CN108823188B - 一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用，其中内切葡聚糖酶CelA，是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明通过对关键的内切葡聚糖酶CelA其氨基酸序列、用于编码该内切葡聚糖酶CelA的基因序列等进行改进，与现有技术相比可以克服现有微生物来源的内切葡聚糖酶普遍酶活不高、催化效率偏低等问题，该内切葡聚糖酶CelA可广泛应用于生物质能源、食品、饲料、纺织等工业领域的高效内切葡聚糖酶，尤其可以应用于苎麻生物脱胶过程中，能够提高麻纤维脱胶率。

Description

一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其是葡聚糖酶CelA的分离及应用技术领 域，更具体地，涉及一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用，该内切葡聚 糖酶CelA可应用于苎麻生物脱胶过程中，本发明还涉及该该酶的纯化。

背景技术

自然界中，木质纤维素生物质是地球上蕴藏量最丰富的可再生的天然 生物质资源，主要包括40-50％纤维素、25-30％半纤维素和15-20％木质素 (Knauf M,MoniruzzmanM.Lignocellulosic biomass processing:a perspective.International SugarJournal 2004,106:147-150.)。其中植物细胞 壁，如苎麻、亚麻、红麻等，是天然的木质纤维素复合材料，纤维素被包 裹在果胶，半纤维素和木质素基质中，在精干麻清洁生产过程中除果胶外， 对于半纤维、非结晶纤维素和木质素等的降解也显得尤为重要，是亟待解 决的关键技术难题(Fan P,He F,Yang Y,Ao MZ,Ouyang J,Liu Y,Yu LJ. In-situmicrobial degumming technology with Bacillus sp.HG-28for industrialproduction of ramie fibers.Biochemical Engineering Journal 2015,97:50-58.)。

内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4)，随机定位于为纤 维素上的非结晶区，水解主链上连接葡萄糖残基之间的β-1,4糖苷键产生大 量的还原端，分子量范围约为23-146kDa。属于GH 5家族的内切葡聚糖酶 包括两个结构域，即活性区和碳水化合物结合域(CBM3)，而活性区为(α/β)₈桶状结构，通常具有多功能性，能够水解多种底物，包括几丁质、甘露聚 糖、纤维素、木聚糖、葡聚糖和地衣多糖(Elifantz H,Waidner LA,Michelou VK,Cottrell MT,Kirchman DL.Diversity and abundance of glycosylhydrolase family 5in the North Atlantic Ocean.Fems Microbiology Ecology 2008,63: 316-327.)。

来源于Erwinia carotovora subspecies carotovora(Ecc)的纤维素酶CelV(GenBank accession no.2009365A)属于糖苷水解酶类第5家族，最适温度 为42℃，最适pH为7.0，不仅对CMCNa具有水解活性，且对部分木聚糖 也具有一定的活性(Cooper VJC,Salmond GPC.Molecular analysis of the major cellulase(CelV)of Erwiniacarotovora:evidence for an evolutionary “mix-and-match”of enzymedomains.Molecular and General Genetics 1993, 241:341-350.)。

现有微生物来源的胞外关键脱胶酶普遍存在酶活不高、产量偏低等问 题，导致脱胶效果不稳定以及达不到麻纺对纤维残胶率的要求。另外野生 型菌株对生长条件要求较苛刻，竞争生存能力较差，工业条件应用推广不 够广泛(谢莉敏,陈桂华,吴晓玉,王园秀.苎麻脱胶工艺的研究进展[J]. 江苏农业科学,2012,40:226-228.)。因此获得高效且性能优良的多功能 糖苷水解酶并将其应用诸如苎麻生物脱胶等势在必行。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种内 切葡聚糖酶及其编码基因与应用，其中通过对关键的内切葡聚糖酶CelA其 氨基酸序列、用于编码该内切葡聚糖酶CelA的基因序列等进行改进，与现 有技术相比可以克服现有微生物来源的胞外关键脱胶酶普遍酶活不高、产 量偏低等问题，本发明可以实现该内切葡聚糖酶CelA的工业化生产，能够 得到具有很好应用前景的内切葡聚糖酶的生产菌种，非常利于内切葡聚糖 酶CelA的推广应用。本发明可以采用基因工程方法制备内切葡聚糖酶，得 到的内切葡聚糖酶CelA可应用于各个领域，是一种新的能够广泛应用于生 物质能源、食品、饲料、纺织等工业领域的高效内切葡聚糖酶，尤其可以 应用于苎麻生物脱胶过程中，提高麻纤维脱胶率，降低麻纺织品刺痒感。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种内切葡聚糖酶 CelA，其特征在于，该内切葡聚糖酶是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列 组成的蛋白质。

按照本发明的另一方面，本发明提供了一种用于编码上述内切葡聚糖 酶CelA的基因。

作为本发明的进一步优选，所述基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷 酸序列。

按照本发明的又一方面，本发明提供了包含上述基因的重组载体。

作为本发明的进一步优选，所述重组载体具体为pET32a-celA，是通过 将上述基因CelA***到表达载体pET32a内的限制性内切酶位点Nco I和 Hind III之间获得的。

按照本发明的又一方面，本发明提供了包含上述基因的重组菌株。

按照本发明的又一方面，本发明提供了制备上述内切葡聚糖酶CelA的 方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以上述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

(2)发酵该重组菌株，获得表达的内切葡聚糖酶CelA；

(3)收集并纯化所表达的内切葡聚糖酶CelA。

按照本发明的再一方面，本发明提供了上述内切葡聚糖酶CelA的应用， 其特征在于，该应用具体是应用于酿酒、造纸、纺织或饲料制备中，优选 是应用于苎麻中。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于对内切葡 聚糖酶CelA其氨基酸序列、用于编码该内切葡聚糖酶CelA的基因序列等 进行改进，可有效解决现有微生物来源的内切葡聚糖酶普遍酶活不高、催 化效率偏低等问题。

本发明涉及葡聚糖酶基因的异源表达及应用，具体涉及基因克隆一种 新的来源于胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum HG-49的葡聚 糖酶CelA及其基因和应用。本发明中的葡聚糖酶CelA，优选具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，且本发明提供编码该酶的基因，优选具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，此外本发明还提供了包含该基因的重组载体 pET32a-celA和重组菌株E.coli BL21-CelA。

本发明可以从胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum HG-49 中克隆获得内切葡聚糖酶基因celA构建了能够高效表达该内切葡聚糖的重 组大肠杆菌，并且纯化后的酶尤其可应用于苎麻生物脱胶过程中。可以将 本发明的内切葡聚糖酶基因(如核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的内切葡 聚糖酶基因)***到表达载pET32a内限制性酶切位点Nco I和Hind III之 间，使该核苷酸序列与载体表达调控序列相连接，可获得重组表达载体 pET32a-celA。本发明还可以包含上述内切葡聚糖酶基因celA的重组菌株， 菌株可以优选为重组大肠杆菌，例如可以为重组菌株E.coli BL21/celA。可 将本发明中的内切葡聚糖酶基因CelA成熟编码序列及推导出的氨基酸序列 进行Blast比对，确定该酶CelA是一种新的内切葡聚糖酶。

本发明中，来源于胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum HG-49的内切葡聚糖酶CelA虽与内切葡聚糖酶CelV相似性高达98％，然 而CelA具有优良的酶学性质，最适pH为7.5，最适温度为55℃，在pH下 处理在pH 5.0～10范围内于37℃处理1h后仍能维持86％以上相对残余酶 活力，对pH具有良好的耐受性，且该酶的底物广泛，对CMCNa，魔芋粉， 木聚糖，瓜尔豆胶和角豆胶均有水解活性，可在饲料添加剂、保健食品、 造纸、洗涤、医药等领域具有广阔的应用前景。

综上，本发明可以实现该内切葡聚糖酶CelA的工业化生产，能够得到 具有很好应用前景的内切葡聚糖酶的生产菌种，非常利于内切葡聚糖酶 CelA的推广应用。利用本发明中内切葡聚糖酶CelA的制备方法，经过纯 化后达到电泳纯级别，分子量约为72KDa，最适pH为7.5，最适温度为55℃， 在pH 5.0～10范围内于37℃处理1h后仍能维持86％以上相对残余酶活力， 对pH具有良好的耐受性。本发明葡聚糖酶CelA稳定性好，底物范围广泛， 能够广泛应用于酿酒、造纸、纺织及饲料等工业领域具有很好的应用潜力。

附图说明

图1内切葡聚糖酶基因celA的琼脂糖电泳分析。

图2纯化后内切葡聚糖酶CelA的SDS-PAGE分析。

图3内切葡聚糖酶CelA的最适pH。

图4内切葡聚糖酶CelA的最适温度。

图5内切葡聚糖酶CelA的pH稳定性。

图6内切葡聚糖酶CelA的热稳定。

图7内切葡聚糖酶CelA的动力学分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图 及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的 本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可 以相互组合。

本发明采用如下实验材料：

1)菌株和质粒：胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum subsp.Carotovorum HG-49由本实验室筛选并保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，编号为M2017016，保藏时间为2017年1月9日，保藏单位 是中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大 学保藏中心。大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株购自天根生化科技(北 京)有限公司。载体pET32a载体购自上海拜力生物科技有限公司。

2)酶和试剂盒：限制性内切酶Nco I和Hind III、PrimeSTAR Max DNAPolymerase、T4 DNA连接酶等工具酶购TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒与 质粒提取试剂盒购自爱思进生物技术有限公司。

3)生化试剂：预染蛋白质Marker购自北京百奥莱博科技有限公司；IPTG、CMCNa购自Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

50mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：取7.10g磷酸氢二钠溶解于800mL 双蒸水，用柠檬酸调节pH为4.0～7.5范围内任一值后，定容至1L。

50mM Tris-HCl缓冲液：取6.06g Tris溶解于800mL双蒸水，用1M HCl节pH至7.5～9.0范围内任一值后，定容至1L。

50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液：取7.50g甘氨酸溶解于800mL双蒸 水，用1M氢氧化钠溶液调pH至9.0～10范围内任一值后，定容至1L。

本发明中的内切葡聚糖酶CelA，其氨基酸序列优选如下所列：

ALSATPVETHGQLSIENGRLVDEQGKRVQLRGVSSHGLQWFGDYV NKDSMKWLRDDWGINVFRVAMYTAADGYISNPSLANKVKEAVAAAQS LGVYIIIDWHILSDNDPNIYKAQAKTFFAEMAGLYGNSPNVIYEIANEPNGGVTWNGQIRPYALEVTETIRSKDPDNLIIVGTGTWSQDIHDAADNQLPDP NTLYALHFYAGTHGQFLRDRIDYAQSRGAAIFVSEWGTSDASGNGGPFL PESQTWIDFLNNRGVSWVNWSLTDKSEASAALAPGASKSGGWTEQNLS ASGKFVRAQIRAAANLSGGDTPTTPTEPTNPGSGTTGDIVLQYRNVDNN PSDDAIRMAVNIKNTGSTPIKLSDLQVRYYFHDDGKPGANLFVDWANIG PNNIVTSTGTPAASTDKANRYVLVTFSSGAGSLQPGAETGEVQVRIHAGD WSNVNETNDYSYGANVTSYTNWDKITVHDKGKLIWGVEP

其中，该酶包括477个氨基酸，该成熟内切聚糖酶CelA理论分子量为 51.7KDa。

本发明筛选到胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum HG-49 所产生的一种内切葡聚糖酶CelA，最适pH为7.5，最适温度为55℃，在 pH下处理在pH 5.0～10范围内于37℃处理1h后仍能维持86％以上相对 残余酶活力，对pH具有良好的耐受性。

本发明也提供了编码上述内切葡聚糖酶基因celA的基因，该基因的基 因组序列优选如下：

GCATTATCCGCCACACCGGTGGAAACGCATGGCCAACTGTCCATT GAAAATGGGCGACTGGTGGACGAACAGGGGAAAAGGGTGCAACTGA GAGGGGTCAGTTCGCACGGTTTGCAGTGGTTTGGTGACTACGTCAAC AAAGATTCGATGAAATGGCTGCGCGATGACTGGGGGATTAACGTATTC CGTGTTGCCATGTACACGGCAGCGGATGGCTATATTTCCAATCCTTCCC TTGCGAATAAGGTCAAAGAAGCCGTTGCGGCGGCACAAAGCCTCGGC GTCTACATCATCATCGACTGGCACATTTTGTCGGATAACGATCCTAATA TTTATAAAGCACAGGCAAAAACCTTCTTTGCCGAAATGGCGGGGCTGT ACGGTAATTCGCCGAACGTGATTTATGAAATCGCCAATGAACCCAACG GCGGCGTGACATGGAACGGGCAAATTCGGCCTTATGCGCTCGAAGTG ACTGAAACTATCCGTAGTAAAGATCCTGATAATCTGATTATCGTTGGCA CGGGTACCTGGAGTCAGGATATTCATGACGCGGCGGATAATCAGCTGC CCGATCCGAATACGCTGTACGCGCTGCATTTCTATGCGGGTACGCACG GGCAGTTCCTGCGCGATCGCATTGATTATGCACAAAGCCGCGGTGCCG CGATTTTTGTCAGCGAGTGGGGCACAAGCGATGCGTCCGGCAATGGT GGACCGTTCCTGCCTGAATCGCAGACCTGGATCGATTTCCTGAACAAC CGTGGTGTGAGCTGGGTTAACTGGTCGCTTACCGATAAATCAGAGGCG TCTGCGGCGCTGGCACCGGGAGCGAGCAAATCTGGCGGTTGGACAGA ACAGAATTTGTCGGCGTCAGGAAAATTTGTCAGAGCACAGATTCGCG CGGCTGCGAATCTAAGCGGTGGCGATACGCCAACCACGCCAACGGAA CCGACCAATCCAGGTAGCGGAACCACGGGTGACATCGTACTGCAATAT CGTAATGTGGATAACAATCCTTCCGATGATGCGATTCGCATGGCCGTCA ACATCAAAAATACCGGAAGTACGCCGATCAAACTTAGCGATCTGCAA GTGCGCTACTACTTCCATGATGATGGCAAACCGGGTGCGAACCTCTTT GTTGACTGGGCGAATATCGGCCCTAACAACATTGTGACCAGCACAGGT ACGCCAGCCGCCAGTACCGATAAAGCCAATCGCTATGTTCTTGTGACC TTCAGCAGCGGAGCCGGTTCTCTTCAGCCGGGTGCAGAAACCGGTGA AGTGCAGGTGCGTATCCACGCCGGAGACTGGAGCAACGTGAATGAAACGAATGACTATTCATACGGTGCTAACGTCACGAGCTACACCAACTGGG ATAAGATCACCGTACACGATAAAGGTAAGCTGATATGGGGCGTGGAGC CG

其中，该酶基因包括1,431bp。

本发明中制备内切葡聚糖酶CelA的方法，概述起来可以包括以下步骤：

1)培养上述重组菌株，诱导重组内切葡聚糖酶CelA表达；

2)收集、浓缩并纯化所表达的内切葡聚糖酶CelA。

例如，内切葡聚糖酶CelA分泌至胞外且N端携带组氨酸标签，以及经 由镍柱纯化获得电泳纯内切葡聚糖酶CelA。

以下为具体实施例，下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为 质量百分含量。

实施例1：胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum subsp.Carotovorum HG-49来源内切葡聚糖酶CelA的基因克隆及工程菌构建

以胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum subsp.Carotovorum HG-49的菌体为模板，利用特异性引物CelAF(5'- CATGCCATGGGTGCCACACCGGTGGAAACGC-3')和CelAR (5'-CCCAAGCTTACGGCTCCACGCCCCATATC-3')，经PCR扩增得到内 切葡聚糖酶CelA的基因片段，以琼脂糖电泳分析，如图1所示。采用限制 性内切酶Nco I和Hind III完成内切葡聚糖酶CelA和表达载体pET32a双酶 切，再使用连接酶将两者连接，构建重组表达载体pET32a-celA。将连接后 的重组表达载体pET32a-celA转化大肠杆菌BL21，用氨苄青霉素进行选 择。为确保正确，筛选转化子进行菌落PCR并进行测序验证，获得重组菌 株E.coliBL21/celA。

DNA全序列分析结果表明，葡聚糖酶基因celA序列全长1431bp，编 码477个氨基酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序 列为SEQ ID NO.2所示。因此，成熟的内切葡聚糖酶CelA的理论分子量 为51.7KDa。将葡聚糖酶CelA氨基酸序列(SEQ IDNO.2所示)在GenBank 中进行BLAST比对，结果，该基因与来源于Erwinia carotovorasubspecies carotovora(Ecc)的内切葡聚糖酶CelV氨基酸序列一致性为98％。

实施例2：重组内切葡聚糖酶CelA的表达

将重组菌株E.coli BL21/celA含100mL LB液体培养基(氨苄青霉素 浓度100μg/mL)，当OD600达到0.6左右时，加入IPTG(终浓度为 1mmol/L)诱导目的蛋白的表达。12h后收集发酵液，于4℃，5000rpm离 心10min，收集上清液，即为粗酶液。

实施例3：内切葡聚糖酶CelV酶活测定

取四支试管各加入0.9mL 0.5％的CMCNa(pH 7.0)作为底物，一、 二和三号试管在与0.1mL待测粗酶液混匀后，四支试管于50℃水浴反应 10min。反应结束后于四支试管内各加入1.5mL的DNS试剂，并在第四 支试管中补加0.1mL的粗酶液。取出并摇匀四支试管后，在沸水浴中反应 5min。迅速冷却至室温。以第四支试管液为对照在540nm波长条件下测 得第一、二和三号试管液的吸光度。根据预先绘制的标准曲线计算出酶活 力。

采用上述方法测定实施例2获得的发酵上清液中酶活为251.36U/mL。

实施例4：内切葡聚糖酶CelV的浓缩与纯化

取100mL粗酶液采用硫酸铵沉淀法浓缩，获得10mL重组内切葡聚糖 酶CelV浓缩液。

以10mL去离子水冲洗Ni-NTA纯化树脂，流速为在重力作用的自然 流速。

以10mL Lysis Buffer进行平衡，流速为在重力作用下的自然流速。

将准备好的样品完成上样(结合时间1h-1.5h流速控制在0.1mL/min 左右)。

以20mL Wash Buffer冲洗柱子，收集洗杂液(流速控制在0.3-0.4 mL/min左右)。

以5mL Elution Buffer洗柱子，收集洗脱液(流速控制在0.1mL/min 左右)。

用10mL去离子水清洗柱子，流速为在重力作用下的自然流速，最后 用10mL 20％乙醇溶液置于4℃保存。

收集到的洗脱液经SDS-PAGE检测，结果显示，洗脱液中蛋白质含量 达到电泳纯级别，分子量大小约为72kDa，如图2所示。

实施例5：内切葡聚糖酶CelA的性质分析

1)内切葡聚糖酶CelA最适pH的测定：采用DNS法检测该内切葡聚 糖酶CelA最适pH，在50℃条件下，取0.9mL内切葡聚糖酶CelA酶液与 0.1mL 0.5％CMCNa溶液在不同pH缓冲液条件下准确反应10min，加入 1.5mL DNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温，于分光光度计中检测OD₅₄₀。 结果显示，内切葡聚糖酶CelA最适pH为7.5，在pH 5.0～9.0范围内均能 保持60％以上的相对酶活力，另外该酶在pH 6.0～8.0范围内具有80％以上 的相对酶活力，如图3所示。

2)内切葡聚糖酶CelA最适温度的测定：pH 7.5条件下，该酶与0.5％ CMCNa溶液分别在不同温度下反应10min，检测OD₅₄₀。以最高酶活力为 100％，计算其它温度条件下的相对残余酶活力。结果显示，内切葡聚糖酶 CelA最适反应温度为55℃，在40℃～60℃下内切葡聚糖酶CelA能够保 持60％以上的相对酶活力，如图4所示。

3)内切葡聚糖酶CelA pH稳定性的测定：于37℃下，将酶液在不同 pH缓冲液中准确处理1h，迅速置于冰上冷却。于55℃，pH 7.5下反应， 检测OD₅₄₀。结果显示，内切葡聚糖酶CelA在pH 5.0～10范围内处理1h 后仍能维持80％以上相对酶活力，如图5所示。

4)内切葡聚糖酶CelA热稳定性的测定：于pH 6.5下将酶液在不同温 度下准确处理30min，迅速置于冰上冷却。于55℃，pH 7.5下反应，检测 OD₅₄₀。结果显示，内切葡聚糖酶CelA在30～50℃下处理30min后仍能维 持75％以上相对酶活力，在60℃条件下处理30min后几乎完全失活，如 图6所示。

5)不同金属离子和化学试剂对内切葡聚糖酶CelA活性的影响：在不 影响反应体系总体积的条件下，在反应体系中预先加入微量不同金属离子 和化学试剂使终浓度分别为1mM和5mM，于最适pH和最适温度条件下 完成各自反应，检测OD₅₄₀。以未加金属离子的酶液反应作为对照，作为 100％，计算其他条件下的相对残余酶活力。结果显示，高浓度的Fe^{2 +}、Mn²⁺、 Cu²⁺对酶活有激活作用，Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺对内切葡聚糖酶CelA无显 著影响；Fe³⁺、Zn²⁺对内切葡聚糖酶CelA有抑制作用；巯基乙醇对该酶有 显著的激活作用，DTT、DMSO对该酶作用效果不显著，SDS、EDTA、 乙醇、尿素都随浓度增加对内切葡聚糖酶CelA有显著抑制作用，如表1所 示。

表1.内切葡聚糖酶CelA底物特异性分析

6)内切葡聚糖酶CelA动力学常数的测定：通过对酶反应初速度的分 析，确定以一级反应时间3min作为动力学常数检测时酶反应的终止时间。 在最适pH和最适温度条件下，以一系列浓度1-10mg/mL的CMCNa作为 底物完成酶反应，检测OD₅₄₀。依据米氏方程双倒数法，使用非线性回归电 脑程序GraFit，如图7所示，最终求得Km和Vmax分别为3.78g/L和5.71μmoL/(min·mg)。

7)内切葡聚糖酶CelA的底物特异性：在最适温度和pH条件下，分别 检测内切葡聚糖酶CelA以0.5％CMCNa，0.5％魔芋粉，0.5％木聚糖，0.5％ 瓜尔豆胶，0.5％角豆胶，0.5％β-葡聚糖和0.5％定性滤纸为底物时的酶活性。 内切葡聚糖酶CelA底物较广泛，该酶对多种底物均有水解活性，尤其对魔 芋粉的水解活性最高，对β-葡聚糖和定性滤纸没有水解能力(表2)。

表2.内切葡聚糖酶CelA底物特异性分析

*未检测到。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等 同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学

<120> 一种内切葡聚糖酶及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum HG-49）

<400> 1

gcattatccg ccacaccggt ggaaacgcat ggccaactgt ccattgaaaa tgggcgactg 60

gtggacgaac aggggaaaag ggtgcaactg agaggggtca gttcgcacgg tttgcagtgg 120

tttggtgact acgtcaacaa agattcgatg aaatggctgc gcgatgactg ggggattaac 180

gtattccgtg ttgccatgta cacggcagcg gatggctata tttccaatcc ttcccttgcg 240

aataaggtca aagaagccgt tgcggcggca caaagcctcg gcgtctacat catcatcgac 300

tggcacattt tgtcggataa cgatcctaat atttataaag cacaggcaaa aaccttcttt 360

gccgaaatgg cggggctgta cggtaattcg ccgaacgtga tttatgaaat cgccaatgaa 420

cccaacggcg gcgtgacatg gaacgggcaa attcggcctt atgcgctcga agtgactgaa 480

actatccgta gtaaagatcc tgataatctg attatcgttg gcacgggtac ctggagtcag 540

gatattcatg acgcggcgga taatcagctg cccgatccga atacgctgta cgcgctgcat 600

ttctatgcgg gtacgcacgg gcagttcctg cgcgatcgca ttgattatgc acaaagccgc 660

ggtgccgcga tttttgtcag cgagtggggc acaagcgatg cgtccggcaa tggtggaccg 720

ttcctgcctg aatcgcagac ctggatcgat ttcctgaaca accgtggtgt gagctgggtt 780

aactggtcgc ttaccgataa atcagaggcg tctgcggcgc tggcaccggg agcgagcaaa 840

tctggcggtt ggacagaaca gaatttgtcg gcgtcaggaa aatttgtcag agcacagatt 900

cgcgcggctg cgaatctaag cggtggcgat acgccaacca cgccaacgga accgaccaat 960

ccaggtagcg gaaccacggg tgacatcgta ctgcaatatc gtaatgtgga taacaatcct 1020

tccgatgatg cgattcgcat ggccgtcaac atcaaaaata ccggaagtac gccgatcaaa 1080

cttagcgatc tgcaagtgcg ctactacttc catgatgatg gcaaaccggg tgcgaacctc 1140

tttgttgact gggcgaatat cggccctaac aacattgtga ccagcacagg tacgccagcc 1200

gccagtaccg ataaagccaa tcgctatgtt cttgtgacct tcagcagcgg agccggttct 1260

cttcagccgg gtgcagaaac cggtgaagtg caggtgcgta tccacgccgg agactggagc 1320

aacgtgaatg aaacgaatga ctattcatac ggtgctaacg tcacgagcta caccaactgg 1380

gataagatca ccgtacacga taaaggtaag ctgatatggg gcgtggagcc g 1431

<210> 2

<211> 477

<212> PRT

<213> 胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum HG-49）

<400> 2

Ala Leu Ser Ala Thr Pro Val Glu Thr His Gly Gln Leu Ser Ile Glu

1 5 10 15

Asn Gly Arg Leu Val Asp Glu Gln Gly Lys Arg Val Gln Leu Arg Gly

20 25 30

Val Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Phe Gly Asp Tyr Val Asn Lys Asp

35 40 45

Ser Met Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp Gly Ile Asn Val Phe Arg Val

50 55 60

Ala Met Tyr Thr Ala Ala Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Pro Ser Leu Ala

65 70 75 80

Asn Lys Val Lys Glu Ala Val Ala Ala Ala Gln Ser Leu Gly Val Tyr

85 90 95

Ile Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Ser Asp Asn Asp Pro Asn Ile Tyr

100 105 110

Lys Ala Gln Ala Lys Thr Phe Phe Ala Glu Met Ala Gly Leu Tyr Gly

115 120 125

Asn Ser Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Gly

130 135 140

Val Thr Trp Asn Gly Gln Ile Arg Pro Tyr Ala Leu Glu Val Thr Glu

145 150 155 160

Thr Ile Arg Ser Lys Asp Pro Asp Asn Leu Ile Ile Val Gly Thr Gly

165 170 175

Thr Trp Ser Gln Asp Ile His Asp Ala Ala Asp Asn Gln Leu Pro Asp

180 185 190

Pro Asn Thr Leu Tyr Ala Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln

195 200 205

Phe Leu Arg Asp Arg Ile Asp Tyr Ala Gln Ser Arg Gly Ala Ala Ile

210 215 220

Phe Val Ser Glu Trp Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Pro

225 230 235 240

Phe Leu Pro Glu Ser Gln Thr Trp Ile Asp Phe Leu Asn Asn Arg Gly

245 250 255

Val Ser Trp Val Asn Trp Ser Leu Thr Asp Lys Ser Glu Ala Ser Ala

260 265 270

Ala Leu Ala Pro Gly Ala Ser Lys Ser Gly Gly Trp Thr Glu Gln Asn

275 280 285

Leu Ser Ala Ser Gly Lys Phe Val Arg Ala Gln Ile Arg Ala Ala Ala

290 295 300

Asn Leu Ser Gly Gly Asp Thr Pro Thr Thr Pro Thr Glu Pro Thr Asn

305 310 315 320

Pro Gly Ser Gly Thr Thr Gly Asp Ile Val Leu Gln Tyr Arg Asn Val

325 330 335

Asp Asn Asn Pro Ser Asp Asp Ala Ile Arg Met Ala Val Asn Ile Lys

340 345 350

Asn Thr Gly Ser Thr Pro Ile Lys Leu Ser Asp Leu Gln Val Arg Tyr

355 360 365

Tyr Phe His Asp Asp Gly Lys Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Asp Trp

370 375 380

Ala Asn Ile Gly Pro Asn Asn Ile Val Thr Ser Thr Gly Thr Pro Ala

385 390 395 400

Ala Ser Thr Asp Lys Ala Asn Arg Tyr Val Leu Val Thr Phe Ser Ser

405 410 415

Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Gly Ala Glu Thr Gly Glu Val Gln Val

420 425 430

Arg Ile His Ala Gly Asp Trp Ser Asn Val Asn Glu Thr Asn Asp Tyr

435 440 445

Ser Tyr Gly Ala Asn Val Thr Ser Tyr Thr Asn Trp Asp Lys Ile Thr

450 455 460

Val His Asp Lys Gly Lys Leu Ile Trp Gly Val Glu Pro

465 470 475

Claims (1)

1.一种内切葡聚糖酶CelA的应用，该内切葡聚糖酶CelA是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，其特征在于，该应用具体是应用于苎麻生物脱胶。

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