CN112029751B - 一种嗜热真菌甘露聚糖酶的生产方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甘露聚糖酶的生产方法及其应用。本发明所提供的生产甘露聚糖酶的方法，包括：将来源于樟绒枝霉S168的甘露聚糖酶基因导入受体酵母，得重组酵母；对所述重组酵母依次进行基础发酵培养、甘油补料发酵阶段和甲醇补料诱导表达阶段，从发酵产物中获得甘露聚糖酶。本发明工程菌经高密度发酵甘露聚糖酶表达水平达42200U/mL，制得的酶最适pH为7.5，最适温度为75℃，具耐酸碱、热稳定性好、水解特性优异的特点，另外本发明拓宽了甘露聚糖酶的应用范围，利用该酶制备得到的部分水解魔芋胶在食品、饲料等行业中具有很大的应用价值，丰富了益生元产品种类，推动了我国益生元产业的发展，具有较大的社会和经济效益。

Description

一种嗜热真菌甘露聚糖酶的生产方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种嗜热真菌甘露聚糖酶的生产方法及其应用。
背景技术
甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是一种特异性水解甘露聚糖中β-1,4-甘露糖苷键的内切水解酶。根据其氨基酸序列的相似性，甘露聚糖酶可以分为糖苷水解酶5、26、113和134家族。作为一种重要的糖苷水解酶，甘露聚糖酶能够水解不同种类的甘露聚糖(线性甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖)产生低聚合度的甘露寡糖(Srivastava andKapoor.Biotechnology Advances,2017,35:1-19)。因此，甘露聚糖酶已经广泛应用于食品、饲料等多种行业中(Chauhan et al.Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93:1817-1830)。甘露聚糖酶来源广泛，在许多微生物、植物和低等动物中均有发现。提高甘露聚糖酶的表达水平，扩大甘露聚糖酶的来源，发掘甘露聚糖酶的更多应用，仍是目前研究的热点。
膳食纤维通常是指不被人体消化吸收的一类多糖，主要包括菊粉、果胶、部分水解瓜尔胶等。它能够有效促进生物体内有益菌群的增殖，抑制病原微生物的产生，并可以改善肠道内菌群结构、减少有毒代谢物产生(Sevinc et al.Journal of Drug Targeting,2014,22:262-266)。此外，膳食纤维还具有促进肠胃蠕动、改善便秘、调节人体代谢等多种功能活性(Kapoor et al.Journal of Functional Foods,2016,24:207-220)。魔芋胶是一种重要的膳食纤维，其主要成分为葡甘露聚糖，具有粘度高、易溶于水、稳定性好等特性(Behera et al.Food Reviews International,2017,33:22-43)。作为一种增稠剂和乳化剂，魔芋胶已广泛应用于食品领域。但是，在食品中添加过多的魔芋胶会破坏食物的口感，甚至会阻碍营养物质的吸收，在一定程度上限制了其在食品中的应用。
目前，瓜尔胶等植物胶是用于生产部分水解甘露聚糖的主要原料。日本太阳株式会社通过水解瓜尔胶成功制备得到部分水解瓜尔胶产品——Sunfiber，产品的重均分子量为2.0×104Da，并已实现大规模生产(Theertham.Physiology and Behavior,2016,164:277-283)。中国专利申请号201610808817.0中公开了一种利用甘露聚糖酶水解瓜尔胶制备膳食纤维(部分水解瓜尔胶)的方法，所得产品的重均分子量为2.5×104Da；中国专利申请号(201610808818.5)中公开了一种利用甘露聚糖酶和半乳糖苷酶复合水解瓜尔胶制备膳食纤维的方法，所得产品的重均分子量为1.5×104Da。目前，魔芋胶主要用于生产甘露寡糖，中国专利申请号200910014349.X、201310428885.0和201510465107.8中公开了多种以魔芋胶为原料生产甘露寡糖的方法，所用底物浓度通常小于20％。尚无以魔芋胶为原料生产具高重均分子量的部分水解魔芋胶的文献报道及专利公开。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘露聚糖酶的生产方法及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种生产甘露聚糖酶的方法。
本发明所提供的生产甘露聚糖酶的方法，可包括如下步骤：
(A)将来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的编码基因导入受体酵母，得到重组酵母；
(B)按照如下步骤对所述重组酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得甘露聚糖酶：
B1)基础发酵培养：将所述重组酵母接种于BSM培养基中培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段；
B2)甘油补料发酵阶段：在步骤B1)的基础上，将甘油以18.4mL/h/L起始发酵液的速度流加到发酵体系中，直至发酵液在600nm处的吸光值达到180-220，饥饿0.5h，然后进行甲醇补料诱导表达阶段；
B3)甲醇补料诱导表达阶段：在步骤B2)的基础上，将甲醇加流到发酵体系中，4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液增加至10.9mL/h/L起始发酵液(流速是线性增加)，然后维持10.9mL/h/L起始发酵液速度流加甲醇至发酵结束。
在步骤(A)中，所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶可为来源于樟绒枝霉S168的甘露聚糖酶。
进一步地，所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶具体可为如下任一所示蛋白质：
a1)SEQ ID No.1自N末端第18至355位氨基酸残基组成的蛋白质(不含信号肽)；
a2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质(含信号肽)；
a3)将a1)或a2)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有甘露聚糖酶活性的蛋白质。
a4)与a1)-a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有甘露聚糖酶活性的蛋白质。
a5)在a1)-a4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
SEQ ID No.1共由355个氨基酸残基组成，其中第1-17位为信号肽序列。SEQ IDNo.1所示蛋白质命名为McMan5A。
在步骤(A)中，所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的编码基因是通过重组载体的形式导入所述受体酵母中的。
进一步地，所述重组载体为将所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的编码基因***到pPIC9K载体的多克隆位点后得到的重组质粒。
在本发明中，所述酵母为毕赤酵母。
进一步地，所述毕赤酵母具体为毕赤酵母GS115。
在步骤(A)中，所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的编码基因为如下任一所述的DNA分子：
b1)SEQ ID No.2的自5′末端第52-1068位所示的DNA分子(不含信号肽)；
b2)SEQ ID No.2所示的DNA分子(含信号肽)；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的DNA分子杂交且编码所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的DNA分子；
b4)与b1)-b3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述来源于樟绒枝霉的甘露聚糖酶的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
SEQ ID No.2共由1068个核苷酸组成，自5′端第1-51位碱基为信号肽编码序列，自5′端第52-1068位碱基为成熟蛋白编码序列。
在步骤B1)中，接种于所述BSM培养基中的所述重组酵母可为所述重组酵母的种子液。
进一步地，所述种子液为将步骤(A)所得的重组酵母接种于BMGY培养基，在30℃、200rpm振荡培养至发酵液在600nm处吸光值达到10。
其中，所述BMGY培养基的组成如下：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％无氨基酵母氮源YNB，4×10-5％生物素，1％甘油，余量为100mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液。其中，％均表示质量体积比(如1％表示1g/100mL)。
步骤B1)中，将所述种子液接种于所述BSM培养基为接种于装有所述BSM培养基的发酵罐中(接种量为所述种子液为所述BSM培养基的1/10体积)，所述BSM培养基在所述发酵罐中的装液量为所述发酵罐容积的1.5/5(如5-L发酵罐中装有1.5L所述BSM培养基)。
步骤B1)中，所述BSM培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：2.67％磷酸，0.093％CaSO4，1.82％K2SO4，1.49％MgSO4·H2O，0.413％KOH，4％甘油。其中，％均表示质量体积比(如1％表示1g/100mL)。
步骤B1)中，还包括加入PTM1溶液(毕赤酵母痕量金属盐溶液)的步骤。
进一步地，所述PTM1溶液的加入量为每1.5L所述BSM培养基中加入6.535mL所述PTM1溶液。所述PTM1溶液溶剂为水，溶质及浓度如下：0.6％CuSO4·5H2O，0.008％NaI，0.3％MnSO4·H2O，0.02％Na2MoO4·2H2O，0.002％H3BO3，0.05％CoCl2，2％ZnCl2，6.5％FeSO4·7H2O，0.02％生物素，0.5％浓硫酸。其中，％均表示质量体积比(如1％表示1g/100mL)。
步骤B1)中，所述培养的温度为30℃、pH为4.0、转速为600rpm、通气量为1.0vvm、培养时间为18-24h。
步骤B2)中，所述甘油是溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液；所述甘油补料发酵阶段的培养温度为30℃、pH为4.0、控制溶氧大于20％。
步骤B3)中，所述甲醇是无水甲醇；所述甲醇补料诱导表达阶段的培养温度为30℃、pH为6.0、控制溶氧大于15％。
在本发明的具体实施方式中，步骤(B)中的所述发酵培养的时间具体为168小时。
步骤(B)中，对所述重组酵母进行发酵培养后还包括如下步骤：将发酵液的上清液进行透析除盐，然后进行阴离子交换层析，用含0-500mM NaCl的20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液进行线性洗脱，收集得到纯化后甘露聚糖酶。
进一步地，所述阴离子交换层析为Q-琼脂糖凝胶FF离子交换层析。
所述用含0-500mM NaCl的20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液进行线性洗脱的洗脱程序为：100min内洗脱液中NaCl的浓度从0线性升至500mM。
所述发酵液的上清液经透析后平衡至20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中。进行所述阴离子交换层析(Q-琼脂糖凝胶FF，Q-Sepharose FF离子交换层析)时，是使用20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡的。进行所述阴离子交换层析(Q-琼脂糖凝胶FF，Q-Sepharose FF离子交换层析)时，是先用20mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱20min，洗净未结合的蛋白后，再用含0-500mM NaCl的pH 8.0Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱。
第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面中所述方法制备得到的甘露聚糖酶。
第三方面，本发明要求保护如下任一所示应用：
(C1)前文第二方面所述甘露聚糖酶在水解甘露聚糖和/或植物胶中的应用；
(C2)前文第二方面所述甘露聚糖酶在制备用于水解甘露聚糖和/或植物胶的产品中的应用；
(C3)前文第二方面所述甘露聚糖酶在生产甘露寡糖中的应用；
(C4)前文第二方面所述甘露聚糖酶在制备用于生产甘露寡糖的产品中的应用；
(C5)前文第二方面所述甘露聚糖酶在生产部分水解魔芋胶中的应用；
(C6)前文第二方面所述甘露聚糖酶在制备用于生产部分水解魔芋胶的产品中的应用。
进一步地，在所述(C1)和所述(C2)中，水解pH为4.0-10.5(具体可为4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5；或上述任两个所述点值间的范围值如4.5-8；或5.5-7.5；或7-7.5内的pH值)；和/或水解温度为30-85℃(具体可为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃；或上述任两个所述点值间的范围值如30-65℃；或65-80℃；或70-75℃内的温度)。
进一步地，在(C3)和(C4)中，所述甘露寡糖由2-10个甘露糖和半乳糖或葡萄糖连接而成。
进一步地，在所述(C3)和所述(C4)中，生产底物为甘露聚糖或植物胶。
进一步地，在所述(C5)和所述(C6)中，生产底物为魔芋胶；和/或魔芋胶在反应体系中的初始浓度为1-20g/100mL；和/或水解时间为0.5-12h；和/或甘露聚糖酶添加量为20-800U/g魔芋胶。
其中，所述甘露聚糖可为线性甘露聚糖或葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖或半乳葡甘露聚糖。所述植物胶可为槐豆胶、魔芋胶、决明子胶和/或瓜尔胶。
第四方面，本发明要求保护如下任一方法或利用所述方法制备所得产物：
(D1)一种制备中分子量部分水解魔芋胶的方法，包括如下步骤：用权利要求8所述的甘露糖酶水解魔芋胶，魔芋胶和所述甘露聚糖酶的配比为1g魔芋胶：20U所述甘露糖酶，于70℃水解8h，得到所述中分子量部分水解魔芋胶；所述中分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为1.6×105D(2×103至6×105Da范围内)。
(D2)一种制备低分子量部分水解魔芋胶的方法，包括如下步骤：用权利要求8所述的甘露糖酶水解魔芋胶，魔芋胶和所述甘露聚糖酶的配比为1g魔芋胶：200U所述甘露糖酶，于70℃水解8h，得到所述低分子量部分水解魔芋胶；所述低分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为2.0×104Da(1×103至7×104Da范围内)。
本发明利用基因工程技术从樟绒枝霉S168中克隆一个糖苷水解酶5家族的β-甘露聚糖酶，在毕赤酵母GS115中进行高效表达，表达水平达42200U/mL。本发明制备得到的该酶的最适pH为7.5，最适温度为75℃，具有耐酸碱、热稳定性好、水解特性优异的特点，能在广泛的pH范围和高温条件下稳定并发挥催化作用，与现有甘露聚糖酶相比存在明显不同，该酶水解甘露聚糖主要产生一些聚合度较高的甘露寡糖，与其他来源的β-甘露聚糖酶存在较大差异，并将该酶用于水解魔芋胶制备得到两种不同的部分水解魔芋胶，其重均分子量分别为1.6×105和2.0×104Da，总膳食纤维含量分比为93.2％个90.6％。本发明拓宽了甘露聚糖酶的应用范围，所得部分水解魔芋胶在食品、饲料等行业中具有很大的应用价值，丰富了益生元产品种类，推动了我国益生元产业的发展，具有较大的社会和经济效益。
附图说明
图1为甘露聚糖酶在5L发酵罐中的产酶历程。其中，(■)为发酵液中甘露聚糖酶活力，(●)为发酵液中的蛋白含量，(▲)为发酵液中的菌体湿重。
图2为甘露聚糖酶的纯化电泳图。其中泳道M为低分子量标准蛋白，泳道1为发酵罐发酵液上清，泳道2为经Q-sepharose柱纯化后的纯酶，泳道3为N-去糖基化酶去糖基后的酶。
图3为甘露聚糖酶的最适pH。其中(●)柠檬酸磷酸缓冲液(pH3.0-7.0)、(■)柠檬酸缓冲液(pH3.0-6.0)、(◆)磷酸缓冲液(pH6.0-8.0)、(▲)MOPS缓冲液(6.5-7.5)、(□)CHES缓冲液(pH8.0-10.0)、(○)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0-10.5)、(◇)CAPS缓冲液(pH10.0-11.0)。
图4为甘露聚糖酶的pH稳定性。其中(●)柠檬酸磷酸缓冲液(pH3.0-7.0)、(■)柠檬酸缓冲液(pH3.0-6.0)、(◆)磷酸缓冲液(pH6.0-8.0)、(▲)MOPS缓冲液(6.5-7.5)、(□)CHES缓冲液(pH8.0-10.0)、(○)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0-10.5)、(◇)CAPS缓冲液(pH10.0-11.0)。
图5为甘露聚糖酶的最适温度测定曲线图。
图6为甘露聚糖酶的温度稳定性测定曲线图。
图7为甘露聚糖酶水解槐豆胶和魔芋胶产物薄层层析图。其中，Mn为甘露寡糖标准品(M为甘露糖；M2为甘露二糖；M3为甘露三糖；M4为甘露四糖；M5为甘露五糖；M6为甘露六糖)。
图8为中分子量部分水解魔芋胶的凝胶排阻色谱分析图。
图9为低分子量部分水解魔芋胶的凝胶排阻色谱分析图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中甘露聚糖酶酶活测定方法如下：取0.1mL适当稀释的酶液，加入到0.9mL 0.5％(质量体积比，即0.5g/100mL)的槐豆胶底物溶液中(用50mM，pH7.5的MOPS缓冲液配制)，75℃水浴反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定所释放的还原糖量，以甘露糖作为标准。
甘露聚糖酶的活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟反应生成1μmol的还原糖(以甘露糖计)所需要的酶量为一个酶活力单位(1U)。
比酶活定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。
1个甘露聚糖酶酶活单位的定义：在pH7.5、75℃条件下，每分钟分解0.5％槐豆胶(质量体积比，即0.5g/100mL)底物释放1μmol的甘露糖所需要的酶量。酶活计算公式为：H＝Cx×n/(T×V)，其中，H代表酶活力(U/mL)，Cx代表生成甘露糖物质的量(μmol)，n代表酶液的稀释倍数，T代表反应时间(min)，V代表加入稀释后的酶液体积(mL)。
樟绒枝霉(Malbranchea cinnamonmea)S168：由本实验室筛选获得，并保存于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏编号：6022。并记载于“李延啸等.樟绒枝霉中一种低分子量木聚糖酶的纯化及性质研究.食品工业科技,2014年17期”一文。
实施例1、甘露聚糖酶基因的克隆与高效表达
1、甘露聚糖酶基因的克隆
使用特异性引物扩增樟绒枝霉来源甘露聚糖酶基因，特异性引物序列如下：
上游引物：5′-ATGAAGTTATCATCCTTCGCT-3′；
下游引物：5′-CTAGCTTGCGTTTCGAGTAGC-3′。
PCR反应以樟绒枝霉(Malbranchea cinnamonmea)S168的cDNA为模板，上述引物对为引物，使用Ex taq DNA聚合酶(Takara公司)扩增。程序为：95℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环扩增；总延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收连接到pMD-18T载体(Takara公司)，热激法转化大肠杆菌，挑选单菌落测序。
经分析，甘露聚糖酶基因全长为1068bp(SEQ ID No.2)，编码355个氨基酸(SEQ IDNo.1)。经SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测自氨基端(N端)第1-17位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第18-355位氨基酸残基为成熟蛋白。SEQ ID No.1所示蛋白质命名为McMan5A。
2、表达甘露聚糖酶工程菌的构建
根据毕赤酵母表达载体和甘露聚糖酶的序列设计表达引物，上下游引物分别添加上EcoRI和NotI酶切位点上下游引物分别如下：
上游引物：5′-CTCAGGAATTCGCTCCCTTGGAATCGCGG-3′；
下游引物：5′-TGACTGCGGCCGCCCTAGCTTGCGTTTCGAGTAGC-3′。
用上述引物对以樟绒枝霉S168的cDNA为模板进行PCR扩增，使用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳回收后，连接到预先使用相应酶切过的pPIC9K载体上。使用PCR和双酶切验证序列，将已经正确的连接到毕赤酵母表达载体命名为pPIC9K-McMan5A。将重组表达载体转化毕赤酵母GS115，得到重组毕赤酵母菌。
3、重组菌毕赤酵母GS115的高密度发酵
发酵采用5L发酵罐。整个发酵过程采用分批培养、甘油分批补料培养、100％甲醇诱导培养三个阶段。具体使用的培养基及操作过程如下：
实验过程中所用的培养基及其成分如下：
BMGY培养基：1％酵母浸粉，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％Biotin，1％甘油，溶液为100mmol/L pH 6.0磷酸钾缓冲溶液。其中，％均表示质量体积比(如1％表示1g/100mL)。
BSM培养基：溶剂为水；溶质为及浓度如下：2.67％磷酸，0.093％CaSO4，1.82％K2SO4，1.49％MgSO4·H2O，0.413％KOH，4％甘油。其中，％均表示质量体积比(如1％表示1g/100mL)。
种子培养：从保藏的甘油管吸取150μL步骤2获得的重组毕赤酵母菌的菌液接种于150mL BMGY培养基中，30℃，200rpm的条件下振荡培养至OD600＝10.0左右。
分批培养：发酵罐装1.5L BSM培养基，灭菌后，浓氨水调节pH至4.0，加入6.535mLPTM1溶液(溶剂为水，溶质及浓度如下：0.6％CuSO4·5H2O，0.008％NaI，0.3％MnSO4·H2O，0.02％Na2MoO4·2H2O，0.002％H3BO3，0.05％CoCl2，2％ZnCl2，6.5％FeSO4·7H2O，0.02％生物素，0.5％浓硫酸。其中，％均表示质量体积比，如1％表示1g/100mL)，接种150mL种子液，接种量10％(V/V)，30℃、转速600rpm，通气量1.0vvm，发酵18～24h。
甘油分批补料培养：待分批培养至甘油耗尽后，开始流加甘油(甘油溶于水中而形成的500g/L的甘油水溶液)，流速18.4mL/h/L起始发酵液，始终监视DO(溶解氧)，通过调整转速和通气量等保持溶氧大于20％。流加时间4h，发酵液在600nm出吸光值达180～220左右。该步骤培养温度为30℃、pH为4.0。
100％甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿30min左右，流加无水甲醇，在4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液增加至10.9mL/h/L起始发酵液(流速是线性增加，并最终维持10.9mL/h/L)，监控DO＞15％。发酵过程中取样分析发酵液的菌体湿重、甘露聚糖酶活力和蛋白含量。该步骤培养温度为30℃、pH为6.0。
高密度发酵历程如图1所示。其中，(■)为发酵液中甘露聚糖酶活力，(●)为发酵液中的蛋白含量，(▲)为发酵液中的菌体湿重。随着发酵时间的逐渐延长，发酵液中甘露聚糖酶活力、蛋白含量和菌体湿重均逐渐增高。当发酵至第7天时，甘露聚糖酶活力达42200U/mL，蛋白含量达10.2mg/mL，菌体湿重达479.5g/L。
实施例2、甘露聚糖酶的纯化及酶学性质测定
1、甘露聚糖酶的纯化
Q-琼脂糖凝胶FF(Q-Sepharose FF)离子交换层析：取10mL经实施例1高密度发酵的发酵液，经10000rpm离心5min获得上清液，在20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中透析过夜，上样于用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡好的Q-sepharose柱。用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱20min，洗脱未结合的蛋白，用含有0-500mmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)线性洗脱目的蛋白，洗脱时间100min，将含有目的蛋白的洗脱液合并后用20mmol/L MOPS缓冲液(pH7.5)透析过夜。
SDS-PAGE纯化图如图2所示。其中，泳道1为发酵上清液，泳道2为经Q-Sepharose柱纯化后的纯酶，泳道3为用N-去糖基化酶去糖基后的酶(泳道中30kDa处的蛋白带为N-去糖基化酶)。去糖基化后，甘露聚糖酶在电泳图中的拖尾明显减少，分子量有所减小，说明甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达有糖基化现象发生。
2、最适pH的测定
将上述制备得到的纯酶液作为待测酶液，将其分别在不同缓冲液体系中，于75℃下进行酶活测定，以最高酶活力为100％计算相对酶活。各种缓冲如下：
1)柠檬酸磷酸缓冲液(pH3.0-7.0)；
2)柠檬酸缓冲液(pH3.0-6.0)；
3)磷酸缓冲液(pH6.0-8.0)；
4)MOPS缓冲液(pH6.5-7.5)；
5)CHES缓冲液(pH8.0-10.0)
6)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0-10.5)。
7)CAPS缓冲液(pH10.0-11.0)。
结果见图3：甘露聚糖酶McMan5A的最适pH为7.5。
3、pH稳定性测定
将甘露聚糖酶纯酶液用上述缓冲液进行稀释，置于50℃水浴锅中处理30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，然后测定酶活力。以未经处理的甘露聚糖酶作为100％，计算经过不同pH处理后McMan5A的相对酶活力。
结果如图4所示：McMan5A具有良好的pH稳定性，在pH4.0-10.5范围内保温30min后仍残留80％以上的酶活力。
4、最适温度的测定
将甘露聚糖酶纯酶液用50mmol/L MOPS缓冲液(pH7.5)适当稀释后，分别在不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100℃)测定酶活力。以最高酶活力为100％，计算相对酶活力。
结果见图5：McMan5A的最适温度为75℃。
5、温度稳定性的测定
将甘露聚糖酶纯酶液用50mmol/L MOPS缓冲液(pH7.5)适当稀释后，分别在不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100℃)保温30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，然后测定酶活力。以未经处理的甘露聚糖酶作为100％，计算经过不同pH处理后McMan5A的相对酶活力。
结果见图6：McMan5A具有极好的热稳定性，在85℃以下处理30min仍残留80％以上的酶活力，在100℃下处理30min仍具有50％的残余酶活力。
6、底物特异性的测定
选择不同的甘露聚糖底物，测定甘露聚糖酶对这些底物的酶活力，底物浓度均为0.5g/100mL。结果见表1，该酶对槐豆胶的酶活力最高，其次为魔芋胶和决明子胶。
表1甘露聚糖酶McMan5A的底物特异性
底物 相对酶活力(％)
槐豆胶 100
魔芋胶 88.4
瓜尔胶 63.5
决明子胶 76.8
香豆胶 20.3
7、水解特性的分析
将槐豆胶、魔芋胶(1g/100mL)溶于50mmol/L MOPS缓冲液(pH7.5)，加入McMan5A(5U/mL)，置于70℃下水解12h，间隔取样，所有样品于沸水浴中10min终止反应。将所有样品进行薄层层析色谱分析。上样量2μL，展层剂为正丁醇：乙酸：水(2：1：1，体积比)，显色剂为甲醇：硫酸(95：5，体积比)。
薄层层析结果如图7所示。可以看出，McMan5A水解槐豆胶主要产生甘露二糖、甘露三糖以及一些聚合度较高的甘露寡糖。McMan5A水解魔芋胶时，几乎不产生甘露寡糖，主要是一些部分降解的聚合度较高的组分。
实施例3、水解不同底物浓度魔芋胶
称取100mL 50mmol/L pH7.5的MOPS缓冲液，加入1g、5g、10g、20g、30g魔芋胶充分搅拌，按照与魔芋胶的比例为200U/g加入甘露聚糖酶McMan5A，置于70℃下水解8h，酶解后沸水浴20min终止反应，得到酶解液。用DV-1旋转粘度计于25℃条件下测量酶解液的粘度。用凝胶排阻色谱测定产物的重均分子量。利用蒸馏水将产物浓度稀释至10mg/mL，10000rpm离心5min后取上清液，过0.22μm滤膜后上样，色谱柱为TSKgel GMPWXL，柱温为35℃，流动相为水，流速为0.6mL/min。用分子量在1200-375500Da之间葡聚糖标准品为标准，测定样品的分子量及分子量分布曲线。
水解不同浓度魔芋胶后，所得酶解液的粘度和产物重均分子量如表2所示。可以看出，随着底物浓度不断提高，酶解液粘度逐渐增大，产物重均分子量也逐渐增大。当底物浓度增大至30g/100mL，酶解液粘度和产物重均分子量均显著增加。魔芋胶浓度为20g/100mL时，酶解8h后，酶解液粘度达42720mPa·s，产物重均分子量达2.0×104Da。这与目前已经商业化的部分水解瓜尔胶产品的重均分子量(2.5×104Da)相似，具有较好的应用前景。
表2甘露聚糖酶水解不同浓度魔芋胶的酶解液粘度和产物重均分子量
魔芋胶(g/100mL) 粘度(mPa·s) 重均分子量(Da)
1 480 3.5×10<sup>3</sup>
5 5090 9.1×10<sup>3</sup>
10 26840 1.8×10<sup>4</sup>
20 42720 2.0×10<sup>4</sup>
30 110030 2.4×10<sup>5</sup>
实施例4、不同甘露聚糖酶添加量水解魔芋胶
称取100mL 50mmol/L pH7.5的MOPS缓冲液，加入20g魔芋胶充分搅拌，按照与魔芋胶的比例分别为20U/g、50U/g、100U/g、200U/g、400U/g、800U/g加入甘露聚糖酶McMan5A，置于70℃下水解8h，酶解后沸水浴20min终止反应，得到酶解液。用DV-1旋转粘度计于25℃条件下测量酶解液的粘度。用凝胶排阻色谱测定产物的重均分子量。利用蒸馏水将产物浓度稀释至10mg/mL，10000rpm离心5min后取上清液，过0.22μm滤膜后上样，色谱柱为TSKgelGMPWXL，柱温为35℃，流动相为水，流速为0.6mL/min。用分子量在1200-375500Da之间葡聚糖标准品为标准，测定样品的分子量及分子量分布曲线。
不同加酶量水解魔芋胶后，所得酶解液的粘度和产物重均分子量如表3所示。可以看出，随着加酶量的逐渐增加，酶解液的粘度逐渐降低，产物的重均分子量也逐渐降低。甘露聚糖酶的添加量在20-800U/g，酶解8h后，酶解液的粘度从110210mPa·s降低至560mPa·s，产物的重均分子量由1.6×105Da降低至6.5×103Da。
表3不同加酶量水解魔芋胶的酶解液粘度和产物重均分子量
Figure BDA0002082301320000111
Figure BDA0002082301320000121
实施例5、不同水解时间水解魔芋胶
称取100mL 50mmol/L pH7.5的MOPS缓冲液，加入20g魔芋胶充分搅拌，按照与魔芋胶的比例为200U/g加入甘露聚糖酶McMan5A，置于70℃下水解0.5、1、2、4、8、12h，酶解后沸水浴20min终止反应，得到酶解液。用DV-1旋转粘度计于25℃条件下测量酶解液的粘度。用凝胶排阻色谱测定产物的重均分子量。利用蒸馏水将产物浓度稀释至10mg/mL，10000rpm离心5min后取上清液，过0.22μm滤膜后上样，色谱柱为TSKgel GMPWXL，柱温为35℃，流动相为水，流速为0.6mL/min。用分子量在1200-375500Da之间葡聚糖标准品为标准，测定样品的分子量及分子量分布曲线。
不同水解时间下，所得酶解液的粘度和产物重均分子量如表4所示。可以看出，随着水解时间的逐渐延长，酶解液的粘度和产物的重均分子量均逐渐降低。魔芋胶经甘露聚糖酶水解0.5-8h后，酶解液的粘度从395000mPa·s降低至38600mPa·s，产物的重均分子量由1.3×106Da降低至1.8×104Da。
表4不同水解时间水解魔芋胶的酶解液粘度和产物重均分子量
水解时间(h) 粘度(mPa·s) 重均分子量(Da)
0.5 395000 1.3×10<sup>6</sup>
1 201600 2.6×10<sup>5</sup>
2 105800 7.7×10<sup>4</sup>
4 53500 3.1×10<sup>4</sup>
8 42720 2.0×10<sup>4</sup>
12 38600 1.8×10<sup>4</sup>
实施例6、中分子量部分水解魔芋胶的制备
称取魔芋胶20g溶于100mL 50mmol/L pH7.5的MOPS缓冲液中，加入20U/g魔芋胶的甘露聚糖酶，置于70℃下水解8h，酶解结束后沸水浴20min终止反应，得到酶解液。随后，测定酶解液的粘度为110210mPa·s，较水解前魔芋胶溶液粘度有显著下降。酶解液经过真空冷冻干燥后，得到粉末状产品，即为中分子量部分水解魔芋胶，产物收得率为93.2％。
称取冻干后的中分子量部分水解魔芋胶6mg，溶于3mL蒸馏水后，10000rpm离心5min，上清液用0.22μm滤膜过滤后，用凝胶排阻色谱进行分析。色谱柱为TSKgel GMPWXL，流动相为纯水，流速为0.6mL/min。用分子量在1200-375500Da之间葡聚糖标准品为标准，测定样品的分子量及分子量分布曲线。中分子量部分水解魔芋胶的凝胶排阻色谱结果如图8所示。该产品主要分布在2×103至6×105Da范围内，分子量分布较宽，产物更丰富。经过计算，中分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为1.6×105Da。
实施例7、低分子量部分水解魔芋胶的制备
称取魔芋胶20g溶于100mL 50mmol/L pH7.5的MOPS缓冲液中，加入200U/g魔芋胶的甘露聚糖酶，置于70℃下水解8h，酶解结束后沸水浴20min终止反应，得到酶解液。经测定，酶解液粘度下降至42720mPa·s，显著低于原始魔芋胶溶液和中分子量部分水解魔芋胶溶液的粘度。酶解液经过真空冷冻干燥后，得到粉末状产品，即为低分子量部分水解魔芋胶，产品收得率为96.8％。
称取冻干后的低分子量部分水解魔芋胶6mg，溶于3mL蒸馏水后，10000rpm离心5min，上清液用0.22μm滤膜过滤后，用凝胶排阻色谱进行分析。色谱柱为TSKgel GMPWXL，流动相为纯水，流速为0.6mL/min。用分子量在1200-375500Da之间葡聚糖标准品为标准，测定样品的分子量及分子量分布曲线。低分子量部分水解魔芋胶的凝胶排阻色谱结果如图9所示。可以看出，该产品的分子量分布范围相对较窄，主要集中在1×103至7×104Da范围内。经过计算，低分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为2.0×104Da。
实施例8、部分水解魔芋胶总膳食纤维的测定
利用AOAC2009.01的方法测定上述两个实施例中两种部分水解魔芋胶的总膳食纤维含量，结果如表5所示。可以看出，两种产品中主要是不可溶性膳食纤维和酒精可沉淀可溶性膳食纤维，分别占84.5％和78.2％，非可沉淀可溶性膳食纤维含量较少。两种产品中，总膳食纤维含量分别为93.2％和90.6％。
表5两种部分水解魔芋胶中总膳食纤维的含量
Figure BDA0002082301320000131
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
对比例1、
将实施例1步骤3中的发酵条件中“100％甲醇诱导培养”条件更改为如下：
100％甲醇诱导培养：停止流加甘油后，立即流加100％甲醇诱导培养基，在4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液增加至20mL/h/L起始发酵液(流速是线性增加，并最终维持20mL/h/L)，监控DO＞0％。发酵过程中取样分析发酵液的菌体湿重、甘露聚糖酶活力和蛋白含量。该步骤培养温度为30℃、pH为6.0。
其他条件与实施例1完全相同。
实验结果如下：
随着发酵时间逐渐延长，发酵液中甘露聚糖酶酶活力、蛋白含量和菌体湿重均逐渐增高，但表达水平显著低于实施例1。当发酵至第7天时，甘露聚糖酶活力仅为10200U/mL，蛋白含量达2.6mg/mL，菌体湿重达351.2g/L。
对比例2、
将实施例2步骤1中甘露聚糖酶的洗脱条件更改为：
用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱20min，洗脱未结合的蛋白，用含有500mmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱目的蛋白，洗脱时间20min，将含有目的蛋白的洗脱液合并后用20mmol/L MOPS缓冲液(pH7.5)透析过夜。
其他条件与实施例2完全相同。
实验结果如下：
经SDS-PAGE分析，该条件下收集的甘露聚糖酶洗脱液中，仍含有较多的杂蛋白，无法实现甘露聚糖酶的纯化分离。
<110> 中国农业大学
<120> 一种嗜热真菌甘露聚糖酶的生产方法及其应用
<130> GNCLN191133
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 355
<212> PRT
<213> Malbranchea cinnamonmea
<400> 1
Met Lys Leu Ser Ser Phe Ala Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Ser Ser
1 5 10 15
Ser Ala Pro Leu Glu Ser Arg Gln Ser Gly Leu Ser Pro Phe Ala Gly
20 25 30
Thr Asn Ala Tyr Trp Leu Pro Phe Leu Thr Asn Asp Ala Asp Val Glu
35 40 45
Ala Ser Phe Gln Ala Met Lys Asn Ala Gly Met Lys Val Val Arg Thr
50 55 60
Trp Ala Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Gln Glu Ile His Phe Gln Cys
65 70 75 80
Trp Lys Asn Gly Gln Pro Thr Ile Asn Thr Gly Glu Asn Gly Leu Gln
85 90 95
Arg Leu Asp Val Ile Val Arg Thr Ala Glu Ala His Gly Ile Gln Leu
100 105 110
Ile Leu Pro Phe Val Asn Asn Trp Gly Asp Tyr Gly Gly Met Asp Val
115 120 125
Tyr Val Gln Gln Leu Gly Gly Asn Gly His Ser Ser Phe Tyr Thr Asp
130 135 140
Ala Ala Ile Gln Asp Ala Tyr Lys Asn Tyr Val Arg Thr Ile Val Asn
145 150 155 160
Arg Tyr Lys Asn Ser Ser Ala Ile Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu
165 170 175
Pro Arg Cys Gln Gly Cys Asp Thr Ser Ile Ile Thr Glu Trp Ala Ser
180 185 190
Asn Met Ser Ala Phe Val Lys Ser Leu Asp Pro Ser His Tyr Val Val
195 200 205
Leu Gly Asp Glu Gly Phe Phe Asn Arg Pro Gly Asp Pro Ser Tyr Pro
210 215 220
Tyr Gln Gly Gly Glu Gly Val Asp Phe Glu Ala Asn Leu Lys Ile Ser
225 230 235 240
Thr Leu Asp Phe Gly Ile Phe His Met Tyr Ile Thr Pro Trp Gly Gln
245 250 255
Thr Tyr Asp Trp Gly Asn Gln Trp Ile Ala Asp His Ser Ala Ala Cys
260 265 270
Glu Ala Ala Gly Lys Pro Cys Ile Leu Glu Glu Tyr Gly Val Asp Gln
275 280 285
Asp Gly Asp Phe Arg Thr Thr Trp Met Thr Asn Trp His Asn Thr Leu
290 295 300
Leu Glu Ser Pro Gly Val Pro Ala Asp Met Phe Trp Gln Phe Gly Leu
305 310 315 320
Gln Leu Ser Tyr Gly Pro Asn His Asp Asp Gly Tyr Thr Ile Tyr Asn
325 330 335
Phe Glu Asp Asn Phe Gln Pro Val Val Val Asp Trp Ala Ala Thr Arg
340 345 350
Asn Ala Ser
355
<210> 2
<211> 1068
<212> DNA
<213> Malbranchea cinnamonmea
<400> 2
atgaagttat catccttcgc tttacccctg ttagcagggc taagttcttc agctcccttg 60
gaatcgcggc aaagtggctt gtctcccttc gcaggtacca atgcctactg gcttccgttc 120
ctcacaaatg acgcagacgt ggaggccagc ttccaggcta tgaaaaacgc cggtatgaaa 180
gtggttcgaa cctgggcgtt caacgacaat actgagtgcc aggaaatcca ttttcagtgc 240
tggaaaaatg gacaacctac aatcaacacc ggagaaaacg ggctgcaacg tcttgatgta 300
attgttcgaa ccgcagaagc ccatggaata cagttgattc tgccatttgt aaacaactgg 360
ggtgattatg gcgggatgga tgtctatgtc caacagcttg gtggcaacgg tcattcttcc 420
ttttataccg atgctgcaat tcaggatgcg tataagaact atgtcagaac tattgtgaac 480
cgctacaaaa attcgtccgc cattttcgct tgggaacttg ccaatgagcc acgctgccaa 540
ggctgcgaca cgtccatcat cacggaatgg gcgtcgaaca tgagcgcatt cgttaaatct 600
ctcgacccat cgcactatgt tgtccttggt gacgagggtt ttttcaatcg acctggtgac 660
ccgtcgtacc cttaccaagg cggcgaaggt gttgacttcg aggccaatct gaagatcagc 720
acactagact tcgggatctt ccacatgtac attaccccct ggggacagac gtacgattgg 780
ggaaatcagt ggatcgccga ccactctgcg gcttgcgagg ctgctggaaa gccatgcatc 840
ttagaagagt atggagtgga tcaggatggt gactttagaa ccacttggat gacaaattgg 900
cacaacacct tgctggagag ccccggtgtc ccagccgata tgttttggca gtttggttta 960
cagttgagtt atgggcccaa ccatgatgat gggtacacca tttacaattt cgaggacaac 1020
tttcagccgg tcgttgtcga ttgggccgct actcgaaacg caagctag 1068

Claims (5)

1.甘露聚糖酶在生产部分水解魔芋胶中的应用；
所述甘露聚糖酶为如下任一所示蛋白质：
a1)SEQ ID No.1自N末端第18至355位氨基酸残基组成的蛋白质；
a2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a3)与a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上同源性且来源于樟绒枝霉具有甘露聚糖酶活性的蛋白质；
a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
所述部分水解魔芋胶为中分子量部分水解魔芋胶或低分子量部分水解魔芋胶；
所述中分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为1.6×105Da；所述低分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为2.0×104Da。
2.甘露聚糖酶在制备用于生产部分水解魔芋胶的产品中的应用；
所述甘露聚糖酶为如下任一所示蛋白质：
a1)SEQ ID No.1自N末端第18至355位氨基酸残基组成的蛋白质；
a2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a3)与a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上同源性且来源于樟绒枝霉具有甘露聚糖酶活性的蛋白质；
a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
所述部分水解魔芋胶为中分子量部分水解魔芋胶或低分子量部分水解魔芋胶；
所述中分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为1.6×105Da；所述低分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为2.0×104Da。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：在生产所述部分水解魔芋胶过程中，生产底物为魔芋胶；魔芋胶在反应体系中的初始浓度为1-20g/100mL；水解时间为0.5-12h；所述甘露聚糖酶添加量为20-800U/g魔芋胶。
4.一种制备中分子量部分水解魔芋胶的方法，包括如下步骤：用甘露聚糖酶水解魔芋胶，魔芋胶和所述甘露聚糖酶的配比为1g魔芋胶：20U所述甘露聚 糖酶，于70℃水解8h，得到所述中分子量部分水解魔芋胶；所述中分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为1.6×105Da；
所述甘露聚糖酶为如下任一所示蛋白质：
a1)SEQ ID No.1自N末端第18至355位氨基酸残基组成的蛋白质；
a2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a3)与a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上同源性且来源于樟绒枝霉具有甘露聚糖酶活性的蛋白质；
a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
5.一种制备低分子量部分水解魔芋胶的方法，包括如下步骤：用甘露聚 糖酶水解魔芋胶，魔芋胶和所述甘露聚糖酶的配比为1g魔芋胶：200U所述甘露聚 糖酶，于70℃水解8h，得到所述低分子量部分水解魔芋胶；所述低分子量部分水解魔芋胶的重均分子量为2.0×104Da；
所述甘露聚糖酶为如下任一所示蛋白质：
a1)SEQ ID No.1自N末端第18至355位氨基酸残基组成的蛋白质；
a2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a3)与a1)-a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上同源性且来源于樟绒枝霉具有甘露聚糖酶活性的蛋白质；
a4)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
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