CN118086251A - β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S、重组菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及β‑甘露聚糖酶高酶活突变体M‑Q7S、重组菌及其应用。本发明得到的单位点β‑甘露聚糖酶突变体Csman5A‑Q7S，所述的β‑甘露聚糖酶突变体为氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β‑甘露聚糖酶的第7位氨基酸天冬酰胺(Q)变为丝氨酸(S)获得。实验表明，突变体Csman5A‑Q7S在整个诱导周期内比酶活显著高于原始Csman5A，在诱导144h后比酶活达到最高值时，突变体Csman5A‑Q7S比酶活达是原始Csman5A比酶活的5.4倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S、重组菌及其应用。
背景技术
为缓解饲料行业资源短缺的难题，寻找新型饲料原料是当前最重要的任务，其中农副产品废弃物的开发利用成为关注重点。在众多农副产品中，棕榈粕具有资源丰富、价格低廉、不含有黄曲霉毒素以及含有VE抗氧化优势，其作为一种新型饲料原料具有广阔的应用前景。然而，棕榈粕中存在大量难以消化的非淀粉多糖，其中主要以甘露聚糖为主。
但是甘露聚糖不易被动物消化道降解，且部分溶于水易形成粘性物质使食糜粘度增大，从而降低营养物质的利用率。β-甘露聚糖酶可以随机水解甘露聚糖主链中β-1,4-糖苷键，产生低分子量的甘露聚糖，是甘露聚糖降解酶系中最重要的糖苷水解酶。因此近年来β-甘露聚糖酶被广泛应用与食品、饲料、能源行业中。目前已经有许多β-甘露聚糖酶被克隆表达，但这些β-甘露聚糖酶往往存在表达量低、酶活力低等问题，例如文献中提到的酶活只有1.5×106U/g（吕潇.嗜糖黄杆菌中两种新的β-甘露聚糖酶的重组表达及功能研究[D].东北师范大学,2023.DOI:10.27011/d.cnki.gdbsu.2023.000636.），开发新型高酶活力的甘露聚糖酶迫在眉睫。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种酶活提高的β-甘露聚糖酶突变体。具体地，本发明的单位点β-甘露聚糖酶突变体Csman5A-Q7S，所述的β-甘露聚糖酶突变体为氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第7位氨基酸天冬酰胺(Q)变为丝氨酸(S)获得。
本发明提供一种β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S，其为氨基酸序列为SEQ IDNO：1的β-甘露聚糖酶的第7位氨基酸天冬酰胺变为丝氨酸(S)获得。
本发明进而提供编码所述的β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S的核酸。
进一步提供包含所述核酸的重组载体。优选地，将所述核酸***到表达载体合适位点，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到重组表达质粒。
进一步优选地，其是酵母表达质粒。
本发明还提供包含所述的重组载体的重组菌。优选地，所述重组菌为毕赤酵母菌。
本发明提供所述的β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S在降解甘露聚糖原料中的应用。
具体地，所述甘露聚糖原料是棕榈粕、椰子粕、豆粕、向日葵粕或芝麻粕中的一种或多种。
另外具体地，所述的β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S是通过重组菌重组表达获得的。
本发明得到的单位点β-甘露聚糖酶突变体Csman5A-Q7S，所述的β-甘露聚糖酶突变体为氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第7位氨基酸天冬酰胺(Q)变为丝氨酸(S)获得。实验表明，突变体Csman5A-Q7S在整个诱导周期内比酶活显著高于原始Csman5A，在诱导144h后比酶活达到最高值时，突变体Csman5A-Q7S比酶活达是原始Csman5A比酶活的5.4倍。并且实验表明对各种甘露聚糖原料的降解效果十分显著，优势明显，具有较大的应用价值。
附图说明
图1为 Csman 5A-Q7S质粒图。
图2为Csman 5A及Csman 5A-Q7S转化子验证琼脂糖凝胶电泳图。
图3 为Csman 5A-Q7S蛋白电泳图。
图4为不同诱导时间原始酶Csman5A和Csman5A-MQ7S的酶活变化。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。
实施例1：利用模型评测甘露聚糖突变体在毕赤酵母中表达量
本发明通过理性设计，采用蛋白质表面电荷优化策略，通过筛选氨基酸单位点筛选，对毛壳菌来源的β-甘露聚糖酶Csman5A(Sequence ID: HQ718590.1,氨基酸序列SEQIDNO: 1，核苷酸序列SEQ IDNO: 2)进行定向进化，获得可以提升甘露聚糖酶Csman5A酶活力的单位点突变体库，通过下述模型评测突变体在毕赤酵母中异源表达量。
我们从之前研究中收集了毕赤酵母蛋白质组学数据，组学数据中计算了3914种蛋白质的蛋白质丰度，每种蛋白质NSAF值范围为 0 到 1（接近 1 的值表示蛋白表达量最丰富，而接近 0 的值表示蛋白表达量较低）。根据NSAF值，数据被分为高表达水平组与低表达水平组。
随后，我们使用以上数据重新训练了深度学***，模型准确率达到78.2%。
其中，预测显示表达量最多的突变体Csman5A-Q7S。下面选择Csman5A-Q7S作为β-甘露聚糖酶Csman5A突变体在毕赤酵母中异源表达，其中甘露聚糖酶Csman5A和突变体Csman5A-Q7S的核苷酸序列按照毕赤酵母优势密码子优化后的序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
实施例2：β-甘露聚糖酶定点突变体重组载体构建
构建重组质粒pPIC9k-Csman5A和pPIC9k-Csman5A-Q7S：
本实施例选用pPIC9k质粒（AOX启动子）构建目的基因表达载体，将pPIC9k质粒骨架（除多克隆位点MCS外的部分，包含AOX1 terminator至α-factor secretion signal序列）通过PCR添加可与目的基因连接的同源臂，并与添加同源臂的Csman5A片段进行Gibson组装获得融合质粒，如图1所示，经过大肠杆菌转化、质粒提取和基因测序，最终获得整合质粒pPIC9k-Csman5A和pPIC9k-Csman5A-Q7S。
以含的基因的重组载体pPIC9k-Csman5A为模板，加入含有突变位点的引物，引物设计有同源臂，用高保真酶进行PCR扩增，将扩增PCR产物进行Gibson组装获得融合质粒，经过大肠杆菌转化，在含kanr的LB平板上筛选阳性克隆，测序验证。重组质粒pPIC9k-Csman5A及突变体质粒构建成功后，在质粒片段AOX1 promoter中设计一对引物，以获取的pPIC9k-Csman5A及突变体质粒pPIC9k-Csman5A-Q7S作为模板，PCR制备线性化pPIC9k-Csman5A及突变体质粒pPIC9k-Csman5A-Q7S，经电泳验证正确后进行纯化回收，并将回收后的线性化pPIC9k-Csman5A及突变体质粒pPIC9k-Csman5A-Q7S通过电击分别转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于MD平板培养基于30℃培养。待MD平板长出菌落后，用无菌ddH2O洗下并进行适度稀释，涂布于含5mg/mLG-418的MDG平板培养基筛选，30℃下培养2-3天，得到单菌落，挑取形态状态较佳的单菌落接种于YPD液体培养基扩大培养，同时使用甘油保存重组毕赤酵母菌株于-80℃冰箱。
YPD液体培养基中扩大培养的菌液进行基因组粗提取，作为PCR模板。使用Phanata高保真酶PCR体系扩增，PCR产物进行电泳验证。泳道显示为1300bp左右长度预期明亮条带（图2），表明目的基因Csman5A及突变体Csman5A-MQ7S成功整合到毕赤酵母GS115菌株的基因组上，在进一步测序结果中验证到与目的基因的序列相符，表明重组毕赤酵母菌株构建成功。
实施例3：β-甘露聚糖酶及其突变体在毕赤酵母中的表达验证
为了检测实施例2中酶活提高的突变体在高密度发酵条件下生产高活性酶液的能力，我们利用5L补料分批发酵的方式培养Csman5A及突变体菌株并诱导酶的表达。
种子培养基及培养条件选择 YPD 复合培养基为种子培养基:1% 酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、 pH 自然。培养条件：在 250 mL 摇瓶中装入 50 mL 种子培养基，毕赤酵母接种量为 1%，于 30℃，220 r/ min 摇床培养 24 h。
5L 发酵罐发酵培养基及培养条件选择毕赤酵母5L发酵罐发酵培养基：42 g/L甘油，1.2 g/L KH2PO4，18 g/L NH4H2PO4，6.5 g/L MgSO4·7H2O。培养条件：5L发酵罐装液量为3 L，毕赤酵母接种量为 1%，培养温度 30 ℃，pH值 4. 5~ 5. 0，空气流量 4~8 m3 / h，甘油按照0.5-1.0 rpm/30min/次补料，维持DO≥20%；连续发酵 24 h 后，补料甲醇0.5%，补料速度0.1 rpm/h/次，维持DO≥25%。补料甲醇后每24h取样，对酶液进行SDS-PAGE分析，如图3所示，表明MQ7S获得高效表达。以刺槐豆胶为底物对原始酶Csman5A和Csman5A-MQ7S的酶活进行了测定，结果如图4所示，突变体M-Q7S在整个诱导周期内比酶活显著高于原始Csman5A，诱导144h后，比酶活达到最高值，M-Q7S比酶活达到1.9×107U/g，原始Csman5A比酶活为3.5×106U/g，突变体M-Q7S的比酶活是原始Csman5A比酶活的5.4倍。
实施例4：β-甘露聚糖酶突变体酶解甘露聚糖原料的应用
为了检测所生产的甘露聚糖变体M-Q7S在实际生产中降解甘露聚糖原料的效果，我们将来自棕榈粕、椰子粕、豆粕、向日葵粕以及芝麻粕经粉碎制得的粉末按照料液比1：3稀释制备底物混合液，即在250 mL 摇瓶中加入10g上述粉末，30ml pH X的磷酸盐缓冲液，分别加入0.02ml、0.1ml、0.5ml发酵制备的β-甘露聚糖酶突变体M-Q7S酶液（比酶活1.9×107），体积差值用pH X的磷酸盐缓冲液补齐，37℃反应48h后使用液相色谱测定甘露糖含量，结果如表1所示。
表1
从表1可知，添加比例分别为0.02ml、0.1ml、0.5ml酶液的甘露聚糖降解率分别为65.2%，73.5%及86.4%。
Claims (10)
1.一种β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S，其特征在于，其为氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第7位氨基酸天冬酰胺变为丝氨酸获得。
2.编码如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S的核酸。
3.包含如权利要求2所述核酸的重组载体。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，将所述核酸***到表达载体合适位点，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到重组表达质粒。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其是酵母表达质粒。
6.包含如权利要求4或5所述的重组载体的重组菌株。
7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为毕赤酵母菌。
8.如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S在降解甘露聚糖原料中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甘露聚糖原料是棕榈粕、椰子粕、豆粕、向日葵粕或芝麻粕中的一种或多种。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的β-甘露聚糖酶高酶活突变体M-Q7S是通过重组菌重组表达获得的。
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