CN101412991B - 以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法 - Google Patents

Abstract

以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法，采用以毕赤酵母做载体生产甘露聚糖酶的基因工程菌的发酵生产工艺，其特征是：在一级种子培养发酵罐中利用种子培养液进行培养；在二级种子培养发酵罐中以基础培养液进行培养；在生产发酵罐中，初期投入部分基础培养液进行培养，随着发酵过程的进行按一定的比例和速度分别流加甘油、甲醇和底物甘露聚糖至发酵液中以完成发酵。可显著增加甘露聚糖酶产量15％~24％。

Description

以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法

技术领域

本发明涉及微生物制品的发酵技术，以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法。

背景技术

传统生产甘露聚糖酶的方法是利用葡萄糖作碳源。葡萄糖作为碳源在高温灭菌过程中，产生焦糖化反应，使得发酵培养基溶液呈褐色或酱油色。其弊端是：第一，焦糖化反应产生有害物，不利于酵母菌的生长；第二，深色发酵液的后处理工作需要脱色，增加生产工序和费用。第三，不加入底物甘露聚糖进行诱导，产率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法，可显著增加甘露聚糖酶产量15％~24％。

本发明的以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法，采用以毕赤酵母做载体生产甘露聚糖酶的基因工程菌的发酵生产工艺，同葡萄糖为碳源的酵母基础培养基培养菌种，其特征是：在一级种子培养发酵罐中用含葡萄糖、蛋白胨和酵母粉的种子培养液进行培养；在二级种子培养发酵罐中以含甘油的基础培养液进行培养；在生产发酵罐中，初期投入部分含甘油的基础培养基进行培养，在发酵过程的各阶段，分别流加甘油、甲醇和底物甘露聚糖至发酵液中，并调整流速，以完成发酵。

工艺改进后的效果：

底物是酶制剂作用的目标，甘露聚糖是甘露聚糖酶的底物。在发酵过程中加入底物甘露聚糖主要起刺激诱导的作用。本发明方法以甘油代替传统的葡萄糖为碳源并流加底物甘露聚糖，在以毕赤酵母为载体生产甘露聚糖酶的基因工程菌生产工艺中所产生的积极效果是：

a、在生产中以甘油为碳源，与以葡萄糖为碳源相比，可以显著减少代谢阻遏物乙醇乙酸的产生，从而增加了最终生产的甘露聚糖酶的量。

b、应用甘油作为碳源进行生产，因为甘油作为碳源在高温灭菌过程中不会产生焦糖化反应，所以可以大大改善发酵液的颜色，从而使酵母菌可以正常生长。

c、因为甘油为碳源大大改善了发酵液的颜色，发酵液颜色浅不需脱色处理，减少了发酵液处理费用，可以降低10％的生产费用。

d、流加底物甘露聚糖，可以起到刺激诱导的作用，从而提高了甘露聚糖酶最终的产 量。

e、利用本方法生产甘露聚糖酶，最终产甘露聚糖酶量比以葡萄糖为碳源且不流加底物甘露聚糖的生产工艺增加15～24％，而生产成本仅为传统工艺成本的不足90％。

具体实施方式

一种以甘油为碳源并流加底物甘露聚糖诱导制备甘露聚糖酶的方法，采用以毕赤酵母做载体生产甘露聚糖酶的基因工程菌发酵生产工艺，其特征在于以甘油为碳源并流加底物甘露聚糖，具体工序如下：

一、培养基

1.种子培养基：含重量百分比为葡萄糖3％，蛋白胨2％，酵母粉2％，余量为水；

2.基础培养基：含重量百分比为甘油2％～10％，磷酸二氢钾1％～5％，硫酸钾1％～5％，纯度为85％的磷酸1％～5％，七水硫酸镁1％～5％，余量为水。所用所有甘油均要求纯度为99.8％以上。

二、发酵工艺

1、菌种的培养

菌种培养和一级种子发酵时采用种子培养基。

a.取适量生产用产甘露聚糖酶菌种培养斜面，分别接入3～4只1000ml三角瓶中，内装500ml种子培养基；

b.培养：30～32℃，250～350转/分钟，生长20～30小时。

2、一级发酵

a、在不锈钢种子罐中装入约占罐容积的70％的种子培养基，蒸汽灭菌121℃，15min，冷却至30℃；

b、取上述步骤1培养好的摇瓶菌种接入种子培养液中；

c、培养：30℃，200～300转/分钟，pH在4.0～6.0范围内保持某一恒定值，通气量0.5～2vvm，生长20～30小时。

3、二级发酵

a.在不锈钢种子罐中装入约占罐容积70％～75％的基础培养液，蒸汽灭菌121℃，15min，冷却至30℃；

b.在二级种子培养发酵时和发酵生产的初始阶段均采用基础培养液。将上述步骤2培养好的菌种液在无菌状态下接入二级种子罐中；

c.培养：30℃，200～300转/分钟，pH在4.0～6.0范围内保持某一恒定值，通气量0.5～2vvm，生长12～30小时。

4、生产发酵

a、不锈钢发酵罐中投入相当于发酵罐容积35～45％的基础培养液，蒸汽灭菌121℃，15min，冷却至30℃；

b、将上述步骤3培养好的菌种液在无菌状态接入发酵罐中；

c、培养发酵：

(1)培养条件：30℃，180～250转/分钟，恒定ph 4.0～6.0这一范围，通气量0.5～2vvm；

(2)配制浓度50％甘油水溶液，灭菌降温备流加用；

(3)当基础培养液中甘油消耗完全后，(用甘油测量计测定残糖含量为0)，以10～40ml/h/l的流速(以初始的发酵液体积为基准计，下同略)，流加上述步骤(2)准备好的甘油溶液至发酵培养基中；

(4)开始流加甲醇后，降低甘油的流速至1～4ml/h/l；

(5)整个甘油流加过程持续约50～80小时。

d.诱导

(1)毕赤酵母产酶基因诱导剂：甲醇

(2)在甘油匀速流加4h或更长时间后，至细菌生产量为200～250g湿重/L，且发酵液无可见的重组蛋白产生时，开始流加甲醇，甲醇流加过程持续到发酵完成前10～15小时。

(3)甲醇流加时采用浓度为99.8％以上的甲醇，初始的流加速度为4～7ml/h/L。

(4)酵母菌以甲醇为碳源继续生长，同时甲醇作为毕赤酵母工程菌的诱导剂，诱导其产甘露聚糖酶；

(5)随着培养的持续及培养物的快速累积，应相应增大甲醇的流加量8～10ml/h/l，且需增加搅拌和通气量并增加压力，以便氧更多的溶解于发酵液中；

(6)甲醇开始流加3～5h后，毕赤酵母工程菌开始产甘露聚糖酶时，开始并根据甘露聚糖酶的活力，以0.5～1ml/h/l的速度同时流加0.002～0.5％的甘露聚糖溶液，流加持续30～50小时，直到结束发酵。

e、在发酵生产中，发酵液的终体积以占发酵罐总体积的70％～75％为宜。

三、生产发酵过程结束：当细菌镜检发现细菌开始自溶时停止发酵。

四、本发明方法与传统工艺的效果对比实验：

传统工艺与本发明方法的效果对比表

说明：

1、从上表中可以看出连续6批对比发酵，甘油型发酵较葡萄糖型发酵有较大的优势；

2、甘油为碳源并流加底物刺激诱导发酵的最终酶活力比葡萄糖型发酵的最终酶活力要高出15～24％不等；

3、发酵液的后处理过程中，脱色成本则更显示出甘油型发酵的优势，其后处理成本只有葡萄糖型发酵的1/3左右。

Claims (6)

1.以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法，采用以毕赤酵母做载体生产甘露聚糖酶的基因工程菌的发酵生产工艺，其特征是：在一级种子培养发酵罐中利用种子培养液进行培养：菌种培养和一级种子发酵时采用种子培养基，其组份重量百分比为葡萄糖3％，蛋白胨2％，酵母粉2％，余量为水；在二级种子培养发酵罐中以基础培养液进行培养：在二级种子培养发酵时和发酵生产的初始阶段均采用基础培养液，其组份重量百分比为甘油2％～10％，磷酸二氢钾1％～5％，硫酸钾1％～5％，纯度为85％的磷酸1％～5％，七水硫酸镁1％～5％，余量为水；在生产发酵罐中，初期投入部分基础培养液进行培养，随着发酵过程的进行按一定的比例和速度分别流加甘油、甲醇和底物甘露聚糖至发酵液中以完成发酵；流加甘油水溶液的浓度为50％；流加甲醇的浓度为99.8％以上；流加甘露聚糖溶液的浓度为0.002～0.5％；诱导工序中在甘油匀速流加4h或更长时间后，至细菌生产量为200～250g湿重/L，且发酵液无可见的重组蛋白的产生时，开始流加甲醇，甲醇流加过程持续到发酵完成前10～15小时；初始的流加速度为4～7ml/h/L，随着培养的持续及培养物的快速累积，需相应增大甲醇的流加量至8～10ml/h/l；甲醇开始流加3～5h后，毕赤酵母工程菌开始产甘露聚糖酶时，开始并根据甘露聚糖酶的活力，同时流加0.002～0.5％的甘露聚糖溶液，以0.5～1ml/h/l的速度流加持续30～50小时，直到结束发酵。

2.根据权利要求1所述的以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法，其特征在于：在种子培养和发酵生产中，发酵液的终体积均保持占发酵罐总容积的70％～75％。

3.根据权利要求1所述的以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法，其特征在于：在发酵过程中以甘油作为碳源代替了葡萄糖，并流加底物甘露聚糖进行刺激诱导以生产更多的甘露聚糖酶。

4.根据权利要求1所述的以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法，其特征在于：当基础培养液中甘油消耗完全后，用甘油测量计测定残糖含量为0时，以10～40ml/h/l的流速流加50％甘油溶液至发酵培养基中；在开始流加甲醇之后，将甘油的流加速度降至1～4ml/h/l。

5.根据权利要求1所述的以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法，其特征在于所用所有甘油均要求纯度为99.8％以上。

6.根据权利要求1所述的以甘油为碳源并流加底物诱导制备甘露聚糖酶的方法，其特征在于：种子发酵和生产发酵的培养条件均为30℃，200～300转/分钟，pH在4.0～6.0范围内保持某一恒定值，通气量0.5～2vvm，生长12～30小时。