CN103215244B

CN103215244B - 一种碱性果胶酶PelN及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103215244B
Application number: CN201310155628.4A
Authority: CN
Inventors: 李小曼; 王辉林; 宋江宁; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2033-04-28
Also published as: CN103215244A

Abstract

本发明公开了一种碱性果胶酶PelN及其编码基因与应用。所述PelN为序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，具有碱性果胶酶活性，含有该蛋白编码基因的重组菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21（DE3）PelN，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7166。实验证明，本发明所提供的蛋白质PelN，降解多聚半乳糖醛酸的酶活为4590—4950U/mg；热稳定性较好，在45℃保温120min的相对酶活仍在90%以上；作为碱性果胶酶的最适pH为9.8，最适温度为65℃。本发明所提供的蛋白质PelN、重组菌及碱性果胶酶生产方法为工业化大规模生产碱性果胶酶提供了有效途径。

Description

一种碱性果胶酶PelN及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种碱性果胶酶PelN及其编码基因与应用。

背景技术

果胶是植物细胞壁的重要组成成分，包括原果胶，果胶酸和果胶酯酸。果胶物质的存在可以增加植物细胞壁的坚硬度，有利于维持植物的特定外形结构，但增加了对植物进行深加工的工业操作的难度。

果胶酶是指能够分解果胶质的一类酶，普遍存在于自然界的高等植物和微生物中，是重要的工业酶制剂。

碱性果胶酶（EC:4.2.2.2）是一类在碱性条件下，以反式消去作用断开果胶质主链，产生不饱和的寡聚半乳糖醛酸的酶，在纺织工业的麻类脱胶、棉织品精炼等领域内有着广泛的应用。相比于传统的高碱、高温处理手段，使用碱性果胶酶不仅对果胶质有较好的去除作用，对天然纤维素纤维损伤较小，而且可以减少材料消耗和环境负担，为纺织工业开辟了一条绿色清洁之路。

目前，碱性果胶酶的广泛应用已受到生产成本和酶稳定性等因素的制约。国内筛选得到的碱性果胶酶野生产酶菌株的生产水平参差不齐，且野生菌的生产能力距离工业应用的需求还很远。因此，筛选稳定性高的碱性果胶酶，并构建生产工艺简单、产量高的工程菌是提高碱性果胶酶工业化水平的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性果胶酶PelN及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质PelN来自类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.PL0602），具有碱性果胶酶的功能，为如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有碱性果胶酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）或（b）中的蛋白质PelN便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基数	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR

Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质PelN可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述蛋白质PelN的编码基因可通过将序列表中序列2第7位至第1434位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的基因（PelN基因）也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）序列表中序列2的第7位至第1434位所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有碱性果胶酶活性的蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有碱性果胶酶活性的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体是将所述基因***载体pET22b的NcoI和XhoI位点间得到的；

所述重组菌是将所述重组表达载体导入大肠埃希氏菌(Escherichia coli)得到的；具体为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21（DE3）PelN，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7166。

本发明所提供的所述蛋白质可用于降解果胶或制备具碱性果胶酶活性的产品。

在上述应用中，所述果胶具体可为多聚半乳糖醛酸。

在上述应用中，所述降解的pH值为7.1—11.0，或7.6—10.4，或8.1—10.4，或8.6—10.4，或9.0—10.4，或9.4—10.4；具体可为7.6、8.1、8.6、9.0、9.4、9.8或10.4；

所述降解的温度为35℃—75℃，或40℃—70℃，或50℃—70℃，或55℃—70℃，或60℃—70℃；具体可为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃。

本发明还提供一种生产碱性果胶酶的方法，包括如下步骤：将所述大肠埃希氏菌BL21(DE3)PelN接种至发酵培养基，35-37℃（如35、36或37℃）振荡培养至OD_600nm=0.4—0.6（如0.4、0.5或0.6），然后加入IPTG至终浓度为100-200μM（如100、150或200μM），28-32℃（如28、30或32℃）继续振荡培养40-45小时（如40、43或45小时），得到碱性果胶酶。

在上述方法中，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨10-15g/L（如10、12或15g/L），酵母提取物15-24g/L（如15、20或24g/L），甘油8-12g/L（如8、10或12g/L），磷酸二氢钾10-17mmol/L（如10、14或17mmol/L），磷酸氢二钾65-75mmol/L（如65、70或75mmol/L）。

在上述方法中，所述大肠埃希氏菌BL21(DE3)PelN以种子液的方式接种至所述发酵培养基；接种量为1%-5%（如1%、3%或5%）；

所述种子液的制备方法如下：将所述大肠埃希氏菌BL21(DE3)PelN接种至种子培养基，35-37℃（如35、36或37℃）振荡培养至OD_600nm=6.0-8.0（如6.0、7.0或8.0），即为所述种子液；

所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨10-15g/L（如10、12、15g/L），酵母提取物5-8g/L（如5、7、8g/L），氯化钠4-6g/L（如4、5、6g/L）；所述种子培养基的pH值为7.0-7.2（如7.0、7.1、7.2）。

实验证明，本发明所提供的蛋白质PelN，在65℃降解多聚半乳糖醛酸的酶活为4590—4950U/mg；热稳定性较好，在45℃保温120min的相对酶活仍在90%以上；作为碱性果胶酶的最适pH为9.8，最适温度为65℃。本发明所提供的蛋白质PelN、重组菌及碱性果胶酶生产方法为工业化大规模生产碱性果胶酶提供了有效途径。

保藏说明

菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

菌株名称：BL21（DE3）PelN

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2013年1月18日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7166

附图说明

图1为本发明蛋白质的SDS-PAGE电泳图。其中，M道为Marker，1道为上清液CK中的蛋白，2道是上清液A中的蛋白，3道是纯化后的溶液A中的蛋白。

图2为本发明蛋白质作为碱性果胶酶的最适pH曲线。

图3为本发明蛋白质作为碱性果胶酶的最适温度曲线。

图4本发明蛋白质作为碱性果胶酶在45℃的热稳定曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中总蛋白质含量测定所使用的试剂盒为伯乐蛋白测定试剂盒QuickStart Bradford Protein Assay Kit，产品目录编号为500-0201。

实施例1、蛋白质PelN及其编码基因的获得

以中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.5696的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）SJN-PL0602的基因组DNA为模板，用引物F和R进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1.4kb的片段，测序表明，该片段大小为1440bp，其序列如序列表序列2所示，其中，序列2的第7位至第1434位编码序列表序列1所示的蛋白质，将该蛋白质命名为PelN，其编码基因命名为PelN。

上述引物F和R的序列如下：

5’-CCATGGATGAAAAGAACAGTACGAAGCT-3’（下划线碱基为NcoI酶切识别序列）；

5’-CTCGAGTTAGTAGGAAGTCTTCAGCCAC-3’（下划线碱基为XhoI酶切识别序列）。

实施例2、重组表达载体及重组菌的构建

1、将序列表序列2的DNA片段，用NcoI和XhoI双酶切，与经过NcoI和XhoI双酶切的载体pET22b（购自Novagen，产品目录编号为69744-3）的骨架片段连接，获得重组载体pET22b-PelN，经测序证实，重组载体pET22b-PelN为在载体pET22b的NcoI和XhoI位点间***了序列表序列2的第7位至第1434位所示的DNA片段。

2、将步骤1获得的重组载体pET22b-PelN转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录编号为CD601-01），将获得的含有重组载体pET22b-PelN的重组菌命名为BL21（DE3）PelN，该重组菌已于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101），其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏编号为CGMCC No.7166。

3、将空载体pET22b转化大肠杆菌BL21（DE3），获得含有空载体pET22b的重组菌（简称为对照菌）。

实施例3、蛋白质PelN的制备

1、制备种子液

将实施例2获得的重组菌BL21（DE3）PelN接种至装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min、振荡培养6-12h至OD_600nm=6.0，获得种子液；

所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物7g/L，氯化钠5g/L；所述种子培养基的pH值为7.2。

2、发酵培养

取步骤1获得的种子液，以5%的接种量接种至装有20-30mL发酵培养基的250mL三角瓶中；先37℃振荡培养至OD_600nm=0.6，然后加入IPTG（诱导剂，诱导目的蛋白质PelN的表达）至终浓度为200μM，30℃继续振荡培养40小时，获得发酵液；

所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油10g/L，磷酸二氢钾17mmol/L，磷酸氢二钾70mmol/L。

3、蛋白质PelN的获得

将步骤2获得的发酵液8000r/min离心10分钟，收集上清液（命名为上清液A）；从该上清液A中分离纯化蛋白质PelN，获得蛋白质PelN的溶液A，具体方法如下：

将上清液A进行离子交换层析，使用层析柱（购于BIO-RAD公司，产品目录编号为720-0003）的体积为6mL，（宽×长）12mm×53mm；使用的洗脱缓冲液（pH均为9.1，溶剂均为水）如下：

溶液Ⅰ：为20mmol/L PBS；

溶液Ⅱ：含500mmol/L氯化钠，20mmol/L PBS；

洗脱过程：（1）将层析柱用30mL溶液Ⅰ平衡，流速为0.5ml/min，以后皆同；（2）上样6mL上清液A；（3）用溶液Ⅰ和溶液Ⅱ梯度混合洗脱，溶液Ⅱ的梯度从0-80%，用时50min，收集A₂₈₀吸收值超过0.1mAU的峰，每管收集1mL的液体；（4）每管液体经碱性果胶酶活性检测（方法如实施例6），具有碱性果胶酶活性、并具有单一50kDa电泳纯的液体，即为蛋白质PelN的溶液A。

4、用对照菌代替重组菌BL21（DE3）PelN进行上述步骤1至3，获得对照菌发酵液的上清液（命名为上清液CK）和经分离纯化获得的溶液（命名为溶液CK）。

5、将上清液A和上清液CK以及溶液A进行SDS-PAGE，结果如图1所示。结果表明，重组菌BL21（DE3）PelN得到的上清液A经纯化后的溶液A得到电泳纯的单一条带，分子量约为50kDa（与蛋白质PelN的预测分子量相近）；对照菌得到的上清液CK没有得到目标大小的蛋白。

实施例4、蛋白质PelN的制备

1、制备种子液

将实施例2获得的重组菌BL21（DE3）PelN接种至装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，35℃、200r/min、振荡培养6-12h至OD_600nm=8.0，获得种子液；

所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物8g/L，氯化钠4g/L；所述种子培养基的pH值为7.0。

2、发酵培养

取步骤1获得的种子液，以1%的接种量接种至装有20-30mL发酵培养基的250mL三角瓶中；先35℃振荡培养至OD_600nm=0.4，然后加入IPTG（诱导剂，诱导目的蛋白质PelN的表达）至终浓度为100μM，32℃继续振荡培养45小时，获得发酵液；

所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物20g/L，甘油8g/L，磷酸二氢钾14mmol/L，磷酸氢二钾65mmol/L。

3、蛋白质PelN的获得

将步骤2获得的发酵液8000r/min离心10分钟，收集上清液；从该上清液中分离纯化蛋白质PelN，获得蛋白质PelN的溶液A，具体方法与实施例3中的步骤3相同。

4、用对照菌代替重组菌BL21（DE3）PelN进行上述步骤1至3，获得溶液CK。

5、将重组菌BL21（DE3）PelN和对照菌获得的上清液、溶液A和溶液CK进行SDS-PAGE，结果与实施例3中的步骤5相同。

实施例5、蛋白质PelN的制备

1、制备种子液

将实施例2获得的重组菌BL21（DE3）PelN接种至装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，36℃、200r/min、振荡培养6-12h至OD_600nm=7.0，获得种子液；

所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨15g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠6g/L；所述种子培养基的pH值为7.1。

2、发酵培养

取步骤1获得的种子液，以3%的接种量接种至装有20-30mL发酵培养基的250mL三角瓶中；先36℃振荡培养至OD_600nm=0.5，然后加入IPTG（诱导剂，诱导目的蛋白质PelN的表达）至终浓度为150μM，28℃继续振荡培养43小时，获得发酵液；

所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨15g/L，酵母提取物15g/L，甘油12g/L，磷酸二氢钾10mmol/L，磷酸氢二钾75mmol/L。

3、蛋白质PelN的获得

将步骤2获得的发酵液8000r/min离心10分钟，收集上清液；从该上清液中分离纯化蛋白质PelN，获得蛋白质PelN的溶液A，具体方法如下：

实施例6、碱性果胶酶的酶活测定

将实施例3—5重组菌BL21（DE3）PelN得到的发酵液的上清液A和溶液A及对照菌得到的发酵液的上清液CK和溶液CK分别用甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol/L，pH9.8)稀释后作为待测溶液进行酶活测定，结果如表2所示。

表2、碱性果胶酶的酶活测定结果

表2的结果表明：蛋白质PelN的碱性果胶酶酶活为4590—4950U/mg，实施例3—5发酵生产所得的发酵液上清中的碱性果胶酶酶活为4365—4950U/mL。

上述碱性果胶酶的酶活测定的具体方法如下：

实验组：在2ml溶液甲中加入20μL待测溶液，65℃反应15min，加入3mL0.03mol/LH₃PO₄水溶液（终止液），测定235nm的吸光度值；

对照组：在2ml溶液甲中依次加入3mL0.03mol/L H₃PO₄水溶液和20μL待测溶液，测定235nm的吸光度值。

溶液甲的配方：含0.2g/100ml多聚半乳糖醛酸（购自Sigma-Aldrich公司，货号81325-50G，简称PGA）和0.44mmol/L CaCl₂的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol/L，pH9.8)。

碱性果胶酶一个标准酶活单位(1U)定义为：在上述条件下，1min反应时间内使PGA产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所需的酶量。

碱性果胶酶酶活（U/mL）计算公式如下：

△OD₂₃₅=实验组235nm的吸光度值-对照组235nm的吸光度值；

4600为不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数，单位为L·mol^-1·cm^-1；

t为酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)，单位为min，本实验中为15min；

b为比色杯厚度，单位为cm，本实验中为1cm；

V₀为体系总体积数，单位为mL，本实验中为5.02mL；

V₁为酶液体积数，单位为mL，本实验中为0.02mL。

将测得的待测溶液的碱性果胶酶酶活（U/mL）除以该溶液中总蛋白的浓度（mg/mL），得到该溶液中蛋白的碱性果胶酶酶活（U/mg）。

实施例7、蛋白质PelN作为碱性果胶酶的性质鉴定

一、最适pH

方法：将实施例3得到的溶液A为待测溶液，按照实施例6的方法，在45℃进行碱性果胶酶活性检测，差异在于将反应体系中的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol/L，pH9.8)分别采用如下不同pH值的缓冲液：

50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.1-9.5)；

50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9.1-10.9)；

50mM Na₂HPO₄-NaOH缓冲液(pH10.5-12.0)；

将最高酶活记为100%，计算采用其它各种不同pH值不同缓冲液的相对酶活（%），结果如图2所示：

采用甘氨酸-NaOH缓冲液，pH为9.8时的相对酶活为100%，酶活值为2510U/mL；

采用50mM Tris-HCl缓冲液，pH为7.1时的相对酶活为0%，pH为7.6时的相对酶活为4.76%，pH为8.1时的相对酶活为9.26%，pH为8.6时的相对酶活为26.67%；

采用50mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH为9.0时的相对酶活为12.77%，pH为9.4时的相对酶活为28.18%，pH为10.4时的相对酶活为29.3%；

采用50mM Na₂HPO₄-NaOH缓冲液，pH为11时的相对酶活为0%，pH为12时的相对酶活为0%。

结果表明，蛋白质PelN作为碱性果胶酶的最适pH为9.8，pH低于7.6或高于11.0几乎丧失所有酶活。

二、最适温度

方法：将实施例3得到的溶液A作为待测溶液，按照实施例6的方法进行碱性果胶酶活性检测，差异仅在于反应条件中使用不同的温度为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃。

将最高酶活记为100%，计算采用其它不同温度的相对酶活（%）。结果：如图3所示。65℃时的相对酶活为100%（酶活值为4593U/mL），35℃的相对酶活为14.75%、40℃的相对酶活为24.29%、45℃的相对酶活为44.44%、50℃的相对酶活为54.73%、55℃的相对酶活为72.41%、60℃的相对酶活为84.61%、70℃的相对酶活为38.92%、75℃的相对酶活为17.97%。

结果表明：蛋白质PelN作为碱性果胶酶的最适温度为65℃，在55—65℃保持70%以上的酶活。

三、热稳定性

方法：将实施例2步骤三中5得到的溶液A在45℃保温不同时间（0—360min）后作为待测溶液，按照实施例6的方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶活性检测。

将最高酶活记为100%，计算采用其它45℃保温处理不同时间的相对酶活（%）。结果如图4所示，45℃保温0min的待测溶液的酶活为100%（酶活值为2012U/mL），45℃保温30min的待测溶液的酶活为98.1%，45℃保温60min的待测溶液的酶活为95.5%，45℃保温90min的待测溶液的酶活为92.3%，45℃保温120min的待测溶液的酶活为90.3%，45℃保温180min的待测溶液的酶活为90.0%，45℃保温240min的待测溶液的酶活为88.0%，45℃保温300min的待测溶液的酶活为87.0%，45℃保温360min的待测溶液的酶活为86.1%。

结果表明：蛋白质PelN的热稳定性较好，45℃保温120min的相对酶活仍大于90%、保温10min的相对酶活为99%。

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于：所述蛋白质由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因，其特征在于：所述编码基因为序列表中序列2的第7位至第1434位所示的DNA分子。

3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体或重组菌，其特征在于：

所述重组菌是将所述重组表达载体导入大肠埃希氏菌(Escherichia coli)得到的。

5.根据权利要求3或4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PelN，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7166。

6.权利要求1所述蛋白质在降解果胶或制备具碱性果胶酶活性的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为7.6-10.4。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为8.1-10.4。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为8.6-10.4。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为9.0-10.4。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为9.4-10.4。

12.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为7.6。

13.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为8.1。

14.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为8.6。

15.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为9.0。

16.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为9.4。

17.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为9.8。

18.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为10.4。

19.根据权利要求6-18任一所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为35℃-75℃。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为40℃-70℃。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为50℃-70℃。

22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为55℃-70℃。

23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为60℃-70℃。

24.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为35℃。

25.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为40℃。

26.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为45℃。

27.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为50℃。

28.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为55℃。

29.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为60℃。

30.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为65℃。

31.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为70℃。

32.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为75℃。

33.一种生产碱性果胶酶的方法，包括如下步骤：将权利要求5所述重组菌大肠埃希氏菌BL21(DE3)PelN接种至发酵培养基，35-37℃振荡培养至OD_600nm＝0.4-0.6，然后加入IPTG至终浓度为100-200μM，28-32℃继续振荡培养40-45小时，得到碱性果胶酶。

34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨10-15g/L，酵母提取物15-24g/L，甘油8-12g/L，磷酸二氢钾10-17mmol/L，磷酸氢二钾65-75mmol/L。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其特征在于：所述大肠埃希氏菌BL21(DE3)PelN以种子液的方式接种至所述发酵培养基；接种量为1％-5％；

所述种子液的制备方法如下：将所述大肠埃希氏菌BL21(DE3)PelN接种至种子培养基，35-37℃振荡培养至OD_600nm＝6.0-8.0，即为所述种子液；

所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨10-15g/L，酵母提取物5-8g/L，氯化钠4-6g/L；所述种子培养基的pH值为7.0-7.2。