CN104762243A - 一种重组菌株与制备碱性β-甘露聚糖酶的方法 - Google Patents

一种重组菌株与制备碱性β-甘露聚糖酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组菌株，该重组菌株为含有编码碱性β-甘露聚糖酶的基因的重组大肠杆菌，且所述基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种制备碱性β-甘露聚糖酶的方法，该方法包括将本发明的重组菌株接种至液体发酵培养基中进行发酵，获得含有碱性β-甘露聚糖酶的发酵液。通过上述技术方案，本发明的重组菌株能够高水平地表达碱性β-甘露聚糖酶，所需发酵的时间较短。采用本发明的方法制备碱性β-甘露聚糖酶，最终得到的发酵液中的酶含量可达6000U/ml。

Description

一种重组菌株与制备碱性β-甘露聚糖酶的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地，涉及一种重组菌株以及利用该重组菌株制备碱性β-甘露聚糖酶的方法。
背景技术
β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC3.2.1.78）是一种半纤维素酶，可以水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖（参见Tipdon,R.S.et al.:Advances in Carbohydrate Chemistry andBiochemistry,32:299-316,Academic Press,New York,1976.）。甘露聚糖是自然界中存在的一种较为丰富的半纤维素资源，数量仅次于纤维素。豆科植物种子、针叶树木材、绿色咖啡豆等都含有大量的甘露聚糖，一些植物胶，如田青胶、角豆胶、魔芋精粉等几乎完全是由半乳糖或葡萄糖与甘露糖组成的甘露聚糖。利用β-甘露聚糖酶对上述植物材料进行深加工和综合利用具有很大的应用潜力。国内外现主要用于造纸工业纸浆的漂白、油井的破胶、降解植物胶生产低聚糖用作双歧杆菌促生长因子，防病抗衰老的保健食品以及饲料工业中作为抗营养因子。
β-甘露聚糖酶按其最适pH值的不同有酸性、中性、碱性之分，其中碱性β-甘露聚糖酶的研究相对较晚，发现主要由嗜碱芽孢杆菌（alkaliphilicBacillus）产生，某些地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）也产生碱性β-甘露聚糖酶，如杨文博等报道了一株地衣芽孢杆菌NK-27，其最适pH值为9.0。一般情况下枯草芽孢杆菌，放线菌等产生中性β-甘露聚糖酶，而霉菌产生酸性β-甘露聚糖酶。第一个碱性β-甘露聚糖酶由Akino等发现。马延和等于199l报道了嗜碱芽孢杆菌N16-5的三个胞外碱性β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质，并于2004年报道了其中一种嗜碱甘露聚糖酶的基因序列。Takeda等于2004年发现了芽孢杆菌属的一个菌株JAMB-602产碱性β-甘露聚糖酶，此酶属于GH家族5，最适pH为9。目前所发现的嗜碱甘露聚糖酶的最适pH值最高为10，由Takeda等于2004年报道。
碱性β-甘露聚糖酶不仅可以生产用作双歧杆菌促生长因子的低聚糖，而且在需碱性环境的纸浆漂白等工业方面具有广泛的应用前景。但到目前为止，碱性β-甘露聚糖酶的制备仍旧是限制其工业应用的瓶颈，前人的报道中无论是使用碱性β-甘露聚糖酶的原产菌株还是使用重组菌株生产，其产量都比较低，或者需要发酵较长的时间。如马延和报道了由嗜碱芽孢杆菌N16-5菌株经培养优化后，产量达到500U/ml（参见CN1266096A）。朱泰承等用毕赤酵母表达来自嗜碱芽孢杆菌N16-5基因，发酵120小时左右碱性β-甘露聚糖酶的酶含量达6000U/ml（参见CN102433267A）。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够较高水平的表达碱性β-甘露聚糖酶的重组菌株以及利用该菌株制备碱性β-甘露聚糖酶的方法。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种重组菌株，该重组菌株为含有编码碱性β-甘露聚糖酶的基因的重组大肠杆菌，且所述基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
第二方面，本发明提供了一种制备碱性β-甘露聚糖酶的方法，该方法包括将第一方面所述的重组菌株接种至液体发酵培养基中进行发酵，获得含有碱性β-甘露聚糖酶的发酵液。
通过上述技术方案，本发明的重组菌株能够高水平地表达碱性β-甘露聚糖酶，所需发酵的时间较短。采用本发明的方法制备碱性β-甘露聚糖酶，最终得到的发酵液中的酶含量可达6000U/ml。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是发酵液中酶含量和蛋白浓度随发酵时间的变化曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，“酶含量”用每ml发酵液中含有的酶活力单位（U）数来表示，单位为U/ml，且在37℃、pH值为9.0的条件下，每分钟降解甘露聚糖释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U；“溶氧量”用溶氧电极测得的结果表示，且定义发酵开始时的溶氧量为100%。
本发明提供了一种重组菌株，该重组菌株为含有编码碱性β-甘露聚糖酶的基因的重组大肠杆菌，且所述基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的重组菌株可以采用常规的基因工程技术获得，例如，获取碱基序列如SEQ ID NO:1所示的基因，构建含有碱基序列如SEQ ID NO:1所示的基因的表达载体，再将该表达载体转入大肠杆菌中即可获得。可以从嗜碱芽孢杆菌N16-5的总DNA中扩增获得碱基序列如SEQ ID NO:1所示的基因，且可以采用“上游引物序列如SEQ ID NO:2所示且下游引物序列如SEQ ID NO:3所示”的引物进行扩增。
agttcaggcttttatgttgatggcaatacgttatatgacgcaaacgggcaaccatttgtcatgaaaggcattaaccatggacatgcttggtataaagacaccgcttcaacagctattcctgccattgcagagcaaggcgcgaacacgatacgtattgttttatcagatggcggtcaatgggaaaaagacgacattgacaccgttcgtgaagttattgagcttgcggagcaaaataaaatggtggctgtcgttgaagttcatgatgccacgggccgtgattcacgcagtgatttagatcgggcagtcgattattggatagagatgaaagatgcacttatcggcaaagaggatactgtcattattaacattgcaaacgaatggtatggcagttgggatggcgccgcttgggctgatggctacattgatgtcattccgaagcttcgcgatgccggcttaacacacaccttaatggttgatgcagcaggatgggggcaatatccgcaatctattcatgattacggacaagatgtgtttaatgcagatccgttaaaaaatacgatattctccatccatatgtatgagtatgctggtggtgatgctaacactgttagatcaaatattgatagagtcatagatcaagaccttgctctcgtaataggtgagttcggtcatagacacactgatggcgatgttgatgaagatacaatccttagttattctgaagaaactggcacaggatggctcgcttggtcttggaaaggcaacagtgccgaatgggattatttagacctttcagaagattgggctggtaaccatttaactgattggggaaataggattgtccacggggcaaatggcttgcaggaaacctccaaaccatccaccgtatttacagatgataacggtggtgcccctgaaccgccaactactactaccttgtatgactttgaaggaagcacacaagggtggcatggaagcaacgtgatgggtggcccttggtccgtaacagaatggggtgcgtcaggcaactactctttaaagggcgatgtcaatttaagctcaaattcttcacatgaactgtatagtgaacaaagtcgtaatctacacggatactctcagctaaatgcaaccgttcgccatgccaattggggaaatcccggtaatggcatgaatgcaagactttacgtgaaaacgggctctgattatacatggtatagcggtccttttacacgtatcaatagctccaactcaggtacaacgttatcttttgatttaaacaacatcgaaaatagtcatcatgttagggaaataggtgtgcaattttcagctgcagataatagcagcggtcaaactgctctatacgttgataatgttactttaaga（SEQ IDNO:1）
根据本发明，所述重组菌株可以为各种常规的用于构建基因工程菌的大肠杆菌，优选地，所述重组菌株的出发菌株为大肠杆菌BW25113（即***糖合成缺陷菌株，可以通过商购获得）。
根据本发明，优选地，所述重组菌株含有表达载体，所述表达载体为在pBAD载体（如pBAD-HisB载体）的NcoI酶切位点和XhoI酶切位点之间***碱基序列如SEQ ID NO:1所示的基因而得到的表达载体。即，编码碱性β-甘露聚糖酶的基因存在于表达载体上，能够自主复制和表达。所述表达载体中的启动子优选为***糖诱导型启动子。
本发明提供的制备碱性β-甘露聚糖酶的方法包括将上述重组菌株接种至液体发酵培养基中进行发酵，获得含有碱性β-甘露聚糖酶的发酵液。
根据本发明，可以采用常规方式进行发酵，优选情况下，所述发酵的方式为：在35-38℃下，将所述重组菌株培养至发酵液的OD600值达45-55，然后，在28-32℃下，往发酵液中添加***糖，继续发酵8-35h（优选10-30h）。发酵过程（包括继续发酵）中，可以控制通气量为1.5-2.5vvm。其中，OD600值是指发酵液在600nm波长处的吸光值，能够反应菌株在发酵液中的浓度（即菌浓）。
其中，所述液体发酵培养基可以为液体LB培养基，优选情况下，所述液体发酵培养基的配方为：8-10g/L的KH2PO4，3-5g/L的(NH4)2HPO4，4-6g/L的酵母提取物。液体发酵培养基的pH值可以为6.6-6.7。
本发明中，在发酵液的OD600值达45-55之前，如果发酵液总的葡萄糖耗尽，可以适当地流加葡萄糖，以促使发酵液的OD600值达到45-55。对葡萄糖的流加方式没有特别的要求，例如，可以每分钟流加0.6-1.2g/L发酵液的葡萄糖。
根据本发明，为了更好地维持重组菌株的生长以使其更佳地表达碱性β-甘露聚糖酶，优选地，在继续发酵过程中，控制发酵体系中的溶氧量为30-50%。可以通过调节通气量或搅拌速度控制溶氧量。
本发明中，对所述***糖的添加量没有特别的要求，优选情况下，所述***糖的添加量为1.5-2.5g/L发酵液。在添加***糖后，可以限制地补加葡萄糖以维持菌株的生长，例如每分钟补加0.1-0.3g/L发酵液的葡萄糖。
本发明中，在发酵之前，还可以对重组菌株进行种子培养，对种子培养的方式没有特别的限制，例如，可以将重组菌株接种至LB培养基中，于36-38℃下培养12-16h，从而获得OD600值为1.5-2的种子液。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，溶氧量采用溶氧量电极（Mettler）进行测定；嗜碱芽孢杆菌N16-5总DNA采用细菌DNA提取试剂盒（OMEGA-D3350）提取得到；OD600值采用722N可见光分光光度计测得；葡萄糖的含量采用HPLC法测得。
实施例1
本实施例用来说明本发明重组菌株的制备。
（1）碱性β-甘露聚糖酶基因的克隆
引物1（上游）：5’-ACCATGGTTCAGGCTTTTATG-3’（SEQ ID NO:2）
引物2（下游）：5’-CGAGCTCTTAACGCAGCGTAACGTT-3’（SEQ ID NO:3）。
以嗜碱芽孢杆菌N16-5（保藏号为CGMCC NO.0369，已在CN1266096A中公布）总DNA为模板，加入引物1、引物2、HiFi Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，进行降落PCR（touchdown PCR），反应条件如下：94℃5min；94℃30s，60-50℃30s，72℃90s，每个循环降1℃，共10个循环；94℃30s，55℃30s，72℃90s，共25个循环。
PCR扩增得到1400bp的片段，命名为manA，用Omega纯化试剂盒（型号为D6493）进行纯化。
（2）碱性β-甘露聚糖酶表达载体和重组菌株的构建
将pBAD-HisB载体（购自Invitrogen公司）用NcoI/XhoI双酶切，得到小片段，将小片段与同样用NcoI/XhoI消化过的manA连接，即得到基于pBAD-HisB的表达载体pBAD-manA。将表达载体pBAD-manA委托给北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，测序结果表明PCR扩增得到的片段具有SEQ ID NO:1所示的碱基序列。
用表达载体pBAD-manA电击转化大肠杆菌BW25113（购自CGSC，CGSC#:7636）后涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养15h，即得含有manA的表达载体的重组菌株BW25113-pBAD-manA。
实施例2
本实施例用来说明利用本发明的重组菌株高水平表达碱性β-甘露聚糖酶的方法。
种子培养：将重组菌株BW25113-pBAD-manA接种于25毫升LB培养基中，37℃下培养15h，获得OD600值为2.0的种子液。
发酵：发酵罐中培养基按50%（v/v）的装液量（培养基组成：9g/L的KH2PO4，4g/L的(NH4)2HPO4，5g/L的酵母提取物，121℃灭菌，灭菌前先进行pH值、溶氧量电极的标定，然后灭菌30分钟，冷却至37℃），210rpm（通气量2vvm），用50%（v/v）的氨水调pH值至6.7。接种量为2%（v/v），在接种前调节溶氧量至100%。当菌体开始生长，耗氧量增加，导致溶氧量降低，调节搅拌转速，以维持溶氧量在30%以上。
当葡萄糖耗尽（溶氧量迅速上升）时，开始流加葡萄糖，葡萄糖的流加量为每分钟1.0g/L发酵液。
当OD600值达50（发酵了24h）时，停止流加葡萄糖，待温度降至30℃后，加入***糖（添加量为2g/L发酵液）。同时限制地补加葡萄糖（每分钟0.3g/L发酵液）以维持菌株的生长，调整通气量或搅拌速度使整个过程的溶氧量控制在30-50%。继续发酵11h，酶含量可达到4000U/ml，继续发酵30h，酶含量可达到6000U/ml，发酵液中的酶含量随发酵时间的变化参见图1。从图1可以看出，采用本发明的方法制备碱性β-甘露聚糖酶时，发酵液中的酶含量较高，特别是在发酵了55小时左右时，发酵液中的酶含量可高达6500U/ml。
实施例3
本实施例用来说明利用本发明的重组菌株高水平表达碱性β-甘露聚糖酶的方法。
种子培养：将重组菌株BW25113-pBAD-manA接种于25毫升LB培养基中，37℃下培养15h，获得OD600值为2.0的种子液。
发酵：发酵罐中培养基按50%（v/v）的装液量（培养基组成：9g/L的KH2PO4，4g/L的(NH4)2HPO4，5g/L的酵母提取物，121℃灭菌，灭菌前先进行pH值、溶氧量电极的标定，然后灭菌30分钟，冷却至36℃），210rpm（通气量2vvm），用50重量%的氨水调pH值至6.7。接种量为2%（v/v），在接种前调节溶氧量至100%。当菌体开始生长，耗氧量增加，导致溶氧量降低，调节搅拌转速，以维持溶氧量在30%以上。
当葡萄糖耗尽（溶氧量迅速上升）时，开始流加葡萄糖，葡萄糖的流加量为每分钟0.6g/L发酵液。
当OD600值达45（发酵了20h）时，停止流加葡萄糖，待温度降至28℃后，加入***糖（添加量为2.0g/L发酵液）。同时限制地补加葡萄糖（每分钟0.3g/L发酵液）以维持菌株的生长，调整通气量或搅拌速度使整个过程的溶氧量控制在30-50%。继续发酵15h，酶含量可达到4015U/ml。
实施例4
本实施例用来说明利用本发明的重组菌株高水平表达碱性β-甘露聚糖酶的方法。
种子培养：将重组菌株BW25113-pBAD-manA接种于25毫升LB培养基中，37℃下培养15h，获得OD600值为2.0的种子液。
发酵：发酵罐中培养基按50%（v/v）的装液量（培养基组成：9g/L的KH2PO4，4g/L的(NH4)2HPO4，5g/L的酵母提取物，121℃灭菌，灭菌前先进行pH值、溶氧量电极的标定，然后灭菌30分钟，冷却至38℃），210rpm（通气量2vvm），用50重量%的氨水调pH值至6.7。接种量为2%（v/v)，在接种前调节溶氧量至100%。当菌体开始生长，耗氧量增加，导致溶氧量降低，调节搅拌转速，以维持溶氧量在30%以上。
当葡萄糖耗尽（溶氧量迅速上升）时，开始流加葡萄糖，葡萄糖的流加量为每分钟1.2g/L发酵液。
当OD600值达55（发酵了22h）时，停止流加葡萄糖，待温度降至32℃后，加入***糖（添加量为2.0g/L发酵液）。同时限制地补加葡萄糖（每分钟0.3g/L发酵液）以维持菌株的生长，调整通气量或搅拌速度使整个过程的溶氧量控制在30-50%。继续发酵14h，酶含量可达到4280U/ml。
从以上实施例可以看出，本发明的重组菌株能够较高水平地表达碱性β-甘露聚糖酶，且所需发酵时间较短。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.一种重组菌株，其特征在于，该重组菌株为含有编码碱性β-甘露聚糖酶的基因的重组大肠杆菌，且所述基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其中，所述重组菌株的出发菌株为大肠杆菌BW25113。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其中，所述重组菌株含有表达载体，所述表达载体为在pBAD载体的NcoI酶切位点和XhoI酶切位点之间***碱基序列如SEQ ID NO:1所示的基因而得到的表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组菌株，其中，所述表达载体中的启动子为***糖诱导型启动子。
5.一种制备碱性β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1-4中任意一项所述的重组菌株接种至液体发酵培养基中进行发酵，获得含有碱性β-甘露聚糖酶的发酵液。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述发酵的方式为：在35-38℃下，将所述重组菌株培养至发酵液的OD600值达45-55，然后，在28-32℃下，往发酵液中添加***糖，继续发酵8-35h。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在继续发酵过程中，控制发酵体系中的溶氧量为30-50%。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述***糖的添加量为1.5-2.5g/L发酵液。
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