CN101550422B - 一种β-甘露聚糖酶编码基因及其应用 - Google Patents

一种β-甘露聚糖酶编码基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β-甘露聚糖酶编码基因。该基因为如下1)-4)中任一所述的基因：1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第7-1020位脱氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码β-甘露聚糖酶的DNA分子；4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码β-甘露聚糖酶的DNA分子。本发明通过将上述β-甘露聚糖酶编码基因转入毕赤酵母中，从而能高效生产β-甘露聚糖酶。结果表明，10升发酵罐中β-甘露聚糖酶的平均酶活达到2100U/mL，该β-甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃，最适催化pH为6.0，适合作为猪、鸡等单胃动物的饲料添加剂使用。

Description

一种β-甘露聚糖酶编码基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种β-甘露聚糖酶编码基因及其应用。
背景技术
甘露聚糖是一种重要的植物半纤维素，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，具有高吸水性。饲料中所含的甘露聚糖在单胃动物的消化道内大量吸水，使食糜的粘度增加，从而对胃肠的蠕动产生抵抗作用，直接影响了动物对营养物质的消化和吸收。近年来，随着豆类产品(豆粕等)在饲粮中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养问题也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶和脱乙酰酶的协同作用，其中β-甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。
发明内容
本发明的目的是提供一种β-甘露聚糖酶编码基因。
本发明所提供的β-甘露聚糖酶编码基因可为如下1)-4)中任一所述的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第7-1020位脱氧核糖核苷酸；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；
3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码β-甘露聚糖酶的DNA分子；
4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码β-甘露聚糖酶的DNA分子。
序列表中的序列1由1026个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第7-1020位碱基，编码β-甘露聚糖酶。
所述β-甘露聚糖酶的氨基酸序列如GenBank Accession No.ACH41133.1所示。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
扩增上述β-甘露聚糖酶编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述β-甘露聚糖酶编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为在毕赤酵母表达载体pPICzαA的多克隆位点间***上述β-甘露聚糖酶编码基因得到的重组载体，如pPIC-mann。
所述重组菌具体可为在毕赤酵母X-33中导入含有上述β-甘露聚糖酶编码基因的重组表达载体得到的重组菌。
本发明的第三个目的是提供一种制备β-甘露聚糖酶的方法。
本发明所提供的制备β-甘露聚糖酶的方法，是发酵培养上述含有β-甘露聚糖酶编码基因的重组菌，得到β-甘露聚糖酶。
上述重组菌可用于制备猪、鸡等单胃动物的饲料添加剂，以提高饲料的利用率。
本发明通过基因工程技术，利用枯草芽孢杆菌MA139的β-甘露聚糖酶的氨基酸序列(GenBank Accession No.ACH41133.1)和毕赤酵母的密码子偏好性，合成了一个β-甘露聚糖酶编码基因，并将其转入毕赤酵母中，从而能高效生产β-甘露聚糖酶。发酵实验结果表明，利用本发明方法生产β-甘露聚糖酶，10升发酵罐中β-甘露聚糖酶的平均酶活达到2100U/mL，该β-甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃，最适催化pH为6.0，适合作为猪、鸡等单胃动物的饲料添加剂使用。
附图说明
图1为重组菌发酵过程曲线
图2为β-甘露聚糖酶的最适催化温度
图3为β-甘露聚糖酶的最适催化pH值
图4为重组菌的SDS-PAGE结果
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、β-甘露聚糖酶编码基因的获得
根据已报道的枯草芽孢杆菌MA139的β-甘露聚糖酶的氨基酸序列(GenBankAccession No.ACH41133.1)和毕赤酵母的密码子偏好性，优化设计了β-甘露聚糖酶的编码基因序列，在该序列的5′末端和3′末端分别添加限制性内切酶EcoRI和XbaI的酶切位点，人工合成β-甘露聚糖酶的编码基因序列。合成的β-甘露聚糖酶编码基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列合成由上海生工生物工程有限公司完成。
实施例2、利用含有β-甘露聚糖酶编码基因的重组菌发酵生产β-甘露聚糖酶1、含有β-甘露聚糖酶编码基因的重组菌的构建
将上述实施例1合成的β-甘露聚糖酶编码基因用限制性内切酶EcoRI和XbaI进行双酶切，然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体pPICzαA(购自Invitrogen公司)相连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，经抗生素Zeocin筛选后，获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，将得到的重组表达载体命名为pPIC-mann。
毕赤酵母X-33感受态细胞的制备：挑取毕赤酵母X-33(购自Invitrogen公司，USA)的单菌落，接种至含有5mL YPD培养基的试管中，28-30℃条件下250-300rpm培养过夜。取50μL培养物接种至含有50mL新鲜YPD培养基的500mL三角瓶中，28-30℃条件下250-300rpm培养过夜，至OD600值达到1.3-1.5。将细胞于4℃条件下1500g离心5min，用500mL冰预冷的灭菌水重悬菌体沉淀。再将菌体沉淀于4℃条件下1500g离心5min，用250mL冰预冷的灭菌水重悬菌体沉淀。然后再于4℃条件下1500g离心5min，用20mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液重悬菌体沉淀。将菌体沉淀于4℃条件下1500g离心5min，用1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液重悬菌体沉淀，得到1.5mL的毕赤酵母X-33的感受态细胞。
将10μg重组表达载体pPIC-mann溶解在5-10μL灭菌的双蒸水中，与80μL上述制备的毕赤酵母X-33的感受态细胞混匀，将混合液转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，将电转化杯冰浴5min后进行电击，电击条件为：2.0kV、5ms。电击完毕后，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，将菌悬液转至50mL离心管中，28℃温育2h。将菌悬液涂布于YPDS培养基(每升YPDS培养基中含有终浓度为10g/L的胰蛋白胨、终浓度为5g/L的NaCl、终浓度为5g/L的酵母提取物、终浓度为15g/L的琼脂粉、终浓度为1M的山梨醇和终浓度为100μg/mL Zeocin)平板上，每100-200μL菌悬液涂布一块平板，于30℃培养2-3d，直至长出清晰的单菌落，将获得的阳性重组菌命名为X-33/PICmann。
2、利用重组菌X-33/PICmann发酵生产β-甘露聚糖酶
挑取上述步骤1获得的重组菌X-33/PICmann的单菌落进行高密度发酵培养。配制4L BMGY培养基，在10L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至28.5℃备用。将上述步骤1获得的重组菌X-33/PICmann按照10％的接种量接种至装有4L BMGY培养基的10L发酵罐中，用氨水和磷酸调节发酵液的pH值至5.5，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30％，发酵温度为28.5℃。接种24h后，当培养基中的甘油消耗完全时(此时培养基溶氧为100％)，进入流加50％质量百分含量甘油的阶段，甘油的流加速度为60mL/h，共流加甘油5h。停止流加50％质量百分含量的甘油1h后，培养基中的甘油再次消耗完全(此时培养基溶氧为100％)，进入流加甲醇阶段，甲醇的流加速度为12mL/h。通过调节转速、空气流量和甲醇的流加速度控制溶氧为20％以上，如溶氧不能保持在20％以上，则停止流加甲醇，直至溶氧回升到20％以上。以12mL/h的流加速度流加甲醇3h后，将甲醇的流加速度调至24mL/h，保持该流加速度2h后，将甲醇的流加速度调至30mL/h，并保持到发酵结束，控制溶氧为20％以上。在发酵过程中的不同时间点取样测定菌体量和酶活。发酵过程曲线如图1所示。
将发酵液离心，取上清液进行12％的SDS-PAGE电泳检测。结果如图4所示。其中，M表示蛋白质分子量标准，0h表示未转入重组表达载体的毕赤酵母X-33发酵上清液的SDS-PAGE结果，12h表示发酵12h后，发酵上清液的SDS-PAGE结果，24h表示发酵24h后，发酵上清液的SDS-PAGE结果，48h表示发酵48h后，发酵上清液的SDS-PAGE结果，72h表示发酵72h后，发酵上清液的SDS-PAGE结果，96h表示发酵96h后，发酵上清液的SDS-PAGE结果。结果表明，重组菌X-33/PICmann的培养上清经SDS-PAGE检测得到一条约40kDa的特异性表达条带，即β-甘露聚糖酶。而未转入重组表达载体的毕赤酵母X-33发酵液的上清液中没有检测到蛋白条带。
对上述得到的β-甘露聚糖酶进行酶活检测。酶活测定采用DNS法，将1个酶活单位(U)定义为：50℃、pH 6.0的条件下，每分钟水解底物半乳甘露聚糖(购自Sigma公司，货号：G0753)产生1μmol的甘露糖的所需的酶量定义为1个酶活单位。
实验设三次重复，每个样品测定均设三个平行实验，相对误差控制在8％以内。结果表明，诱导培养72h时，发酵液中β-甘露聚糖酶的平均酶活为2100U/mL，发酵液中平均湿菌重为380g/L。
3、β-甘露聚糖酶的酶学性质分析
(1)酶最适反应温度的测定
将上述步骤1获得的β-甘露聚糖酶置于pH6.0的缓冲液中，在不同温度(20-60℃)下测定β-甘露聚糖酶的酶活力。酶活测定结果如图2所示。结果表明，pH6.0的条件下，上述步骤1获得的β-甘露聚糖酶在40℃时酶活最高。
(2)酶反应最适pH值和pH值稳定性的测定
室温条件下，将上述步骤1获得的β-甘露聚糖酶置于不同pH值(4.0-9.0)条件下分别测定其酶活，以在pH 4.0-9.0范围内的最高酶活力为基础，其它pH条件下测得的酶活力与之相比，所得数值即为该pH条件下的相对酶活力。
同时在室温条件下，将上述步骤1获得的β-甘露聚糖酶置于不同pH值(4.0-9.0)的缓冲液中并放置1h，然后在40℃和pH6.0条件下测定不同pH条件下放置1h后的β-甘露聚糖酶的残存酶活力，并计算β-甘露聚糖酶的残存相对酶活力。以在pH 4.0-9.0范围内放置1h后测得的最高酶活力为基础，其它pH条件下放置1h后测得的酶活力与之相比，所得数值即为该pH条件下的残存相对酶活力。实验设三次重复，结果如图3所示。其中，带有方框的曲线表示不同pH条件下的相对酶活力，带有圆点的曲线表示不同pH值条件下残存的相对酶活力。结果表明，40℃条件下，上述步骤1获得的β-甘露聚糖酶在pH6.0时酶活最高，此时的平均相对酶活力为100％。
(3)金属离子及EDTA对酶活性的影响
在上述步骤1获得的β-甘露聚糖酶溶液中分别加入终浓度为10mM的表1所示的多种金属离子及EDTA，静置30min后，在pH6.0和40℃条件下测定酶的残存活力，并计算β-甘露聚糖酶的相对酶活力。以加入不同金属离子后测得的最高酶活力为基础，加入不同金属离子后测得的酶活力与之相比，所得数值即为加入该金属离子条件下的相对酶活力。实验设三次重复，结果如表1所示。
表1.金属离子及EDTA重组酶活性的影响。
  试剂   相对酶活力(％)
  FeSO4   101.32±0.86
  CuSO4   37.79±1.79
  MnSO4   53.41±0.46
  ZnSO4   79.22±2.71
  MgSO4   97.09±2.18
  Na2SO4   93.91±2.32
  EDTA   63.73±1.39
结果表明，在酶溶液中加入各种金属离子或EDTA后，Cu2+、Mn2+、Zn2+、EDTA对酶活性影响较明显，而其他离子对酶活没有显著影响。
序列表
<110>北京德宝群兴科技有限公司
<120>一种β-甘露聚糖酶编码基因及其应用
<130>CGGNARZ92261
<160>1
<210>1
<211>1026
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gaattcgctc acactgtttc cccagtgaac ccaaacgctc aacaaactac taagactgtt     60
atgaactggt tggctcactt gccaaacaga actgaaaaca gagttttgtc cggtgctttc    120
ggtggttact cccacgacac tttctccatg gctgaggctg acagaatcag atccgctact    180
ggtcaatccc cagctatcta cggttgtgac tacgctagag gttggttgga gactgctaac    240
atcgaggacc caatcgacgt ttcctgtaac ggtgacttga tgtcctactg gaaaaacggt    300
ggtatcccac aaatctcctt gcacttggct aacccagctt tccaatccgg tcacttcaag    360
actccaatca ctaacgacca atacaagaag atcttggact cctccactgc tgagggtaag    420
agattgaacg ctatgttgtc caagatcgct gacggtttgc aagagttgga gaaccaaggt    480
gttccagttt tgttcagacc attgcacgag atgaacggtg agtggttctg gtggggtttg    540
acttcctaca accaaaagga caacgagaga atctccttgt acaagcaatt gtacaagaag    600
atctaccatt acatgactga cactagaggt ttggaccact tgatctgggt ttactcccca    660
gacgctaaca gagacttcaa gactgacttc tacccaggtg cttcctacgt tgacatcgtt    720
ggtttggacg cttacttcca agacgcttac tccatcaacg gttacgacca attgactgct    780
ttgaacaaac cattcgcttt cacagaggtt ggtccacaaa ctgctaacgg ttccttcgac    840
tactccttgt tcatcaacgc tatcaagcaa aagtacccaa agactatcta cttcttggct    900
tggaacgacg agtggtcccc agctgttaac aagggtgctt ccgctttgta ccacgactcc    960
tggactttga acaagggtga gatctggaac ggtgactcct tgactccaat cgttgagtaa   1020
tctaga                                                              1026

Claims (10)

1.一种β-甘露聚糖酶编码基因，为如下1)或2)所述的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第7-1020位脱氧核糖核苷酸；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列1。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所述β-甘露聚糖酶的氨基酸序列如GenBank Accession No.ACH41133.1所示。
3.含有权利要求1所述基因的表达盒。
4.含有权利要求1所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在毕赤酵母表达载体pPICzαA的多克隆位点间***权利要求1所述基因得到的重组表达载体。
6.含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求1所述基因的重组菌。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组载体导入毕赤酵母X-33中得到的重组菌。
9.一种制备β-甘露聚糖酶的方法，是发酵培养权利要求7或8所述的重组菌，得到β-甘露聚糖酶。
10.权利要求7或8所述的重组菌在制备饲料添加剂中的应用。
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Address after: 100193 No. 2, West Old Summer Palace Road, Beijing, Haidian District, feed center of the Ministry of agriculture, China Agricultural University

Applicant after: Beijing Tonglixing Agricultural Science & Technology Co., Ltd.

Address before: 100193 No. 2, West Old Summer Palace Road, Beijing, Haidian District, feed center of the Ministry of agriculture, China Agricultural University

Applicant before: Beijing Debao Qunxing Technologies Co., Ltd.

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Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: BEIJING DEBAO QUNXING TECHNOLOGIES CO., LTD. TO: BEIJING TONGLI XINGKE AGRICULTURAL TECHNOLOGY CO., LTD.

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