CN102732494B - β-甘露聚糖酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β-甘露聚糖酶及其制备方法。本发明提供的β-甘露聚糖酶，具体是如下1)或2)或3)的蛋白质：1)由序列表中序列1的第22-416位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；3)将1)或2)的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-甘露聚糖酶活性的由1)或2)衍生的蛋白质。将该蛋白的编码基因导入毕赤酵母中构成的工程菌在5L发酵罐中高密度发酵，发酵液的酶活力可达50029.6U/mL(蛋白含量为6.1mg/mL)，实现了高效表达。本发明的β-甘露聚糖酶在食品、医药、造纸、饲料、石油开采及精细化工等行业具有应用的潜力。

Description

β-甘露聚糖酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及β-甘露聚糖酶及其制备方法。

背景技术

β-甘露聚糖酶(endo-1，4-β-D-mannanmanno hydroase EC 3.2.1.78)是水解以β-1，4-D-吡喃甘露糖为主链的甘露聚糖(葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖等)的内切水解酶。甘露聚糖是由β-1，4-D-吡喃甘露糖连接而成的线状多聚体，是半纤维素的第二大组分，广泛存在于自然界中，它是多种植物细胞壁的主要组成成分。β-甘露聚糖酶广泛的应用于饲料、食品、造纸、生物转化等行业，是一种重要的工业酶类(崔栩，曹云鹤，李瑞国.β-甘露聚糖酶研究进展.中国畜牧杂志，2010，46(15)：69-72)。β-甘露聚糖酶在自然界中广泛的存在。植物、一些低等的动物和绝大多数微生物，都能够产生甘露聚糖酶。而微生物因为其生长的条件相对简单、产酶量大、酶的性质多样，是甘露聚糖酶的主要来源。其中研究比较多的产酶微生物，有细菌中的芽孢杆菌，真菌中的曲霉、里氏木霉，以及放线菌中的链霉菌等(毛绍名，章怀云.β-甘露聚糖酶分子生物学研究进展.生物技术通讯，2006，17(6)：995-997)。

传统β-甘露聚糖酶来自于天然菌株产酶，产酶产量低，酶的性质不够理想。近些年来，由于工业应用的需要和生物技术发展，特别是基因工程技术的发展，许多研究者在新的酶资源的筛选、高效表达、催化机理的研究和酶分子的改造上做了大量的工作。中国发明专利ZL 200510081649.1公开了一种将地衣芽孢杆菌甘露聚糖酶在大肠杆菌或芽孢杆菌中高效表达的方法，提高现有甘露聚糖酶的表达水平和质量。ZL200510103125.8公开了一种将枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶在毕赤酵母中高效表达的方法，发酵罐产酶量达到200,000IU/mL(按μmol计算为1,100U/mL)，比原有的芽孢杆菌产酶量高，生成成本低。ZL 200910084472.9公开了将枯草芽孢杆菌通过密码子优化后在毕赤酵母中表达的方法，发酵罐平均酶活达到2100U/mL。中国专利ZL200610033307.7公开了假蜜环菌的甘露聚糖酶基因，并构建了毕赤酵母表达体系。ZL200610073160.4公开了硫色曲霉甘露聚糖酶基因，其最适pH为2.4。ZL201010022054.X公开了黑曲霉26家族甘露聚糖酶基因，其最适pH 5.0、最适反应温度40℃，90℃处理1小时残留酶活66.39％。关于β-甘露聚糖酶基因表达的专利相对还不多，酶的来源较少，不能适应多种工业的需要；且表达量也不高，难于廉价的应用于工业生产当中。

毛壳霉属(Chaetomium)为常见的霉腐菌，大多数具有较强的纤维素分解能力。国内对毛壳霉的纤维素酶、木聚糖酶的研究比较多，但未见有对其产甘露聚糖酶的研究，也未见国外的相关报道(BRENDA http://www.brenda-enzymes.org/)。毛壳霉CQ31是本实验室从土壤中筛到的一株真菌，它能利用魔芋粉为碳源，大量的分泌甘露聚糖酶，是甘露聚糖酶的一个重要的资源。毕赤酵母能够高效的分泌表达外源蛋白，特别是真菌来源的蛋白。毕赤酵母表达，具有培养简单、表达量大的特点，适合于工业化的生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白，来源于毛壳霉(Chaetomium sp.)CQ31。菌株CQ31已于2009年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC № 3341。

本发明提供的蛋白，命名为CsManA，具体是如下1)或2)或3)的蛋白质：

1)由序列表中序列1的第22-416位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)将1)或2)的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-甘露聚糖酶活性的由1)或2)衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID No：1由416个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第1-21位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第22-416位氨基酸残基为成熟蛋白。

为了使1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中1)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述3)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述3)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2的第98-1285位或第35-1285位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白的编码基因(命名为CsManA)也属于本发明的保护范围之内。

上述编码基因具体可为如下1)-5)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第98-1285位；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2的自5′末端第35-1285位；

3)序列表中序列2所示的基因；

4)在严格条件下与1)或2)或3)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；

5)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No：2由1495个碱基组成，编码序列为自5′端第35-1285位碱基，编码具有序列表中SEQ ID No：1的氨基酸序列的蛋白质，自5′端第1-34位碱基为5′端非翻译区，自5′端第35-97位碱基为信号肽编码序列，自5′端第98-1285位碱基为成熟蛋白编码序列，自5′端第1286-1495位碱基为3′端非翻译区。

扩增上述基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述基因的表达盒或重组载体或转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体具体可以是在pPIC9K的多克隆位点间***上述基因得到的重组表达载体。

上述重组菌是将上述的重组载体导入毕赤酵母得到的重组毕赤酵母。

上述毕赤酵母可以是GS115。

本发明的另一目的在于提供一种生产权利要求上述蛋白的方法。

上述方法是将上述的重组菌发酵培养，得到所述蛋白。

所述发酵培养依次经过如下步骤：

1)基础培养：将权利要求4或6所述的重组菌在BMGY培养基中培养，待甘油消耗完全进行流加甘油阶段；

2)加甘油阶段：在步骤1)的基础上，将甘油加进所述培养基中，待甘油消耗完全进行流加甲醇阶段；

3)加甲醇阶段：在步骤2)的基础上，将甲醇加进所述培养基中进行培养。

其中：步骤1)中，所述BMGY培养基的溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，100mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液，质量百分浓度为1.34％的YNB，质量百分浓度为4×10^-5％生物素，和体积百分比1％的甘油；所述培养的温度为30℃、pH为5.0、溶氧大于20％；

步骤2)中，所述甘油是溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液；所述甘油加进所述培养基的速度为30mL/h/1L起始发酵液，时间为4h；步骤2)温度为30℃、pH为5.0、溶氧大于20％；

步骤3)中，温度为30℃、pH为6.0、溶氧大于20％；所述甲醇的流加速度为6mL/h/1L起始发酵液。

上述蛋白作为β-甘露聚糖酶中的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用优选是权利要求1所述蛋白分解槐豆胶和/或魔芋粉。

本发明提供了一种来源于毛壳霉CQ31的β-甘露聚糖酶CsManA及其编码基因。本发明构建出β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌。将该菌株在5L发酵罐中高密度发酵，发酵液的酶活力可达50029.6U/mL(蛋白含量为6.1mg/mL)，实现了高效表达。酶学性质表达，CsManA的最适pH为5.0，最适温度为65℃。CsManA具有比酶活高、热稳定性好的特点，能在广泛的pH范围内稳定并发挥催化作用。本发明的β-甘露聚糖酶在食品、医药、造纸、饲料、石油开采及精细化工等行业具有应用的潜力。

附图说明

图1为5L发酵罐的产酶历程，其中(■)为发酵液中的蛋白浓度，(▲)为发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活。

图2为β-甘露聚糖酶纯化过程的SDS-PAGE。其中泳道标记1为发酵罐发酵液上清，2为经Q-sepharose柱层析纯化后的纯酶，3为用N-去糖基化酶去糖基后的结果(泳道中30kDa处的蛋白条带为N-去糖基化酶)。

图3为β-甘露聚糖酶的(a)最适pH和(b)pH稳定性。其中(◆)柠檬酸缓冲液(pH3.5-6.0)、(■)醋酸缓冲液(pH 4.0-5.5)、(▲)MOPS缓冲液(pH 6.0-8.0)、(×)磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)、(△)CHES缓冲液(pH 8.0-10.0)、(□)CAPS缓冲液(pH 9.0-11.0)、(○)Glycine-NaOH(pH 9.0-12.0)。

图4为β-甘露聚糖酶的(a)最适温度和(b)温度稳定性。

图5为β-甘露聚糖酶(a)水解槐豆胶，(b)水解魔芋粉的TLC结果。

图6为β-甘露聚糖酶(a)水解甘露二糖，(b)水解甘露三糖的TLC结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述培养基中的溶剂均为水，所述引物的合成及测序工作均由上海生工生物工程有限公司(北京公司)完成。

实施例1：毛壳霉CQ31的β-甘露聚糖酶基因的克隆

毛壳霉CQ31的β-甘露聚糖酶的全长基因序列的获得包括以下步骤：

1、β-甘露聚糖酶基因片段的克隆

根据GenBank中公布真菌β-甘露聚糖酶的氨基酸序列，经过比对分析保守序列，用Codehop软件(http://bioinformatics.weizmann.ac.i1/blocks/codehop.html)在线设计简并引物，简并引物和对应保守氨基酸的序列如下：

DP1(上游引物)：CCTGCGCGTCTGGGGNTTYAA(LRVWGF)

DP2(下游引物)：CGTTGGCCAGCTCCCANGCRAA(FAWELANE)

其中Y：A/G，N：A/T/G/C，R：C/T

PCR反应以毛壳霉CQ31总DNA为模板，DP1、DP2为引物，使用Ex taq DNA聚合酶(Takara公司)扩增。程序为：94℃预变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，30个循环扩增；延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收连接到pMD-18 T载体(Takara公司)，热激法转化大肠杆菌，挑选单菌落测序。扩增片段长为445bp。

2、RACE反应以及全长cDNA序列的获得

将CQ31接种到产酶培养基中(1％酵母膏、1％蛋白胨、2％魔芋粉、0.03％MgSO₄·7H₂O、0.03％CaCl₂、0.03％FeSO₄·7H₂O)，37℃摇床培养3d。菌丝用抽滤的方法收集，并置于液氮中研磨。取大约100mg研磨后菌体，置于1.5mL离心管中，加入1mL Trizol试剂(Invitrogen公司)，提取总RNA。使用磁珠法(Omega公司)纯化mRNA，作为反转录的模板。

根据扩增出来的序列片段，设计5’、3’RACE引物。引物序列如下：

5’SP1：CTAACTCCCACGCGAAGATGGTG

5’SP2：GTAGCGGGTCACCATCTCTTTGAC

3’SP1：TGGTGACCCGCTACAAGGATTCTC

3’SP2：ATCTTCGCGTGGGAGTTAGCCAAC

用纯化的mRNA作为模板，按照SMART RACE eDNA Amplification Kit(Takara公司)试剂盒方法反转录合成5’、3’RACE-Ready eDNA。以上述5’、3’eDNA为模板，对应的SP1、SP2为基因特异性引物，分别进行2轮嵌套PCR反应。扩增片段连接到pMD-18T载体上测序。其中通过5’RACE获得619bp的产物，3’RACE获得861bp产物。经序列拼接后，获得eDNA序列，长1495bp(SEQ ID No：2)，其中含有1251bp的开放阅读框。该基因翻译得到由416个氨基酸残基组成的肽段，经SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测自氨基端(N端)第1-21位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第22-416位氨基酸残基为成熟蛋白。使用BlastP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与NCBI上的蛋白序列比较，该蛋白与Aspergillus nidulans FGSC A4、Aspergillus terreus NIH2624的甘露聚糖酶序列的相同性仅为74％与72％，具有一定的新颖性。

实施例2：毛壳霉CQ31 β-甘露聚糖酶的表达工程菌的构建及高效表达

1、β-甘露聚糖酶表达工程菌的构建

根据酵母表达载体和β-甘露聚糖酶的序列设计表达引物，上下游引物分别添加上EcoR I和Not I酶切位点上下游引物分别如下：

上游引物：GAATTCCCAAGCCGAGCTGTGCAGG(EcoR I)

下游引物：GCGGCCGCTTAGTCACTTCTCGCCTCGCTA(Not I)。

用上述引物对从实施例1的毛壳霉CQ31的总RNA反转录得到的eDNA中扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收连接到pMD-18T载体，转化到E.coli JM109(购自博迈德生物公司)中，挑选单菌落测序，扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列2的第98-1285位所示，其可编码序列表中序列1的第22-416位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。序列表中序列2的第35-97位为信号肽基因序列，编码序列1的1-21位的信号肽。

将序列正确的转化子，酶切(EcoR I/Not I)后连接到预先相应酶切过的pPIC9K载体上(购自Invitrogen公司)。使用PCR和双酶切验证序列，将已经正确的连接到毕赤表达载体命名为pPIC-CsmanA。

毕赤酵母GS115(购自Invitrogen公司)感受态按照毕赤酵母使用说明(Invitrogen公司)上的方法制备。用限制性内切酶Sal I线性化质粒pPIC-CsmanA，并调整浓度到1ug/uL。取80uL酵母感受态，与10uL线性的质粒混匀，置于预冷的0.2cm的电击杯中(Bio-rad公司)，电击转化。电击后，迅速加入1.0mL预冷的1M山梨醇溶液，涂布于营养缺陷筛选板上，培养3-4d，用无菌水收集菌体。将收集的菌体适当稀释后涂布不同浓度G418筛选板上，G418的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL，分别挑选不同G418浓度下生长良好的单菌落，进行摇瓶复筛。按照下述方法选择表达量高的菌株，然后进行步骤2的发酵罐高密度发酵验证：

挑选毕赤酵母转化子单菌落，接种于25mL BMGY培养基，30℃，200rpm振荡培养至OD_600nm为12左右，离心收集菌体，转接到装有100mL改进的BMGY培养基(将甘油替换为0.5％的甲醇)的500mL三角瓶中，使OD_600nm达到8，相同培养条件培养，每24h补加100％甲醇至终浓度1％，诱导5d。挑选到一株毕赤酵母(从8mg/mL浓度G418筛选得到)，产酶量高达567.8U/ml(酶活测定方法和酶活定义参照实施例3)，命名为GS115/pPIC-CsmanA。

2、发酵罐高密度发酵(5L发酵罐发酵)

种子培养：将实验例2步骤1获得的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC-CsmanA，接种到装有100mL BMGY培养基的500mL三角瓶中，在30℃、200转振荡培养24h以上，得到OD_600nm约为3.0的种子液。

基础培养：接种到5L发酵罐中(装有2L BMGY培养基，该培养基溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，100mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液，质量百分浓度为1.34％的YNB，质量百分浓度为4×10^-5％生物素，和体积百分比1％的甘油)。过程中温度为30℃，用氨水和磷酸调节pH至5.0，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20％(相对值，本发明以发酵条件30℃，pH 5.0，转速700rpm确定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液溶氧为0)。待甘油消耗完全(溶氧DO值迅速上升)，进入流加甘油阶段。

流加甘油阶段：甘油(50％W/V即500g/L甘油水溶液)流速为30mL/h/1L起始发酵液，流加4h。待甘油消耗完全后，停止流加，进入甲醇流加阶段；其中该阶段温度为30℃、pH为5.0、溶氧大于20％。

甲醇流加阶段：温度为30℃，将pH调整到6.0，控制甲醇流速约为6mL/h/1L起始发酵液，流加直至发酵结束，同时保持溶氧在20％以上(如不能使溶氧保持在20％以上，适当减小流加速度)。发酵过程见图1，其中(■)为发酵液中上清中蛋白质含量，(▲)为发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活。酶活在第6天达到最大，最高酶活达到50029.6U/mL(酶活测定方法和酶活定义参照实施例3)，同时发酵液中的蛋白含量达到6.1mg/mL。将空载体pPIC9K按照本实施例步骤1的方法导入GS115中，然后进行步骤2的发酵，结果显示发酵液中无上述蛋白产生。(摇瓶验证酵母本身不产β-甘露聚糖酶)。

实施例3：毛壳霉β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质

1、酶活的定义及测定方法

酶活测定采用DNS法。100μL适当稀释的酶液，加入到900μL 50mM pH 5.0柠檬酸缓冲液配制的0.5％的槐豆胶(LBG)，55℃反应10min。反应后，用DNS试剂终止反应并与还原糖反应。以甘露糖为标线，定义每分钟生成1μmol甘露糖所需要的酶量为1U。

2、β-甘露聚糖酶的纯化

10mL发酵罐的发酵液上清，透析平衡后，上样用20mM pH 6.5的磷酸缓冲液平衡的Q-Sepharose柱。用5个柱体积的缓冲液洗净未结合的蛋白后，0-500mM NaCl线性洗脱并分部收集。将得到的纯酶合并后，用pH 5.0的柠檬酸缓冲液透析备用。整个纯化过程见表2；SDS-PAGE电泳图见图2，其中泳道1为发酵罐发酵液上清，2为经Q-Sepharose柱层析纯化后的纯酶，3为用N去糖基化酶(NEB公司)去糖基后的结果(泳道中30kDa处的蛋白带为N去糖基化酶)。

表2β-甘露聚糖酶的纯化过程

3、β-甘露聚糖酶最适反应pH及pH稳定性

最适反应pH的测定：在pH为3.5到11.0范围的不同缓冲体系中，55℃下测定酶活，以最高酶活力为100％计算相对酶活。结果如图3a，缓冲体系是(◆)柠檬酸缓冲液(pH 3.5-6.0)、(■)醋酸缓冲液(pH 4.0-5.5)、(▲)MOPS缓冲液(pH6.0-8.0)、(×)磷酸缓冲液(pH 6.0-8.0)、(△)CHES缓冲液(pH 8.0-10.0)、(□)CAPS缓冲液(pH 9.0-11.0)、(○)Glycine-NaOH(pH 9.0-12.0)。

pH稳定性的检测：将酶液分别用上述缓冲体系稀释适当倍数，置于50℃水浴中保温30min，立即冰浴30min测定残存的酶活，以未处理的对照为100％，结果见图3b。

实验测得该酶的最适pH为5.0，在pH 4.0时具有最高酶活的50％以上，在pH 9.5下依然具有最高酶活的40％以上。该酶在pH 5.0-11.0的范围内热处理30min后仍保持酶活力的70％以上，在广泛的pH范围内稳定。实验说明该酶属于酸性甘露聚糖酶，并能够在很宽的pH范围下具有较高的反应能力。

4、β-甘露聚糖酶最适反应温度及温度稳定性

最适反应温度的测定：pH 5.0柠檬酸缓冲体系，在30℃-90℃范围内的不同温度下反应，以最高酶活力为100％。结果见图4a，该酶的最适温度为65℃。

温度稳定性的检测：将酶液用pH 5.0的柠檬酸缓冲液适当稀释后，置于不同温度下保温30min，立即冰浴30min测定残存的酶活，以为经处理的对照为100％。结果见图4b，该酶在≤55℃时保持稳定，酶活几乎不损失。

5、酶的底物特异性及动力学参数的测定

水解特异性：选择不同的底物，测定酶活，底物浓度均为0.5％。结果见表3。该酶对槐豆胶、瓜儿豆胶、魔芋粉具有较高的活性，对木聚糖也有少量活性，对淀粉和纤维素不具有活性。

表3毛壳霉CQ31β-甘露聚糖酶的底物特异性

动力学参数(K_m：米氏常数、V_max：最大反应速度)的测定：用pH 5.0柠檬酸配制一系列槐豆胶、瓜儿豆胶、魔芋粉，浓度分别从1.5mg/mL到17.5mg/mL为底物，50℃反应5min，测定生产的还原糖量。使用“Grafit”软件，分析K_m以及V_max。结果见表4。该甘露聚糖酶对槐豆胶和瓜尔豆胶具有较高的V_max(分别为5974μmol min^-1mg^-1和5693μmol min^-1 mg^-1)，反映该甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖酶具有更高的催化活性。但是该β-甘露聚糖酶对槐豆胶的底物亲和力更强，K_m为3.1mg/mL，远小于对瓜儿豆胶的亲和力。

表4毛壳霉CQ31β-甘露聚糖酶的动力学参数

6、β-甘露聚糖酶的水解特性分析

将上述的甘露聚糖酶加入到pH 5.0柠檬酸配制1％的不同的底物中，50℃保温24h，每隔一定时间取样。底物包括槐豆胶、魔芋粉、甘露二糖、甘露三糖，加酶量为5U/mL，TLC分析产物。实验结果显示，该酶水解槐豆胶的产物主要是甘露二糖和甘露糖，单糖和二糖的量随反应时间的延长逐渐增大；水解魔芋粉的产物是甘露糖、甘露二糖、甘露三糖及迁移率间于甘露二糖和三糖的一种糖(见图5a、图5b)。另外，在两种底物水解的过程中，观察不到甘露四糖、五糖(以槐豆胶为底物也看不到三糖)的生成，不过在TLC板的底部始终有分子量很大的寡糖出现。以甘露二糖和甘露三糖为底物(见图6a、图6b)，结果显示该甘露聚糖酶不能分解甘露二糖，但是能够分解甘露三糖生成甘露二糖和甘露糖。

Claims (12)

1.一种蛋白，是如下1）或2）的蛋白质：

1）由序列表中序列1的第22-416位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1）-2）中任一所述的基因：

1）其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第98-1285位；

2）其核苷酸序列是序列表中的序列2的自5′末端第35-1285位。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pPIC9K的多克隆位点间***权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求5或6所述的重组载体导入毕赤酵母得到的重组毕赤酵母。

9.一种生产权利要求1所述蛋白的方法，是将权利要求7或8所述的重组菌发酵培养，得到所述蛋白。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述发酵培养依次经过如下步骤：

1）基础培养：将权利要求7或8所述的重组菌在BMGY培养基中培养，待甘油消耗完全进行流加甘油阶段；

2）加甘油阶段：在步骤1）的基础上，将甘油加进所述培养基中，待甘油消耗完全进行流加甲醇阶段；

3）加甲醇阶段：在步骤2）的基础上，将甲醇加进所述培养基中进行培养。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤1）中，所述BMGY培养基的溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：质量百分浓度为1%的酵母提取物，质量百分浓度为2%的蛋白胨，100mmol/L pH6.0磷酸缓冲液，质量百分浓度为1.34%的YNB，质量百分浓度为4×10^-5%生物素，和体积百分比1%的甘油；所述培养的温度为30℃、pH为5.0、溶氧大于20%；

步骤2）中，所述甘油是溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液；所述甘油加进所述培养基的速度为30mL/h/1L起始发酵液，时间为4h；步骤2）温度为30℃、pH为5.0、溶氧大于20%；

步骤3）中，温度为30℃、pH为6.0、溶氧大于20%；所述甲醇的流加速度为6mL/h/1L起始发酵液。

12.权利要求1所述蛋白作为β-甘露聚糖酶中的应用，所述应用是权利要求1所述蛋白分解槐豆胶和/或魔芋粉。

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