醇25ml,250W、40KHz超声处理30min,滤过,取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
d.测定法:精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,测定,即得;
e.测定结果:供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算,相似度应大于0.80。
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