CN108396017A - 一种甘露聚糖酶的工业发酵方法 - Google Patents

一种甘露聚糖酶的工业发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，所述方法包括：步骤1：一级发酵罐发酵；步骤2：二级发酵罐发酵；步骤3：高密度发酵；步骤4：补料发酵，饥饿；步骤5：诱导、混饲。本发明甘露聚糖酶的工业发酵方法，具有放罐酶活高、发酵效率高的特点。

Description

一种甘露聚糖酶的工业发酵方法
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，具体地说，涉及一种甘露聚糖酶的工业发酵方法。
背景技术
植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖酶，即β-甘露聚糖酶为一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团。β-甘露聚糖酶(β-mannanase EC3.2.1.78)是一种水解甘露聚糖的内切水解酶，以内切方式降解甘露糖主链β-l,4糖苷键，释放出短的β-1,4甘露寡糖。
近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，能源的再生利用研究，人们对β-甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。
β-甘露聚糖酶为一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长，其主要作用有：1、消除饲料中甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高豆粕的能量消化率，能给玉米豆粕型日粮提高100-150kcal/kg的代谢能。2、甘露聚糖分解产生的甘露寡糖，可被动物肠道中的有益菌吸收，改善菌群组成，减少大肠杆菌、沙门氏菌的感染。减少肉鸡球虫病的危害，提高肉鸡均匀度。3、降低肠道粘度，促进能量、蛋白、纤维素的消化和吸收。
β-甘露聚糖酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。细菌来源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35kDa～55kDa之间，最适反应作用温度为50℃～70℃。目前研究最多的是芽孢杆菌，除嗜碱性芽孢杆菌的最适作用pH达到pH9.0以上，大多最适反应pH在5.5～8.0之间。真菌的β-甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大约在45kDa～55kDa，最适作用pH为4.0～6.0，最适作用温度为55℃～75℃。相对细菌而言，真菌来源的β-甘露聚糖酶最适反应pH值、pH稳定性都偏低，耐热性比细菌差。目前国内外，虽然许多β-甘露聚糖酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，pH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到一种新的能够满足实际应用需求的β-甘露聚糖酶，从而能够进一步推广该β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中应用。
通过基因工程手段使甘露聚糖酶基因在重组菌株中高效表达是甘露聚糖酶得以大规模廉价生产的有效途径。目前，甘露聚糖酶的生产主要依靠真菌、细菌的微生物发酵。传统的甘露聚糖酶的工业发酵存在发酵工艺陈旧，成本高而效益低等问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种甘露聚糖酶的工业发酵方法。
本发明采用的技术方案如下。
一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于所述方法包括如下步骤。
步骤1：一级发酵罐发酵
在一级发酵罐中装入一级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对一级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将发酵种子液以体积比为5-10％的接种量移种到一级发酵罐中扩大培养，向发酵罐中补加微量元素溶液，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：20-25；发酵种子液接种量为1.5-2％；一级发酵罐转速为180-200rpm；培养温度为29-32℃；当一级发酵罐中的发酵液的残糖低于3-3.5g/L或者湿重≥55-60g/L时，停止；通风量，0-6h为45-50m3/h，6h-结束为65-70m3/h；一级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。所述微量元素溶液为体积比为0.8-1.2％的PTM1的水溶液。
步骤2：二级发酵罐发酵
在二级发酵罐中装入二级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对二级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将一级发酵罐培养的菌体以体积比为10-15％的接种量移种到二级发酵罐中扩大培养，二级发酵罐培养为恒温培养，培养温度为29-32℃，二级发酵罐转速为180-200rpm，当二级发酵罐中的发酵液的湿重≥80g/L时停止；通风量，0-6h为550-650m3/h，6h-结束为850-950m3/h；所述二级发酵罐培养过程中发酵液的pH为4.5-4.6；二级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤3：高密度发酵
在高密度发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对高密度发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将二级发酵罐培养的菌体以体积比为10-13％的接种量移种到高密度发酵罐中扩大培养，高密度发酵罐培养为恒温培养，高密度发酵罐转速为120-140rpm；从发酵起始24小时内用氨水控制发酵液的pH值在4.5-4.7，直至溶解快速反弹至80％时停止；培养温度控制在29-32℃；通风量：0h-4h，1500-1600m3/h；大于4h：2200-2400m3/h；高密度发酵罐压控制在0.03-0.08Mpa；
步骤4：补料发酵
向高密度发酵罐中补加料液；
在0-2h小时内，以300-350L/h的速度流加料液；
在2-4h小时内，以500-550L/h的速度流加糖液；在4小时以后，以650-700L/h的速度流加料液；补料发酵整个过程中，当DO低于25％时，降低各时段内料液流速20％；DO低于20％时，则停止料液流加，直至溶氧回升；当发酵液的菌体湿重达到190g/L时，停止流加；
每吨料液中含有葡萄糖55-70kg、30％浓度的甘油15-20kg，NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kg、MgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH 0.3-0.6kg，其余为水。
步骤5：饥饿
停止补料后，不补加任何碳源，观察DO回升至80％，pH值回升0.2-0.3时停止。
步骤6：诱导、混饲
0-1h按40L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；1-2h按45L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；2-3h按50L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；3-5h按65L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按7:1体积比的混合液；5-7h按80L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按6:1体积比的混合液；7-9h按95L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按5:1体积比的混合液；9-11h按110L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按4:1体积比的混合液；11-13h按120L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按3:1体积比的混合液；13-19h按130L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按2:1体积比的混合液；19-22h按140L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按1:1体积比的混合液；
22h后，按145L/h的流速向高密度发酵罐中流加盐溶液和甲醇按1:4体积比的混合液并根据发酵液的吨位和溶氧量调节转速、空气流量以及混合液流速，具体为：控制溶氧在20％以上，当溶氧升至60％时，将混合液流速加大20％，如不能保持溶氧在20％以上，则停止混合液流加，直至溶氧回升；
其中盐溶液的配方为：
CuSO4·5H2O 3-3.8g、NaI0.03-0.08g、MnSO4·H2O1.5-2g、H3BO3 0.01-0.03g、Na2MoO4.2H2O0.1-0.3g、CoCl20.2-0.5g、ZnCl2 10-16g、FeSO4·7H2O30-45g、H2SO4 2.5-3g、生物素0.2-0.3g；
当直至发酵液中湿菌重达到180g/L时，流加甘油进行混饲，混饲流速为40-60L/h；诱导开始后90-110h停止混饲；甘油的浓度为10-15％。
诱导不低于160-170h后，结束发酵。
进一步，在步骤1中，所述种子液的制备包括：将毕赤酵母菌经斜面培养基培养长出毕赤酵母菌单菌落，然后接种于摇瓶中进行培养，控制摇瓶转速180-220rpm、30-32℃恒温摇床培养24-62h左右，得到摇瓶种子，湿重45-70g/L。
进一步，在步骤1中，每吨一级培养基中含有：酵母粉2-4kg、蛋白胨6-15kg、葡萄糖6-10kg、余量为水。
进一步，在步骤2中，每吨二级培养基中含有：葡萄糖160-240kg、NH4H2PO4 30-50kg、K2SO460-80kg、MgSO425-40kg、CaSO43-6kg％、KOH3-5kg，余量为水。
进一步，在步骤3中，每吨发酵培养基中含有葡萄糖55-70kg、NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kg MgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH0.3-0.6kg、蛋白胨1.0-1.5kg、酵母粉0.3-0.6kg、CuSO4·5H2O 300-380g、NaI:3-8g、MnSO4·H2O 150-200g、H3BO3 1-3g、Na2MoO4.2H2O:10-20g、CoCl2:20-35g、ZnCl2 1-1.6kg、FeSO4·7H2O3-4.5kg、H2SO4 250-300g、生物素20-30g。
进一步，在步骤5中，饥饿阶段持续时间不低于4h。
进一步，所述甘露聚糖酶的工业发酵方法还包括分离纯化从步骤6得到的发酵液的步骤，具体为：离心得粗酶液，用丙酮沉淀和离子交换层析对粗酶液进行纯化，丙酮浓度为60-63％，离子交换层析柱pH为5.2-5.4。
进一步，所述甘露聚糖酶的工业发酵方法还包括在步骤6得到的发酵液中加入甘露聚糖酶协同剂，经吸附、干燥后得到甘露聚糖酶的步骤。
进一步，所述甘露聚糖酶协同剂主要由甲酸、环糊精和淀粉组成；其中所述甲酸的质量与发酵液体积比值为0.1-0.12％；环糊精与发酵液体积比值为1.1-1.3％，淀粉与发酵液体积的比值为1.1-1.3％。
进一步，干燥的过程采用喷雾干燥，干燥的温度不超过100℃；最终得到的甘露聚糖酶酶产品水分不超过10％。
本发明的有益效果是：在原有工艺基础上将补糖完溶氧回升立即补甲醇诱导，更新为采用饥饿处理，处理时间为4-5个小时，其中要求溶氧回升至80％以上、pH回升0.5-0.6，采用此处理基于糖能够完全消耗，利于细胞更优化的进行诱导。在原有工艺基础上在诱导期间采用适宜浓度甘油(30％-40％)与甲醇进行混饲。因甘油作为碳源在细胞的生化反应循环中更有利于吸收，同时甘油的分子结构和渗透性更有利于保持细胞渗透压，从而促进细胞的代谢产酶。采取以上新培养方法后，其放罐酶活由原来平均11000u/ml，提高至目前平均酶活13000u/ml，提高发酵水平约18％。
附图说明
图1显示了现有技术方法生产的的甘露聚糖酶的湿重与酶活测试图。
图2出示了本发明实施例2所示方法生产的甘露聚糖酶的湿重与酶活测试图。
其中：系列1为酶活*100曲线，系列2为湿重曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1。一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于所述方法包括如下步骤。
步骤1：一级发酵罐发酵
在一级发酵罐中装入一级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对一级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将发酵种子液以体积比为5-10％的接种量移种到一级发酵罐中扩大培养，向发酵罐中补加微量元素溶液，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：20-25；发酵种子液接种量为1.5-2％；一级发酵罐转速为180-200rpm；培养温度为29-32℃；当一级发酵罐中的发酵液的残糖低于3-3.5g/L或者湿重≥55-60g/L时，停止；通风量，0-6h为45-50m3/h，6h-结束为65-70m3/h；一级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤2：二级发酵罐发酵
在二级发酵罐中装入二级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对二级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将一级发酵罐培养的菌体以体积比为10-15％的接种量移种到二级发酵罐中扩大培养，二级发酵罐培养为恒温培养，培养温度为29-32℃，二级发酵罐转速为180-200rpm，当二级发酵罐中的发酵液的湿重≥80g/L时停止；通风量，0-6h为550-650m3/h，6h-结束为850-950m3/h；所述二级发酵罐培养过程中发酵液的pH为4.5-4.6；二级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤3：高密度发酵
在高密度发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对高密度发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将二级发酵罐培养的菌体以体积比为10-13％的接种量移种到高密度发酵罐中扩大培养，高密度发酵罐培养为恒温培养，高密度发酵罐转速为120-140rpm；从发酵起始24小时内用氨水控制发酵液的pH值在4.5-4.7，直至溶解快速反弹至80％时停止；培养温度控制在29-32℃；通风量：0h-4h，1500-1600m3/h；大于4h：2200-2400m3/h；高密度发酵罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤4：补料发酵
向高密度发酵罐中补加料液；
在0-2h小时内，以300-350L/h的速度流加料液；每吨料液中含有葡萄糖55-70kg、30％浓度的甘油15-20kg，NH4H2PO4 5-7kg、K2SO4 10-15kg、MgSO4 4-9kg、CaSO40.8-1.5kg、KOH 0.3-0.6kg，其余为水。甘油吸收的快，初期甘油有利于吸收，不会长生糖的累积。
在2-4h小时内，以500-550L/h的速度流加糖液；在4小时以后，以650-700L/h的速度流加料液；补料发酵整个过程中，当DO低于25％时，降低各时段内料液流速20％；DO低于20％时，则停止料液流加，直至溶氧回升；当发酵液的菌体湿重达到190G/L时，停止流加。
步骤5：饥饿
停止补料后，不补加任何碳源，观察DO回升至80％，pH值回升0.2-0.3时停止。
步骤6：诱导、混饲
0-1h按40L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；1-2h按45L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；2-3h按50L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；3-5h按65L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按7:1体积比的混合液；5-7h按80L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按6:1体积比的混合液；7-9h按95L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按5:1体积比的混合液；9-11h按110L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按4:1体积比的混合液；11-13h按120L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按3:1体积比的混合液；13-19h按130L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按2:1体积比的混合液；19-22h按140L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按1:1体积比的混合液。采用这种方式，不会产生糖分累积，有利于提高产品质量。
22h后，按145L/h的流速向高密度发酵罐中流加盐溶液和甲醇按1:4体积比的混合液并根据发酵液的吨位和溶氧量调节转速、空气流量以及混合液流速，具体为：控制溶氧在20％以上，当溶氧升至60％时，将混合液流速加大20％，如不能保持溶氧在20％以上，则停止混合液流加，直至溶氧回升；
其中盐溶液的配方为：
CuSO4·5H2O 3-3.8g、NaI0.03-0.08g、MnSO4·H2O1.5-2g、H3BO3 0.01-0.03g、Na2MoO4.2H2O0.1-0.3g、CoCl20.2-0.5g、ZnCl2 10-16g、FeSO4·7H2O30-45g、H2SO4 2.5-3g、生物素0.2-0.3g。
当直至发酵液中湿菌重达到180g/L时，流加甘油进行混饲，混饲流速为40L/h；诱导开始后90h停止混饲；
诱导不低于160h后，结束发酵。
所述种子液的制备包括：将毕赤酵母菌经斜面培养基培养长出毕赤酵母菌单菌落，然后接种于摇瓶中进行培养，控制摇瓶转速180-220rpm、30-32℃恒温摇床培养24-62h左右，得到摇瓶种子，湿重45-70g/L。
所用酵母为巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。Koichi Ogata等人于1969年首次发现了某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长(Ogata,eta1.1969)，此后，用甲醇利用型酵母生产单细胞蛋白作为动物饲料的潜力就引起了广泛关注。1987年，Cregg等人首次报道了用甲醇营养型酵母表达乙型肝炎表面抗原(HbsAg随后Philip Petroleum公司与Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates(SIBIA)就开始了毕赤酵母表达***的合作开发。SIBIA.的研究人员分离了AOX基因的启动子和宿主菌株，构建了载体，并开发出了相应的毕赤酵母基因操作技术，结合PhilipPetroleum公司生产单细胞蛋白的发酵工艺，实现了外源蛋白的高效表达。1993年，PhilipPetroleum公司将毕赤酵母表达***的专利卖给Research Corporation Technologies公司，并委托Invitrogea公司进行有关产品销售。其优点有：(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；(2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90％以上,有利于目的蛋白的分离纯化；(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养；(4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(5)由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。毕赤酵母Pichia pastoris目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达***，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，已有上千种蛋白在毕赤酵母***中得到成功地表达。近些年，毕赤酵母被美国FDA认定为GRAS(Generally recognized assafe)微生物，为其在食品和医药上的应用铺平了道路。在医药蛋白领域，已有胰岛素、乙肝表面抗原、人血清白蛋白、表皮生长因子等多种蛋白使用毕赤酵母表达实现商品化制备。在工业酶制剂领域，也有许多酶制剂包括甘露聚糖酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等利用毕赤酵母实现了产业化规模的生产。
在步骤1中，每吨一级培养基中含有：酵母粉2-4kg、蛋白胨6-15kg、葡萄糖6-10kg、余量为水。
在步骤2中，每吨二级培养基中含有：葡萄糖160-240kg、NH4H2PO4 30-50kg、K2SO460-80kg、MgSO425-40kg、CaSO43-6kg％、KOH3-5kg，余量为水。
在步骤3中，每吨发酵培养基中含有葡萄糖55-70kg、NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kg MgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH0.3-0.6kg、蛋白胨1.0-1.5kg、酵母粉0.3-0.6kg、CuSO4·5H2O 300-380g、NaI:3-8g、MnSO4·H2O 150-200g、H3BO3 1-3g、Na2MoO4.2H2O:10-20g、CoCl2:20-35g、ZnCl2 1-1.6kg、FeSO4·7H2O3-4.5kg、H2SO4 250-300g、生物素20-30g。
在步骤5中，饥饿阶段持续时间不低于4h；在步骤6中，甘油的浓度为10-15％。
所述甘露聚糖酶的工业发酵方法还包括分离纯化从步骤6得到的发酵液的步骤，具体为：离心得粗酶液，用丙酮沉淀和离子交换层析对粗酶液进行纯化，丙酮浓度为60-63％，离子交换层析柱pH为5.2-5.4。
实施例2。一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于所述方法包括如下步骤。
步骤1：一级发酵罐发酵
在一级发酵罐中装入一级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对一级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将发酵种子液以体积比为5-10％的接种量移种到一级发酵罐中扩大培养，向发酵罐中补加微量元素溶液，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：20-25；发酵种子液接种量为1.5-2％；一级发酵罐转速为180-200rpm；培养温度为29-32℃；当一级发酵罐中的发酵液的残糖低于3-3.5g/L或者湿重≥55-60g/L时，停止；通风量，0-6h为45-50m3/h，6h-结束为65-70m3/h；一级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。毕赤酵母本身并不产酶，是通过基因工程手段将不同产酶基因转移至酵母基因中，因此同样的酵母会产不同的酶种。
步骤2：二级发酵罐发酵
在二级发酵罐中装入二级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对二级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将一级发酵罐培养的菌体以体积比为10-15％的接种量移种到二级发酵罐中扩大培养，二级发酵罐培养为恒温培养，培养温度为29-32℃，二级发酵罐转速为180-200rpm，当二级发酵罐中的发酵液的湿重≥80g/L时停止；通风量，0-6h为550-650m3/h，6h-结束为850-950m3/h；所述二级发酵罐培养过程中发酵液的pH为4.5-4.6；二级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤3：高密度发酵
在高密度发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对高密度发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将二级发酵罐培养的菌体以体积比为10-13％的接种量移种到高密度发酵罐中扩大培养，高密度发酵罐培养为恒温培养，高密度发酵罐转速为120-140rpm；从发酵起始24小时内用氨水控制发酵液的pH值在4.5-4.7，直至溶解快速反弹至80％时停止；培养温度控制在29-32℃；通风量：0h-4h，1500-1600m3/h；大于4h：2200-2400m3/h；高密度发酵罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤4：补料发酵
向高密度发酵罐中补加料液；
在0-2h小时内，以300-350L/h的速度流加料液；
在2-4h小时内，以500-550L/h的速度流加糖液；在4小时以后，以650-700L/h的速度流加料液；补料发酵整个过程中，当DO低于25％时，降低各时段内料液流速20％；DO低于20％时，则停止料液流加，直至溶氧回升；当发酵液的菌体湿重达到190G/L时，停止流加；
每吨料液中含有葡萄糖55-70kg、30％浓度的甘油15-20kg，NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kg、MgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH 0.3-0.6kg，其余为水。
步骤5：饥饿
停止补料后，不补加任何碳源，观察DO回升至80％，pH值回升0.2-0.3时停止。
步骤6：诱导、混饲
0-1h按40L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；1-2h按45L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；2-3h按50L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；3-5h按65L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按7:1体积比的混合液；5-7h按80L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按6:1体积比的混合液；7-9h按95L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按5:1体积比的混合液；9-11h按110L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按4:1体积比的混合液；11-13h按120L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按3:1体积比的混合液；13-19h按130L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按2:1体积比的混合液；19-22h按140L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按1:1体积比的混合液。
22h后，按145L/h的流速向高密度发酵罐中流加盐溶液和甲醇按1:4体积比的混合液并根据发酵液的吨位和溶氧量调节转速、空气流量以及混合液流速，具体为：控制溶氧在20％以上，当溶氧升至60％时，将混合液流速加大20％，如不能保持溶氧在20％以上，则停止混合液流加，直至溶氧回升；发酵液吨位和甲醇添加量是呈正比例的关系，可以通过实践加以摸索固定。
其中盐溶液的配方为：
CuSO4·5H2O 3-3.8g、NaI0.03-0.08g、MnSO4·H2O1.5-2g、H3BO3 0.01-0.03g、Na2MoO4.2H2O0.1-0.3g、CoCl20.2-0.5g、ZnCl2 10-16g、FeSO4·7H2O30-45g、H2SO4 2.5-3g、生物素0.2-0.3g。
当直至发酵液中湿菌重达到180g/L时，流加甘油进行混饲，混饲流速为60L/h；诱导开始后110h停止混饲；
诱导不低于170h后，结束发酵。
所述种子液的制备包括：将毕赤酵母菌经斜面培养基培养长出毕赤酵母菌单菌落，然后接种于摇瓶中进行培养，控制摇瓶转速180-220rpm、30-32℃恒温摇床培养24-62h左右，得到摇瓶种子，湿重45-70g/L。
在步骤1中，每吨一级培养基中含有：酵母粉2-4kg、蛋白胨6-15kg、葡萄糖6-10kg、余量为水。
在步骤2中，每吨二级培养基中含有：葡萄糖160-240kg、NH4H2PO4 30-50kg、K2SO460-80kg、MgSO425-40kg、CaSO43-6kg％、KOH3-5kg，余量为水。
在步骤3中，每吨发酵培养基中含有葡萄糖55-70kg、NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kgMgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH0.3-0.6kg、蛋白胨1.0-1.5kg、酵母粉0.3-0.6kg、CuSO4·5H2O 300-380g、NaI:3-8g、MnSO4·H2O 150-200g、H3BO3 1-3g、Na2MoO4.2H2O:10-20g、CoCl2:20-35g、ZnCl2 1-1.6kg、FeSO4·7H2O3-4.5kg、H2SO4 250-300g、生物素20-30g。
在步骤5中，饥饿阶段持续时间不低于4h；在步骤6中，甘油的浓度为10-15％。
所述甘露聚糖酶的工业发酵方法还包括在步骤6得到的发酵液中加入甘露聚糖酶协同剂，经吸附、干燥后得到甘露聚糖酶的步骤。
所述甘露聚糖酶协同剂主要由甲酸、环糊精和淀粉组成；其中所述甲酸的质量与发酵液体积比值为0.1-0.12％；环糊精与发酵液体积比值为1.1-1.3％，淀粉与发酵液体积的比值为1.1-1.3％。
干燥的过程采用喷雾干燥，干燥的温度不超过100℃；最终得到的甘露聚糖酶酶产品水分不超过10％。
实施例3。一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于所述方法包括如下步骤。
步骤1：一级发酵罐发酵
在一级发酵罐中装入一级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对一级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将发酵种子液以体积比为5-10％的接种量移种到一级发酵罐中扩大培养，向发酵罐中补加微量元素溶液，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：20-25；发酵种子液接种量为1.5-2％；一级发酵罐转速为180-200rpm；培养温度为29-32℃；当一级发酵罐中的发酵液的残糖低于3-3.5g/L或者湿重≥55-60g/L时，停止；通风量，0-6h为45-50m3/h，6h-结束为65-70m3/h；一级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤2：二级发酵罐发酵
在二级发酵罐中装入二级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对二级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将一级发酵罐培养的菌体以体积比为10-15％的接种量移种到二级发酵罐中扩大培养，二级发酵罐培养为恒温培养，培养温度为29-32℃，二级发酵罐转速为180-200rpm，当二级发酵罐中的发酵液的湿重≥80g/L时停止；通风量，0-6h为550-650m3/h，6h-结束为850-950m3/h；所述二级发酵罐培养过程中发酵液的pH为4.5-4.6；二级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤3：高密度发酵
在高密度发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对高密度发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将二级发酵罐培养的菌体以体积比为10-13％的接种量移种到高密度发酵罐中扩大培养，高密度发酵罐培养为恒温培养，高密度发酵罐转速为120-140rpm；从发酵起始24小时内用氨水控制发酵液的pH值在4.5-4.7，直至溶解快速反弹至80％时停止；培养温度控制在29-32℃；通风量：0h-4h，1500-1600m3/h；大于4h：2200-2400m3/h；高密度发酵罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤4：补料发酵
向高密度发酵罐中补加料液；
在0-2h小时内，以300-350L/h的速度流加料液；
在2-4h小时内，以500-550L/h的速度流加糖液；在4小时以后，以650-700L/h的速度流加料液；补料发酵整个过程中，当DO低于25％时，降低各时段内料液流速20％；DO低于20％时，则停止料液流加，直至溶氧回升；当发酵液的菌体湿重达到190G/L时，停止流加；
每吨料液中含有葡萄糖55-70kg、30％浓度的甘油15-20kg，NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kg、MgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH 0.3-0.6kg，其余为水。
步骤5：饥饿
停止补料后，不补加任何碳源，观察DO回升至80％，pH值回升0.2-0.3时停止。
步骤6：诱导、混饲
0-1h按40L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；1-2h按45L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；2-3h按50L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；3-5h按65L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按7:1体积比的混合液；5-7h按80L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按6:1体积比的混合液；7-9h按95L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按5:1体积比的混合液；9-11h按110L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按4:1体积比的混合液；11-13h按120L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按3:1体积比的混合液；13-19h按130L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按2:1体积比的混合液；19-22h按140L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按1:1体积比的混合液。
22h后，按145L/h的流速向高密度发酵罐中流加盐溶液和甲醇按1:4体积比的混合液并根据发酵液的吨位和溶氧量调节转速、空气流量以及混合液流速，具体为：控制溶氧在20％以上，当溶氧升至60％时，将混合液流速加大20％，如不能保持溶氧在20％以上，则停止混合液流加，直至溶氧回升；吨位和融氧量成正比，溶氧量与转速、空气流量以及混合液流速成正比。
其中盐溶液的配方为：
CuSO4·5H2O 3-3.8g、NaI0.03-0.08g、MnSO4·H2O1.5-2g、H3BO3 0.01-0.03g、Na2MoO4.2H2O0.1-0.3g、CoCl20.2-0.5g、ZnCl2 10-16g、FeSO4·7H2O30-45g、H2SO4 2.5-3g、生物素0.2-0.3g；
当直至发酵液中湿菌重达到180g/L时，流加甘油进行混饲，混饲流速为40-60L/h；诱导开始后100h停止混饲；
诱导不低于160-170h后，结束发酵。
所述种子液的制备包括：将毕赤酵母菌经斜面培养基培养长出毕赤酵母菌单菌落，然后接种于摇瓶中进行培养，控制摇瓶转速180-220rpm、30-32℃恒温摇床培养24-62h左右，得到摇瓶种子，湿重45-70g/L。
在步骤1中，每吨一级培养基中含有：酵母粉2-4kg、蛋白胨6-15kg、葡萄糖6-10kg、余量为水。
在步骤2中，每吨二级培养基中含有：葡萄糖160-240kg、NH4H2PO4 30-50kg、K2SO460-80kg、MgSO425-40kg、CaSO43-6kg％、KOH3-5kg，余量为水。
在步骤3中，每吨发酵培养基中含有葡萄糖55-70kg、NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kgMgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH0.3-0.6kg、蛋白胨1.0-1.5kg、酵母粉0.3-0.6kg、CuSO4·5H2O 300-380g、NaI:3-8g、MnSO4·H2O 150-200g、H3BO3 1-3g、Na2MoO4.2H2O:10-20g、CoCl2:20-35g、ZnCl2 1-1.6kg、FeSO4·7H2O3-4.5kg、H2SO4 250-300g、生物素20-30g。
在步骤5中，饥饿阶段持续时间不低于4h；在步骤6中，甘油的浓度为10-15％。
所述甘露聚糖酶的工业发酵方法还包括分离纯化从步骤6得到的发酵液的步骤，具体为：离心得粗酶液，用丙酮沉淀和离子交换层析对粗酶液进行纯化，丙酮浓度为60-63％，离子交换层析柱pH为5.2-5.4。毕赤酵母本身并不产酶，是通过基因工程手段将不同产酶基因转移至酵母基因中，因此同样的酵母会产不同的酶种。
实施例4。一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于所述方法包括如下步骤。
步骤1：一级发酵罐发酵
在一级发酵罐中装入一级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对一级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将发酵种子液以体积比为5-10％的接种量移种到一级发酵罐中扩大培养，向发酵罐中补加微量元素溶液，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：20-25；发酵种子液接种量为1.5-2％；一级发酵罐转速为180-200rpm；培养温度为29-32℃；当一级发酵罐中的发酵液的残糖低于3-3.5g/L或者湿重≥55-60g/L时，停止；通风量，0-6h为45-50m3/h，6h-结束为65-70m3/h；一级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤2：二级发酵罐发酵
在二级发酵罐中装入二级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对二级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将一级发酵罐培养的菌体以体积比为10-15％的接种量移种到二级发酵罐中扩大培养，二级发酵罐培养为恒温培养，培养温度为29-32℃，二级发酵罐转速为180-200rpm，当二级发酵罐中的发酵液的湿重≥80g/L时停止；通风量，0-6h为550-650m3/h，6h-结束为850-950m3/h；所述二级发酵罐培养过程中发酵液的pH为4.5-4.6；二级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤3：高密度发酵
在高密度发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对高密度发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将二级发酵罐培养的菌体以体积比为10-13％的接种量移种到高密度发酵罐中扩大培养，高密度发酵罐培养为恒温培养，高密度发酵罐转速为120-140rpm；从发酵起始24小时内用氨水控制发酵液的pH值在4.5-4.7，直至溶解快速反弹至80％时停止；培养温度控制在29-32℃；通风量：0h-4h，1500-1600m3/h；大于4h：2200-2400m3/h；高密度发酵罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤4：补料发酵
向高密度发酵罐中补加料液；
在0-2h小时内，以300-350L/h的速度流加料液；
在2-4h小时内，以500-550L/h的速度流加糖液；在4小时以后，以650-700L/h的速度流加料液；补料发酵整个过程中，当DO低于25％时，降低各时段内料液流速20％；DO低于20％时，则停止料液流加，直至溶氧回升；当发酵液的菌体湿重达到190G/L时，停止流加；
每吨料液中含有葡萄糖55-70kg、30％浓度的甘油15-20kg，NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kg、MgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH 0.3-0.6kg，其余为水。
步骤5：饥饿
停止补料后，不补加任何碳源，观察DO回升至80％，pH值回升0.2-0.3时停止。
步骤6：诱导、混饲
0-1h按40L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；1-2h按45L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；2-3h按50L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；3-5h按65L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按7:1体积比的混合液；5-7h按80L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按6:1体积比的混合液；7-9h按95L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按5:1体积比的混合液；9-11h按110L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按4:1体积比的混合液；11-13h按120L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按3:1体积比的混合液；13-19h按130L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按2:1体积比的混合液；19-22h按140L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按1:1体积比的混合液。
22h后，按145L/h的流速向高密度发酵罐中流加盐溶液和甲醇按1:4体积比的混合液并根据发酵液的吨位和溶氧量调节转速、空气流量以及混合液流速，具体为：控制溶氧在20％以上，当溶氧升至60％时，将混合液流速加大20％，如不能保持溶氧在20％以上，则停止混合液流加，直至溶氧回升.
其中盐溶液的配方为：
CuSO4·5H2O 3-3.8g、NaI0.03-0.08g、MnSO4·H2O1.5-2g、H3BO3 0.01-0.03g、Na2MoO4.2H2O0.1-0.3g、CoCl20.2-0.5g、ZnCl2 10-16g、FeSO4·7H2O30-45g、H2SO4 2.5-3g、生物素0.2-0.3g；
当直至发酵液中湿菌重达到180g/L时，流加甘油进行混饲，混饲流速为40-60L/h；诱导开始后90-110h停止混饲；
诱导不低于160-170h后，结束发酵。
所述种子液的制备包括：将毕赤酵母菌经斜面培养基培养长出毕赤酵母菌单菌落，然后接种于摇瓶中进行培养，控制摇瓶转速180-220rpm、30-32℃恒温摇床培养24-62h左右，得到摇瓶种子，湿重45-70g/L。
在步骤1中，每吨一级培养基中含有：酵母粉2-4kg、蛋白胨6-15kg、葡萄糖6-10kg、余量为水。
在步骤2中，每吨二级培养基中含有：葡萄糖160-240kg、NH4H2PO4 30-50kg、K2SO460-80kg、MgSO425-40kg、CaSO43-6kg％、KOH3-5kg，余量为水。
在步骤3中，每吨发酵培养基中含有葡萄糖55-70kg、NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kgMgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH0.3-0.6kg、蛋白胨1.0-1.5kg、酵母粉0.3-0.6kg、CuSO4·5H2O 300-380g、NaI:3-8g、MnSO4·H2O 150-200g、H3BO3 1-3g、Na2MoO4.2H2O:10-20g、CoCl2:20-35g、ZnCl2 1-1.6kg、FeSO4·7H2O3-4.5kg、H2SO4 250-300g、生物素20-30g。
在步骤5中，饥饿阶段持续时间不低于4h；在步骤6中，甘油的浓度为10-15％。
所述甘露聚糖酶的工业发酵方法还包括在步骤6得到的发酵液中加入甘露聚糖酶协同剂，经吸附、干燥后得到甘露聚糖酶的步骤。
所述甘露聚糖酶协同剂主要由甲酸、乙酸、环糊精和淀粉组成；其中所述甲酸的质量与发酵液体积比值为0.05-0.0.06％；其中所述甲酸的质量与发酵液体积比值为0.05-0.06％；环糊精与发酵液体积比值为1.1-1.3％，淀粉与发酵液体积的比值为1.1-1.3％。
干燥的过程采用喷雾干燥，干燥的温度不超过100℃；最终得到的甘露聚糖酶酶产品水分不超过10％。
实施例5。一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于所述方法包括如下步骤。
步骤1：一级发酵罐发酵
在一级发酵罐中装入一级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对一级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将发酵种子液以体积比为5-10％的接种量移种到一级发酵罐中扩大培养，向发酵罐中补加微量元素溶液，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：20-25；发酵种子液接种量为1.5-2％；一级发酵罐转速为180-200rpm；培养温度为29-32℃；当一级发酵罐中的发酵液的残糖低于3-3.5g/L或者湿重≥55-60g/L时，停止；通风量，0-6h为45-50m3/h，6h-结束为65-70m3/h；一级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤2：二级发酵罐发酵
在二级发酵罐中装入二级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对二级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将一级发酵罐培养的菌体以体积比为10-15％的接种量移种到二级发酵罐中扩大培养，二级发酵罐培养为恒温培养，培养温度为29-32℃，二级发酵罐转速为180-200rpm，当二级发酵罐中的发酵液的湿重≥80g/L时停止；通风量，0-6h为550-650m3/h，6h-结束为850-950m3/h；所述二级发酵罐培养过程中发酵液的pH为4.5-4.6；二级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤3：高密度发酵
在高密度发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对高密度发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将二级发酵罐培养的菌体以体积比为10-13％的接种量移种到高密度发酵罐中扩大培养，高密度发酵罐培养为恒温培养，高密度发酵罐转速为120-140rpm；从发酵起始24小时内用氨水控制发酵液的pH值在4.5-4.7，直至溶解快速反弹至80％时停止；培养温度控制在29-32℃；通风量：0h-4h，1500-1600m3/h；大于4h：2200-2400m3/h；高密度发酵罐压控制在0.03-0.08Mpa。
步骤4：补料发酵
向高密度发酵罐中补加料液；
在0-2h小时内，以300-350L/h的速度流加料液；
在2-4h小时内，以500-550L/h的速度流加糖液；在4小时以后，以650-700L/h的速度流加料液；补料发酵整个过程中，当DO低于25％时，降低各时段内料液流速20％；DO低于20％时，则停止料液流加，直至溶氧回升；当发酵液的菌体湿重达到190G/L时，停止流加；
每吨料液中含有葡萄糖55-70kg、30％浓度的甘油15-20kg，NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kg、MgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH 0.3-0.6kg，其余为水。
步骤5：饥饿
停止补料后，不补加任何碳源，观察DO回升至80％，pH值回升0.2-0.3个时停止。
步骤6：诱导、混饲
0-1h按40L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；1-2h按45L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；2-3h按50L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；3-5h按65L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按7:1体积比的混合液；5-7h按80L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按6:1体积比的混合液；7-9h按95L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按5:1体积比的混合液；9-11h按110L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按4:1体积比的混合液；11-13h按120L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按3:1体积比的混合液；13-19h按130L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按2:1体积比的混合液；19-22h按140L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按1:1体积比的混合液；
22h后，按145L/h的流速向高密度发酵罐中流加盐溶液和甲醇按1:4体积比的混合液并根据发酵液的吨位和溶氧量调节转速、空气流量以及混合液流速，具体为：控制溶氧在20％以上，当溶氧升至60％时，将混合液流速加大20％，如不能保持溶氧在20％以上，则停止混合液流加，直至溶氧回升；
其中盐溶液的配方为：
CuSO4·5H2O 3-3.8g、NaI0.03-0.08g、MnSO4·H2O1.5-2g、H3BO3 0.01-0.03g、Na2MoO4.2H2O0.1-0.3g、CoCl20.2-0.5g、ZnCl2 10-16g、FeSO4·7H2O30-45g、H2SO4 2.5-3g、生物素0.2-0.3g；
当直至发酵液中湿菌重达到180g/L时，流加甘油进行混饲，混饲流速为60L/h；诱导开始后110h停止混饲；
诱导不低于160-170h后，结束发酵。
所述种子液的制备包括：将毕赤酵母菌经斜面培养基培养长出毕赤酵母菌单菌落，然后接种于摇瓶中进行培养，控制摇瓶转速180-220rpm、30-32℃恒温摇床培养24-62h左右，得到摇瓶种子，湿重45-70g/L。
在步骤1中，每吨一级培养基中含有：酵母粉2-4kg、蛋白胨6-15kg、葡萄糖6-10kg、余量为水。
在步骤2中，每吨二级培养基中含有：葡萄糖160-240kg、NH4H2PO4 30-50kg、K2SO460-80kg、MgSO425-40kg、CaSO43-6kg％、KOH3-5kg，余量为水。
在步骤3中，每吨发酵培养基中含有葡萄糖55-70kg、NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kgMgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH0.3-0.6kg、蛋白胨1.0-1.5kg、酵母粉0.3-0.6kg、CuSO4·5H2O 300-380g、NaI:3-8g、MnSO4·H2O 150-200g、H3BO3 1-3g、Na2MoO4.2H2O:10-20g、CoCl2:20-35g、ZnCl2 1-1.6kg、FeSO4·7H2O3-4.5kg、H2SO4 250-300g、生物素20-30g。
在步骤5中，饥饿阶段持续时间不低于4h；在步骤6中，甘油的浓度为10-15％。
所述甘露聚糖酶的工业发酵方法还包括分离纯化从步骤6得到的发酵液的步骤，具体为：离心得粗酶液，用丙酮沉淀和离子交换层析对粗酶液进行纯化，丙酮浓度为60-63％，离子交换层析柱pH为5.2-5.4。
试验例1。为验证本发明补料发酵效果，通过实施例2补糖与现有技术中补糖(单纯施加葡萄糖且补糖速度增加块)进行对比，结果如下表。
可见本发明实施例2通过改变补糖量和补糖速率，明显提高了湿重。
验证本发明甲醇、甘油混饲诱导效果，通过实施例2甲醇、甘油混饲诱导与现有技术中甲醇诱导进行对比，结果如下表。
甲醇、甘油混饲诱导与现有技术单纯甲醇诱导的参数对比
注：混饲工艺采用25％的甘油，混饲过程流量为20～25L/h。
可见本发明实施例2明显提高了诱导湿重。
试验例2。平均放罐酶活检测。
发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD600nm以及菌体湿重，取上清液进行甘露聚糖酶活性检测。放罐离心及酶活检测：诱导、混饲结束后放罐，4℃条件下以5000rpm离心30min收集上清液。
按照中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2009》进行。甘露聚糖酶活性定义是指在37℃pH值5.50的条件下，每min从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个甘露聚糖酶活性单位，以U表示。
X＝ym×t×n]]>
X—试样中甘露聚糖酶的活性，单位为酶活性单位每克(U/g)或酶活性单位单位每毫升(U/mL)；y—根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的无机磷的量，单位为微摩尔；t—酶解反应时间，单位为min；n—试样的稀释倍数；m—试样的量，单位为克或毫升。
取50μL稀释酶液加底物4mmol/L植酸钠950μL(用0.1mol/L pH5.5的醋酸缓冲液配制)，37℃反应30min，加1mL 10％TCA终止反应，加2mL显色液(10g四水合钼酸铵+32mL硫酸+73.2g硫酸亚铁，加水定容至1L)，对反应液进行显色。对照则加酶液后先加TCA混匀，再加底物。显色10min后，在700nm下测其OD值，计算酶活。
为验证本发明实验效果，采用现有技术的二级发酵罐发酵、流加葡萄糖、饥饿、甲醇诱导工艺生产甘露聚糖酶，与本发明对比结果如下。
放罐酶活
实施例1 12900U/mL
实施例2 13000U/mL
实施例3 13500U/mL
实施例4 13200U/mL
实施例5 12950U/mL
传统方法 11000U/mL
图1显示了现有技术采用两级发酵、补糖发酵、饥饿和甲醇诱导后的甘露聚糖酶的湿重与酶活测试图。图2出示了本发明实施例2所示方法生产的甘露聚糖酶的湿重与酶活测试图。可以看出，相同周期条件下，经过调整的酶活增长速率较快，采取以上新培养方法后，其放罐酶活由原来平均11000u/ml，提高至目前平均酶活13000u/ml，提高发酵水平约18％。
试验例3。试验选择平均体重为8.48kg的健康乳猪360头，经统计分析体重差异不显著。随机分成6组(5个试验组和1个对照组)，每组6个重复，每个重复10头。对照组日粮为基础日粮，试验组1、3、5日粮中分别添加实施例1、3、5制得的甘露聚糖酶，试验组,2、4日粮中分别添加实施例2、4制得的甘露聚糖酶，实验组添加的甘露聚糖酶总量相同，仔猪自由采食和饮水，按常规进行免疫和驱虫，试验期内每天观察并记录仔猪的腹泻情况，试验期共30天。试验结束后计算乳猪日增重和料肉比。
试验结果表明，与对照组相比，本发明产品能有效提高乳猪的生长性能，尤具有非常明显的优势，说明本发明产品对提高乳猪养殖效益具有很大帮助。

Claims (10)

1.一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1：一级发酵罐发酵
在一级发酵罐中装入一级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对一级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将毕赤酵母发酵种子液以体积比为5-10％的接种量移种到一级发酵罐中扩大培养，向发酵罐中补加微量元素溶液，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：20-25；发酵种子液接种量为1.5-2％；一级发酵罐转速为180-200rpm；培养温度为29-32℃；当一级发酵罐中的发酵液的残糖低于3-3.5g/L或者湿重≥55-60g/L时，停止；通风量，0-6h为45-50m3/h，6h-结束为65-70m3/h；一级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa；
步骤2：二级发酵罐发酵
在二级发酵罐中装入二级发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对二级发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将一级发酵罐培养的菌体以体积比为10-15％的接种量移种到二级发酵罐中扩大培养，二级发酵罐培养为恒温培养，培养温度为29-32℃，二级发酵罐转速为180-200rpm，当二级发酵罐中的发酵液的湿重≥80g/L时停止；通风量，0-6h为550-650m3/h，6h-结束为850-950m3/h；所述二级发酵罐培养过程中发酵液的pH为4.5-4.6；二级发酵罐罐压控制在0.03-0.08Mpa；
步骤3：高密度发酵
在高密度发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为6000-8500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌25-40min；灭菌结束后，对高密度发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至29-32℃时，将二级发酵罐培养的菌体以体积比为10-13％的接种量移种到高密度发酵罐中扩大培养，高密度发酵罐培养为恒温培养，高密度发酵罐转速为120-140rpm；从发酵起始24小时内用氨水控制发酵液的pH值在4.5-4.7，直至溶解快速反弹至80％时停止；培养温度控制在29-32℃；通风量：0h-4h，1500-1600m3/h；大于4h：2200-2400m3/h；高密度发酵罐压控制在0.03-0.08Mpa；
步骤4：补料发酵
向高密度发酵罐中补加料液；
在0-2h小时内，以300-350L/h的速度流加料液；
在2-4h小时内，以500-550L/h的速度流加糖液；在4小时以后，以650-700L/h的速度流加料液；补料发酵整个过程中，当DO低于25％时，降低各时段内料液流速20％；DO低于20％时，则停止料液流加，直至溶氧回升；当发酵液的菌体湿重达到190g/L时，停止流加；
每吨料液中含有葡萄糖55-70kg、30％浓度的甘油15-20kg，NH4H2PO4 5-7kg、K2SO4 10-15kg、MgSO4 4-9kg、CaSO4 0.8-1.5kg、KOH 0.3-0.6kg，其余为水；
步骤5：饥饿
停止补料后，不补加任何碳源，观察DO回升至80％，pH值回升0.2-0.3时停止；
步骤6：诱导、混饲
0-1h按40L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；1-2h按45L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；2-3h按50L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按8:1体积比的混合液；3-5h按65L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按7:1体积比的混合液；5-7h按80L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按6:1体积比的混合液；7-9h按95L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按5:1体积比的混合液；9-11h按110L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按4:1体积比的混合液；11-13h按120L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按3:1体积比的混合液；13-19h按130L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按2:1体积比的混合液；19-22h按140L/h的流速向高密度发酵罐中流加质量百分浓度50％的葡萄糖溶液和甲醇按1:1体积比的混合液；
22h后，按145L/h的流速向高密度发酵罐中流加盐溶液和甲醇按1:4体积比的混合液并根据发酵液的吨位和溶氧量调节转速、空气流量以及混合液流速，具体为：控制溶氧在20％以上，当溶氧升至60％时，将混合液流速加大20％，如不能保持溶氧在20％以上，则停止混合液流加，直至溶氧回升；
其中盐溶液的配方为：
CuSO4·5H2O 3-3.8g、NaI0.03-0.08g、MnSO4·H2O1.5-2g、H3BO3 0.01-0.03g、Na2MoO4.2H2O 0.1-0.3g、CoCl20.2-0.5g、ZnCl2 10-16g、FeSO4·7H2O30-45g、H2SO4 2.5-3g、生物素0.2-0.3g；当直至发酵液中湿菌重达到180g/L时，流加甘油进行混饲，混饲流速为40-60L/h；诱导开始后90-110h停止混饲；甘油的浓度为10-15％；
诱导不低于160-170h后，结束发酵。
2.如权利要求1所述的一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于：在步骤1中，所述种子液的制备包括：将毕赤酵母菌经斜面培养基培养长出毕赤酵母菌单菌落，然后接种于摇瓶中进行培养，控制摇瓶转速180-220rpm、30-32℃恒温摇床培养24-62h左右，得到摇瓶种子，湿重45-70g/L。
3.如权利要求1所述的一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于：在步骤1中，每吨一级培养基中含有：酵母粉2-4kg、蛋白胨6-15kg、葡萄糖6-10kg、余量为水。
4.如权利要求1所述的一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于：在步骤2中，每吨二级培养基中含有：葡萄糖160-240kg、NH4H2PO4 30-50kg、K2SO460-80kg、MgSO425-40kg、CaSO43-6kg％、KOH3-5kg，余量为水。
5.如权利要求1所述的一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于：在步骤3中，每吨发酵培养基中含有葡萄糖55-70kg、NH4H2PO4 5-7kg、K2SO410-15kg MgSO4 4-9kg、CaSO40.8-1.5kg、KOH0.3-0.6kg、蛋白胨1.0-1.5kg、酵母粉0.3-0.6kg、CuSO4·5H2O 300-380g、NaI3-8g、MnSO4·H2O 150-200g、H3BO3 1-3g、Na2MoO4.2H2O10-20g、CoCl220-35g、ZnCl2 1-1.6kg、FeSO4·7H2O3-4.5kg、H2SO4 250-300g、生物素20-30g。
6.如权利要求1所述的一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于：在步骤5中，饥饿阶段持续时间不低于4h。
7.如权利要求1所述的一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于：所述甘露聚糖酶的工业发酵方法还包括分离纯化从步骤6得到的发酵液的步骤，具体为：离心得粗酶液，用丙酮沉淀和离子交换层析对粗酶液进行纯化，丙酮浓度为60-63％，离子交换层析柱pH为5.2-5.4。
8.如权利要求1所述的一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于：所述甘露聚糖酶的工业发酵方法还包括在步骤6得到的发酵液中加入甘露聚糖酶协同剂，经吸附、干燥后得到甘露聚糖酶的步骤。
9.如权利要求8所述的一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于：所述甘露聚糖酶协同剂主要由甲酸、环糊精和淀粉组成；其中所述甲酸的质量与发酵液体积比值为0.1-0.12％；环糊精与发酵液体积比值为1.1-1.3％，淀粉与发酵液体积的比值为1.1-1.3％。
10.如权利要求8所述的一种甘露聚糖酶的工业发酵方法，其特征在于：干燥的过程采用喷雾干燥，干燥的温度不超过100℃；最终得到的甘露聚糖酶酶产品水分不超过10％。
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