CN102809617B - 一种鱼腥草地上部分的检测方法 - Google Patents
一种鱼腥草地上部分的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102809617B CN102809617B CN201210298974.3A CN201210298974A CN102809617B CN 102809617 B CN102809617 B CN 102809617B CN 201210298974 A CN201210298974 A CN 201210298974A CN 102809617 B CN102809617 B CN 102809617B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peak
- retention time
- relative
- cordate houttuynia
- relative retention
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
本发明提供了一种鱼腥草地上部分的提取物。本发明还提供了鱼腥草地上部分的检测方法，它是采用HPLC指纹图谱法进行检测的。本发明制备得到的鱼腥草地上部分提取物，涵盖了多类有效成分，其物质基础较为明确，可以作为药材质量检测中一种新的标准对照物，更有利于对鱼腥草地上部分的质量控制。本发明通过对供试品溶液制备方法、色谱条件的综合考察，最终得到了最佳的鱼腥草地上部分检测方法。利用本发明方法检测时，基线平稳，各色谱峰峰形和分离度均良好，并且，可以同时对鱼腥草地上部分的黄酮类、有机酸类化合物进行检测，为鱼腥草地上部分的质量检测提供了可靠的方法，为鱼腥草地上部分的药材质量提供了保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼腥草地上部分的检测方法。
背景技术
鱼腥草，是三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草或干燥地上部分，其味辛，性微寒，归肺经，可清热解毒，消痈排脓，利尿通淋，用于治疗肺痈吐脓，痰热喘咳，热痢，热淋，痈肿疮毒。
药理研究发现，鱼腥草对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等多种细菌有较强的抗菌作用；鱼腥草煎剂对病毒有抑制作用，其非挥发油部分，能明显预防流感病毒；鱼腥草煎剂还能增强白细胞的吞噬能力，具有免疫增强作用；鱼腥草中所含槲皮苷能扩张肾血管，提高肾血流量，可能与鱼腥草的利尿作用相关。当前对鱼腥草的研究发现，其地上部分含有较多的化学成分与其药用活性相关，如挥发油：癸酰乙醛、月桂醛、α-蒎烯、芳樟醇、丁香烯、乙酸龙脑酯等；黄酮类：金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、异槲皮苷等；有机酸：绿原酸、亚油酸等（《中药大辞典》2006版）。
对于鱼腥草地上部分和地下部分的研究还发现，地上部分中金丝桃苷、槲皮苷等含量明显高于地下部分（郑一敏，等，高效液相色谱法测定鱼腥草中金丝桃苷与槲皮苷的含量，现代中药研究与实践，2005年19卷第3期）。上述对化学成分含量的研究结果，说明了鱼腥草地上部分的药用活性更为良好；同时，药典中还指出其干燥地上部分可以单独作为鱼腥草药材来源，这也说明了鱼腥草地上部分的药用价值较高，与上述化学成分含量的研究结果相对应。
为了有效控制鱼腥草药材的质量，目前已有研究人员采用高效液相色谱指纹图谱对鱼腥草地上部分的化学成分进行了分析，如卢红梅等，以甲醇-磷酸盐缓冲液***为流动相，对鱼腥草地上部分的50%乙醇提取物进行了HPLC检测，并测定了芦丁、槲皮苷和槲皮素3种黄酮类成分的含量（卢红梅，等，鱼腥草中黄酮类成分的高效液相色谱指纹图谱分析，色谱，2010年28卷10期）。但是，该检测方法中，是以一定浓度的乙醇提取药材后进行测定，而当前制剂中多是采用水煎形式提取鱼腥草，所得成分与50%乙醇提取物有一定差异；同时，该方法中用于评价药材质量的指标仅有黄酮类化合物，而鱼腥草中的其他化学成分也具有良好的药用活性（如有机酸类化合物），因 此，仅以黄酮类化合物为评价指标，并不能完全反应鱼腥草药材的治疗。
因此，急需一种能够为全面地检测鱼腥草地上部分质量的方法。
同时，目前在使用液相检测中药材质量时，多是采用对照品或指纹图谱进行检测，其中，采用对照品检测时，不能充分反映药材的质量；而采用指纹图谱时，虽然能够全面反应药材质量，但是，也可能因为检测仪器、流动相、环境条件等多种因素的差异，造成测量的误差。若能够提供一种药材的标准提取物，该提取物中包含了较多的有效成分，且物质基础明确，那么，将该提取物与指纹图谱检测手段联合使用后，必定能够避免或降低外界因素带来的误差，更能有效反映药材质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更有利于对鱼腥草地上部分进行质量控制的鱼腥草地上部分提取物；本发明的另一目的在于提供一种鱼腥草地上部分的检测方法。
本发明提供了一种鱼腥草地上部分提取物，该提取物的HPLC指纹图谱中的特征如下：有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间为0.224-0.273，相对峰面积为0.26-1.02；
2号峰：相对保留时间为0.300-0.366，相对峰面积为0.26-1.05；
3号峰：相对保留时间为0.351-0.429，相对峰面积为0.12-0.48；
4号峰：相对保留时间为0.824-0.870，相对峰面积为0.34-1.37；
5号峰：相对保留时间为0.843-0.890，相对峰面积为0.06-0.26；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1；
上述HPLC指纹图谱的色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂；
检测波长：254±5nm；
流动相：以0.1-0.5%V/V冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：
从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%。
进一步地，所述指纹图谱的特征如下：有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间0.24-0.25，占参照峰的面积比0.4-0.6；
2号峰：相对保留时间0.33-0.34，占参照峰的面积比0.4-0.6；
3号峰：相对保留时间0.39-0.40，占参照峰的面积比0.2-0.4；
4号峰：相对保留时间0.84-0.85，占参照峰的面积比0.6-0.8；
5号峰：相对保留时间0.86-0.87，占参照峰的面积比0.1-0.2；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
更进一步地，所述指纹图谱的特征如下：有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间0.248，占参照峰的面积比0.51；
2号峰：相对保留时间0.333，占参照峰的面积比0.52；
3号峰：相对保留时间0.392，占参照峰的面积比0.24；
4号峰：相对保留时间0.848，占参照峰的面积比0.68；
5号峰：相对保留时间0.867，占参照峰的面积比0.13；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
进一步优选地，所述标准指纹图谱如图4所示。
本发明还提供了一种鱼腥草地上部分的检测方法，它是采用HPLC指纹图谱法进行检测的，它包括如下操作步骤：
（1）供试品溶液的制备：
取鱼腥草地上部分，经水提醇沉后的上清液，除去乙醇后，上非极性或弱极性大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至水洗液无色，再用50%～90%V/V乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，除去溶剂后，残渣用50%～90%V/V甲醇溶解，过滤，即得供试品溶液；
（2）色谱条件：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂；
检测波长：254±5nm；
流动相：以0.1-0.5%V/V冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：
从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%，并维持10分钟；
（3）将供试品溶液所得色谱图与标准指纹图谱进行比对，计算相似度。
进一步地，步骤（1）中，上D101大孔吸附树脂柱。
进一步地，步骤（1）中，洗脱用乙醇的浓度为70%V/V，甲醇浓度为70%V/V。
进一步地，所述的水提醇沉是指：将鱼腥草地上部分加水煎煮后，水煎 液浓缩至60～80℃时相对密度为1.10～1.30的清膏，加乙醇至含醇量为50%～90%V/V，静置。
进一步地，步骤（2）中，所述流动相A为0.2%V/V冰醋酸溶液。
进一步地，步骤（2）中，检测波长为254nm。
进一步地，所述色谱柱为Inertsil ODS-3 150×4.6mm，5μm。
进一步地，步骤（2）中，柱温为35℃，流速为1.0ml/min。
进一步地，所述HPLC指纹图谱法中，以槲皮苷、金丝桃苷、绿原酸中的一种化合物或两种以上的混合物为对照品。
槲皮苷和金丝桃苷为黄酮类成分，绿原酸为有机酸类化合物。目前药理研究发现，金丝桃苷，具有很好的治疗急慢性气管炎、哮喘的作用，还有抗心肌缺血损伤、心肌脂质过氧化等作用；槲皮苷，具有较强的抗病毒作用；绿原酸，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗诱变、抗血小板凝固、保肝利胆等作用。上述三种成分的药理作用与鱼腥草的常用药效活性密切相关。因此，若以上述3种成分为对照品，更有利于对鱼腥草地上部分的质量控制。
进一步地，所述鱼腥草地上部分为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜地上部分。
进一步地，该方法中还包括如下步骤：
其中，所述标准指纹图谱的特征如下：有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间为0.224-0.273，相对峰面积为0.26-1.02；
2号峰：相对保留时间为0.300-0.366，相对峰面积为0.26-1.05；
3号峰：相对保留时间为0.351-0.429，相对峰面积为0.12-0.48；
4号峰：相对保留时间为0.824-0.870，相对峰面积为0.34-1.37；
5号峰：相对保留时间为0.843-0.890，相对峰面积为0.06-0.26；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
进一步地，所述标准指纹图谱的特征如下：有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间0.24-0.25，占参照峰的面积比0.4-0.6；
2号峰：相对保留时间0.33-0.34，占参照峰的面积比0.4-0.6；
3号峰：相对保留时间0.39-0.40，占参照峰的面积比0.2-0.4；
4号峰：相对保留时间0.84-0.85，占参照峰的面积比0.6-0.8；
5号峰：相对保留时间0.86-0.87，占参照峰的面积比0.1-0.2；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
更进一步地，所述标准指纹图谱的特征如下：有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间0.248，占参照峰的面积比0.51；
2号峰：相对保留时间0.333，占参照峰的面积比0.52；
3号峰：相对保留时间0.392，占参照峰的面积比0.24；
4号峰：相对保留时间0.848，占参照峰的面积比0.68；
5号峰：相对保留时间0.867，占参照峰的面积比0.13；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
进一步优选地，所述标准指纹图谱如图4所示。
本发明制备得到的鱼腥草地上部分提取物，涵盖了多类活性成分，其物质基础较为明确，可以作为药材质量检测中一种新的标准对照物，更有利于对鱼腥草地上部分的质量控制。
本发明通过对供试品溶液制备方法、色谱条件的综合考察，最终得到了最佳的鱼腥草地上部分检测方法。利用本发明方法检测时，基线平稳，各色谱峰峰形和分离度均良好，并且，可以同时对鱼腥草地上部分的黄酮类、有机酸类化合物进行检测，从13批不同产地的鱼腥草地上部分中得出了该药材的产品共性——即标准指纹图谱，为鱼腥草地上部分的质量检测提供了可靠的方法，为鱼腥草地上部分的药材质量提供了保障。
附图说明
图1参照品图谱（槲皮苷）
图2金丝桃苷对照品图谱
图3绿原酸对照品图谱
图4鲜鱼腥草地上部分对照指纹图谱
图5流动相条件2的考察图谱
图6流动相条件3的考察图谱
图7流动相条件4的考察图谱
图8色谱柱条件2的考察图谱
图9色谱柱条件3的考察图谱
图10未过柱样品的考察图谱
图1113批鲜鱼腥草样品地上部分指纹图谱
具体实施方式
实施例1本发明鱼腥草地上部分提取物的制备
取新鲜鱼腥草的地上部分，加水煎煮两次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20（60～80℃）的清膏，加乙醇至含 醇量为70%，搅匀，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至适量（含生药材5g/ml）。取5ml溶液上D101大孔吸附树脂（内径1cm，长10cm），吸附，用水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，收集70%乙醇洗脱液，水浴上蒸干，残渣用70%甲醇溶解，过滤，回收溶剂后，即得本发明鱼腥草地上部分提取物。
实施例2本发明鱼腥草地上部分的检测方法
（1）对照品溶液制备
取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1633mg的溶液，作为参照品溶液。
分别取金丝桃苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含金丝桃苷0.0881mg，含绿原酸0.1157mg的溶液，作为对照品溶液。
（2）供试品溶液制备
取新鲜鱼腥草的地上部分，加水煎煮两次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20（60～80℃）的清膏，加乙醇至含醇量为70%，搅匀，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至适量（含生药材5g/ml）。取5ml溶液上D101大孔吸附树脂（内径1cm，长10cm），吸附，用水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，收集70%乙醇洗脱液，水浴上蒸干，残渣用70%甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜作为鲜鱼腥草地上部分的供试品溶液。
（3）检测方法
分别精密吸取各对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，其色谱条件如下：
色谱柱：Inertsil ODS-3150×4.6mm，5μm
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
流动相：以0.2%冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%，并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
根据上述方法，以13批鱼腥草样品地上部分为基础，按中药色谱指纹图谱评价***，得出鱼腥草地上部分的标准指纹图谱，如图4所示，该指纹图谱中，有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算 其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间0.248，占参照峰的面积比0.51；
2号峰：相对保留时间0.333，占参照峰的面积比0.52；
3号峰：相对保留时间0.392，占参照峰的面积比0.24；
4号峰：相对保留时间0.848，占参照峰的面积比0.68；
5号峰：相对保留时间0.867，占参照峰的面积比0.13；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
将供试品溶液所得色谱图与标准指纹图谱进行比对，计算相似度。若相似度在0.90以上，则表明待测鱼腥草地上部分符合检测标准。
实施例3本发明检测方法的考察
（一）色谱条件的考察
(1)流动相的筛选试验
①对照品溶液制备
取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1633mg的溶液，作为参照品溶液。
分别取金丝桃苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含金丝桃苷0.0881mg，含绿原酸0.1157mg的溶液，作为对照品溶液。
②供试品溶液制备
取新鲜鱼腥草的地上部分，加水煎煮两次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20（60～80℃）的清膏，加乙醇至含醇量为70%，搅匀，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至适量（含生药材5g/ml）。取5ml溶液上D101大孔吸附树脂（内径1cm，长10cm），吸附，用水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，收集70%乙醇洗脱液，水浴上蒸干，残渣用70%甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜作为鲜鱼腥草地上部分的供试品溶液。
③流动相条件筛选
条件1：以0.2%冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%，并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
条件2：以0.2%冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至10分钟，流动相A由95%变为90%，从10分钟开始至40分钟，流动相A由90%变为85%，从40分钟开始至55分钟， 流动相A由85%变为65%，从55分钟开始至60分钟，流动相A由65%变为95%，并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
条件3：以0.2%冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至20分钟，流动相A由95%变为85%，从20分钟开始至50分钟，流动相A由85%变为83%，从50分钟开始至60分钟，流动相A由83%变为65%，从60分钟开始至65分钟，流动相A由65%变为95%，并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
条件4：0.1%磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至10分钟，流动相A由80%变为70%，并维持10分钟，从20分钟开始至50分钟，流动相A由70%变为35%，并维持5分钟，从55分钟开始至56分钟，流动相A由35%变为80%，并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
仪器：Waters2695-2996高效液相色谱仪，Empower色谱工作站。
色谱柱：Inertsil ODS-3（150mm×4.6mm,5um），柱温35℃。
④测定方法与结果：
分别精密吸取各对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，紫外检测器检测，测定波长为254nm，记录色谱图，观察色谱峰的分离情况，结果参见图4-7。
结果表明，流动相条件1分离最佳。
（2）色谱柱的筛选试验
①对照品溶液制备
取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1633mg的溶液，作为参照品溶液。
分别取金丝桃苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含金丝桃苷0.0881mg，含绿原酸0.1157mg的溶液，作为对照品溶液。
②供试品溶液制备
取新鲜鱼腥草的地上部分，加水煎煮两次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20（60～80℃）的清膏，加乙醇至含醇量为70%，搅匀，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至适量（含生药材5g/ml）。取5ml溶液上D101大孔吸附树脂（内径1cm，长10cm），吸附，用水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，收集70%乙醇洗脱液，水浴上蒸干，残渣用70%甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜作为鲜鱼腥草地上部分的供试品溶液。
③色谱柱种类
条件1：色谱柱：Inertsil ODS-3 150mm×4.6mm,5um
条件2：色谱柱：Alltech C18 150×4.6mm，5μm
条件3：色谱柱：Waters C18 150×4.6mm，5μm
仪器Waters2695-2996高效液相色谱仪，Empower色谱工作站。
流动相：以0.2%冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%，并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
④测定方法与结果：
分别精密吸取各对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，紫外检测器检测，测定波长为254nm，记录色谱图，观察色谱峰的分离情况，结果参见图4、8、9。
结果表明，色谱柱条件1分离最佳。
（3）大孔吸附树脂柱处理样品的考察结果
按实施例1中供试品制备方法进行上柱洗脱，与未洗脱的样品分别进样，色谱条件如实施例1，其结果参见图4、10:
图10为未上柱的色谱图，与图4比较，在保留时间10分钟之前有较多极性大的物质不易分离，所以上柱后的色谱图（图4）更适合指纹图谱的质量控制。
结果表明，上柱洗脱后分离效果良好。
（二）仪器精密度试验
①色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3 150×4.6mm，5μm
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
流动相：以0.2%冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%，并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
②对照品溶液制备
取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1633mg的溶液，作为参照品溶液。
分别取金丝桃苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含 金丝桃苷0.0881mg，含绿原酸0.1157mg的溶液，作为对照品溶液。
③供试品溶液制备
取新鲜鱼腥草的地上部分，加水煎煮两次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20（60～80℃）的清膏，加乙醇至含醇量为70%，搅匀，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至适量（含生药材5g/ml）。取5ml溶液上D101大孔吸附树脂（内径1cm，长10cm），吸附，用水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，收集70%乙醇洗脱液，水浴上蒸干，残渣用70%甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜作为鲜鱼腥草地上部分的供试品溶液。
④测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，紫外检测器检测，测定波长为254nm，记录色谱图。鲜鱼腥草地上部分进样测定9次，计算9次测定的图谱与对照指纹图谱的相似度，记录如下表。
表1鲜鱼腥草地上部分的测定精密度试验
（三）稳定性试验
①色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3 150×4.6mm，5μm
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
流动相：以0.2%冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%，并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
②对照品溶液制备
取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1633mg的溶液，作为参照品溶液。
分别取金丝桃苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含金丝桃苷0.0881mg，含绿原酸0.1157mg的溶液，作为对照品溶液。
③供试品溶液制备
取新鲜鱼腥草的地上部分，加水煎煮两次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20（60～80℃）的清膏，加乙醇至含醇量为70%，搅匀，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至适量（含生药材5g/ml）。取5ml溶液上D101大孔吸附树脂（内径1cm，长10cm），吸附，用水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，收集70%乙醇洗脱液，水浴上蒸干，残渣用70%甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜作为鲜鱼腥草地上部分的供试品溶液。
④测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别在0小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时注入液相色谱仪，紫外检测器检测，测定波长为254nm，记录色谱图。鲜鱼腥草地上部分在上述时间点进样，计算6次测定的图谱与对照指纹图谱的相似度，记录如下表。
表2鲜鱼腥草地上部分测定的稳定性试验
（四）重现性试验
①色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3 150×4.6mm，5μm
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
流动相：以0.2%冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%， 并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
②对照品溶液制备
取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1633mg的溶液，作为参照品溶液。
分别取金丝桃苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含金丝桃苷0.0881mg，含绿原酸0.1157mg的溶液，作为对照品溶液。
③供试品溶液制备
取新鲜鱼腥草的地上部分，加水煎煮两次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20（60～80℃）的清膏，加乙醇至含醇量为70%，搅匀，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至适量（含生药材5g/ml）。取5ml溶液上D101大孔吸附树脂（内径1cm，长10cm），吸附，用水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，收集70%乙醇洗脱液，水浴上蒸干，残渣用70%甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜作为鲜鱼腥草地上部分的供试品溶液。分别按照上述要求各制备9个供试品溶液。
④测定法
分别精密吸取对照品溶液与各供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，紫外检测器检测，测定波长为254nm，记录色谱图。计算9个供试品溶液的图谱与对照指纹图谱的相似度，记录如下表。
表3鲜鱼腥草地上部分测定的重现性试验
（五）13批鲜鱼腥草样品（地上部分）指纹图谱的详细测定情况和测定数据
①色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3 150×4.6mm，5μm
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
流动相：以0.2%冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%，并维持10分钟，梯度均为线性梯度。
②对照品溶液制备
取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1633mg的溶液，作为参照品溶液。
分别取金丝桃苷、绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含金丝桃苷0.0881mg，含绿原酸0.1157mg的溶液，作为对照品溶液。
③供试品溶液制备
取新鲜鱼腥草的地上部分，加水煎煮两次，每次0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20（60～80℃）的清膏，加乙醇至含醇量为70%，搅匀，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至适量（含生药材5g/ml）。取5ml溶液上D101大孔吸附树脂（内径1cm，长10cm），吸附，用水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，收集70%乙醇洗脱液，水浴上蒸干，残渣用70%甲醇溶解并定容至25ml容量瓶中，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜作为鲜鱼腥草地上部分的供试品溶液。鲜鱼腥草的地上部分有如下13个批次，13批样品均符合《中国药典》2010年版一部相关规定，详细信息见下表。
表4鲜鱼腥草地上部分收集情况
④测定法
分别精密吸取各对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，紫 外检测器检测，测定波长为254nm，记录色谱图。
⑤结果讨论：
比较13批鱼腥草样品地上部分的指纹图谱，发现：a.13批样品中共有的色谱峰6个；b.由样品1~13的指纹图谱，拟定生成对照指纹图谱。将其他样品的指纹图谱与对照指纹图谱进行比较，在供试品色谱图中，均有6个与对照指纹图谱对应的特征峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价***计算，除S峰外，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.90。
表513批鲜鱼腥草地上部分的相似度数据
所述鲜方鱼腥草地上部分的标准指纹图谱中对应的6个特征峰为：
以槲皮苷为参照时，1-5号峰的具体数据：
1号峰：相对保留时间0.248，占参照峰的面积比51.0%；
2号峰：相对保留时间0.333，占参照峰的面积比52.0%；
3号峰：相对保留时间0.392，占参照峰的面积比24.0%；
4号峰：相对保留时间0.848，占参照峰的面积比68.0%；
5号峰：相对保留时间0.867，占参照峰的面积比13.0%；
S峰：为参照峰（槲皮苷）。
将上述标准指纹图谱的特征峰，通过相似度计算后，可以得出以下可接受范围：
1号峰：相对保留时间0.224-0.273，占参照峰的面积比26.0%-102.0%；
2号峰：相对保留时间0.300-0.366，占参照峰的面积比26.0%-105.0%；
3号峰：相对保留时间0.351-0.429，占参照峰的面积比12.0%-48.0%；
4号峰：相对保留时间0.824-0.870，占参照峰的面积比34.0%-137.0%；
5号峰：相对保留时间0.843-0.890，占参照峰的面积比6.0-26.0%；
S峰：为参照峰。
综上所述，本发明制备得到的鱼腥草地上部分提取物，涵盖了多类有效成分，其物质基础较为明确，可以作为药材质量检测中一种新的标准对照物，更有利于对鱼腥草地上部分的质量控制。
本发明通过对供试品溶液制备方法、色谱条件的综合考察，最终得到了最佳的鱼腥草地上部分检测方法。利用本发明方法检测时，基线平稳，各色谱峰峰形和分离度均良好，并且，可以同时对鱼腥草地上部分的黄酮类、有机酸类化合物进行检测，从13批不同产地的鱼腥草地上部分中得出了该药材的产品共性——即标准指纹图谱，为鱼腥草地上部分的质量检测提供了可靠的方法，为鱼腥草地上部分的药材质量提供了保障。
Claims (14)
1.一种鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：它是采用HPLC指纹图谱法进行检测的，包括如下操作步骤：
（1）供试品溶液的制备：
取鱼腥草地上部分，经水提醇沉后的上清液，除去乙醇后，上非极性或弱极性大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至水洗液无色，再用50%～90%V/V乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，除去溶剂后，残渣用50%～90%V/V甲醇溶解，过滤，即得供试品溶液；
（2）色谱条件：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂；
检测波长：254±5nm；
流动相：以0.1-0.5%V/V冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：
从0分钟开始至15分钟，流动相A由95%变为89%，从15分钟开始至45分钟，流动相A由89%变为87%，从45分钟开始至60分钟，流动相A由87%变为65%，从60分钟开始至63分钟，流动相A由65%变为95%；
（3）将供试品溶液所得色谱图与标准指纹图谱进行比对，计算相似度。
2.根据权利要求1所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述大孔吸附树脂型号为D101。
3.根据权利要求1所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，洗脱用乙醇的浓度为70%V/V，甲醇浓度为70%V/V。
4.根据权利要求1所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：所述的水提醇沉是指：将鱼腥草地上部分加水煎煮后，水煎液浓缩至60～80℃时相对密度为1.10～1.30的清膏，加乙醇至含醇量为50%～90%V/V，静置。
5.根据权利要求1所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述流动相A为0.2%V/V冰醋酸溶液。
6.根据权利要求1所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，检测波长为254nm。
7.根据权利要求1所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：所述色谱柱为Inertsil ODS-3 150×4.6mm，5μm。
8.根据权利要求1所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，柱温为35℃，流速为1.0ml/min。
9.根据权利要求1所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：所述HPLC指纹图谱法中，以槲皮苷、金丝桃苷、绿原酸中的一种化合物或两种以上的混合物为对照品。
10.根据权利要求1或5所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：所述鱼腥草地上部分为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜地上部分。
11.根据权利要求1所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：所述标准指纹图谱的特征如下：有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间为0.224-0.273，相对峰面积为0.26-1.02；
2号峰：相对保留时间为0.300-0.366，相对峰面积为0.26-1.05；
3号峰：相对保留时间为0.351-0.429，相对峰面积为0.12-0.48；
4号峰：相对保留时间为0.824-0.870，相对峰面积为0.34-1.37；
5号峰：相对保留时间为0.843-0.890，相对峰面积为0.06-0.26；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
12.根据权利要求11所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于: 所述标准指纹图谱的特征如下：有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间0.24-0.25，占参照峰的面积比0.4-0.6；
2号峰：相对保留时间0.33-0.34，占参照峰的面积比0.4-0.6；
3号峰：相对保留时间0.39-0.40，占参照峰的面积比0.2-0.4；
4号峰：相对保留时间0.84-0.85，占参照峰的面积比0.6-0.8；
5号峰：相对保留时间0.86-0.87，占参照峰的面积比0.1-0.2；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
13.根据权利要求12所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于: 所述标准指纹图谱的特征如下：有6个特征峰，以槲皮苷色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，其中，
1号峰：相对保留时间0.248，占参照峰的面积比0.51；
2号峰：相对保留时间0.333，占参照峰的面积比0.52；
3号峰：相对保留时间0.392，占参照峰的面积比0.24；
4号峰：相对保留时间0.848，占参照峰的面积比0.68；
5号峰：相对保留时间0.867，占参照峰的面积比0.13；
槲皮苷色谱峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
14.根据权利要求13所述的鱼腥草地上部分的检测方法，其特征在于：所述标准指纹图谱如图4所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210298974.3A CN102809617B (zh) | 2012-08-21 | 2012-08-21 | 一种鱼腥草地上部分的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210298974.3A CN102809617B (zh) | 2012-08-21 | 2012-08-21 | 一种鱼腥草地上部分的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102809617A CN102809617A (zh) | 2012-12-05 |
| CN102809617B true CN102809617B (zh) | 2014-07-02 |
Family
ID=47233377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210298974.3A Active CN102809617B (zh) | 2012-08-21 | 2012-08-21 | 一种鱼腥草地上部分的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102809617B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103254049B (zh) * | 2013-04-16 | 2014-12-10 | 华东师范大学 | 一种从鱼腥草中提取癸酰乙醛的方法 |
| CN104849363A (zh) * | 2015-03-17 | 2015-08-19 | 中山市中智药业集团有限公司 | 鱼腥草破壁饮片的指纹图谱构建及其质量检测方法 |
| CN107860848A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-03-30 | 成都中医药大学 | 一种检测鱼腥草黄酮类成分含量的hplc方法 |
| CN108037197B (zh) * | 2017-11-27 | 2020-08-07 | 中山市中智药业集团有限公司 | 一种鱼腥草破壁饮片非挥发类次生代谢产物化学成分定性及定量分析的方法 |
| CN108484388B (zh) * | 2018-03-06 | 2021-03-19 | 成都中医药大学 | 一种鱼腥草中新化合物及其制备方法和用途 |
| CN115372516B (zh) * | 2022-08-24 | 2023-11-03 | 浙江惠松制药有限公司 | 一种鱼腥草芩蓝合剂中间体核苷类成分的含量测定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1803179A (zh) * | 2005-01-13 | 2006-07-19 | 北京凯瑞创新医药科技有限公司 | 一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法 |
| CN102590424A (zh) * | 2012-03-06 | 2012-07-18 | 浙江国镜药业有限公司 | 一种复方鱼腥草合剂的质量检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4031544B2 (ja) * | 1996-11-05 | 2008-01-09 | 日本製粉株式会社 | クロロフィラーゼ抑制剤、それを含む食品、飼料及び化粧料 |
-
2012
- 2012-08-21 CN CN201210298974.3A patent/CN102809617B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1803179A (zh) * | 2005-01-13 | 2006-07-19 | 北京凯瑞创新医药科技有限公司 | 一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法 |
| CN102590424A (zh) * | 2012-03-06 | 2012-07-18 | 浙江国镜药业有限公司 | 一种复方鱼腥草合剂的质量检测方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 卢红梅等.鱼腥草中黄酮类成分的高效液相色谱指纹图谱分析.《色谱》.2010,第28卷(第10期), |
| 孟江.鱼腥草化学成份及其指纹图谱的研究.《中国博士学位论文医药卫生科技辑》.2006,E057-45. |
| 张颖.鱼腥草黄酮类有效成分的提取与精制.《中国优秀硕士论文工程科技Ⅰ辑》.2009,B016-268. |
| 郑一敏等.高效液相色谱法测定鱼腥草中金丝桃苷与槲皮苷的含量.《现代中药研究与实践》.2005,第19卷(第3期), |
| 高效液相色谱法测定鱼腥草中金丝桃苷与槲皮苷的含量;郑一敏等;《现代中药研究与实践》;20050630;第19卷(第3期);27-28页 * |
| 鱼腥草中黄酮类成分的高效液相色谱指纹图谱分析;卢红梅等;《色谱》;20101028;第28卷(第10期);965-970页 * |
| 鱼腥草化学成份及其指纹图谱的研究;孟江;《中国博士学位论文医药卫生科技辑》;20061231;第47页第1、8段，第48页第1、4段，第50页第2段，第51页第1-2段，第53页第1段，第62页第1段，图12、15-16，表8 * |
| 鱼腥草黄酮类有效成分的提取与精制;张颖;《中国优秀硕士论文工程科技Ⅰ辑》;20090430;第43页第2、9-12段，第44页第7段，53页第1-2段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102809617A (zh) | 2012-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102809617B (zh) | 一种鱼腥草地上部分的检测方法 | |
| CN102091118B (zh) | 大花红景天药材的检测方法 | |
| CN103134871B (zh) | 高效液相色谱法检测乌头类生物碱用的供试品溶液的制备方法 | |
| CN104749306B (zh) | 一种构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法 | |
| CN101703599B (zh) | 栀子提取物的检测方法 | |
| CN1935798B (zh) | 一种穿心莲内酯的制备方法 | |
| CN106680403A (zh) | 一种检测铁皮石斛中石斛酚的方法 | |
| CN102488819A (zh) | 萱草花提取物的制备方法 | |
| CN102309531B (zh) | 一种西洋参药材指纹图谱的测定方法 | |
| CN101961405B (zh) | 检测复方杜仲片中松脂醇二葡萄糖苷含量的方法 | |
| CN103822888B (zh) | 赶黄草的质量检测方法 | |
| CN108627596A (zh) | 一种红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法及其制备方法 | |
| CN100388940C (zh) | 一种小儿高热不退的中药制剂质量控制方法 | |
| CN103293261A (zh) | 白及药材的含量测定方法 | |
| CN103969356B (zh) | 一种丹参药材的指纹图谱的鉴别方法 | |
| CN100445730C (zh) | 中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法 | |
| CN104807944A (zh) | 鸦葱总黄酮的制备方法及其指纹图谱 | |
| CN102628838B (zh) | 一种药材马蓝的hplc指纹图谱构建方法 | |
| CN101732431A (zh) | 液相色谱分离制备中药附子中主要酯型生物碱的方法 | |
| CN103058859B (zh) | 一种香椿叶中没食子酸及其甲酯的同时制备及检测方法 | |
| CN105061212B (zh) | 一种新绿原酸的制备方法 | |
| CN104327026A (zh) | 一种提取分离木香烃内酯和去氢木香烃内酯的方法 | |
| CN109828055B (zh) | 一种三白草药材的hplc指纹图谱的建立方法 | |
| CN103115997B (zh) | 一种治疗直肠炎药物的质量控制方法 | |
| CN101518565B (zh) | 一种野葛藤提取物hplc指纹图谱的构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |