CN104046645A - 一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法。本发明运用分子生物学技术在表达黑曲霉β-甘露聚糖酶的重组菌中转化含分子伴侣蛋白PDI基因编码区的质粒，使β-甘露聚糖酶与分子伴侣共表达。在伴侣蛋白的协同作用下，加速了外源蛋白的合成速率，从而增加了外源蛋白β-甘露聚糖酶的分泌速率。本发明将β-甘露聚糖酶与分子伴侣共表达，提高了β-甘露聚糖酶的表达水平。

Description

一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法。

背景技术

植物细胞壁主要由半纤维素、纤维素、木质素等组成。β-甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，由β-1,4-D吡喃甘露聚糖连接而成的线状多糖，主要存在于植物细胞壁和豆科植物种子中。作为一种非淀粉多糖，β-甘露聚糖能产生抗营养作用。单胃动物不含有降解β-甘露聚糖的内源酶，不能消除β-甘露聚糖的抗营养作用，因而对动物的生产性能产生负面影响。

β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC3.2.1.78)是一种半纤维素酶，以内切方式降解β-1,4糖苷键。β-甘露聚糖酶主要来源于微生物，如细菌、放线菌和真菌等。丝状真菌黑曲霉是一种重要的工业微生物，已被FDA认定为属于GRAS(公认安全)的微生物，其能分泌多种胞外酶和有机酸。目前，微生物来源的β-甘露聚糖酶已被广泛应用于造纸工业、食品工业、饲料工业、纺织工业和石油工业等。但所有这些工业化应用能否成功的关键因素之一是β-甘露聚糖酶的高水平表达。

毕赤酵母表达***具有原核生物表达***所不具有的对外源蛋白质的翻译后修饰等优点，近年来已被广泛用于工业化生产各种异源蛋白，且被认为是最有效的蛋白表达***之一。大量研究表明，当外源蛋白大量表达时，酵母分泌途径的超载导致内质网工具酶量的减少，造成蛋白错误的装配折叠而使其聚集在内质网中，最终导致蛋白表达量降低。而在酵母中共表达能辅助蛋白质正确折叠装配的分子伴侣能改善这一状况。分子伴侣的概念早在1978年被Laskey等提出，它能帮助蛋白质正确折叠和提高外源蛋白表达量，从而逐渐被众多学者所关注。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)是内质网中一种重要的折叠催化剂，能通过其氧化活性催化蛋白质分子中二硫键的形成，也能通过异构作用促进蛋白质正确折叠，同时还具有类似分子伴侣抑制错误折叠蛋白质聚集的功能。目前，国内外已有很多成功实例表明PDI能提高外源蛋白表达水平。Inan等(2005)研究发现过表达PDI可使钩虫分泌蛋白(Na-SP1)在毕赤酵母中的表达量显著增加；屈琳(2009)发现共表达PDI能提高IFNβ-HAS在毕赤酵母中的表达量达60％；Zhang等(2011)发现共表达PDI能增加β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达；Sha等(2013)研究表明，共表达PDI能显著增加脂肪酶在毕赤酵母中的产量。

综上可知，酵母细胞表达外源蛋白分泌产率与PDI及二硫键形成有很大的相关性。国内外有很多研究证实了酵母中PDI的过量表达能大幅度提高外源蛋白的表达量。因此，当蛋白质含较多的二硫键时，了解和操纵内质网中二硫键形成途径是提高外源基因表达水平的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法。

本发明的技术方案如下：

一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法，其步骤如下：

(1)黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

提取黑曲霉总RNA，将其反转录成cDNA；根据已知的丝状真菌β-甘露聚糖酶基因编码区序列，设计一对简并引物，设计的引物为：上游引物MAN-F：5’-ATGAAG(T/C)T(C/T)TCCA(G/A)C(T/G)CCCTC-3’，下游引物MAN-R：5’-TTA(G/A)GC(G/A)CTA(T/C)(G/C)AATA(T/G)CAGCAAG-3’；

PCR反应体系为50μL：ddH₂O19μL，10μM上下游引物各1μL，模板cDNA4μL，2×Taq PCR MasterMix25μL；PCR反应条件均为95℃预变性3min，然后进行95℃30s，52℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min；切胶回收PCR产物并将其克隆至T载体上；对所获得的β-甘露聚糖酶进行信号肽分析，将β-甘露聚糖酶成熟肽编码序列克隆至毕赤酵母表达质粒pPIC9K上，构建成pPIC9K-MAN质粒并实现其在毕赤酵母中的表达，并筛选一株能高表达β-甘露聚糖酶的重组菌；

(2)伴侣蛋白PDI基因编码区的克隆及pPICZαA-PDI质粒的构建

将伴侣蛋白PDI基因编码区的序列***到pPICZαA质粒中，构建成pPICZαA-PDI质粒；

(3)共表达分子伴侣蛋白PDI对β-甘露聚糖酶产量的影响

转化pPICZαA-PDI质粒到表达β-甘露聚糖酶的重组菌中，诱导表达β-甘露聚糖酶，并对其表达条件进行优化，同时鉴定表达产物并分析表达产物的酶学性质。

所述的方法，步骤(3)中，所述优化的表达条件是：诱导表达时间为7d，甲醇的体积浓度为1.5％。

本发明将在表达黑曲霉β-甘露聚糖酶的重组菌中转化含分子伴侣蛋白PDI基因编码区的质粒，使β-甘露聚糖酶与分子伴侣共表达，提高了β-甘露聚糖酶的表达水平。

附图说明

图1为黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区的克隆；M：DNA标准分子量；1：PCR扩增产物

图2为毕赤酵母转化子基因组DNA为模板的PCR鉴定结果；M：DNA标准分子量；1：5’AOX1/3’AOX1为引物的PCR结果；2：EcoRI-MAN/NotI-MAN为引物的PCR结果。

图3为毕赤酵母PDI基因编码区的克隆；M：DNA标准分子量；1：PCR扩增产物。

图4为毕赤酵母转化子基因组DNA为模板的PCR鉴定结果；M：DNA标准分子量；1：EcoRI-MAN/NotI-MAN为引物的PCR结果；2：PDI-F/PDI-R为引物的PCR结果；3：5’AOX1/3’AOX1为引物的PCR结果。

图5为重组β-甘露聚糖酶去糖基化后的SDS-PAGE电泳分析；M：DNA标准分子量；1：重组β-甘露聚糖酶去糖基化；2：重组β-甘露聚糖酶未去糖基化。

图6为高表达β-甘露聚糖酶毕赤酵母重组子最适诱导条件的优化结果。

图7为重组β-甘露聚糖酶的Western-blot分析；1：未诱导表达上清；2：甲醇诱导表达上清。

图8为重组β-甘露聚糖酶最适反应pH。

图9为重组β-甘露聚糖酶最适反应温度。

图10为重组β-甘露聚糖酶pH稳定性。

图11为重组β-甘露聚糖酶温度稳定性。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1黑曲霉β-甘露聚糖酶基因(MAN)编码区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

1、黑曲霉液体培养

黑曲霉(Aspergillus niger)GIM3.452购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。配制液体培养基：Sucrose(蔗糖)30g，NaNO₃3g，MgSO₄·7H₂O0.5g，KCl0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，K₂HPO₄1g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2，高压灭菌，冷却，接种黑曲霉到无菌液体培养基，25℃，200r/min，培养3-4d，收集菌体进行RNA提取。

2、黑曲霉总RNA的提取和反转录

将培养好的菌体吸干表面的培养基后放研钵中加液氮研磨，取适量研磨菌体于无菌去RNA酶的1.5mL离心管中，加1mlTRIzol，用手剧烈摇晃使粉末充分溶解后，室温放置5min；4℃，12000g离心10min；转移上清至另一新的1.5mL离心管，加0.2mL氯仿，盖紧离心管后用力剧烈晃动15s，室温放置3min；4℃12000g离心15min，移取上清至一新的1.5mL离心管，加0.4mL冰预冷的异丙醇，轻缓上下颠倒6-8次使其充分混匀后室温静置10min；4℃，12000g离心10min后弃上清，加入1mL75％(v/v)乙醇(DEPC处理过的水配制)洗涤沉淀一次；4℃，7500g离心5min后弃上清，晾干残余乙醇，加入20μL DEPC处理过的水溶解沉淀；取3μL RNA样品于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余的RNA样品于-80℃保存备用。

取1μg总RNA、1μL Oligo dT引物(50μM)和1μL dNTP mixture(10mM each)，用DEPC处理过的水补充至10μL，65℃加热变性5min后快速置于冰中，再加入4μL5×PrimeScript Buffer、0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)、4.5μLDEPC处理过的水和1μLPrimeScript RTase(200U/μL)，于42℃反应45min将其中的mRNA反转录为cDNA，最后于70℃作用15min以灭活反转录酶，立即使用或-20℃保存备用。

3、引物的设计及PCR反应

根据已知的丝状真菌来源的β-甘露聚糖酶编码区序列设计一对简并引物，上游引物自起始密码子处设计，下游引物至终止密码子处设计，设计的引物为：

上游引物(MAN-F)：5’-ATGAAG(T/C)T(C/T)TCCA(G/A)C(T/G)CCCTC-3’

下游引物(MAN-R)：5’-TTA(G/A)GC(G/A)CTA(T/C)(G/C)AATA(T/G)CAGCAAG-3’

PCR反应体系为50μL：ddH₂O19μL，上下游引物(10μM)各1μL，cDNA(模板)4μL，2×Taqmix25μL。

PCR反应条件：95℃预变性3min，然后进行95℃30s，52℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳，结果表明，在1000～1500bp之间有一特异性条带(图1)。

4、PCR产物的回收和纯化

采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，具体操作步骤为：

按照步骤3所述，制备100uLPCR反应液，电泳后割胶，步骤如下：

a、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外光下用消毒刀片切下目的条带，将切下的胶切成小块置于1.5mL离心管中，称量胶的重量，加入3-6倍的BufferB2，于50℃水浴至胶块完全溶化。

b、将胶溶液移入吸附柱中，8000g离心30s，倒掉收集管中液体。

c、向吸附柱中加入500μL Wash solution，9000g离心30s，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次。

d、将空吸附柱于9000g离心1min。

e、向空吸附柱中加入30μL灭菌ddH₂O，室温静置2min，13000g离心2min。

f、离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液。

g、取3μL于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余DNA样品于-20℃贮存。

5、T克隆

a、DNA连接反应

将凝胶回收后的PCR产物(由步骤4获得)与pMD19-T载体连接，连接体系为10μL：回收后的PCR产物4.5μL，pMD19-T Vector0.5μL，SolutionI5μL。以上操作在冰上进行，混匀后在连接仪上于16℃连接3-4h。

b、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化

将大肠杆菌DH5α单菌落接种于3mLLB液体培养基，37℃振荡培养过夜。按1％接种于50mLLB液体培养基，37℃振荡培养至OD600为0.3-0.5，冰浴10min。4℃，5000rpm离心3min，弃上清，加入15-20mL80mmol/LCaCl₂，轻轻悬浮，冰浴20-25min。4℃，5000rpm离心3min，弃上清，菌体用1-2mL80mmol/LCaCl₂轻轻悬浮，制得DH5α感受态细胞，然后加20％的甘油，分装，于-70℃保存备用。

取a中的10μL连接产物与80μL的DH5α感受态细胞混合，冰浴25-30min；42℃热激1.5min，立即置冰上2min，再加入400-600μLLB液体培养基，37℃培养1h；涂布于LB固体平板(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。

c、菌落PCR初步鉴定

用灭菌的牙签挑取少量单菌落至含10μL灭菌水的PCR管中，于PCR仪上95℃变性5min，立即置于冰上。

混匀并稍微离心后，加入10μM的上下游引物MAN-F/MAN-R各1μL、0.5μL水和12.5μL Taq mix。

混合均匀后，按以下条件进行PCR反应：95℃30s，52℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，初步筛选重组载体。

d、DNA测序及检验实验的正确性

挑取菌落PCR鉴定为阳性克隆的菌落，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。将测序后获得的序列用DNAMAN软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性。测序结果表明，所获得的DNA片段含有β-甘露聚糖酶基因编码区。该β-甘露聚糖酶基因编码区序列全长为1152bp，编码383个氨基酸。成功构建的质粒命名为pMD19-T-MAN。

黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区T克隆测序结果如下：

1ATGAAGCTTTCCAACGCCCTCCTCACCCTGGCTAGCCTGGCGCTGGCCAACGTCTCCACG

61GCTCTGCCGAAAGCCTCCCCTGCACCGAGCACCAGCAGCAGTGCTGCCTCCACCTCCTTC

121GCCAGCACCTCCGGCCTCCAATTCACCATTGATGGCGAAACTGGCTACTTCGCCGGAACG

181AACAGCTACTGGATCGGTTTCCTCACTGACAACGCGGACGTCGACCTCGTCATGGGCCAC

241CTGAAGTCGTCCGGCCTCAAGATCCTCCGCGTGTGGGGCTTCAACGATGTCACCTCGCAG

301CCCTCCTCCGGCACAGTCTGGTACCAACTGCACCAGGACGGCAAATCGACAATCAACACG

361GGTGCCGACGGTCTCCAGCGCCTCGACTACGTCGTCTCGTCTGCCGAACAGCACGACATC

421AAACTCATCATCAACTTCGTCAACTACTGGACCGATTACGGTGGTATGTCTGCGTACGTG

481AGCGCGTATGGCGGATCCGGCGAGACGGATTTCTATACCAGTGATACCATGCAGAGTGCC

541TATCAGACATATATCAAGACGGTCGTGGAGCGGTACAGTAACTCCTCGGCGGTGTTTGCG

601TGGGAGTTGGCGAATGAGCTGAGATGTCCGAGTTGCGATACTTCTGTGTTGTATAACTGG

661ATTGAGAAGACGAGTAAGTTTATTAAGGGGTTGGATGCGGATCGTATGGTTTGTATTGGT

721GATGAGGGCTTCGGTCTCAACATCGACTCGGACGGCAGCTACCCTTATCAATTCTCCGAG

781GGCTTGAACTTTACGATGAACCTCGGTATCGATACTATTGACTTTGGTACCCTCCACTTG

841TACCCTGATAGCTGGGGCACCTCCGACGACTGGGGCAACGGCTGGATCACCGCCCACGGC

901GCAGCCTGCAAAGCGGCCGGCAAGCCATGTCTCCTGGAGGAATACGGAGTCACCTCGAAC

961CACTGCAGTGTGGAGGGCTCGTGGCAGAAGACAGCGCTCAGCACAACGGGCGTCGGCGCG

1021GATCTGTTCTGGCAGTATGGTGATGATTTGAGTACCGGGAAGTCGCCGGATGATGGGAAT

1081ACTATCTACTATGGGGCTAGTGATTATCAGTGCCTGGTGACGGATCATCTTGCTGCTATT

1141GGTAGTGCTTAA

氨基酸序列如下：

1 M K L S N A L L T L A S L A L A N V S T

21 A L P K A S P A P S T S S S A A S T S F

41 A S T S G L Q F T I D G E T G Y F A G T

61 N S Y W I G F L T D N A D V D L V M G H

81 L K S S G L K I L R V W G F N D V T S Q

101 P S S G T V W Y Q L H Q D G K S T I N T

121 G A D G L Q R L D Y V V S S A E Q H D I

141 K L I I N F V N Y W T D Y G G M S A Y V

161 S A Y G G S G E T D F Y T S D T M Q S A

181 Y Q T Y I K T V V E R Y S N S S A V F A

201 W E L A N E L R C P S C D T S V L Y N W

221 I E K T S K F I K G L D A D R M V C I G

241 D E G F G L N I D S D G S Y P Y Q F S E

261 G L N F T M N L G I D T I D F G T L H L

281 Y P D S W G T S D D W G N G W I T A H G

301 A A C K A A G K P C L L E E Y G V T S N

321 H C S V E G S W Q K T A L S T T G V G A

341 D L F W Q Y G D D L S T G K S P D D G N

361 T I Y Y G A S D Y Q C L V T D H L A A I

381 G S A *

6、β-甘露聚糖酶基因重组毕赤酵母表达载体(pPIC9K-MAN)的构建

a、β-甘露聚糖酶成熟肽编码序列的克隆

对所克隆的黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区所编码的蛋白序列通过在线分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，结果表明，β-甘露聚糖酶基因N端前21个氨基酸为信号肽。根据pPIC9K质粒所含的酶切位点，设计引物进行PCR扩增β-甘露聚糖酶成熟肽(不含信号肽)编码序列，引物序列如下：

EcoRI-MAN：5’-CCGGAATTCCTGCCGAAAGCCTCCC-3’(下划线为EcoRI位点)

NotI-MAN：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAAGCACTACCAATAG-3’(下划线为NotI酶切位点)

以pMD19-T-MAN质粒为模板进行PCR反应，PCR反应体系为50μL：pMD19-T-MAN质粒1μL，EcoRI-MAN/NotI-MAN(10μM)引物各1μL，2×Taq PCRMasterMix25μL，ddH₂O22μL。PCR反应条件为95℃预变性3min，然后进行95℃30s，60℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。

b、PCR切胶回收产物和pPIC9K质粒的双酶切

PCR切胶回收产物和pPIC9K质粒均用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用(胶回收采用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒方法进行)。

PCR切胶回收产物酶切体系为100μL：回收后的PCR片段15μL，ddH₂O51μL，EcoRI4μL，NotI4μL，0.1％(w/v)BSA8μL，0.1％(v/v)TritonX-1008μL，10×bufferH10μL。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37℃反应3h。

pPIC9K质粒酶切体系为100μL：pPIC9K质粒10μL，ddH₂O56μL，EcoRI4μL，NotI4μL，0.1％(w/v)BSA8μL，0.1％(v/v)Triton X-1008μL，10×buffer H10μL。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37℃反应3h。

c、DNA连接反应

琼脂糖凝胶回收上述EcoRI和NotI双酶切后的PCR产物(β-甘露聚糖酶成熟肽编码区和pPIC9K质粒)，将它们用T4DNA连接酶进行连接，，连接体系为10μL：回收后的PCR片段4.5μL，回收后的pPIC9K质粒0.5μL，SolutionI(含T4DNA连接酶)5μL。以上操作在冰上进行，混匀后在连接仪上于16℃连接3-4h。

d、连接产物的转化和鉴定

连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化后长出的菌落进行菌落PCR鉴定和测序鉴定。测序结果表明，与步骤5所获得的β-甘露聚糖酶成熟肽编码区序列100％同源，表明序列连接正确。成功构建的质粒命名为pPIC9K-MAN。

7、β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

a、pPIC9K-MAN质粒的小量提取

采用OMEGA公司Plasmid Mini kit I试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：

从LB平板上挑取鉴定正确的携带pPIC9K-MAN质粒的重组菌，接种到4mL含有卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中，振荡培养16h左右。取1.5mL菌液加入到2mL离心管中，常温，12000rpm离心30s，弃尽上清。加入100μL溶液I，振荡混匀。加入200μL新配制的溶液II，上下轻轻颠倒数次，混匀，置冰上5min。加入300μL冰预冷的溶液III，上下轻轻颠倒数次，使裂解物分散均匀，置冰上5min。常温，12000rpm离心5min。转移上清至新离心管中，加入500μL苯酚/氯仿。常温，12000rpm离心8min。上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀，冰浴30min。常温，12000rpm离心15min。沉淀用70％乙醇洗涤沉淀两次，真空抽干，加20μL含RNase(20μg/mL)的TE(pH8.0)溶解沉淀。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA纯度，-20℃贮存。

b、pPIC9K-MAN质粒的线性化

pPIC9K-MAN质粒线性化体系为150μL：pPIC9K-MAN质粒(6μg)15μL，SacI6μL，10×buffer L15μL，ddH₂O114μL。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37℃反应5h。

c、毕赤酵母感受态细胞的制备

挑取酵母GS115单菌落，接种至含有5mL YPD培养基试管中，28-30℃，250-300rpm培养过夜。取50μL的培养物接种至含有50mL新鲜YPD培养基的500mL三角瓶中，28-30℃，250-300rpm培养过夜，至OD600值达到1.3-1.5。将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用50mL冰预冷的灭菌水将菌体沉淀重悬。4℃，1500g离心5min，用25mL冰预冷的灭菌水将菌体沉淀重悬。4℃，1500g离心5min，用20mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。4℃，1500g离心5min，用1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5mL。每管80μL分装，-70℃保存。

d、毕赤酵母的电转化

取80μL步骤c中感受态细胞与6μg步骤b得到的线性化pPIC9K-MAN质粒混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，将电转化杯冰浴5min后进行电击。电击完毕后，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，转至50mL离心管中，28℃孵育3h。将菌体悬液涂布于YPDS平板上(含G418浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL)，每100-200μL涂布一块平板，于30℃培养2-5d。

e、β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

挑选步骤d中平板上长出的单菌落，置于装有30mLBMGY培养基的250mL三角瓶中，于28-30℃，250-300rpm培养至OD600为2-6。4℃，2000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600为1.0。置于500mL的三角瓶中，用双层纱布封口，于28-30℃，250-300rpm的摇床上继续生长。每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为0.5％(v/v)。按时间点分别取菌液样品(24h、48h、60h、72h和96h)，取样量为1mL，置于2mL离心管中，常温，12000rpm离心5min，收集上清，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。用12％SDS-PAGE电泳和活性检测确定重组蛋白的表达和酶活力。

①β-甘露聚糖酶活性检测

在40℃和pH5.5条件下，每分钟从浓度为0.8％(w/v)的甘露聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位U。

吸取2mL经过适当稀释的酶液(已经过40℃平衡)，加入到刻度试管中，然后加入2mL甘露聚糖溶液(0.8％)，电磁振荡3s，40℃保温30min，加入5mL DNS试剂(3，5－二硝基水杨酸)，电磁振荡3秒，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度。结果表明，对所长出的重组子进行诱导表达后酶活测定，筛选出一株能高表达β-甘露聚糖酶的重组菌，酶活力为26.6U/mL。

②酵母基因组DNA提取和鉴定

提取①中的那株高表达β-甘露聚糖酶的重组菌的基因组DNA并进行PCR鉴定。基因组DNA提取按TIANGEN公司酵母基因组DNA提取试剂盒说明书进行。以所提取基因组DNA为模板，分别以EcoRI-MAN/NotI-MAN和5’AOX1/3’AOX1(上游引物5’AOX1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，下游引物3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)为引物，对重组子进行PCR鉴定。

PCR反应体系为50μL：ddH₂O21μL，上下游引物(10μM)各1μL，基因组DNA(模板)2μL，2×Taq PCR MasterMix25μL。

以EcoRI-MAN/NotI-MAN为引物的PCR反应条件：95℃预变性3min，然后进行95℃30s，57℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。以5’AOX1/3’AOX1为引物的PCR反应条件：95℃预变性3min，然后进行95℃30s，53℃30s，72℃45s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。

反应结束后以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。电泳结果表明，以5’AOX1/3’AOX1和EcoRI-MAN/NotI-MAN为引物分别能扩增出约1500bp和1100bp大小的片段(图2)，与预测大小相符，表明重组子已成功整合到毕赤酵母基因组DNA中。

实施例2伴侣蛋白PDI基因编码区的克隆及pPICZαA-PDI质粒的构建

1、毕赤酵母GS115总RNA的提取

挑取毕赤酵母GS115菌落于5mLYPD培养基中，于30℃，220r/min振荡培养过夜，收集菌体进行总RNA提取。RNA提取方法和反转录按实施例1中所述的方法进行。

2、PDI基因编码区的PCR扩增

根据GenBank上公布的毕赤酵母PDI基因序列(GenBank登录号：EU805807)设计下列引物：

上游引物PDI-F：5’-CCGGAATTCATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTG-3’(下划线为EcoRI酶切位点)

下游引物PDI-R：5’-GCTCTAGATTAAAGCTCGTCGTGAGCGTC-3’(下划线为XbaI酶切位点)

PCR反应体系为50μL：ddH₂O21μL，PDI-F和PDI-R引物(10μM)各1μL，cDNA(模板，由本实施例步骤1所提取的总RNA经反转录而成)2μL，2×Taq PCR MasterMix25μL。

PCR反应条件均为95℃预变性3min，然后进行95℃30s，60℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。反应结束后以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，结果表明，所扩目的片段大小约为1500bp(图3)。

3、pPICZαA-PDI质粒的构建

①双酶切

pPICZαA为毕赤酵母表达质粒。为构建pPICZαA-PDI质粒，一方面，将本实施例步骤2获得的PCR产物(PDI基因编码区)进行切胶回收，然后用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切；另一方面，将pPICZαA质粒用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切。上述酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用(胶回收采用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒方法进行)。

PCR产物的酶切体系为100μL：回收后的PCR产物15μL，ddH₂O67μL，EcoRI4μL，XbaI4μL，10×bufferM10μL。以上操作在冰上进行，混匀后放置于水浴锅中37℃反应3h。

pPICZαA质粒的酶切体系为100μL：pPICZαA质粒10μL，ddH₂O62μL，EcoRI4μL，XbaI4μL，10×buffer M10μL。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37℃反应3h。

②DNA连接反应

琼脂糖凝胶回收EcoRI和XbaI双酶切的PCR产物(PDI基因编码区)和pPICZαA质粒，将它们用T4DNA连接酶进行连接，连接体系为10μL：回收后的PCR产物4.5μL，回收后的pPICZαA质粒0.5μL，Solution I(含T4DNA连接酶)5μL。以上操作在冰上进行，混匀后在连接仪上于16℃连接3-4h。

③连接产物的转化和鉴定

将本实施例步骤4所获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α，对转化后长出的菌落进行菌落PCR鉴定和测序鉴定。测序结果表明，所获得的酵母PDI基因编码区序列与GenBank上已知的序列100％同源。成功构建的质粒命名为pPICZαA-PDI。

毕赤酵母PDI基因编码区与pPICZαA连接克隆测序结果如下：

1ATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTGTGGCAAGTATTTTGTCCGCTCTCACACTAGCA

61CAAGCAAGTGATCAGGAGGCTATTGCTCCAGAGGACTCTCATGTCGTCAAATTGACTGAA

121GCCACTTTTGAGTCTTTCATCACCAGTAATCCTCACGTTTTGGCAGAGTTTTTTGCCCCT

181TGGTGTGGTCACTGTAAGAAGTTGGGCCCTGAACTTGTTTCTGCTGCCGAGATCTTAAAG

241GACAATGAGCAGGTTAAGATTGCTCAAATTGATTGTACGGAGGAGAAGGAATTATGTCAA

301GGCTACGAAATTAAAGGGTATCCTACTTTGAAGGTGTTCCATGGTGAGGTTGAGGTCCCA

361AGTGACTATCAAGGTCAAAGACAGAGCCAAAGCATTGTCAGCTATATGCTAAAGCAGAGT

421TTACCCCCTGTCAGTGAAATCAATGCAACCAAAGATTTAGACGACACAATCGCCGAGGCA

481AAAGAGCCCGTGATTGTGCAAGTACTACCGGAAGATGCATCCAACTTGGAATCTAACACC

541ACATTTTACGGAGTTGCCGGTACTCTCAGAGAGAAATTCACTTTTGTCTCCACTAAGTCT

601ACTGATTATGCCAAAAAATACACTAGCGACTCGACTCCTGCCTATTTGCTTGTCAGACCT

661GGCGAGGAACCTAGTGTTTACTCTGGTGAGGAGTTAGATGAGACTCATTTGGTGCACTGG

721ATTGATATTGAGTCCAAACCTCTATTTGGAGACATTGACGGATCCACCTTCAAATCATAT

781GCTGAAGCTAACATCCCTTTAGCCTACTATTTCTATGAGAACGAAGAACAACGTGCTGCT

841GCTGCCGATATTATTAAACCTTTTGCTAAAGAGCAACGTGGCAAAATTAACTTTGTTGGC

901TTAGATGCCGTTAAATTCGGTAAGCATGCCAAGAACTTAAACATGGATGAAGAGAAACTC

961CCTCTATTTGTCATTCATGATTTGGTGAGCAACAAGAAGTTTGGAGTTCCTCAAGACCAA

1021GAATTGACGAACAAAGATGTGACCGAGCTGATTGAGAAATTCATCGCAGGAGAGGCAGAA

1081CCAATTGTGAAATCAGAGCCAATTCCAGAAATTCAAGAAGAGAAAGTCTTCAAGCTAGTC

1141GGAAAGGCCCACGATGAAGTTGTCTTCGATGAATCTAAAGATGTTCTAGTCAAGTACTAC

1201GCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAGAATGGCTCCTGCTTATGAGGAATTGGCTACTCTT

1261TACGCCAATGATGAGGATGCCTCTTCAAAGGTTGTGATTGCAAAACTTGATCACACTTTG

1321AACGATGTCGACAACGTTGATATTCAAGGTTATCCTACTTTGATCCTTTATCCAGCTGGT

1381GATAAATCCAATCCTCAACTGTATGATGGATCTCGTGACCTAGAATCATTGGCTGAGTTT

1441GTAAAGGAGAGAGGAACCCACAAAGTGGATGCCCTAGCACTCAGACCAGTCGAGGAAGAA

1501AAGGAAGCTGAAGAAGAAGCTGAAAGTGAGGCAGACGCTCACGACGAGCTTTAA

其氨基酸序列如下：

1 M Q F N W N I K T V A S I L S A L T L A

21 Q A S D Q E A I A P E D S H V V K L T E

41 A T F E S F I T S N P H V L A E F F A P

61 W C G H C K K L G P E L V S A A E I L K

81 D N E Q V K I A Q I D C T E E K E L C Q

101 G Y E I K G Y P T L K V F H G E V E V P

121 S D Y Q G Q R Q S Q S I V S Y M L K Q S

141 L P P V S E I N A T K D L D D T I A E A

161 K E P V I V Q V L P E D A S N L E S N T

181 T F Y G V A G T L R E K F T F V S T K S

201 T D Y A K K Y T S D S T P A Y L L V R P

221 G E E P S V Y S G E E L D E T H L V H W

241 I D I E S K P L F G D I D G S T F K S Y

261 A E A N I P L A Y Y F Y E N E E Q R A A

281 A A D I I K P F A K E Q R G K I N F V G

301 L D A V K F G K H A K N L N M D E E K L

321 P L F V I H D L V S N K K F G V P Q D Q

341 E L T N K D V T E L I E K F I A G E A E

361 P I V K S E P I P E I Q E E K V F K L V

381 G K A H D E V V F D E S K D V L V K Y Y

401 A P W C G H C K R M A P A Y E E L A T L

421 Y A N D E D A S S K V V I A K L D H T L

441 N D V D N V D I Q G Y P T L I L Y P A G

461 D K S N P Q L Y D G S R D L E S L A E F

481 V K E R G T H K V D A L A L R P V E E E

501 K E A E E E A E S E A D A H D E L

实施例3共表达分子伴侣蛋白PDI对β-甘露聚糖酶产量的影响

1、pPICZαA-PDI质粒线性化及双重重组毕赤酵母工程菌的构建

大量提取实施例2步骤3构建的pPICZαA-PDI质粒，用限制性内切酶SacI线性化处理。反应体系和反应条件如下：

线性化反应体系为150μL：pPICZαA-PDI质粒(6μg)10μL，SacI5μL，10×bufferL15μL，水120μL。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37℃反应5h。线性化的pPICZαA-PDI质粒的回收按照生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行。

将上述线性化的pPICZαA-PDI质粒与80μL毕赤酵母感受态细胞(感受态细胞由实施例1中所筛选获得的高表达β-甘露聚糖酶的基因工程菌制备，制备方法同实施例1)混匀，后续方法同实施例1中的毕赤酵母的电转化。

2、高拷贝重组子筛选

将上述转化物涂布于YPDS+Zeocin平板，其中Zeocin浓度分别为100、250、500、1000μg/mL，每块板涂布200μL菌悬液。于30℃，培养3-6d，至平板上长出菌落。

3、高表达β-甘露聚糖酶毕赤酵母重组子的筛选

分别挑取2中在250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL抗生素Zeocin的YPDS+Zeocin平板长出的5-10个菌落，分别接种于装有50mLBMGY培养基的250mL三角瓶中，于28℃，200rpm/min摇荡培养至OD600为2-6左右。4℃，2000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600为1.0。置于500mL的三角瓶中，于28℃，200rpm的摇床上继续生长，进行诱导培养。每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，持续诱导培养5d。取1mL诱导培养物置于2mL离心管中，常温，12000rpm离心5min，收集上清和沉淀，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。用12％SDS-PAGE电泳和活性检测重组蛋白的表达和酶活力。

结果表明，对所长出的重组子进行诱导表达后酶活测定，筛选出一株能高表达β-甘露聚糖酶的重组菌，酶活力为40.0U/mL，该表达量比实施例1中未共表达PDI的重组菌提高了1.5倍。

4、基因组DNA的提取和鉴定

提取本实施例步骤3获得的那株高表达β-甘露聚糖酶基因工程菌的基因组DNA，提取方法按TIANGEN公司酵母基因组DNA提取试剂盒说明书进行。以所提取的基因组DNA为模板，分别以EcoRI-MAN/NotI-MAN、PDI-F/PDI-R和5’AOX1/3’AOX1为引物，对重组子进行PCR鉴定。

PCR反应体系为50μL：ddH2O21μL，上下游引物(10μM)各1μL，基因组DNA(模板)2μL，2×Taq PCRMasterMix25μL。

以EcoRI-MAN/NotI-MAN为引物的PCR反应条件：95℃预变性3min，然后进行95℃30s，57℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。以PDI-F/PDI-R为引物的PCR反应条件：95℃预变性3min，然后进行95℃30s，60℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。以5’AOX1/3’AOX1为引物的PCR反应条件：95℃预变性3min，然后进行95℃30s，53℃30s，72℃45s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。

反应结束后以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。电泳结果表明，以EcoRI-MAN/NotI-MAN为引物能扩出约1100bp大小的片段，以PDI-F/PDI-R为引物能扩出约1500bp大小的片段，以5’AOX1/3’AOX1为引物能扩增出约1500bp和2000bp大小的片段(图4)，与预测大小相符，表明重组子已成功整合到毕赤酵母基因组DNA中。

5、β-甘露聚糖酶的糖基化分析

糖基化酶活定义：在10μL总反应体积，37℃下1h从10μg核糖核酸酶去除大于95％的糖类所需的酶量定义为一个单位。

在100℃，用1×糖蛋白缓冲液变性20μg糖蛋白10min；加1/10体积10×G5缓冲液；加1-5μg Endo H并在37℃下反应1h，反应液用12％SDS-PAGE电泳检测。

本实施例步骤3的重组表达产物经SDS-PAGE电泳分析，结果表明，表达出来的蛋白分子量比从氨基酸序列推断出的理论分子量(约39kDa)大6kDa，分析β-甘露聚糖酶的氨基酸序列，发现含有两处潜在的糖基化位点，所以可能是因糖基化造成蛋白分子量偏大。对所表达的产物进行末端去糖基化酶Endo H去糖基化，SDS-PAGE分析表明(图5)，表达产物去糖基化后，蛋白分子量降低，约为39kDa，与预计的酶蛋白分子量大小一致。因此可以认为表达产物分子量比预期偏大是由于糖基化引起的。

6、重组子最适诱导表达条件的优化和鉴定

采用不同诱导时间(0-10d)和不同甲醇浓度(0-3％)(v/v)对步骤3获得的重组菌进行诱导表达。结果表明，最佳诱导表达条件为：时间7d，甲醇浓度为1.5％，酶活力达222.8U/mL(图6)。对诱导表达产物采用Western-blot方法进行鉴定，可见一条特异的反应条带，而对照(未诱导表达上清液)未见任何条带(图7)，表明所获得的表达产物为β-甘露聚糖酶。

7、β-甘露聚糖酶酶学特性分析

(1)最适pH值和最适反应温度

a、最适反应pH值的确定：将稀释好的酶液置于不同pH值(2.4-8.0)的缓冲液中，测定β-甘露聚糖酶的酶活。以最高酶活为100％，其它pH下测得的酶活与之相比，即得到该pH下的相对酶活。最适反应pH曲线见图8。

b、最适反应温度：将稀释好的酶液置于不同温度(30-80℃)下反应，测定β-甘露聚糖酶的酶活。以最高酶活为100％，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。最适反应温度曲线见图9。

从图8和图9可以看出，该重组β-甘露聚糖酶的最适pH值为4.4，最适反应温度为60℃。

(2)pH值稳定性

将酶液稀释适当倍数，在不同pH值(2.4-8.0)的缓冲液处理60min后，以未处理的酶液为对照，测定β-甘露聚糖酶的相对酶活力。结果如图10所示。

结果显示，该重组β-甘露聚糖酶的最适pH为4.4，并且在pH2.4-8.0范围内相对酶活均可达到70％以上，说明该重组β-甘露聚糖酶的pH稳定性良好。

(3)温度稳定性

将酶液稀释适当倍数，在不同温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃)下保温30min，以未处理的酶活力为对照测定重组β-甘露聚糖酶的相对酶活。结果如图11所示。

结果显示，该重组β-甘露聚糖酶在温度低于或等于60℃时酶活相对稳定，仍能保持75％以上的相对酶活，但当温度超过60℃时酶活力急剧下降，80℃时仅保持10％左右的酶活力。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

提取黑曲霉总RNA，将其反转录成cDNA；根据已知的丝状真菌β-甘露聚糖酶基因编码区序列，设计一对简并引物，设计的引物为：上游引物MAN-F：5’-ATGAAG(T/C)T(C/T)TCCA(G/A)C(T/G)CCCTC-3’，下游引物MAN-R：5’-TTA(G/A)GC(G/A)CTA(T/C)(G/C)AATA(T/G)CAGCAAG-3’；

PCR反应体系为50μL：ddH₂O19μL，10μM上下游引物各1μL，模板cDNA4μL，2×Taq PCR MasterMix25μL；PCR反应条件均为95℃预变性3min，然后进行95℃30s，52℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min；切胶回收PCR产物并将其克隆至T载体上；对所获得的β-甘露聚糖酶进行信号肽分析，将β-甘露聚糖酶成熟肽编码序列克隆至毕赤酵母表达质粒pPIC9K上，构建成pPIC9K-MAN质粒并实现其在毕赤酵母中的表达，并筛选一株能高表达β-甘露聚糖酶的重组菌；

(2)伴侣蛋白PDI基因编码区的克隆及pPICZαA-PDI质粒的构建

将伴侣蛋白PDI基因编码区的序列***到pPICZαA质粒中，构建成pPICZαA-PDI质粒；

(3)共表达分子伴侣蛋白PDI对β-甘露聚糖酶产量的影响

转化pPICZαA-PDI质粒到表达β-甘露聚糖酶的重组菌中，诱导表达β-甘露聚糖酶，并对其表达条件进行优化，同时鉴定表达产物并分析表达产物的酶学性质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(3)中，所述优化的表达条件是：诱导表达时间为7d，甲醇的体积浓度为1.5％。