CN113151216B - 一种具有高***木聚糖活力的耐热木聚糖酶及其编码基因与应用 - Google Patents

一种具有高***木聚糖活力的耐热木聚糖酶及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有高***木聚糖活力的耐热木聚糖酶及其编码基因与应用。本发明所要保护的蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列1的蛋白质或序列1的第18至222位氨基酸，或上述序列具有80％以上的同一性的且具有木聚糖酶活性的蛋白质。该蛋白质来源于嗜热真菌毛壳菌CQ31，具有木聚糖酶活性，具有较好的耐热性和pH稳定性，最适温度为70℃，最适pH为7.0；该酶水解特性优异，具有高***木聚糖活力。将该蛋白的编码基因导入毕赤酵母中，得到的表达重组木聚糖酶的发酵液的酶活达19,000U/mL，蛋白含量为10.8mg/mL，可应用于面包制作过程，有效延缓面包的老化，在食品、饲料等工业具有很大潜力。

Description

一种具有高***木聚糖活力的耐热木聚糖酶及其编码基因 与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有高***木聚糖活力的耐热木聚糖酶及其编码基因与应用。
背景技术
木聚糖(Xylan)是半纤维素的主要成分，在自然界中极其丰富，其含量仅次于纤维素，广泛存在于植物组织的细胞壁中。木聚糖的完全水解需要多种酶的参与，木聚糖酶(Xylanase,EC 3.2.1.8)是其中最关键的水解酶，可将木聚糖降解为木糖和低聚木糖(专利公开号：CN11254132A，申请日：20200121)。木聚糖酶在食品、饲料等工业具有广泛的应用。在食品工业，面粉是一种重要的食品原料，***木聚糖作为面粉中一种成分，含量约占比面粉中的2％-3％，由于其粘度大且具有很强的吸水能力，对面制品的品质具有显著的影响。在面包烘焙工业中，具有高***木聚糖活力的木聚糖酶可高效降解面粉中的***木聚糖，从而改善面团的流变学特性，提高面包的比容，降低面包的硬度，延缓面包的老化，提高面包的经济价值。
木聚糖酶广泛存在于自然界中，其中微生物是最主要的来源。截止目前，已有许多微生物木聚糖酶的研究报道，其中细菌来源报道最多，且大多属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)，真菌来源相对较少，多数来源于曲霉属(Aspergillus sp.)、青霉属(Penicillum sp.)和木霉属(Trichoderma sp.)。嗜热真菌来源的木聚糖酶热稳定性好，适合应用于食品和饲料工业，但嗜热真菌来源的木聚糖酶报道不多。另外，具有***木聚糖活性的木聚糖酶报道同样较少，因此具有***木聚糖活力的耐热木聚糖酶基因发掘越来越受到关注。
利用基因工程手段可提高酶的产量，满足大规模工业化应用的要求。迄今，已有一些木聚糖酶在大肠杆菌(Escherchia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和毕赤酵母(Pichia pastoris)中成功表达，但绝大多数木聚糖酶表达量仍较低，为了降低木聚糖酶的生产和应用成本，木聚糖酶的基因发掘和异源表达策略仍亟待研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高木聚糖酶的活力或如何制备具有高***木聚糖活力的耐热木聚糖酶。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质。
所述蛋白质可为如下A1)、A2)、A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第18至222位氨基酸残基的蛋白质；
A3)将A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的且具有木聚糖酶活性的蛋白质；
A4)在A1)、A2)或A3)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，序列表中的序列1由222个氨基酸残基组成。上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白质可来源于毛壳菌(Chaetomium sp.)。
上述蛋白质可为木聚糖酶。所述木聚糖酶的底物可为榉木木聚糖、桦木木聚糖、小麦***木聚糖和燕麦木聚糖中的至少一种。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了与上文所述蛋白质相关的生物材料。所述生物材料可为下述B1)-B6)中的任一种：
B1)编码上文所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)提高或促进上文所述蛋白质的活性或上文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
B6)含有B5)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
上文所述微生物可为酵母或丝状真菌。所述酵母可为毕赤酵母。上文所述重组微生物可为重组毕赤酵母。所述丝状真菌可为黑曲霉。上文所述重组微生物也可为重组黑曲霉。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下b1)、b2)或b3)所示的所述蛋白质的编码基因：
b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2的第52-699位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的cDNA或DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
本文中，术语“同一性”指与核酸序列或氨基酸的序列的相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上文所述蛋白质的DNA。所述表达盒还可包括表达上述任意一种蛋白的核酸分子所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达上述任一种蛋白质。所述调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与编码蛋白质的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导蛋白质表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内蛋白质的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码蛋白质的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码蛋白质的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在蛋白质氨基端的氨基酸序列，能引导编码蛋白质进入细胞分泌途径。能引导表达后的蛋白质进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。添加能根据宿主细胞的生长情况来调节蛋白质表达的调控序列可能也是需要的。调控***的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的***。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码蛋白质的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。
本发明还涉及包含本发明编码上述任一种蛋白质的核酸分子、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。制备表达载体时，可使编码上述任一种蛋白的核酸分子位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。所述载体含有1或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fEhrlich,1978，美国国家科学院学报75：1433)。可以向宿主细胞***1个以上拷贝的本发明编码上述任一种蛋白质的核酸分子以提高该基因产物的产量。该核酸分子的拷贝数增加可以通过将该核酸分子的至少1个附加拷贝***宿主细胞基因组中，或者与该核酸分子一起***一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸分子的细胞。用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。
术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导蛋白质的表达。
本发明的还涉及一种含有编码上述任一种蛋白质的核酸分子的重组细胞。重组细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌(如大肠杆菌细胞)或酵母细胞。
上文所述蛋白质在作为木聚糖酶中的应用也属于本发明的保护范围。
上文所述的生物材料在制备木聚糖酶中的应用也属于本发明的保护范围。
上文所述木聚糖酶的底物可为榉木木聚糖、桦木木聚糖、小麦***木聚糖和燕麦木聚糖中的至少一种。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述的蛋白质和/或上文所述的生物材料的下述任一种应用：
P1、在制备面制品中的应用；
P2、在制备低聚木糖中的应用；
P3、在制备面制品食品中的应用；
P4、在制备面制品饲料中的应用；
P5、在制备食品添加剂产品中的应用；
P6、在食品或饲料加工中的应用；
P7、在面包烘焙中的应用；
P8、在馒头制作中的应用。
含有上文所述蛋白质的产品也属于本发明的保护范围。所述产品可为食品添加剂或饲料添加剂。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种制备木聚糖酶的方法。所述方法包括：使上文所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到木聚糖酶。所述生物可为微生物、植物或非人动物。所述微生物可为酵母或丝状真菌。所述酵母可为毕赤酵母。所述丝状真菌可为黑曲霉。
上文所述木聚糖酶的最适pH可为7.0。所述木聚糖酶在pH 4.0-10.0间处理30min，残余酶活力在80％以上。所述木聚糖酶最适反应温度可为70℃，可在60℃下保持较好的稳定性。所述木聚糖酶产物可为聚合度2-6的木寡糖。
本发明的实施例中将来源于毛壳菌CQ31的木聚糖酶的编码基因连接到通用载体pPIC9K质粒骨架上，构建多拷贝强表达重组质粒pPCAU-CsXyn11A；然后将重组质粒导入巴斯德毕赤酵母，得到的重组巴斯德毕赤酵母菌株pPCAU-CsXyn11A在5L发酵罐中高密度发酵得到的重组木聚糖酶的酶活力达19,000U/mL，蛋白含量为10.8mg/mL。该木聚糖酶的最适pH为7.0，在pH 4.0-10.0间处理30min，残余酶活力在80％以上；最适反应温度为70℃，在60℃下保持较好的稳定性。该酶底物特异性专一，对小麦***木聚糖活性高，比酶活力为1850U/mg，水解榉木木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖和***木聚糖的产物为聚合度2-6的木寡糖。将该木聚糖酶(5ppm)用于面包制作过程，可增加面包比容(25.6％)和降低面包硬度(46％)，还可有效延缓面包的老化。本发明提供的蛋白质具有良好的木聚糖酶酶学性质，具有较好的耐热性和pH稳定性，水解特性优异，具有高***木聚糖活力，在食品、饲料等工业中具有良好的应用价值。
附图说明
图1为重组载体pPIC9K-CsXyn11A的载体图谱。
图2为重组载体pPCAU-CsXyn11A的载体图谱。
图3为重组木聚糖酶CsXyn11A毕赤酵母菌株在5-L发酵罐的产酶历程(■：酶活力；●：蛋白浓度；▲：湿重)。
图4为木聚糖酶CsXyn11A在5-L发酵罐中高密度发酵过程的SDS-PAGE电泳图(列M：低分子量标准蛋白；列1-8：分别为诱导0、24、48、72、96、120、144、156h的发酵上清液)。
图5为木聚糖酶CsXyn11A的纯化电泳图(M：低分子量标准蛋白；1：粗酶液；2：纯酶液)。
图6为木聚糖酶CsXyn11A的最适pH测定曲线图(Glycine-HCl(■,pH 3.0-7.0)；Sodium Citrate(●,pH 3.0-6.0)；Acetic acid-Sodium acetate(▲,pH 4.0-6.0)；MES(◆,pH 5.5-6.5)；MOPS(▼,6.5-7.5)；Tris-HCl(□,pH 7.0-9.0)；CHES(○,pH 8.0-10.0)；Glycine-NaOH(△,9.0-10.5)；Na2HPO4-NaOH(◇,pH 11.0-12.0))。
图7为木聚糖酶CsXyn11A的pH稳定性测定曲线图(Glycine-HCl(■,pH 3.0-7.0)；Sodium Citrate(●,pH 3.0-6.0)；Acetic acid-Sodium acetate(▲,pH 4.0-6.0)；MES(◆,pH 5.5-6.5)；MOPS(▼,6.5-7.5)；Tris-HCl(□,pH 7.0-9.0)；CHES(○,pH 8.0-10.0)；Glycine-NaOH(△,9.0-10.5)；Na2HPO4-NaOH(◇,pH 11.0-12.0))。
图8为木聚糖酶CsXyn11A的最适温度测定曲线图。
图9为木聚糖酶CsXyn11A的温度稳定性测定曲线图。
图10为木聚糖酶CsXyn11A的半衰期测定曲线图。50℃(■),y＝-0.001x+4.6292,R2＝0.9959；55℃(●),y＝-0.0016x+4.6342,R2＝0.9937；60℃(▲),y＝-0.0032x+4.6342,R2＝0.9569；65℃(◆),y＝-0.0082x+4.1343,R2＝0.9828。
图11为CsXyn11A水解榉木木聚糖(a)、桦木木聚糖(b)、燕麦木聚糖(c)木二糖及木三糖(d)、木四糖(e)和木五糖(f)的薄层层析分析结果图(X：木糖；X2：木二糖；X3：木三糖；X4：木四糖；X5：木五糖；X6：木六糖)。
图12为木聚糖酶CsXyn11A在面包中的应用效果图。
图13为重组载体Blunt-CsXyn11A-HygB的载体图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在以下实施例中，参照Liu等(Liu et al.,Food Chemistry,2018,264:310-318)测定木聚糖酶的酶活力：添加900μL 1％(1g/100mL)的榉木木聚糖溶液于小试管中，70℃预热3min，然后加入100μL适当稀释的待测酶液(即待测蛋白的溶液)，整个反应体系中使用50mM pH 7.0的MOPS，70℃反应10min后加入1000μL DNS试剂(每1L水溶液包含10g 3,5-二硝基水杨酸，10g NaOH和2g苯酚，其余为水)，煮沸15min后加入1000μL饱和酒石酸钾钠溶液，冷却后于540nm波长下测定吸光值，以木糖作为标准。酶活力定义：上述条件下每分钟水解榉木木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量。
下述实施例中所涉及的培养基：
1、BMGY培养基的组成如下：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，质量百分浓度为1.34％的无氨基酵母氮源YNB，质量百分浓度为4×10-5％的生物素，体积百分比1％的甘油，余量为100mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液。
2、改进的BMMY培养基的组成如下：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，质量百分浓度为1.34％的无氨基酵母氮源YNB，质量百分浓度为4×10-5％的生物素，体积百分比0.5％的甲醇，余量为100mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液。
3、YPD培养基的组成如下：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，质量百分浓度为2％的葡萄糖，质量百分浓度为2％的琼脂，余量为水。
4、MD培养基的组成如下：质量百分浓度为2％的葡萄糖，质量百分浓度为1.34％的无氨基酵母氮源YNB，质量百分浓度为4×10-5％的生物素，质量百分浓度为2％的琼脂，余量为水。
5、BSM培养基：85％磷酸(85％磷酸是分析纯，％表示g/100mL)40mL，CaSO4 1.4g，K2SO4 27.3g，MgSO4·7H2O 22.4g，KOH 6.19g，甘油60g，加蒸馏水至1.5L。
下述实施例中所涉及的生物材料：
毛壳菌CQ31筛选于土壤并保存于实验室(记载于“Jiang et al.,FoodChemistry,2010,2:457-462”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)。
载体pPIC9K为美国Invitrogen公司产品。
桦木木聚糖、榉木木聚糖、燕麦木聚糖和小麦***木聚糖均为Sigma公司产品。
Blunt载体骨架为北京全式金公司产品。
实施例1、木聚糖酶基因的克隆和在毕赤酵母和黑曲霉中表达
嗜热真菌毛壳菌(Chaetomium sp.)CQ31来源的CsXyn11A成熟蛋白(序列表中序列1)分子量为23.91kDa，等电点为5.0。Signal P4.1分析其N端有17个氨基酸为信号肽序列(序列表中序列1的第1-17位)。将上述成熟蛋白氨基酸序列在NCBI比对分析，发现CsXyn11A与来源于Achaetomium sp.Xz-8 GH11家族的木聚糖酶(AHE13930)同源性最高，为72％，与来自于Aspergillus nidulans(P55333)、Chaetomium sp.CQ31(HM640243)、Humicolagrisea(Q9HGE1)的GH11家族木聚糖酶同源性分别为62％、60％、59％。因此CsXyn11A为新型GH11家族木聚糖酶。
一、重组载体pPIC9K-CsXyn11A、pPCAU-CsXyn11A和Blunt-CsXyn11A-HygB的构建
1.1重组载体pPIC9K-CsXyn11A的构建：
设计上游引物CsXyn11AEcoRIF和下游引物CsXyn11ANotIR，并以嗜热真菌毛壳菌CQ31的cDNA为模板进行PCR，扩增编码糖苷水解酶(GH)11家族的木聚糖酶基因(命名CsXyn11A)的成熟蛋白(序列表中序列1)的CDS核苷酸序列(序列表中序列2)。序列表中序列1的第1-17位氨基酸为CsXyn11A的信号肽序列，对应的序列2的第1-51位核苷酸分子为CsXyn11A蛋白信号肽的编码序列。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次；最后72℃延伸5min。产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，将酶切后的产物与相同酶切的表达载体pPIC9K与T4 DNA连接酶进行连接，热激转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃倒置培养12-16h。挑选菌落PCR验证为阳性的转化子提取质粒进行测序。经测序得到重组质粒pPIC9K-CsXyn11A，测序结果表明pPIC9K-CsXyn11A是将pPIC9K的限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点和限制性内切酶NotⅠ的识别位点之间的片段(小片段)替换为编码链的核苷酸序列是序列表中序列2的第52-669位所示的双链DNA分子，保持pPIC9K的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体，pPIC9K-CsXyn11A质粒图谱如图1所示。pPIC9K-CsXyn11A能表达氨基酸序列为序列表中序列1的第18-222位所示的蛋白质。CsXyn11AEcoRIF：5′-CATGGAATTCTTCCCCTTCAACGCCACCG-3′(引物划线部分碱基代表EcoRⅠ识别位点序列)；
CsXyn11ANotIR：5′-GAATGCGGCCGCTTACGGCTCGACAGTGATAGAGGAC-3′(引物划线部分碱基代表NotⅠ识别位点序列)。
1.2重组多拷贝载体pPCAU-CsXyn11A的构建：
设计上游引物CsXyn11AF和下游引物CsXyn11AR，并以毛壳菌CQ31的cDNA为模板PCR，扩增编码成熟蛋白CsXyn11A的核苷酸序列。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次；最后72℃延伸5min。产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收。利用吉布森组装方法体外串联AOX1启动子，连接CsXyn11A去掉信号肽的编码序列(序列表中序列2的第52-669位)、α-factor信号肽的编码基因(序列表中序列3)、2×AOX1启动子(序列表中序列4)和AOX1终止子(序列表中序列5)，形成CsXyn11A基因单拷贝表达盒(图2)，再将三个如上表述的表达盒按照顺式-反式-顺式依次串联，得到CsXyn11A基因多拷贝表达盒，连接到通用载体pPIC9K质粒骨架上酶切识别位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，构建多拷贝强表达质粒pPCAU-CsXyn11A，质粒图谱见图2。
将其热激转化E.coli Top10感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃倒置培养12-16h。挑选转化子利用验证引物PCR扩增测序，提取测序正确的转化子质粒命名为pPCAU-CsXyn11A，用于下一步实验。pPCAU-CsXyn11A能多拷贝强表达氨基酸序列为序列表中序列1的第18-222位所示的木聚糖酶蛋白质。
CsXyn11AF：5′-GCTGAAGCTTACGTAGAATTCCAGATTCCCCTTCAACGCCACCG-3′(引物划线部分碱基代表EcoRⅠ识别位点序列)；
CsXyn11AR：5′-AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTACGGCTCGACAGTGATAGAGGAC-3′(引物划线部分碱基代表NotⅠ识别位点序列)。
1.3重组载体Blunt-CsXyn11A-HygB的构建：
使用吉布森组装方法将含有CsXyn11A基因目的片段的DNA片段(序列表中序列6)连接到Blunt表达质粒上识别位点Kpn I和Xba I之间得到重组载体Blunt-CsXyn11A-HygB(图13所示)。其中，序列表中序列6的第7-1006位核苷酸所示的DNA序列为黑曲霉启动子序列Pgla；序列6的第1007-1060位核苷酸所示的DNA序列为糖化酶信号肽序列；序列6的第1061-1678位核苷酸所示的DNA序列为CsXyn11A基因目的片段；序列表序列6的第3359-4384位核苷酸所示的DNA序列为潮霉素抗性基因序列。
将构建的表达载体Blunt-CsXyn11A-HygB转化至克隆宿主E.coli DH5α，对阳性大肠杆菌转化子进行菌落PCR验证并测序，验证引物为ZD-Pgla-F:(5′-GTTGATGCATGTGCTTCTTCCTTCAG-3′)和ZD-Pgla-R:(5′-CGGATTAATAATCATCCACTGCACCTC-3′)。
测序结果表明Blunt-CsXyn11A-HygB含有序列表中序列2的第52-669位所示的CsXyn11A基因，能表达氨基酸序列为序列表中序列1的第18-222位所示的CsXyn11A蛋白质。
从测序结果正确的大肠杆菌中提取质粒进行双酶切，400μL酶切体系为：356μL重组质粒Blunt-CsXyn11A-HygB，40μL Cutsmart buffer，2μL KpnⅠ和2μL XbaⅠ，37℃酶切过夜。将酶切后的质粒(即线性化质粒Blunt-CsXyn11A-HygB)进行醇沉回收。
二、重组木聚糖酶在毕赤酵母和黑曲霉中的表达
2.1重组木聚糖酶在毕赤酵母表达
毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)感受态按照毕赤酵母使用说明(Invitrogen公司)所述方法制备。用限制性内切酶SalⅠ线性化上述重组载体质粒pPIC9K-CsXyn11A和pPCAU-CsXyn11A，并调整各自浓度1μg/μL。取80μL酵母感受态细胞，与10μL线性化的pPIC9K-CsXyn11A或pPCAU-CsXyn11A质粒混匀，置于预冷的0.2cm的电击杯中(Bio-rad公司)，电击转化。电击后，迅速加入1.0mL预冷的1M山梨醇水溶液，分别涂布于营养缺陷筛选板(MD)上，培养3-4d，分别从pPIC9K-CsXyn11A转化毕赤酵母GS115的MD板上挑选50个单菌落(pPIC9K-CsXyn11A重组毕赤酵母菌株)或pPCAU-CsXyn11A转化毕赤酵母GS115的MD板上挑选50个单菌落(pPCAU-CsXyn11A重组毕赤酵母菌株)进行产酶发酵水平比较，产酶发酵过程如下：将单菌落接种于25mL BMGY培养基，30℃200rpm振荡培养至发酵液的OD600nm为12(以BMGY培养基为空白对照)，离心收集菌体，转接到装有100mL改进的BMMY培养基的500mL三角瓶中，使发酵液的OD600nm达到8(以改进的BMMY培养基为空白对照)，相同培养条件培养，每24h补加甲醇至终浓度0.5％(体积百分含量，即100mL改进的BMMY每24h补加甲醇500μL)，诱导5d。
表1不同质粒转化毕赤酵母转化子木聚糖酶CsXyn11A酶活力比较
Figure GDA0003725801410000101
表1为各自pPIC9K-CsXyn11A和pPCAU-CsXyn11A质粒代表性转化子测定的木聚糖酶酶活力，从表中可以看出，步骤一构建的多拷贝强表达质粒pPCAU-CsXyn11A转化毕赤酵母GS115得到的pPCAU-CsXyn11A重组毕赤酵母菌株比重组质粒pPIC9K-CsXyn11A转化毕赤酵母GS115得到的pPIC9K-CsXyn11A重组毕赤酵母菌株酶活力可高2-3倍，因此选择pPCAU-CsXyn11A构建的重组毕赤酵母用于下一步的G418筛选。
用无菌水收集pPCAU-CsXyn11A转化毕赤酵母GS115的MD板上的菌体，将收集的菌体适当稀释后涂布不同浓度G418筛选板上，G418的浓度分别为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL，分别挑选不同G418浓度下生长良好的单菌落，进行摇瓶复筛。按照下述方法选择表达量高的菌株(摇瓶发酵验证)：挑选毕赤酵母转化子单菌落，接种于25mL BMGY培养基，30℃200rpm振荡培养至OD600nm为12(以BMGY培养基为空白对照)，离心收集菌体，转接到装有100mL改进的BMMY培养基的500mL三角瓶中，使OD600nm达到8(以改进的BMMY培养基为空白对照)，相同培养条件培养，每24h补加甲醇至终浓度0.5％(体积百分含量，即100mL改进的BMMY每24h补加甲醇500μL)，诱导5d。
经过筛选，获得产酶量最高的重组毕赤酵母菌株pPCAU-CsXyn11A，采用重组毕赤酵母菌pPCAU-CsXyn11A使用摇瓶发酵验证，重组木聚糖酶表达量190U/mL。后续将采用重组毕赤酵母菌pPCAU-CsXyn11A进行发酵罐高密度发酵验证。
2.2重组木聚糖酶在黑曲霉中表达
黑曲霉原生质体的制备与纯化：利用DPY液体培养基在30℃空气摇床中培养无孢黑曲霉(A.niger)(生物风，菌株号as3.3289)GA 3d。将裂解后的原生质体于4℃、1000g条件下离心10min弃上清，加入20mL预冷的STC溶液洗涤原生质体，枪头反复吹打、重悬后于4℃、1000g条件下离心15min。对上述步骤重复1次后加入0.6mL的STC重悬，备用。
黑曲霉原生质体PEG介导转化：取3个2mL的EP管分别标记对照组、实验组和再生组。对照组：160μL原生质体+100μL STC+60μL PEG；实验组：160μL原生质体+100μL线性化质粒(步骤1.3中得到的线性化Blunt-CsXyn11A-HygB质粒)+60μL PEG；再生组：160μL原生质体+100μL STC+60μL PEG。三个组别轻弹混匀后冰浴30min，每间隔10min轻弹一次，之后每个EP管加入1mL的PEG于室温下静置25min。
倾注培养：使用3mL STC缓冲液和6mL蔗糖CD高渗软琼脂加入至15mL离心管中进行混匀，分别将对照组、实验组和再生组转移至15mL离心管中，并在实验组和对照组中加入终浓度为300μg/mL的HygB，上下颠倒混匀后分别取6mL倒入蔗糖CD高渗琼脂板(对照组和实验组含300μg/mL HygB)，均匀分布后于30℃培养3-4d。
转化子鉴定：对实验组高渗平板中生长出来的单菌落两次传代培养后进行基因组提取，设计验证引物ZD-Pgla-F:(5′-GTTGATGCATGTGCTTCTTCCTTCAG-3′)和ZD-Pgla-R:(5′-CGGATTAATAATCATCCACTGCACCTC-3′)进行扩增并测序验证。PCR反应体系同上。
对基因型正确的转化子进行摇瓶发酵培养，在恒温摇床于34℃、200rpm条件下培养120h后，取离心后的发酵上清液检测木聚糖酶活力和SDS-PAGE分析。
经测定阳性转化菌株Blunt-CsXyn11A-HygB的木聚糖酶活力为1200U/mL。
实施例2、重组木聚糖酶CsXyn11A的高密度发酵及纯化
一、重组木聚糖酶CsXyn11A的高密度发酵
种子培养：将实验例1获得的重组毕赤酵母菌株pPCAU-CsXyn11A接种到装有100mLBMGY或YPD培养基的500mL三角瓶中，在30℃、200rpm振荡培养24-30h，得到OD600nm约为2.0-6.0的种子液。
甘油发酵阶段：将种子液接种到5L发酵罐中(装有1.5L BSM培养基)。过程中温度为30℃，用氨水和磷酸调节pH至5.0，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20％(相对值，本发明以发酵条件30℃，pH 5.0，转速600rpm确定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液溶氧为0，下同)(如搅拌转速为600rpm，通气量为2.0vvm)。待甘油消耗完全(溶氧DO值迅速上升)，进入甘油补料发酵阶段。
甘油补料发酵阶段：甘油水溶液(50％w/v，即500g/L的甘油水溶液)流速为30mL/h/L起始发酵液，流加4h。待甘油消耗完全后，停止流加，饥饿1h然后进入甲醇补料诱导表达阶段。甘油补料发酵阶段培养温度为30℃、pH为5.0、控制溶氧大于20％。
甲醇补料诱导表达阶段：温度为30℃，将pH调整到6.0，控制甲醇流速约为6mL/h/L起始发酵液，流加甲醇至菌体湿重达320g/L时停止流加，该阶段保持溶氧在20％以上，如不能使溶氧保持在20％以上，适当减小流加速度。
混合补料诱导表达阶段：温度继续保持30℃，pH继续控制在6.0，控制甲醇流速约为4-5mL/h/L起始发酵液，同时控制甘油水溶液(50％w/v，即500g/L的甘油水溶液)流速约为90mL/h/L起始发酵液至发酵结束，该阶段保持溶氧在20％以上，如不能使溶氧保持在20％以上，适当减小甘油和甲醇流加速度。
发酵过程见图3，(■)为发酵上清液(发酵结束后发酵液在10000×g条件下离心10min所得的上清液)中木聚糖酶的酶活；(●)为发酵上清液中蛋白质含量；(▲)：为菌体湿重。酶活在第7天达到最大，最高酶活达19000U/mL，同时发酵上清液中的蛋白含量达10.8mg/mL，菌体湿重为520g/L。发酵历程SDS-PAGE分析见图4，泳道M：低分子量标准蛋白；泳道1-8：分别为诱导0、24、48、72、96、120、144、156h的发酵上清液蛋白含量。
二、重组木聚糖酶CsXyn11A的纯化
Q-琼脂糖凝胶FF(Q-Sepharose FF)离子交换层析：取10mL发酵罐中的发酵液上清液(发酵结束后发酵液在10000×g条件下离心10min所得的上清液，即表2中的粗酶液)，透析平衡至20mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，随后上样于用20mM pH7.5Tris-HCl缓冲液平衡的Q-Sepharose FF层析柱。用5个柱体积的缓冲液(20mM pH 7.5Tris-HCl缓冲液)洗净未结合的蛋白后，含0-500mM NaCl缓冲液(NaCl添加到20mM Tris-HCl pH 7.5缓冲液中得到的液体)线性洗脱50min(50min内NaCl从0线性升至500mM)并分部收集。缓冲液平衡Q-Sepharose的流速为1mL/min，上样时流速为0.5mL/min，5个柱体积洗脱未结合蛋白流速为1mL/min，含0-500mM NaCl缓冲液线性洗脱速度为1mL/min(50min内NaCl从0线性升至500mM)。将得到的纯酶-重组木聚糖酶CsXyn11A合并后，用pH 7.0的MOPS缓冲液透析备用。
重组蛋白CsXyn11A经Q-Sepharose(Tris-HCl pH 7.5)阴离子交换层析一步纯化，得到电泳级纯酶，该酶回收率为72％，纯化倍数为1.1倍，纯酶比酶活为1920U/mg(表2)。重组毕赤酵母菌株的粗酶液及其得到的纯化产物(CsXyn11A)的SDS-PAGE如图5所示。其中，泳道M为分子量标准，泳道1为发酵液上清，泳道2为经Q-Sepharose柱层析纯化后的纯酶。图5的结果表明，重组蛋白CsXyn11A的大小为20kDa。
表2木聚糖酶的纯化表
Figure GDA0003725801410000131
实施例3、重组木聚糖酶CsXyn11A的性质
一、CsXyn11A的最适pH测定
分别以下述具有不同pH值的缓冲体系测定该酶最适pH值：(甘氨酸-盐酸)Glycine-HCl(pH 3.0-7.0)；(柠檬酸-柠檬酸钠)Sodium Citrate(pH 3.0-6.0)；(醋酸盐)Acetic acid-Sodium acetate(pH 4.0-6.0)；MES(pH 5.5-6.5)；MOPS(6.5-7.5)；Tris-HCl(pH 7.0-9.0)；CHES(pH 8.0-10.0)；(甘氨酸-氢氧化钠)Glycine-NaOH(9.0-10.5)；Na2HPO4-NaOH(pH 11.0-12.0)。然后在70℃采用标准方法测定木聚糖酶酶活力，以酶活力最高为100％，分别计算各个pH下测定的酶活力。
结果如图6所示，实施例2的重组木聚糖酶CsXyn11A的最适pH值为7.0。
二、CsXyn11A的pH稳定性测定
分别用上述步骤一中不同pH的缓冲液稀释CsXyn11A酶液，将稀释的酶液在60℃恒温水浴锅中保温30min，然后冰水浴中冷却30min，最后在70℃和pH 7.0条件下按照步骤一中方法测定木聚糖酶酶活力，以未经处理的酶液的酶活力作为对照，分别计算经过不同酸碱条件处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。
结果如图7所示，实施例2的重组木聚糖酶CsXyn11A具有较宽的pH稳定范围，当pH为2.0-9.0时，残余酶活力在80％以上。
三、CsXyn11A的最适反应温度测定
将CsXyn11A在50mM的MOPS缓冲液(pH 7.0)中适当稀释，然后分别在30-85℃不同温度下按照步骤一中方法测定木聚糖酶的酶活力，以酶活力最高值作为100％，分别计算各个温度下测定的相对酶活力。
结果如图8所示，实施例2的重组木聚糖酶CsXyn11A的最适温度为70℃。
四、CsXyn11A的温度稳定性测定
将CsXyn11A在50mM的MOPS缓冲液(pH 7.0)中适当稀释，然后分别在30-85℃保温30min，随后置于冰水浴中冷却30min，最后在70℃和pH 7.0条件下按照上述方法测定木聚糖酶的酶活力，以未经热处理的酶液作为对照，分别计算不同热处理后酶液的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比计算相对酶活力。
结果如图9所示，实施例2的重组木聚糖酶CsXyn11A在60℃下保持稳定，残余酶活力在80％以上。
五、CsXyn11A的半衰期测定
将实施例2的重组木聚糖酶CsXyn11A在50mM的MOPS缓冲液(pH 7.0)中适当稀释，然后分别在50-65℃保温4h，并在不同时间段进行取样，随后置于冰水浴中冷却30min，最后在70℃和pH 7.0条件下按照上述方法测定木聚糖酶的酶活力，以未经热处理的酶液作为对照，分别计算不同热处理后酶液的残余酶活力。根据残余酶活力计算CsXyn11A在不同温度下的半衰期。
结果如图10所示，重组木聚糖酶CsXyn11A在50℃、55℃、60℃、65℃的半衰期分别为717、450、182、27min。
六、底物特异性
使用多种聚糖和人工合成的对硝基苯酚-糖苷(pNP-糖苷)作为底物测定CsXyn11A的底物特异性。聚糖包括：桦木木聚糖、榉木木聚糖、燕麦木聚糖、小麦***木聚糖、大麦葡聚糖、CMC、胶体几丁质、壳聚糖、可溶性淀粉、罗望子胶和槐豆胶。pNP-糖苷包括：pNP-β-xylopyranoside、pNP-β-glucopyranoside和pNP-β-galactopyranoside。
具体测定方法如下：
聚糖类底物：用50mM pH 7.0 MOPS缓冲液配制为1％(w/v，1g/100mL)的浓度，根据木聚糖酶活力测测定方法测定。
pNP-糖苷类底物：上述不同人工合成糖苷类底物用50mM pH 7.0MOPS缓冲液配制为5mM的浓度，在70℃下反应10min，于OD540nm测定吸光值，酶活力单位(U)定义在上述反应条件下每分钟水解底物释放1μmol pNP所需要的酶量。
结果如表3所示，CsXyn11A对榉木木聚糖、桦木木聚糖、小麦***木聚糖和燕麦***木聚糖表现出高活性，对其他底物均未表现出活性，证实该酶底物特异性专一。
表3重组木聚糖酶CsXyn11A的底物特异性
底物种类 比酶活力(U/mg) 相对酶活力(％)
榉木木聚糖 1920 100
桦木木聚糖 1800 94
小麦***木聚糖 1850 96
燕麦木聚糖 2540 132
大麦葡聚糖 -
CMC -
胶体几丁质 -
壳聚糖
罗望子胶 -
可溶性淀粉
pNP-β-xylopyranoside -
pNP-β-glucopyranoside -
“-”表示未测到活性
七、CsXyn11A的水解特性
以50mM pH 7.0的MOPS缓冲液配制1％(即1g/100mL)不同底物(木二糖-木六糖、榉木木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖和小麦***木聚糖)，加酶量为10U/mL，50℃保温12h。为监测反应进程，分别于0min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h取样，沸水浴保温10min灭酶。通过薄层层析(TLC)分析水解产物(展层剂：正丁醇/乙酸/水＝2:1:1(体积比)；显色剂：硫酸/甲醇＝5/95(体积比))。
薄层层析结果如图11所示。可以看出，CsXyn11A能够水解小麦***木聚糖和燕麦木聚糖，水解产物以木二糖和木三糖为主。水解榉木木聚糖和桦木木聚糖的产物以木二糖、木三糖、木五糖和木六糖为主。CsXyn11A水解木四糖和木五糖的水解产物为木二糖和木三糖，最小水解产物为木三糖。
实施例4、重组木聚糖酶CsXyn11A在面包烘焙中的应用
一、面包的制作过程及相关参数测定方法
称取700g面粉，向其中加入8.4g干酵母粉。称取70g的白砂糖和7.0g的盐溶解于406mL纯净水，并加入一定量的纯酶液(0-6ppm，1ppm即1kg中添加1mg酶)。将面粉和混合好的溶液倒入和面机，低速搅拌2min，高速搅拌3min，加入28g黄油后继续低速搅拌2min，高速搅拌3min。搅拌完成后取出面团，静置5min。将面团分割为150g/个，揉至表面光滑圆润，静置15min后擀气泡、整形、装盒，于38℃，相对湿度80％的条件下，醒发90min。醒发后的面胚于上火180℃，下火200℃的烤箱，烘烤20min。烘烤结束后，将面包放在25℃的条件下冷却2h，装入保鲜袋密封。
比容的测定：采用油菜籽排体积法测定面包体积；利用天平称量面包质量。
硬度的测定：将面包从中部切成厚度为20mm的均匀薄片，采用质构仪(配有R-36A圆柱型探头)测定面包芯的硬度。测试速度1mm/s，压缩形变量40％，感应力为0.5N。
面包老化的测定：将面包置于4℃条件下储藏，按照相同时间间隔以相同条件测定面包硬度，记录面包硬度变化。
在面包制作过程中添加重组木聚糖酶(CsXyn11A)对面包品质的影响如表4所示。结果表明随着CsXyn11A的添加量增大，面包的比容在增加，硬度在减小，当加酶量为5ppm时，面包比容增大了25.6％，硬度降低了46％。另外，CsXyn11A可有效延缓面包的老化(图12)
表4重组木聚糖酶(CsXyn11A)对面包的影响
酶添加量 面包比容 面包比容增大 硬度 硬度降低
(ppm) (mL/g) 百分比(％) (N) 百分比(％)
0 4.96±0.13 0 5.17±0.03 0
1 5.35±0.06 7.9 3.77±0.12 27.1
2 5.65±0.15 13.9 3.26±0.02 36.9
3 5.80±0.10 16.9 2.99±0.10 42.2
4 6.14±0.06 23.8 2.89±0.03 44.1
5 6.23±0.09 25.6 2.79±0.02 46.0
6 6.16±0.08 24.2 2.74±0.11 47.0
实施例5、重组木聚糖酶CsXyn11A在馒头制作中的应用
一、馒头的制作过程及相关参数测定方法
称取500g面粉，向其中加入2.5g干酵母粉及一定量的纯酶液(2-5ppm)。以不加酶液的为对照组，低速搅拌成团，约5min，再告诉搅拌3min。将面团取出，于室温下覆膜静置10min，然后分割成100g/个的面坯，将面坯揉至成型，放入38℃、相对湿度为80％的醒发箱中醒发40min，然后放入蒸锅中蒸制15min。蒸制结束后，将馒头放在室温下冷却1h后装入自封袋，待测定比容与硬度。
比容的测定：采用油菜籽排体积法测定馒头体积；利用天平称量馒头质量。
硬度的测定：将面包从中部切成厚度为20mm的均匀薄片，采用质构仪(配有R-36A圆柱型探头)测定馒头的硬度。测试速度1mm/s，压缩形变量30％，感应力为0.5N。
老化的测定：将馒头置于4℃条件下储藏，按照相同时间间隔以相同条件测定馒头硬度，记录馒头硬度变化。
在馒头制作过程中添加重组木聚糖酶(CsXyn11A)对馒头品质的影响如表5所示。结果表明随着CsXyn11A的添加量增大，馒头的比容在增加，硬度在减小，当加酶量为4ppm时，馒头比容增大了29.3％，硬度降低了41％。另外，CsXyn11A可有效延缓馒头的老化。
表5重组木聚糖酶(CsXyn11A)对馒头的影响
酶添加量 馒头比容 馒头比容增大 硬度 硬度降低
(ppm) (mL/g) 百分比(％) (N) 百分比(％)
0 2.08±0.09 0 27.43±0.03 0
2 2.30±0.01 10.6 22.17±0.12 19.1
3 2.44±0.05 17.3 18.29±0.02 33.3
4 2.69±0.04 29.3 16.19±0.10 40.9
5 2.71±0.03 30.2 16.09±0.03 41.3
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种具有高***木聚糖活力的耐热木聚糖酶及其编码基因与应用
<130> GNCSQ210507
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 222
<212> PRT
<213> 毛壳菌（Chaetomium sp. ）
<400> 1
Met Val Ser Thr Lys Ala Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ser Gly Ala Leu
1 5 10 15
Ala Phe Pro Phe Asn Ala Thr Glu Val Arg Glu Leu Val Gly Arg Ala
20 25 30
Gly Thr Pro Ser Gly Thr Gly Thr His Asp Gly Phe Phe Tyr Ser Phe
35 40 45
Trp Thr Asp Asn Gly Gly Thr Val Trp Tyr Glu Asn Gly Pro Gly Gly
50 55 60
Ser Tyr Ser Val Asn Trp Glu Asn Cys Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys
65 70 75 80
Gly Trp Asn Pro Gly Ser Asp Arg Thr Ile Asn Tyr Ser Gly Gln Phe
85 90 95
Asn Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Ile Tyr Gly Trp Thr Arg Asn
100 105 110
Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ala Phe Gly Asn Tyr Asp Pro
115 120 125
Ser Ser Gln Ala Glu Val Leu Gly Thr Val Glu Thr Asp Gly Ser Thr
130 135 140
Tyr Thr Ile Ala Lys Ser Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly
145 150 155 160
Asp Ser Ser Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg His Asn His Arg
165 170 175
Ser Ser Gly Ser Val Asn Val Gly Asn His Phe Arg Ala Trp Ala Glu
180 185 190
Arg Gly Leu Asn Leu Gly Ser His Asp Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu
195 200 205
Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Thr Val Glu Pro
210 215 220
<210> 2
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
atggtctcca cgaaggctct gctccttgcc gccgcctcgg gagctctagc atttcctttt 60
aatgccactg aagttagaga attggttggt agagcaggta ctccatctgg tactggtact 120
cacgacggtt tcttttactc attttggact gataatggtg gtacagtttg gtatgaaaat 180
ggtccaggtg gttcttactc agttaactgg gaaaactgtg gtaacttcgt tggtggtaaa 240
ggttggaacc caggttctga tagaactatt aattactctg gtcaattcaa tccatctggt 300
aatggttatt tggctatcta tggttggaca agaaacccat tggttgaata ctacatcgtt 360
gaagctttcg gtaactacga tccatcttca caagcagaag ttttgggtac tgttgaaaca 420
gatggttcta cttacacaat cgctaagtca actagataca atgcaccatc tattgagggt 480
gactcttcaa cattcgatca atactggtca gttagacata accatagatc ttcaggttct 540
gttaatgttg gtaatcattt tagagcttgg gcagaaagag gtttgaattt gggttctcat 600
gattaccaaa tagttgccac agaaggttat caatcatcag gtagtagtag tattacagta 660
gaaccataa 669
<210> 3
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagct 267
<210> 4
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
attggagctc gctcattcca attccttcta ttaggctact aacaccatga ctttattagc 60
ctgtctatcc tggcccccct ggcgaggttc atgtttgttt atttccgaat gcaacaagct 120
ccgcattaca cccgaacatc actccagatg agggctttct gagtgtgggg tcaaatagtt 180
tcatgttccc caaatggccc aaaactgaca gtttaaacgc tgtcttggaa cctaatatga 240
caaaagcgtg atctcatcca agatgaacta agtttggttc gttgaaatgc taacggccag 300
ttggtcaaaa agaaacttcc aaaagtcgcc ataccgtttg tcttgtttgg tattgattga 360
cgaatgctca aaaataatct cattaatgct tagcgcagtc tctctatcgc ttctgaaccc 420
cggtgcacct gtgccgaaac gcaaatgggg aaacacccgc tttttggatg attatgcatt 480
gtctccacat tgtatgcttc caagattctg gtgggaatac tgctgatagc ctaacgttca 540
tgatcaaaat ttaactgttc taacccctac ttgacagcaa tatataaaca gaaggaagct 600
gccctgtctt aaaccttttt ttttatcatc attattagct tactttcata attgcgactg 660
gttccaattg acaagctttt gattttaacg acttttaacg acaacttgag aagatcaaaa 720
aacaactaat tattcgaaat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt aggctactaa 780
caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat gtttgtttat 840
ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag ggctttctga 900
gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt ttaaacgctg 960
tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag tttggttcgt 1020
tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcgccat accgtttgtc 1080
ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta gcgcagtctc 1140
tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa acacccgctt 1200
tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt gggaatactg 1260
ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt gacagcaata 1320
tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat tattagctta 1380
ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac ttttaacgac 1440
aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaa 1476
<210> 5
<211> 247
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
tcaagaggat gtcagaatgc catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt 60
ttatttgtaa cctatatagt ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc 120
ttgctcctga tcagcctatc tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa 180
tcattcgagt ttgatgtttt tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta 240
agtgaga 247
<210> 6
<211> 5390
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
ggtacccctc tcgtatgcag aggaaatctc ccctgatctt ccgaactggt cgtacctggc 60
gacctatgac tatggcaccc cagttctggg gaccttccac ggaagtgacc tgctgcaggt 120
gttctatggg atcaagccaa actatgcagc tagttctagc cacacgtact atctgagctt 180
tgtgtatacg ctggatccga actccaaccg gggggagtac attgagtggc cgcagtggaa 240
ggaatcgcgg cagttgatga atttcggagc gaacgacgcc agtctcctta cggatgattt 300
ccgcaacggg acatatgagt tcatcctgca gaataccgcg gcgttccaca tctgatgcca 360
ttggcggagg ggtccggacg gtcaggaact tagccttatg agatgaatga tggacgtgtc 420
tggcctcgga aaaggatata tggggatcat gatagtacta gccatattaa tgaagggcat 480
ataccacgcg ttggacctgc gttatagctt cccgttagtt atagtaccat cgttatacca 540
gccaatcaag tcaccacgca cgaccgggga cggcgaatcc ccgggaattg aaagaaattg 600
catcccaggc cagtgaggcc agcgattggc cacctctcca aggcacaggg ccattctgca 660
gcgctggtgg attcatcgca atttcccccg gcccggcccg acaccgctat aggctggttc 720
tcccacacca tcggagattc gtcgcctaat gtctcgtccg ttcacaagct gaagagcttg 780
aagtggcgag atgtctctgc aggaattcaa gctagatgct aagcgatatt gcatggcaat 840
atgtgttgat gcatgtgctt cttccttcag cttcccctcg tgcagatgag gtttggctat 900
aaattgaagt ggttggtcgg ggttccgtga ggggctgaag tgcttcctcc cttttagacg 960
caactgagag cctgagcttc atccccagca tcattacacc tcagcaatgt cgttccgatc 1020
tctactcgcc ctgagcggcc tcgtctgcac agggttggca ttccccttca acgccaccga 1080
ggtgagggag ctcgtgggcc gcgccggaac ccccagcggt actggcaccc acgacggctt 1140
cttctactcg ttctggaccg acaacggcgg cactgtctgg tacgagaacg gccctggcgg 1200
ctcgtacagc gtcaactggg agaactgcgg caactttgtc ggcggcaagg gctggaaccc 1260
cggctcggac cggaccatca actactcggg ccagttcaac ccgtcgggca acggctacct 1320
ggccatctac ggctggacgc gcaacccgct ggtcgagtac tacatcgtcg aggcgttcgg 1380
caactacgac ccctcgtcgc aggccgaggt gctgggcacg gtcgagacgg acggcagcac 1440
gtacaccatc gccaagagca cgcggtacaa cgcgccgtcg atcgagggcg actcgagcac 1500
gttcgaccag tactggtcgg tccgccacaa ccaccggtcc agcggctccg tcaacgtcgg 1560
caaccacttc cgcgcctggg ccgagagggg cctcaacctc ggctcgcacg actaccagat 1620
cgtcgccacc gagggctacc agagcagcgg ctcgtcctct atcactgtcg agccgtaaga 1680
tccacttaac gttactgaaa tcatcaaaca gcttgacgaa tctggatata agatcgttgg 1740
tgtcgatgtc agctccggag ttgagacaaa tggtgttcag gatctcgata agatacgttc 1800
atttgtccaa gcagcaaaga gtgccttcta gtgatttaat agctccatgt caacaagaat 1860
aaaacgcgtt tcgggtttac ctcttccaga tacagctcat ctgcaatgca ttaatgcatt 1920
ggacctcgca accctagtac gcccttcagg ctccggcgaa gcagaagaat agcttagcag 1980
agtctatttt cattttcggg agacgagatc aagcagatca acggtcgtca agagacctac 2040
gagactgagg aatccgctct tggctccacg cgactatata tttgtctcta attgtacttt 2100
gacatgctcc tcttctttac tctgatagct tgactatgaa aattccgtca ccagcccctg 2160
ggttcgcaaa gataattgca ctgtttcttc cttgaactct caagcctaca ggacacacat 2220
tcatcgtagg tataaacctc gaaaatcatt cctactaaga tgggtataca atagtaacca 2280
gaataagatg gtggagagct tataccgagc tcccaaatct gtccagatca tggttgaccg 2340
gtgcctggat cttcctatag aatcatcctt attcgttgac ctagctgatt ctggagtgac 2400
ccagagggtc atgacttgag cctaaaatcc gccgcctcca ccatttgtag aaaaatgtga 2460
cgaactcgtg agctctgtac agtgaccggt gactctttct ggcatgcgga gagacggacg 2520
gacgcagaga gaagggctga gtaataagcg ccactgcgcc agacagctct ggcggctctg 2580
aggtgcagtg gatgattatt aatccgggac cggccgcccc tccgccccga agtggaaagg 2640
ctggtgtgcc cctcgttgac caagaatcta ttgcatcatc ggagaatatg gagcttcatc 2700
gaatcaccgg cagtaagcga aggagaatgt gaagccaggg gtgtatagcc gtcggcgaaa 2760
tagcatgcca ttaacctagg tacagaagtc caattgcttc cgatctggta aaagattcac 2820
gagatagtac cttctccgaa gtaggtagag cgagtacccg gcgcgtaagc tccctaattg 2880
gcccatccgg catctgtagg gcgtccaaat atcgtgcctc tcctgctttg cccggtgtat 2940
gaaaccggaa aggccgctca ggagctggcc agcggcgcag accgggaaca caagctggca 3000
gtcgacccat ccggtgctct gcactcgacc tgctgaggtc cctcagtccc tggtaggcag 3060
ctttgccccg tctgtccgcc cggtgtgtcg gcggggttga caaggtcgtt gcgtcagtcc 3120
aacatttgtt gccatatttt cctgctctcc ccaccagctg ctcttttctt ttctctttct 3180
tttcccatct tcagtatatt catcttccca tccaagaacc tttatttccc ctaagtaagt 3240
actttgctac atccatactc catccttccc atcccttatt cctttgaacc tttcagttcg 3300
agctttccca cttcatcgca gcttgactaa cagctacccc gcttgagcag acatcaccat 3360
gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag 3420
cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt 3480
aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg 3540
ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg 3600
ggaattcagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca 3660
agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctgcagccg gtcgcggagg ccatggatgc 3720
gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat 3780
cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca 3840
ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct 3900
gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc 3960
caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat 4020
gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg 4080
tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg 4140
gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg 4200
caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc 4260
cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg 4320
tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaagga 4380
atagacaatc aatccatttc gctatagtta aaggatgggg atgagggcaa ttggttatat 4440
gatcatgtat gtagtgggtg tgcataatag tagtgaaatg gaagccaagt catgtgattg 4500
taatcgaccg acggaattga ggatatccgg aaatacagac accgtgaaag ccatggtctt 4560
tccttcgtgt agaagaccag acagacagtc cctgatttac ccttgcacaa agcactagaa 4620
aattagcatt ccatccttct ctgcttgctc tgctgatatc actgtcattc aatgcatagc 4680
catgagctca tcttagatcc aagcacgtaa ttccatagcc gaggtccaca gtggagcagc 4740
aacattcccc atcattgctt tccccagggg cctcccaacg actaaatcaa gagtatatct 4800
ctaccgtcca atagatcgtc ttcgcttcaa aatctttgac aattccaaga gggtccccat 4860
ccatcaaacc cagttcaata atagccgaga tgcatggtgg agtcaattag gcagtattgc 4920
tggaatgtcg gggccagttg gcccggtggt cattggccgc ctgtgatgcc atctgccact 4980
aaatccgatc attgatccac cgcccacgag gcgcgtcttt gctttttgcg cggcgtccag 5040
gttcaactct ctctgcagct ccagtccaac gctgactgac tagtttacct actggtctga 5100
tcggctccat cagagctatg gcgttatccc gtgccgttgc tgcgcaatcg ctatcttgat 5160
cgcaaccttg aactcactct tgttttaata gtgatcttgg tgacggagtg tcggtgagtg 5220
acaaccaaca tcgtgcaagg gagattgata cggaattgtc gctcccatca tgatgttctt 5280
gccggctttg ttggccctat tcgtgggatg cgatgccctc gctgtgcagc agcaggtact 5340
gctggatgag gagccatcgg tctctgcacg caaacccaac ttcctctaga 5390

Claims (10)

1.蛋白质，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第18至222位氨基酸残基的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B4)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的所述蛋白质的编码基因：
b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2的第52-699位核苷酸的cDNA分子或DNA分子。
4.权利要求1中所述的蛋白质在作为木聚糖酶中的应用。
5.权利要求2或3中所述的生物材料在制备木聚糖酶中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述木聚糖酶的底物为榉木木聚糖、桦木木聚糖、小麦***木聚糖和燕麦木聚糖中的至少一种。
7.权利要求1中所述的蛋白质和/或权利要求2或3中所述的生物材料的下述任一种应用：
P1、在制备面制品中的应用；
P2、在制备低聚木糖中的应用；
P3、在制备面制品食品中的应用；
P4、在制备面制品饲料中的应用；
P5、在制备食品添加剂产品中的应用；
P6、在食品或饲料加工中的应用；
P7、在面包烘焙中的应用；
P8、在馒头制作中的应用。
8.含有权利要求1中所述蛋白质的产品，其特征在于：所述产品为食品添加剂或饲料添加剂。
9.一种制备木聚糖酶的方法，包括：使权利要求1中所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到木聚糖酶；所述生物为微生物、植物或非人动物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述微生物为酵母或丝状真菌。
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