CN102419350B - 一种同时定量分析五味子原料和五味子浸膏中四种木脂素成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定五味子原料或五味子浸膏中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素含量的方法，所述方法采用粉碎、过筛、甲醇超声提取、定容、过滤等手段处理北五味子或五味子浸膏后得到供试样品溶液，利用高效液相色谱法同时测定四种五味子木脂素的含量。该方法在柱温25～45℃，流动相为甲醇和0.05～0.2％三氟乙酸水溶液(甲醇和三氟乙酸水溶液体积比为50∶50～100∶0)，洗脱时间30～60min，流速0.7～1.5ml/min、检测波长210～280nm条件下，利用反向分配层析原理，通过梯度洗脱对样品进行分析。该质量检测方法简便、快速、灵敏、准确。

Description

一种同时定量分析五味子原料和五味子浸膏中四种木脂素成分的方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，涉及一种中药成分的定量分析方法，具体涉及一种以高效液相色谱方法定量分析五味子原料和/或五味子浸膏中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素含量的方法。

背景技术

五味子俗称山花椒、秤砣子、药五味子、面藤、五梅子等，为木兰科植物五味子(Schisandra chinesnsis Baill)的干燥成熟果实。唐等《新修本草》载“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有成味”，故有五味子之名。古医书称它荎蕏、玄及、会及，最早列于神农本草经上品，中药功效在于滋补强壮之力，药用价值极高，临床主要用于久咳虚喘、津伤口渴、阴虚消渴、自汗、盗汗、遗精、久泻不止、心悸、失眠、多梦等，是我国中医应用最广泛的滋补中药之一。

李时珍曾谓：“五味今有南北之分，南产者色红，北产者色黑，人滋补药必用北产者良”。中国药典2000年版将北五味子和南五味子分别收载为两个品种，五味子只特指北五味子的干燥成熟果实，而南五味子特指华中五味子的干燥成熟果实。

北五味子是著名的药用植物，自然分布黑龙江省小兴安岭、完达山、张广才岭、老爷岭等山区。主产于东北和河北等地的五味子果实干品，商品习惯称为“北五味子”。新鲜的北五味子果为鲜艳红色的浆果，多汁、味酸而微涩，有花椒气味。鲜果汁是加工天然保健饮品的原料；干果黑***，有绉皱，是传统的中药材，对人体的中枢神经***、呼吸***有兴奋作用，对心脏、肝脏、血压有调节作用，对人的视力、听力有强化功能；促进胆汁分泌，提高抗菌能力。

北五味子主要成分是木脂素、挥发油、三萜、有机酸、维生素和多糖等。其中木脂素类化合物主要是联苯环辛烯类化合物，现代医学表明，木脂素类为五味子中最主要的药效活性成分，对中枢神经***、心血管***、消化***等具有多种药理作用。目前，对于木脂素的生理活性研究较多的是对肝脏有作用的成分。对五味子7种有效成分药理研究和临床证明，均有降低肝炎患者血清谷丙转氨酶水平的作用，其中五味子酯乙作用最强，其次是醇乙、丙素、乙素、甲素、酯甲和醇甲。其化学结构式分别如下所示：

(I)五味子酯乙

(II)五味子醇乙

(III)五味子丙素

(IV)五味子乙素：

(V)五味子甲素

(VI)五味子酯甲

(VII)五味子醇甲

五味子降酶机理主要是对肝细胞的保护作用，能促进损伤肝细胞的修复和抑制肝细胞病变，使细胞膜发生某种机能性改变，通透性降低，从而使漏到血浆中转氨酶减少，对转氨酶的合成并无抑制作用。此外还发现五味子木脂素成分还具有抗氧化作用，以五味子乙素的抗氧化活性最强。

五味子木脂素化学成分的分离检测方法主要有分光光度法、毛细管电色谱法和高效液相色谱法，其中应用最多的分析方法是高效液相色谱法。

CN 101373182 A提供了一种中药北五味子的质量检测方法，其利用粉碎、过筛、甲醇超声提取、定容、过滤处理手段将北五味子处理后，通过电喷雾质谱得到木脂素类成分及有机酸类成分的指纹图谱，根据其指纹图谱确定北五味子中所含的木脂素及有机酸的种类，利用高效液相色谱法测定木脂素类化合物的含量，综合其指纹图谱及含量测定数据，可以对北五味子的质量进行评价。

CN 1866026 A公开了南五味子醇浸膏的质量检控方法。所述南五味子醇浸膏采用下述至少一种方法实施质量检控：以干膏重量计，用紫外分光光度法测定其总木脂素含量(以五味子甲素重量计)不少于5.6％；或用高效液相色谱法测定其五味子酯甲含量不少于0.7％；或用高效液相色谱法测定其五味子甲素含量不少于1.0％。本发明通过对生产工艺过程中南五味子醇浸膏有效成分的含量检测控制，可有效地控制由南五味子醇浸膏制成的药物的内在质量。

目前关于五味子的质量控制主要是以单个或是某几个成分为主，即使是测定同样的组分对于不同的分析仪器，分析条件也并不能完全适用，需要进行调整或者重新摸索分析方法。且目前对于在不同的分析仪器中确定最佳的高效液相色谱分析条件的方法研究报道都不完善，尚未有过关于用反相分配柱为ZORBAX Extend-C18(150×4.6mm，5μm)以甲醇-0.1％三氟乙酸水溶液为流动相同时定量测定五味子原料和/或五味子浸膏中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的相关报道。

发明内容

目前，尚未有关于用反相分配柱为ZORBAX Extend-C18(150×4.6mm，5μm)以甲醇-0.1％三氟乙酸水溶液为流动相同时定量测定五味子原料和/或五味子浸膏中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的相关报道。因此本发明的目的就在于提供一种简便、快速、灵敏、准确度高、精确度好的同时定量测定五味子原料和/或五味子浸膏中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素方法。

本发明的同时定量测定五味子原料和/或五味子浸膏中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的方法，包括如下步骤：

(1)供试样品溶液制备

供试样品溶液I：选择50％～100％的低碳醇为提取溶剂，将北五味子粉碎，干燥后加入所述提取溶剂，进行超声提取，经微孔膜过滤获得样品溶液I。或：

供试样品溶液II：经醇提，减压干燥后的浸膏用低碳醇溶解，经微孔膜过滤获得样品溶液II。

所述低碳醇优选1-5个碳原子的低碳醇，如甲醇、乙醇、丙醇或其混合物，更优选采用甲醇。

供试样品溶液I所述的干燥，其干燥温度优选为40-70℃，进一步优选50-60℃，最优选55℃；其干燥时间优选6-48h，进一步优选12～24h。

供试样品溶液I所述的干燥后的五味子粉碎物，优选紧接着过30～80目筛。

所述五味子粉末与低碳醇的混合比为：(0.25～0.5g)五味子粉末/(25～50mL)低碳醇。

所述超声提取时间为10～90min，优选30～60min，超声提取温度优选室温～60℃，进一步优选20～40℃。

所述浸膏用低碳醇溶解后，优选按(150～250mg)浸膏/10ml的比例定容，定容后过滤。

所述过滤优选采用孔径小于0.60μm的微孔膜滤膜，更优选采用孔径小于0.45μm的微孔膜滤膜。

(2)五味子木脂素含量的测定

高效液相色谱实验条件：ZORBAX Extend-C18液相色谱柱(150×4.6mm，5μm)；柱温25℃～45℃；流动相：低碳醇和0.05％～0.2％三氟乙酸水溶液；洗脱时间30～60min；流速0.7～1.5ml/min；检测波长210～280nm；样品进样量10～50μl。

所述低碳醇和三氟乙酸水溶液的体积比为50∶50～100∶0，优选50∶50～80∶20。本发明所述的100∶0表示流动相仅为低碳醇，不包括三氟乙酸水溶液，但本发明优选包括三氟乙酸水溶液，即三氟乙酸水溶液的含量大于0，低碳醇含量小于100，进而低碳醇和三氟乙酸水溶液的体积比小于100∶0。

木脂素含量的测定：(I)准确称取减压干燥后的五味子醇甲5mg，五味子酯甲1.4mg，五味子甲素2mg，五味子乙素3.6mg，用色谱级低碳醇溶解，定容至10ml，经过微孔膜过滤，制备标准对照品溶液；(II)然后对步骤(I)的标准对照品溶液进行色谱分析，分别进样2μl，5μl，15μl，25μl，35μl，45μl，以进样25μl计算所得浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标绘制标准曲线；(III)对步骤(1)制备的所述供试样品溶液进行色谱分析；(IV)根据标准曲线计算供试样品中四种五味子木脂素的含量。

本发明选取特定的流动相：低碳醇和0.05％～0.2％三氟乙酸水溶液、特定的ZORBAX Extend-C18液相色谱柱，以及特定的分析条件，实现了五味子原料和五味子浸膏中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和/或五味子乙素的同时测量，解决了现有技术中无法同时测量五味子原料和五味子浸膏中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的技术难题。

本发明的五味子木脂素含量的测定步骤中，所采用的配置标准对照品并获取标准曲线，随后对试样进行色谱分析并根据标准曲线计算具体组分含量，是所属技术领域的已有技术，所属技术领域的技术人员有能力获取该技术并将其应用到五味子木脂素含量的测定步骤中，这是所属技术领域的技术人员的必备技能，因此本发明不再就所述特定分析条件之外的测定步骤、进样步骤以及计算步骤做详细描述。

根据本发明的测定方法，经计算得知，五味子原料中各木脂素含量范围分别为五味子醇甲4～8mg/g、五味子酯甲0.2～0.5mg/g、五味子甲素0.5～1mg/g、五味子乙素2.5～3mg/g，五味子浸膏中各木脂素含量分别为五味子醇甲9～12mg/g、五味子酯甲0.6～1mg/g、五味子甲素1～2mg/g、五味子乙素4～6mg/g。因此，根据所述计算结果得出的范围，在多次测定之后，可将获得的不在该范围内的具体含量舍弃，其余部分进行平均从而获得平均值，进而完成五味子原料和五味子浸膏中四种木脂素含量的定量分析。

本发明的样品前处理过程简单，提取效率高。可以简便、快速、灵敏、准确、稳定的同时测定五味子原料和/或五味子浸膏中四种木脂素的含量。

附图说明

图1、四种五味子木脂素的紫外可见吸收光谱图

图2、洗脱程序0～60min：2％～100％甲醇-水溶液

图3、洗脱程序0～30min：50％～80％甲醇-水溶液30～40min：80％～100％甲醇-水溶液

图4、洗脱程序为：0～5min：55％甲醇-水溶液，5～20min：55％～60％甲醇-水溶液，20～25min：60％～62％甲醇-水溶液，25～60min：75％甲醇-水溶液

图5、洗脱程序为：0～15min，58～63％；15～20min，63～65％；20～55min，65～78％

图6、柱温对保留时间的影响

图7、流动相的流速对保留时间的影响

图8、流动相为甲醇-0.1％三氟乙酸溶液的色谱图

图9、定量分析标准曲线图

具体实施方式

(1)色谱柱和流动相的选择

一般药材或复方总提物的分析选择反相液相色谱模式，首选C18柱。对于一般的反相柱，用甲醇-水或者乙腈水作为流动相，五味子木脂素可溶于甲醇、乙醇、乙腈，难溶于水，能溶于石油醚，但是溶解度比较小。一般甲醇/水或者乙腈/水为流动相作色谱分析，从分离效果和峰型等几方面进行比较，采用甲醇/水为流动相。

(2)检测波长的选择

取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素标准溶液进样分析，在190～700nm范围内进行了紫外光谱扫描。从紫外吸收光谱图(图1)可见在218nm和254nm处四种组分均有较好的吸收峰，由于230nm以下流动相会有吸收，会造成基线不稳，从而影响定量分析。而溶剂在这个波长下干扰最小，所以选择254nm为同时测定四种木脂素含量的首选检测波长。

(3)梯度洗脱程序的选择

根据出峰效果逐渐改变梯度洗脱程序，从保留时间、分离效果、色谱峰型等几方面进行比较，确定适宜的洗脱梯度。

(4)柱温的选择

比较不同柱温条件下所得样品的色谱图，选择合适的柱温使待测组分与试样中共存成分得到最佳分离，且分析效率高。

(5)流速的选择

取不同流动相流速做了供试样品的色谱分析，从保留时间、分离效果、色谱峰型等几方面进行比较，确定适宜的流速。

(6)改性剂的选择

加入适当浓度的不同的改良剂，从峰型改良情况上进行比较，确定改良剂。

以上所述的分析条件是以五味子浸膏制备的供试样品为对象而确立的，有许多杂质成分的干扰，在方法的实际应用中遇到其他样品大多是这种复杂组分的，利用这种测试方法一般能使待测组分和干扰组分得到有效的分离，在测试仪器有所差异的时候可以适当的调整分析条件组合，如流动相配比、柱温、流速和梯度洗脱程序等而实现准确快速的定量分析。

实施例1：HPLC分析条件的确定

本实施例采用Agilent高效液相色谱***：四元泵G1311A，在线脱气机G1379A，自动进样器G1329A，可变波长检测1314A；试剂：甲醇和乙腈均为HPLC专用，水为去离子水。

1.色谱柱和流动相的选择

由于中药成分的复杂多样性，分析方法的确定首先要针对其特点，寻找色谱模式和最佳柱***，一般药材或复方总提物的分析选择反相液相色谱模式，建立从纯水反相到中药高效液相色谱非水反相的全浓度范围的分析方法，离子性和强极性化合物没有保留，非极性化合物在非水反相浓度下能从柱子中流出，而介于这两极的化合物在反相色谱柱上获得分离。对于反相色谱，首选C18柱。对于一般的反相柱，用甲醇-水或者乙腈水作为流动相，五味子木脂素可溶于甲醇、乙醇、乙腈，难溶于水，能溶于石油醚，但是溶解度比较小。一般甲醇/水或者乙腈/水为流动相作色谱分析，从分离效果和峰型等几方面进行比较，采用甲醇/水为流动相。

2.检测波长的选择

取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素标准溶液进样分析，在190～700nm范围内进行了紫外光谱扫描。从紫外吸收光谱图(图1)可见在218nm和254nm处四种组分均有较好的吸收峰，由于230nm以下流动相会有吸收，会造成基线不稳，从而影响定量分析。而溶剂在这个波长下干扰最小，所以选择254nm为同时测定四种木脂素含量的首选检测波长。

3.梯度洗脱程序程序的选择

改变梯度洗脱程序，从保留时间、分离效果、色谱峰型等几方面进行比较，确定适宜的洗脱梯度。

首先用2％甲醇水溶液作为起始浓度，在60min甲醇浓度上升至100％，对五味子供试样品进行梯度洗脱，从色谱图(图2)可见谱峰主要集中在40min以后。

由于后面三个目标峰分离效果较差，因此考虑降低浓度梯度，延长出峰时间，将梯度洗脱程序调为0～30min：50％～80％甲醇-水溶液，30～40min：80％～100％甲醇-水溶液。从色谱图(图3)可以看出第一个目标峰与第一个杂质峰之间的分离度很大，基线漂移太大，后三个目标峰分析效果不好。

考虑提高甲醇起始浓度，降低浓度梯度，并通过在出峰处减缓浓度的改变。调整梯度洗脱程序为：0～5min：55％甲醇-水溶液，5～20min：55％～60％甲醇-水溶液，20～25min：60％～62％甲醇-水溶液，25～60min：75％甲醇-水溶液。此梯度洗脱下分离效果较好(图4)，第一个目标峰可以继续前移，第四个峰分离效果稍差。

再次考虑降低此处洗脱浓度，重新调整梯度洗脱程序为：0～15min，58～63％；15～20min，63～65％；20～55min，65～78％；56～62min，95％。分离效果好(图5)，但是峰有拖尾现象，基线漂移较大。

4.柱温的选择

分别在柱温25℃，30℃，35℃，40℃，45℃条件下对样品溶液作了色谱分析，在20℃～40℃范围内，色谱峰均能得到较好的分离，由目标组分的保留时间随着柱温的变化图(图6)可见，柱温升高，保留时间明显的前移。同时杂质峰的分离度随柱温变化也明显改变，在35℃时杂质峰已经达到了很好的分离，40℃和45℃分离度稍差。综合分析效率和分离效果考虑，选择35℃作为色谱分析柱温。

5.流动相流速的选择

分别在流动相流速0.5ml/min，0.75ml/min，1.0ml/min，1.25ml/min，1.5ml/min时做了样品的色谱分析。当流速过低时，虽然各组分能达到很好的分离，但是色谱峰过宽，峰型差，而且分析效率低；当流速过高时，虽然出峰快，分析效率高，但是分离度低，有些组分不能得到较好的分离。由目标组分的保留时间随流动相流速的变化图(图7)可见，目标组分的保留时间随着流速的增加明显降低，当流速为1.0ml/min时，样品中的待测组分已经得到较好的分离，基于保留时间、分离效果、色谱峰型等几方面考虑，选择1.0ml/min为流动相的检测流速。

6.改性剂的选择

峰拖尾的原因一般是因为硅胶基质上Si-OH羟基未被完全键合而与溶质发生反应，常用小分子含甲基的物质再次对硅胶进行键合封闭硅羟基，或是在流动相中加入对羟基敏感的物质，对残余羟基进行掩蔽。考察了在水相中加入0.1％的磷酸、醋酸和三氟乙酸对峰型的影响，加入磷酸和醋酸对峰型的改进不大，而加入三氟乙酸改进了色谱峰的拖尾现象(图8)，同时三氟乙酸挥发性好，不伤柱子，所以选择流动相为甲醇和0.1％三氟乙酸水溶液。

实施例2：定量相关性试验

将制备的标准溶液按上述分析条件改变进样量进行色谱分析，将得到的色谱峰面积与溶液浓度作线性回归分析，所得到的回归曲线具有良好的线性关系(图9)。

实施例3：仪器精密度实验

在最佳色谱条件下，精密吸取对照品溶液25μl平行进样10次，由测定结果可以看出，四种物质的相对偏差均小于3.0％，测定结果的可靠性可以满足分析要求。

实施例4：回收率与重复性实验

分别取标准品0.5mg加入0.100g浸膏中，制备供试样品溶液进行分析，平行实验三次计算回收率，五味子木脂素的回收率分别为五味子醇甲102.5％，五味子酯甲106.6％，五味子甲素99.4％，五味子乙素99.6％，相对标准偏差分别为五味子醇甲2.9％，五味子酯甲4.6％，五味子甲素2.6％，五味子乙素1.9％，测定结果满足分析要求。

实施例5：

供试样品溶液I：五味子粉碎，在55℃干燥12h，过30目筛子，精确称取等量五味子粉末0.25g，加入25mL甲醇，称重，在25℃超声30min，取出，称重并用甲醇补足重量，摇匀。

供试样品溶液II：精密称取经醇提、减压干燥后浸膏183mg，用甲醇溶解，并定容至10ml，0.45μm滤膜滤过即得。

高效液相色谱实验条件：ZORBAX Extend-C18液相色谱柱(150×4.6mm，5μm)；柱温35℃；流动相：甲醇和0.1％三氟乙酸水溶液；梯度洗脱程序为：为0～15min，58％A～63％线性梯度；15～20min，63％A～65％A线性梯度；20～55min，65％A～78％A线性梯度；流速1ml/min；检测波长254nm；样品进样量25μl。

色谱分析由标注曲线计算得到五味子原料中各木脂素含量分别为五味子醇甲5.8mg/g、五味子酯甲0.38mg/g、五味子甲素0.75mg/g、五味子乙素2.6mg/g，五味子浸膏中各木脂素含量分别为五味子醇甲10.7mg/g、五味子酯甲0.72mg/g、五味子甲素1.38mg/g、五味子乙素0.45mg/g。

实施例6：

供试样品溶液I：五味子粉碎，在55℃干燥12h，过30目筛子，精确称取等量五味子粉末0.5g，加入30mL甲醇，称重，在35℃超声45min，取出，称重并用甲醇补足重量，摇匀。

供试样品溶液II：精密称取经醇提、减压干燥后浸膏205mg，用甲醇溶解，并定容至10ml，0.45μm滤膜滤过即得。

高效液相色谱实验条件：ZORBAX Extend-C18液相色谱柱(150×4.6mm，5μm)；柱温35℃；流动相：甲醇和0.1％三氟乙酸水溶液；梯度洗脱程序为：为0～15min，58％A～63％线性梯度；15～20min，63％A～65％A线性梯度；20～55min，65％A～78％A线性梯度；流速1ml/min；检测波长254nm；样品进样量25μl。

色谱分析由标注曲线计算得到五味子原料中各木脂素含量分别为五味子醇甲5.6mg/g、五味子酯甲0.39mg/g、五味子甲素0.68mg/g、五味子乙素2.4mg/g，五味子浸膏中各木脂素含量分别为五味子醇甲11.3mg/g、五味子酯甲0.92mg/g、五味子甲素1.31mg/g、五味子乙素0.49mg/g。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (13)

1.一种同时定量测定五味子原料或五味子浸膏中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的方法，包括如下步骤：

(1)供试样品溶液制备

供试样品溶液I：选择50％～100％的低碳醇为提取溶剂，将北五味子粉碎，干燥后加入所述提取溶剂，所述五味子粉末与低碳醇的混合比为(0.25～0.5g)五味子粉末/(25～50mL)低碳醇，进行超声提取，经微孔膜过滤获得样品溶液I；或

供试样品溶液II：经醇提，减压干燥后的浸膏用低碳醇溶解，所述浸膏用低碳醇溶解后，按(150～250mg)浸膏/10mL的比例定容，定容后过滤，经微孔膜过滤获得样品溶液II；

(2)五味子木脂素含量的测定

高效液相色谱实验条件：150×4.6mm，5μm ZORBAX Extend-C18液相色谱柱；柱温25℃～45℃；流动相：低碳醇和0.05％～0.2％三氟乙酸水溶液；洗脱时间30～60min；流速0.7～1.5mL/min；检测波长210～280nm；样品进样量10～50μL；

木脂素含量的测定：(I)准确称取减压干燥后的五味子醇甲5mg，五味子酯甲1.4mg，五味子甲素2mg，五味子乙素3.6mg，用色谱级低碳醇溶解，定容至10mL，经过微孔膜过滤，制备标准对照品溶液；(II)然后对步骤(I)的标准对照品溶液进行色谱分析，分别进样2μL，5μL，15μL，25μL，35μL，45μL，以进样25μL计算所得浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标绘制标准曲线；(III)对步骤(1)制备的所述供试样品溶液进行色谱分析；(IV)根据标准曲线计算供试样品中四种五味子木脂素的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，供试样品溶液I所述的干燥，其干燥温度为40-70℃；其干燥时间为6-48h；

供试样品溶液I所述的干燥后的五味子粉碎物，紧接着过30～80目筛；

所述超声提取时间为10～90min，超声提取温度为室温～60℃。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，供试样品溶液I所述的干燥，其干燥温度为50-60℃；干燥时间为12～24h；

所述超声提取时间为30～60min，超声提取温度为20～40℃。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，供试样品溶液I所述的干燥，其干燥温度为55℃。

5.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，所述低碳醇为甲醇、乙醇、丙醇或其混合物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述低碳醇为甲醇。

7.如权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，所述过滤采用孔径小于0.60μm的微孔膜滤膜。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述过滤采用孔径小于0.45μm的微孔膜滤膜。

9.如权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，述步骤(1)中，提取溶剂为80％甲醇，超声时间为40min。

10.如权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，柱温为35℃，流动相为甲醇和0.1％三氟乙酸水溶液。

11.如权利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述低碳醇和三氟乙酸水溶液的体积比为50∶50～100∶0。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述低碳醇和三氟乙酸水溶液的体积比为50∶50～80∶20。

13.如权利要求1-8之一所述的方法，其特征在于，将多次测量结果中含量在下述范围之外的数据舍弃：五味子原料中各木脂素含量范围分别为五味子醇甲4～8mg/g、五味子酯甲0.2～0.5mg/g、五味子甲素0.5～1mg/g、五味子乙素2.5～3mg/g，或五味子浸膏中各木脂素含量分别为五味子醇甲9～12mg/g、五味子酯甲0.6～1mg/g、五味子甲素1～2mg/g、五味子乙素4～6mg/g，并将其余测量结果平均，获得五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的平均值。

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