CN101965349B - 用作抗增殖剂的吡唑并[3,4-d]-嘧啶衍生物 - Google Patents

用作抗增殖剂的吡唑并[3,4-d]-嘧啶衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及式(I)的新型吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物及其药用盐和酯，其中R，环A，L和环B如本文中所述。这些化合物和它们的药用盐和酯抑制Raf激酶并且具有抗增殖活性。如此，它们可以用于治疗或控制增殖性疾病如癌症，特别是实体瘤，更特别地是乳腺肿瘤、结肠肿瘤、肺肿瘤、***肿瘤和黑素瘤。还公开了包含这样的化合物或其药用盐或酯的组合物和单位剂量制剂，制备这些化合物的方法和将这些化合物或它们的药用盐或酯用于治疗增殖性疾病的方法。

Description

用作抗增殖剂的吡唑并[3,4-D]-嘧啶衍生物
本发明涉及下式的新型吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物：
及其药用盐和酯，其中R，环A，L和环B如本文中所述。
这些化合物和它们的药用盐和酯抑制Raf激酶并且具有抗增殖活性。如此，它们可以用于治疗或控制增殖性疾病如癌症，特别是实体瘤。本发明还涉及包含这样的化合物或其药用盐或酯的组合物或单位剂量制剂，制备这些化合物的方法和将这些化合物或它们的药用盐或酯用于治疗增殖性疾病，特别是实体瘤，并且最特别地是乳腺肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、***肿瘤和黑素瘤的方法。
发明背景
许多疾病症状的特征在于细胞不受控制的增殖和分化。这些疾病症状包括各种细胞类型和疾病如癌症，动脉粥样硬化症，和再狭窄。在许多的这类疾病症状中，激酶，即通过调节细胞***和增殖而进行基本功能的重要细胞酶，看来似乎起着决定性的作用。
调节细胞增殖和生存的分子机理和信号路径作为抗癌策略的潜在标靶而正受到相当多的关注。近年来，针对靶向MAPK路径的努力有了显著的增加，所述的路径将由受体酪氨酸激酶(RTKs)和G蛋白偶合受体引起的增殖信号的广泛阵列集成在一起。
MAPK信号串包括由三种激酶：Raf、MEK1/2和ERK1/2组成的中心模块的G蛋白Ras工作上游。Raf磷酸化并且由此活化MEK1/2，而MEK1/2又最终导致ERK1/2的活化。长期认为Raf激酶对于药物发现是有吸引力的靶，原因在于其作为癌症相关的信号转导用的潜在关卡的重要性(Strumberg和Seeber，Onkologie，2005，28：101-107；Beeram等，J.Clin.Oncol.2005，23：6771-6790)。用于肿瘤细胞的增殖和生存的MAPK信号串的重要性最近随着在人类肿瘤中活化B-Raf突变的发现而增加。已经在黑素瘤、甲状腺、结肠和其它癌症中确定活化Raf突变(Strumberg和Seeber，Onkologie，2005，28：101-107；Bollag等，CurrentOpinioninInvestigationalDrugs，2003，4：1436-1441)。
因此，除了用Ras突变和活化生长因子受体控制肿瘤的任务外，Raf激酶抑制剂在携带B-Raf致癌基因的肿瘤中可具有治疗潜力(Sharma等，CancerRes.2005，65：2412-2421)。
哺乳动物Raf丝氨酸/苏氨酸激酶家族由称作A-Raf，B-Raf和C-Raf(Raf-1)的三种68-至74-kd蛋白组成，它们高度共享保存氨基终端调节区域和在羧基终端的催化域。Raf蛋白通常是胞质的，但是它们被小G-蛋白Ras恢复成质膜。Ras的恢复这对于Raf由生长因子、细胞因子和激素的活化是基本步骤。在膜上，通过包括一些残基的构象变化、结合到其它蛋白上、结合到脂质上和磷酸化和脱磷酸化的高度复杂的过程，发生Raf活化。
已经发现各种试剂干涉Raf激酶，包括反义寡核苷酸和小分子。这些抑制剂防止Raf蛋白的表达、阻断Ras/Raf相互作用，或阻隔其激酶活性。B-Raf活性由siRNA或通过激酶抑制剂BAY-43-9006的向下调节导致黑素瘤细胞生长的抑制和导致1205Lu细胞肿瘤发生潜力降低的B-Raf的siRNA-介导减少。目前正进行临床评价的Raf抑制剂显示出具有完全可容忍安全分布的抗癌功效的有望信号。临床上最先进的是Raf抑制剂BAY43-9006，它是最近由FDA认可的，用于治疗转移性肾细胞癌，其中另外的第III期临床试验用于治疗其它癌症。
尽管已经取得了进展，但是对于可以用于治疗各种各样的肿瘤和其它增殖性疾病的小分子化合物继续研究，所述的其它增殖性疾病包括再狭窄，血管发生，糖尿病性视网膜病，银屑病，手术粘连，黄斑变性和动脉粥样硬化症。因此，对于提供具有抗增殖活性的组合物、药品和/或药物存在强烈需要。与其它的抗增殖药剂相比，这些组合物、药品和/或药物可以不仅具有强活性，而且表现出减少的副作用。此外，响应于用这些组合物、药品和/或药物治疗的肿瘤范围可以是广泛的。这种类型的活性成分可以作为单个药剂和/或组合治疗而适宜于上述症状，所述的组合治疗是它与其它的治疗剂，与放射线，与手术/外科程序，热处理或在所述的症状中已知的任何其它治疗相结合。
发明详述
本发明涉及式(I)的化合物：
其中
R是低级烷基；
环A选自：
杂芳基；
被1至5个取代基取代的杂芳基，所述的取代基独立地选自：低级烷基；卤素；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；和氰基；
苯基；和
被1至4个取代基取代的苯基，所述的取代基独立地选自：低级烷基；卤素；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；和氰基；
环B选自：
杂芳基；
被1至5个取代基取代的杂芳基，所述的取代基选自：低级烷基；氟化烷基；芳基取代的烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；和-NR1R2；
苯基；和
被1至5个取代基取代的苯基，所述的取代基选自：低级烷基；氟化烷基；芳基取代的烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；氰基；和-NR1R2；
R1和R2各自独立地选自：氢；低级烷基；和被羟基或低级烷氧基取代的低级烷基；和R1和R2与N一起可以形成5-或6-元杂环；并且
L选自：键，-OCH2-，-CH2O-，-NHCO-，-CONH-，-O-，-OCH2CH2-，-CH2OCH2，-CH2CH2O-，-CF＝CH-，-CH＝CF-，-NH-，-NHCH2-，-CH2NH-，-SCH2-，-CH2S-，-SOCH2-，-CH2SO-，-SO2CH2-，-CH2SO2-，-S-，-CH＝CH-，和低级烷基；
当L是键时，环B是被1至4个取代基取代的唑，所述的取代基选自：低级烷基；氟化烷基；芳基取代的烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；氰基；和-NR1R2；
或这样化合物的药用盐或酯。
本发明的化合物是Raf激酶的小分子抑制剂，并且因此可以用作选择性抗癌剂。
如本文所用的术语“链烯基”是指具有至少一个双键和2至6个，优选2至4个碳原子的直链或支链烃基。“链烯基”的实例是乙烯基，烯丙基，异丙烯基，1-丙烯基，2-甲基-1-丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，2-乙基-1-丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基和5-己烯基。
如本文所用的术语″烷氧基″和″烷氧基团″各自是指其中烷基(如下定义的)连接到氧原子上的基团。术语″低级烷氧基″是指低级烷基(如下定义的)连接到氧原子上的基团。典型的低级烷氧基包括甲氧基，乙氧基，异丙氧基或丙氧基，丁氧基等。还包括在烷氧基的含义内的是被烷氧基取代的烷氧基，例如乙氧基乙氧基，甲氧基乙氧基，甲氧基乙氧基乙氧基等，和取代的烷氧基侧链如二甲基氨基乙氧基，二乙基氨基乙氧基等。
如本文所用的术语“烷基”是指直链或支链饱和烃基，其具有1至约20个碳原子，并且在一些实施方案中，具有1至约7个碳原子。术语“低级烷基”是指烷基，其具有1至6个碳原子，并且在一些实施方案中，具有1至4个碳原子。烷基的实例包括但不限于：甲基，乙基，正-丙基，异-丙基，正-丁基，仲-丁基，叔-丁基，正-戊基和仲-戊基。术语“氟化烷基”是指如上定义的烷基，其中一个或数个氢原子被氟代替。实例是三氟甲基，五氟乙基等。
如本文所用的术语“炔基”是指具有至少一个叁键和2至6个，优选2至4个碳原子的直链或支链烃基。“炔基”的实例是乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，3-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，3-戊炔基，4-戊炔基，1-己炔基，2-己炔基，3-己炔基，4-己炔基和5-己炔基。
如本文所用的术语″芳基″是指单环或双环芳族烃基，其优选含有6至10个环碳原子。优选的芳基包括但不限于：苯基，萘基，甲苯基和二甲苯基。
如本文所用的术语″唑(azole)″是指5-元杂芳基(下面定义)，其中至少一个杂原子(下面定义)是氮。″噁二唑″是具有三个杂原子的唑，其中两个杂原子是氮并且一个是氧。″***″是具有三个杂原子的唑，其中所有三个杂原子都是氮。″四唑″是具有四个杂原子的唑，其中所有四个杂原子都是氮。
如本文所用的术语″载体″是指药学上惰性的媒介物(例如，溶剂，悬浮剂)，其可以用于将活性化合物如式(I)化合物(下面定义)递送给患者。
如本文所用的术语″环烯基″是指稳定的单环或多环的非芳族烃基，其是未饱和的并且其含有5至10个环原子。环烯基的实例包括但不限于：环戊烯基或环己烯基。
如本文所用的术语″环烷基″是指稳定的单环或多环的非芳族的饱和烃基，其含有3至10个环原子。环烷基的实例包括但不限于：环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，金刚烷基，环辛基，双环烷基，包括：双环辛烷如[2.2.2]双环辛烷或[3.3.0]双环辛烷，双环壬烷如[4.3.0]双环壬烷，和双环癸烷如[4.4.0]双环癸烷(十氢化萘)和螺化合物。
如本文所用的术语″赋形剂″是指药学上惰性的物质。
如本文所用的术语“卤素”是指氟，氯，溴或碘，优选氟和氯。
如本文所用的术语″杂芳基″是指含有至少一个杂原子的芳族单或双环基团。优选的杂芳基包括但不限于：噻吩基，呋喃基，吲哚基，吡咯基，吡啶基，吡嗪基，噁唑基，噁二唑基，噻唑基，喹啉基，嘧啶基，咪唑，***基和四唑基。在双环杂芳基的情况下，应当理解一个环的原子可以全部是碳而另一个环可以含有杂原子。
如本文所用的术语″杂环″是指4-至8-元单或双环的饱和或部分未饱和的非芳族基团，其含有1至3个″杂原子″。如本文所用的术语″杂原子″是指环原子，其是氮、氧或硫。杂环的实例包括吡咯烷-2-基；吡咯烷-3-基；哌啶基；吗啉-4-基等。在双环杂环的情况下，应当理解一个环的环原子可以全部是碳而另一个环可以含有杂原子。
“IC50”是指需要抑制50％具体测量活性的特定化合物的浓度。IC50可被测定，尤其如在下文中所述测定。
如本文提及化合物(如载体、盐、酯等)所用的术语“药用的”是指对给予特定化合物的受试者而言是药理上可接受的且基本上无毒性的。
化合物的“药用盐”是指保留所述化合物的生物有效性和特性且由适宜的无毒性有机酸或无机酸或有机碱或无机碱形成的常规酸加成的盐或碱加成的盐。酸加成的盐的实例包括那些来源于无机酸、诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的盐以及那些来源于有机酸、诸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、三氟乙酸等的盐。碱加成的盐的实例包括那些来源于铵、锂、钾、钠和季铵氢氧化物的盐、诸如氢氧化四甲铵。将药物化合物(即药物)化学修饰成盐是药剂师众所周知的获得化合物改善的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性的技术。例如，参见Ansel等《药物剂型和药物转运***》(PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems)(第6版1995)196和1456-页；和RichardJ.Bastin，MichaelJ.Bowker，BryanJ.Slater，《有机工艺研究与开发》(OrganicProcessResearch&Development)2000，4，427-435。
化合物的“药用酯”是指含有羧基或羟基的化合物的常规酯，该酯保留了化合物的生物有效性和特性且能够在体内(在生物体内)分别被裂解成相应的活性羧酸或醇。
如本文用来描述上述化学基团(例如取代的烷基，取代的芳基，取代的杂芳基)所用的术语″取代的″是指化学基团，其中1至5个氢原子，优选1至3个已经独立地被取代基代替。
如本文所用的术语″单位剂量制剂″是指处于稳定形式并且能够作为单一剂量对患者给药的药物制剂(如片剂，胶囊)，其含有活性药剂，例如根据式(I)的化合物(下面定义)。
在本发明的一个优选的实施方案中，环A被1个取代基取代，所述的取代基选自：低级烷基；卤素；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基。
在本发明的另一个优选的实施方案中，当环A是苯基或取代的苯基时，L在相对于1-烷基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基是间位的位置连接。
在本发明的另一个优选的实施方案中，当环B是取代的杂芳基或取代的苯基时，环B由1或2个取代基取代，所述的取代基选自：低级烷基；氟化烷基；芳基取代的烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；氰基；和-NR1R2；其中R1和R2如上定义。在一个特别优选的实施方案中，环B是3或4单取代的或3，4-双取代的，其中取代基可以不同，并且取代基优选独立地选自：卤素；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；-NR1R2；和-CF3；其中R1和R2如上定义。
在本发明的一个优选的实施方案中，L是键和环B选自：取代的1，3，4-噁二唑；取代的1，2，4-噁二唑；取代的1，2，3-***；取代的1，2，4-***；和取代的四唑；其中取代基独立地选自：低级烷基；氟化烷基；芳基取代的烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；氰基；和-NR1R2；其中R1和R2如上定义。特别优选其中环B是取代的1，3，4-噁二唑的实施方案。
在另一个优选的实施方案中，环A是被甲基在相对于1-烷基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基是邻位的位置取代的苯基。在一个特别优选的实施方案中，环A是被甲基在相对于1-烷基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基是邻位的位置取代的苯基，并且L在相对于甲基为对位的位置连接到环A上。
在另一个优选的实施方案中，R是甲基。
在另一个优选的实施方案中，卤素选自：Cl和F。
在另一个优选的实施方案中，L选自：-CH2O-，-NHCO-，和-CONH-。
在一个优选的实施方案：
环A是被1至4个取代基取代的苯基，所述的取代基独立地选自：低级烷基；卤素；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；和氰基；
L选自：-CH2O-，-NHCO-和-CONH-；和
环B是被1至5个取代基取代的苯基，所述的取代基选自：低级烷基；氟化烷基；芳基取代的烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；氰基；和-NR1R2；其中R1和R2如上定义。
更优选R是甲基。再更优选R是甲基，并且环B是3或4单取代或3，4-双取代的，其中两个取代基可以不同。对于环B的优选取代基是卤素，-NR1R2，羟基，低级烷氧基，被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基和-CF3，其中R1和R2如上定义。
在另一个优选的实施方案中：
环A选自：苯基和被甲基取代的苯基；
L是键；和
环B是取代的唑，例如取代的1，3，4-噁二唑，取代的1，2，4-噁二唑，取代的1，2，3-***，取代的1，2，4-***和取代的四唑，优选取代的1，3，4-噁二唑，其中取代基独立地选自：低级烷基；氟化烷基；芳基取代的烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；氰基；和-NR1R2；其中R1和R2如上定义。
更优选R是甲基。再更优选R是甲基，并且环B被低级烷基，-NR1R2，羟基，低级烷氧基，被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基或-CF3取代，其中R1和R2如上定义。特别优选R是甲基，并且环B是如上取代的1，3，4-噁二唑。
在根据本发明的再一个优选的实施方案中，提供式(I)化合物，其中
R是(C1-6)烷基；
环A是未取代的或被(C1-6)烷基取代一次的苯基；
L是-CH2-O-，-O-CH2-，-C(O)-NH-，或-NH-C(O)-；
环B是苯基，所述苯基是未取代的或被取代基取代1或2次的，所述的取代独立地选自：
卤素，或
-NH-(CH2)2-OH；
或
L是键，并且
环B是3-甲基-[1，2，4]噁二唑-5-基。
特别优选下列具体化合物：
3-(3-苄氧基-苯氧基甲基)-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺；
N-[3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-3-氯-4-(2-羟基-乙基氨基)-苯甲酰胺；
N-[3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-3-氯-苯甲酰胺；
4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(3-甲基-[1，2，4]噁二唑-5-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶；
3-(5-苄氧基-2-甲基-苯氧基甲基)-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺；
3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-N-(4-氯-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺；
3-[5-(4-氯-苄氧基)-2-甲基-苯氧基甲基]-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺；
1-甲基-3-[2-甲基-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺；和
3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-N-(3-氯-4-氟-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺；和
上述化合物中任何一种的药用盐和酯。
式(I)化合物或其盐或酯(以下统称为″本发明化合物″)可以作为外消旋混合物或作为分离的立体异构体存在。可以由已知的分离方法如由色谱分离立体异构体。
本发明的化合物可以显示互变异构现象或结构同分异构现象。本发明意欲涵盖本发明化合物的任何互变异构形式或结构异构形式，或这些形式的混合物，并且不限于在式(I)中所描述的任何一种互变异构形式或结构异构形式。
本发明的化合物可以用于治疗或控制细胞增殖性疾病，特别是肿瘤疾病。所述化合物和含有这样化合物的组合物和单位剂量制剂可以用于治疗或控制实体瘤，诸如乳腺肿瘤、结肠肿瘤、肺肿瘤、***肿瘤和黑素瘤。
本发明化合物的治疗有效量是有效预防、缓解或改善疾病症状或延长所治疗受试者存活的量。治疗有效量或剂量可以在宽限内改变并且可以按照本领域公知的方式测定。可以在每种特定情况中根据个体需要调整这类剂量，包括所给予的具体化合物、给药途径、所治疗的疾病和所治疗的患者。一般来说，在就对体重约为70Kg的成年人口服或非肠道给药本发明化合物的情况下，约10mg至约10,000mg，优选约200mg至约1,000mg的每日剂量应是合适的，不过，当必要时，可以超过上限。可以将每日剂量作为单剂量或分剂量给药，或就非肠道给药而言，可以作为连续输注给药。
因而，在根据本发明的另一个实施方案中，提供用作药剂的式(I)化合物。
在再一个实施方案中，提供式(I)化合物，其用作用于治疗癌症，特别是实体瘤，更特别地是乳腺肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、***肿瘤和黑素瘤的药剂。
在又一个实施方案中，提供式(I)化合物在制备药剂中的应用，所述的药剂用于治疗癌症，特别是实体瘤，更特别地是乳腺肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、***肿瘤和黑素瘤。
本发明还涉及用于制备式(I)化合物的方法。本发明化合物可以由任何常规的手段制备。用于合成这些化合物的适宜方法提供于实施例中。通常，可以根据下面描述的方案制备式(I)化合物。
1)1-(乙氧基亚乙基)丙二腈(Aldrich)与水合肼(Aldrich)反应，以制备5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-腈。然后5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-腈与硫酸反应，以制备5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-羧酸酰胺。
2)5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-羧酸酰胺与甲酰胺(Aldrich)反应，以制备3-甲基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮。
3)3-甲基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮与磷酰氯反应，以制备4-氯-3-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶。
4)4-氯-3-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶与其中R是如上所述的低级烷基，并且I是碘化物的RI(如，获自Aldrich的碘代甲烷)反应，以制备1-烷基-4-氯-3-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶。
5)1-烷基-4-氯-3-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶与N-溴琥珀酸酯(Aldrich)反应，以制备1-烷基-3-溴甲基-4-氯-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶。
6)1-烷基-3-溴甲基-4-氯-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶与式(II)化合物
(例如，3-苄氧基-苯酚，可获自TCI)反应，以制备式(III)化合物，
7)在(6)中制备的化合物与氨反应，以制备式(I)化合物。
根据上述步骤1至7，特别是步骤6和7的方法形成根据本发明的另一个实施方案。
本发明还涉及包含本发明化合物的组合物和单位剂量制剂。组合物和单位剂量制剂包含治疗有效量的本发明化合物和载体。组合物和单位剂量制剂还可以包含另外的辅助成分，例如其它赋形剂。通常，约1至约99％，优选5至约70％，并且最优选约10至约30％的组合物和单位剂量制剂由本发明的化合物组成。
可以使用例如乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等作为用于片剂、包衣片剂、糖锭剂和硬明胶胶囊的载体材料。软明胶胶囊的合适载体材料为，例如植物油、蜡、脂肪以及半固体和液体多元醇等。但是，根据活性成分的性质，在软明胶胶囊的情况下通常不需要载体。用于制备溶液或糖浆的合适载体材料为，例如水、多元醇、甘油、植物油等。栓剂的合适载体材料为，例如天然或硬化油、蜡、脂肪，半液体或液体多元醇等。
本发明的组合物和单位剂量制剂还可以包含另外的赋形剂，例如防腐剂、增溶剂，稳定剂，湿润剂，乳化剂，甜味剂，色料，香料，用于改变渗透压的盐，缓冲剂，掩蔽剂和和抗氧化剂。
本发明的组合物和单位剂量制剂还可以包含另外的治疗活性物质。
本发明的单位剂量制剂包括适宜于以下的那些：口服、鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、***和/或胃肠外给药。制剂可以由制药学领域中周知的任何方法制备。
适宜于口服给药的本发明单位剂量制剂可以是以下形式：胶囊剂、扁囊剂、小药囊、丸剂、片剂、锭剂(使用香料基质(flavoredbasis)，通常是蔗糖和***胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂、酏剂、糖浆剂、软锭剂(使用惰性基质(inertbase)，如明胶和甘油，或蔗糖和***胶)、漱口剂等。制剂还可以是本发明化合物在水性或非水性液体中的溶液剂或悬浮剂。制剂还可以是水包油或油包水液体乳剂。还可以将本发明的化合物作为大丸剂、药糖剂或糊剂给药。
本发明还涉及用于制备本发明的组合物和单位剂量制剂的方法。这样的方法包括使本发明的化合物与载体和任选的一种或多种辅助成分联合的步骤。通常，本发明的组合物和制剂是通过将本发明的化合物与液体载体或细碎的固体载体，或它们两者，均匀并且密切地组合，然后，如果需要，成型为产品而制备的。
本发明还涉及用于治疗患有增殖性疾病的方法，所述方法包括向患者给药本发明化合物的步骤。可以将所述化合物包含在组合物或单位剂量制剂中。在一个优选的实施方案中，增殖性疾病是实体瘤。在一个特别优选的实施方案中，增殖性疾病选自：乳腺肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、***肿瘤和黑素瘤的药剂。
提供下列实施例和参考以帮助理解本发明，本发明的真实范围列于后附权利要求中。
实施例1
5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-羧酸酰胺
根据Robins，R.K.J.Am.Chem.Soc.，1956，78，784的程序制备。
步骤1：
将1-(乙氧基亚乙基)丙二腈(25.05g，184.0mmol)(Aldrich)以小部分加入到35％(wt)水合肼(37mL，Aldrich)中。在加入1-(乙氧基亚乙基)-丙二腈约一半后，将反应混合物在冷水中冷却，并且余下的1-(乙氧基-亚乙基)丙二腈以使得烧瓶中的内容物温和沸腾的速率加入。在加入完成后，将混合物加热回流2小时。冷却后，将固体过滤，用冷水洗涤，并且在真空干燥器中干燥，得到5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-腈。(产量15.0g)。
步骤2：
将5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-腈(15.0g，见上文)加入到用冷却浴冷却的搅拌浓硫酸(47mL，95％)中。在加入后，将反应混合物于室温搅拌2小时，然后将其在搅拌的情况下倾倒入冰和水的混合物中。将沉淀物通过过滤收集，用冷水洗涤，以除去过量的硫酸，并且在真空干燥器中干燥，得到5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-羧酸酰胺。(产量19.6g)。
实施例2
3-甲基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮
将5-氨基-3-甲基-1H-吡唑-4-羧酸酰胺(11.06g，79.0mmol，实施例1)和甲酰胺(60mL，Aldrich)的混合物于180℃加热3.5小时。在冷却至80℃之后，加入冰水(100g)，并且强力搅拌混合物，得到白色沉淀物。将沉淀物过滤并且用冷水洗涤，然后在真空干燥器中干燥，得到3-甲基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮，为灰白色固体。(产量9.07g)。将此物质在没有进一步纯化的情况下用于下一步骤(描述于实施例3中)。
实施例3
4-氯-3-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶
向3-甲基-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮(7.50g，50.0mmol，实施例2)在磷酰氯(150mL)中的搅拌悬浮液中，加入二异丙基乙胺(31mL，175mmol，Aldrich)。将混合物加热回流2.5小时，之后在减压下蒸发溶剂。将剩余物用冰(200g)处理，用4N氢氧化钠水溶液使其略显碱性，并且用乙酸乙酯(3x250mL)萃取。将合并的有机萃取物用水，盐水洗涤，干燥且浓缩，得到4-氯-3-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶，为白色固体。(产量6.38g)。
实施例4
4-氯-1，3-二甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶
向4-氯-3-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(150.4mg，0.89mmol，实施例3)和碳酸钾(187mg，1.35mmol)在二甲基甲酰胺(6mL)中的混合物中，加入碘代甲烷(225mg，1.59mmol，Aldrich)。将反应混合物于室温搅拌2小时，之后将其用乙酸乙酯稀释，用水，盐水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化，得到4-氯-1，3-二甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶，为白色固体。(产量162.3mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C7H7ClN4+H[(M+H)+]计算值：183.0431。实测值：183.0432。
实施例5
3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶
向4-氯-1，3-二甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(752mg，4.12mmol，实施例4)在四氯化碳(45mL)中的溶液中，加入N-溴琥珀酰亚胺(964.4mg，5.36mmol，Aldrich)和AIBN(209.6mg，1.25mmol，Aldrich)。将混合物加热回流7小时。将得到的反应混合物在减压下浓缩，并且将剩余物由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，95/5至70/30)纯化，得到3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶，为白色固体。(产量941.3mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C7H6BrClN4+H[(M+H)+]计算值：260.9537。实测值：260.9537。
实施例6
3-(3-苄氧基-苯氧基甲基)-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶
将3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(90.2mg，0.28mmol，实施例5)，3-苄氧基-苯酚(75.2mg，0.36mmol，TCI)和碳酸钾(59.6mg，0.43mmol)在二甲基甲酰中的混合物于室温搅拌过夜。将得到的混合物在减压下浓缩，并且将剩余物溶解于乙酸乙酯中，用水和盐水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物或者直接用于下一步骤(描述于实施例7中)或者由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化，得到纯的3-(3-苄氧基-苯氧基甲基)-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶。(产量33mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C20H17ClN4O2+H[(M+H)+]计算值：381.1115。实测值：381.1113。
实施例7
3-(3-苄氧基-苯氧基甲基)-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺
将氨气鼓泡通过3-(3-苄氧基-苯氧基甲基)-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(20mg，实施例6)在2-丙醇(11mL)中的悬浮液15分钟。然后，将混合物在微波条件下于130℃加热1小时。在减压下除去溶剂，并且将剩余物由快速色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，99/1至95/5)纯化，得到3-(3-苄氧基-苯氧基甲基)-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺，为白色固体。(产量5mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C20H19N5O2+H[(M+H)+]计算值：362.1611。实测值：362.1612。
实施例8
3-氯-N-[3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-4-(2-羟基-乙基氨基)-苯甲酰胺
步骤1
在磁力搅拌并且在冰-水浴中冷却的情况下，将3-氯-4-氟苯甲酰氯(21.23g，110mmol，Avocado)在四氢呋喃(50mL)中的溶液滴加到5-氨基-邻-甲酚(6.16g，50mmol，Aldrich)，三乙胺(17.5mL，125mmol，Aldrich)和四氢呋喃(50mL)的溶液中。当加入完成时，将混合物温热至室温并且搅拌16小时。然后将混合物用水(125mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(125mL)稀释。在搅拌另外30分钟之后，收集沉淀物，得到粗制的3-氯-4-氟-苯甲酸5-(3-氯-4-氟-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯酯，为灰白色粉末。(产量21.83g)。
将3-氯-4-氟-苯甲酸5-(3-氯-4-氟-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯酯(3.93g，9mmol，获自上述)溶解于四氢呋喃(25mL)，甲醇(50mL)和1N氢氧化钠水溶液(9mL，9mmol)的混合物中。将混合物于室温搅拌18小时。然后将混合物在减压下浓缩，以除去大部分的有机溶剂。然后将得到的悬浮液用水(45mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)稀释。在放置30分钟，收集沉淀物之后，用水洗涤并且干燥，得到粗制的3-氯-4-氟-N-(3-羟基-4-甲基-苯基)-苯甲酰胺，为白色粉末。(产量2.59g)。
步骤2
将3-氯-4-氟-N-(3-羟基-4-甲基-苯基)-苯甲酰胺(1.0g，3.58mmol，获自上述)在二甲亚砜(5.0mL)中的溶液用乙醇胺(10.0mL)(Aldrich)处理，并且在微波反应器中于140℃加热50分钟。然后，将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。将水相用2N盐酸酸化。将沉淀物过滤，用水洗涤并且干燥。将水相用乙酸乙酯(2X)萃取。将合并的有机相用水和盐水洗涤，干燥(硫酸镁)并且浓缩。将两种固体样品合并并且干燥，得到3-氯-4-(2-羟基-乙基氨基)-N-(3-羟基-4-甲基-苯基)-苯甲酰胺。(产量1.13g)。
步骤3
将3-氯-4-(2-羟基乙基氨基)-N-(3-羟基-4-甲基-苯基)-苯甲酰胺(34.2mg，0.11mmol)和碳酸钾(17.3mg，123mmol)的混合物于室温搅拌30分钟，之后加入3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(25.4mg，0.097毫摩尔，实施例5)。将反应物于室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩，以除去二甲基甲酰胺。将剩余物溶解于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物或者直接用于下一步骤(描述于实施例9中)或者由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化，得到纯的3-氯-N-[3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-4-(2-羟基-乙基氨基)-苯甲酰胺，为白色固体。(产量22mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C23H22Cl2N6O3+H[(M+H)+]计算值：501.1197。实测值：503.1203。
实施例9
N-[3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-3-氯-4-(2-羟基-乙基氨基)-苯甲酰胺
将氨气鼓泡通过3-氯-N-[3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-4-(2-羟基-乙基氨基)-苯甲酰胺(20.9mg，实施例8)在2-丙醇(10mL)中的悬浮液15分钟。然后将混合物在微波条件下于130℃加热1小时，之后在减压下除去溶剂。将剩余物由快速色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，99/1至95/5)纯化，得到N-[3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-3-氯-4-(2-羟基-乙基氨基)-苯甲酰胺。(产量7.9mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C23H24ClN7O3+H[(M+H)+]计算值：482.1702。实测值：482.1702。
实施例10
3-氯-N-[3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-苯甲酰胺
步骤1
在磁力搅拌并且在冰-水浴中冷却的情况下，将3-氯苯甲酰氯(32.81g，187.5mmol，Aldrich)在四氢呋喃(50mL)中的溶液滴加到5-氨基-邻-甲酚(9.24g，75mmol，Aldrich)，三乙胺(31.43mL，225mmol，Aldrich)和四氢呋喃(150mL)的溶液中。当加入完成时，将混合物温热至室温，并且搅拌16小时。然后将混合物用水(200mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)稀释。在搅拌另外30分钟之后，收集沉淀物，得到粗制的3-氯-苯甲酸5-(3-氯-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯酯，为灰白色粉末。(产量31.74g)。将粗制的3-氯-苯甲酸5-(3-氯-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯酯(11.42g，28.5mmol)溶解于四氢呋喃(70mL)，甲醇(140mL)和1N氢氧化钠水溶液(28.5mL，28.5mmol)的混合物中。将混合物于室温搅拌18小时，然后在减压下浓缩，以除去大部分有机溶剂。将得到的悬浮液用水(90mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)稀释。在静置30分钟之后，收集沉淀物，用水洗涤并且干燥，得到3-氯-N-(3-羟基-4-甲基-苯基)-苯甲酰胺，为灰白色粉末。(产量6.06g)。
步骤2
将3-氯-N-(3-羟基-4-甲基-苯基)-苯甲酰胺(100mg，0.38mmol，36721-253A)和碳酸钾(63.1mg，0.45mmol)的混合物于室温搅拌30分钟，之后加入3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(90.9mg，0.28mmol，实施例5)。将反应物于室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩，以除去二甲基甲酰胺。将剩余物溶解于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物或者直接用于下一步骤(描述于实施例11中)或者由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化，得到纯的3-氯-N-[3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-苯甲酰胺，为白色固体。(产量33.3mg)。
实施例11
N-[3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-3-氯-苯甲酰胺
将氨气鼓泡通过3-氯-N-[3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-苯甲酰胺(56.7mg，实施例10)在2-丙醇(15mL)中的悬浮液15分钟。然后将混合物在微波条件下于130℃加热1小时，之后在减压下除去溶剂。将剩余物由快速色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，99/1至95/5)纯化，得到N-[3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-3-氯-苯甲酰胺。(产量46.7mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C21H19ClN6O2+H[(M+H)+]计算值：423.1331。实测值：423.1331。
实施例12
4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(3-甲基-[1，2，4]噁二唑-5-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶
步骤1
将3-羟基-4-甲基苯甲酸(25.0g，164mmol，Aldrich)和浓硫酸(3mL)在无水乙醇(165mL)中的混合物加热回流20小时。冷却后，加入固体碳酸氢钠(7g)，以中和酸。然后将混合物在二***(2X300mL)和水(2X300mL)之间分配。将有机层用盐水(300mL)洗涤，合并，干燥(MgSO4)，过滤，并且浓缩。将剩余物从己烷中重结晶，得到两批3-羟基-4-甲基-苯甲酸乙酯，为白色晶体。(产量28.90g，97.8％)。
步骤2
氢化钠(在油中60％，4.80g，120mmol，Aldrich)用戊烷(2X50mL)洗涤。通过移液除去戊烷。将得到的固体悬浮于无水二甲基甲酰胺(30mL)中，并且在冰-水浴中冷却。在30分钟内滴加3-羟基-4-甲基-苯甲酸乙酯(14.42g，80mmol)在二甲基甲酰胺(30mL)中的溶液。在搅拌另外30分钟之后，在10分钟内滴加氯甲基甲基醚(8.2mL，108mmol，Aldrich)。于室温搅拌另外2小时之后，将反应混合物在水(3X250mL)和二***(2X250mL)之间分配。将有机层洗涤用盐水(250mL)洗涤，然后合并，干燥(MgSO4)，过滤和浓缩，得到无色油状物。将其通过硅胶(Biotage40L，二氯甲烷-己烷，v/v2∶3，然后二氯甲烷)过滤，得到粗制的3-甲氧基甲氧基-4-甲基-苯甲酸乙酯，为无色油状物(含有痕量的低级Rf物质)。(产量18.01g，100％)。
步骤3
将3-甲氧基甲氧基-4-甲基-苯甲酸乙酯(4.5g，20mmol)溶解于乙醇(50mL)，水(20mL)和1N氢氧化钠水溶液(30mL)的混合物中，并且于室温搅拌18小时。将混合物在减压下浓缩，以除去大部分的乙醇。将得到的水溶液通过加入乙酸(2.5g，41.6mmol)而酸化。形成白色沉淀物。在静置另外30分钟之后，将沉淀物通过过滤收集，用水洗涤并且干燥，得到粗制的3-甲氧基甲氧基-4-甲基-苯甲酸，为白色粉末。(产量3.82g，97.0％)。
步骤4
将3-甲氧基甲氧基-4-甲基-苯甲酸(1.96g，10mmol)，1-(3-二甲基-氨基丙基-3-乙基碳二亚胺(1.92g，10mmol，Aldrich)和1-羟基苯并***水合物(1.5g，10mmol，Aldrich)的混合物于室温搅拌30分钟。加入乙酰胺肟(0.74g，10mmol)(GFSChemicals)，并且在磁力搅拌下，将混合物于140℃加热2小时。冷却后，将混合物在乙酸乙酯(2X100mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)之间分配。将乙酸乙酯溶液合并，并且浓缩，得到粗制的5-(3-甲氧基甲氧基-4-甲基-苯基)-3-甲基-[1，2，4]噁二唑。(产量1.23g，52.5％)。
步骤5
向5-(3-甲氧基甲氧基-4-甲基-苯基)-3-甲基-[1，2，4]噁二唑(1.23g，5.25mmol)在四氢呋喃/异丙醇(1∶1，30mL)中的溶液中，加入13.1mL和4MHCl的二噁烷溶液。将反应混合物于室温搅拌18小时。浓缩溶液。将剩余物用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，干燥(硫酸镁)并且浓缩。将剩余物从乙酸乙酯/己烷中重结晶，提供2-甲基-5-(3-甲基-[1，2，4]噁二唑-5-基)-苯酚。(产量0.88g，88％)。
步骤6
将2-甲基-5-(3-甲基-[1，2，4]噁二唑-5-基)-苯酚(72.0mg，0.0.379mmol)和碳酸钾(64.2mg，0.455毫摩尔)在二甲基甲酰胺中的混合物于室温搅拌30分钟，之后加入3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(89.8mg，0.280mmol，实施例5)。将反应物于室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩，以除去二甲基甲酰胺。将剩余物溶解于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化，得到纯的4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(3-甲基-[1，2，4]噁二唑-5-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶，为白色固体。(产量41.0mg)。
实施例13
4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(3-甲基-[1，2，4]噁二唑-5-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶
将氨气鼓泡通过4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(3-甲基-[1，2，4]噁二唑-5-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(40.0mg，实施例12)在2-丙醇(15mL)中的悬浮液15分钟。然后将混合物在微波条件下于130℃加热1小时，之后在减压下除去溶剂。将剩余物由快速色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，99/1至95/5)纯化，得到4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(3-甲基-[1，2，4]噁二唑-5-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶。(产量21.8mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C17H17N7O2+H[(M+H)+]计算值：352.1516。实测值：352.1517。
实施例14
3-(5-苄氧基-2-甲基-苯氧基甲基)-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶
步骤1
向4-苄氧基-2-羟基苯甲醛(2.28g，10.0mmol，由下面实施例18的方法制备)和氰基硼氢化钠(2.0g，15.9mmol)在四氢呋喃(60mL)中的溶液中，加入作为指示剂的甲基橙，使溶液为黄色；慢慢地加入1NHCl水溶液(15mL)，以保持溶液为橙色。将混合物于室温搅拌过夜。加入水，并且将混合物用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机相用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并且浓缩。将剩余物由用在己烷中的0-40％乙酸乙酯洗脱的快速色谱纯化，得到5-苄氧基-2-甲基-苯酚。(产量0.64g)。
步骤2
将5-苄氧基-2-甲基-苯酚(83.4mg，0.389mmol，37009-93A)和碳酸钾(61.8mg，0.438毫摩尔)的混合物于室温搅拌30分钟，之后加入3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(89.8mg，0.344毫摩尔，实施例5)。将反应物于室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩，以除去二甲基甲酰胺。将剩余物溶解于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物或者直接用于下一步骤或者由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化，得到纯的3-(5-苄氧基-2-甲基-苯氧基甲基)-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶，为白色固体。(产量48.0mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C21H19ClN4O2+H[(M+H)+]计算值：395.1270。实测值：395.1270。
实施例15
3-(5-苄氧基-2-甲基-苯氧基甲基)-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺
将氨气鼓泡通过3-(5-苄氧基-2-甲基-苯氧基甲基)-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(46.6mg，实施例14)在2-丙醇(15mL)中的悬浮液15分钟。然后将混合物在微波条件下于130℃加热1小时，之后在减压下除去溶剂。将剩余物由快速色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，99/1至95/5)纯化，得到3-(5-苄氧基-2-甲基-苯氧基甲基)-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺。(产量34.5mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C21H21N5O2+H[(M+H)+]计算值：376.1768。实测值：376.1768。
实施例16
3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-N-(4-氯-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺
步骤1
将3-羟基-4-甲基苯甲酸(10.73g，70.5mmol，Lancaster)在乙酸酐(25mL，265mmol，Aldrich)中的悬浮液加热回流5小时。在冷却至室温之后，将混合物倾倒入冰-水混合物(600mL)中，并且搅拌过夜。将固体块破碎并且通过过滤收集。将剩余物用水洗涤，并且在真空炉中干燥，得到3-乙酰氧基-4-甲基-苯甲酸，为茶色固体。(产量11.82g)。将3-乙酰氧基-4-甲基-苯甲酸(1.94g，10mmol)悬浮于亚硫酰二氯(3mL，40mmol，Aldrich)和N，N-二甲基-甲酰胺(3滴)中，并且加热回流2小时。在冷却至室温之后，将混合物用甲苯(30mL)稀释，并且在减压下浓缩。将得到的油状物溶解于二氯甲烷(30mL)中，并且滴加到4-氯苯胺(1.34g，10.5mmol，Aldrich)和N，N-二异丙基乙胺(1.6g，12.5mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液中。在搅拌另外2小时后，将混合物用水(50mL)稀释，并且搅拌另外30分钟。进行层分离。将有机层用水(50mL)洗涤。将水层用二氯甲烷(50mL)反洗。然后将有机层合并并且浓缩。将剩余物溶解于四氢呋喃(25mL)，甲醇(25mL)和1N氢氧化钠水溶液(10mL，10mmol)的混合物中。在搅拌16小时后，将混合物用水(100mL)和乙酸(5mL)稀释，并且在减压下浓缩，以除去大部分有机溶剂。将形成的沉淀物通过过滤收集，用水洗涤，并且干燥，得到N-(4-氯-苯基)-3-羟基-4-甲基-苯甲酰胺，为灰白色晶体。(产量2.57g)。
步骤2
将N-(4-氯-苯基)-3-羟基-4-甲基-苯甲酰胺(127.4mg，0.487mmol)和碳酸钾(77.7mg，0.551毫摩尔)的混合物于室温搅拌30分钟，之后加入3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(90.6mg，0.346毫摩尔，实施例5)。将反应物于室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩，以除去二甲基甲酰胺。将剩余物溶解于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物或者直接用于下一步骤(描述于实施例17中)或者由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化，得到纯的3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)N-(4-氯-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺，为白色固体。(产量25.0mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C21H17Cl2N5O2+H[(M+H)+]计算值：442.0830。实测值：442.0832。
实施例17
3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-N-(4-氯-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺
将氨气鼓泡通过3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-N-(4-氯-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺(24.0mg，实施例16)在2-丙醇(11mL)中的悬浮液15分钟。然后将混合物在微波条件下于130℃加热1小时，之后在减压下除去溶剂。将剩余物由快速色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，99/1至95/5)纯化，得到3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-N-(4-氯-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺。(产量19.2mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C21H19ClN6O2+H[(M+H)+]计算值：423.1327。实测值：423.1331。
实施例18
4-氯-3-[5-(4-氯-苄氧基)-2-甲基-苯氧基甲基]-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶
步骤1
将2，4-二羟基苯甲醛(6.62g，48mmol，Fluka)，氟化钾(5.57g，96mmol，Aldrich)和4-氯苄基氯(13.50g，84mmol，Aldrich)在乙腈(50mL)中的混合物于90℃加热24小时。冷却后，将混合物在***(2X100mL)和水(2X100mL)之间分配。将有机层用盐水(100mL)洗涤，合并，干燥(MgSO4)，过滤并且浓缩。将剩余物由快速色谱(Biotage75S，己烷，然后己烷-二氯甲烷1∶1，作为溶剂)纯化，得到部分分离。将纯的产物馏分合并，并且浓缩，将剩余物从具有痕量二氯甲烷的己烷中结晶，得到4-(4-氯-苄氧基)-2-羟基-苯甲醛，为白色晶体。(产量4.74g)。将母液和不纯的馏分合并并且进一步由快速色谱(Biotage40L，如上相同的溶剂)纯化并且将纯的馏分合并并且浓缩。将剩余物重结晶，得到第二批的4-(4-氯-苄氧基)-2-羟基-苯甲醛。(产量3.03g)。
步骤2
向4-(4-氯-苄氧基)-2-羟基苯甲醛(1.31g，5.0mmol)和氰基硼氢化钠(1.0g，15.9mmol，Aldrich)在四氢呋喃(30mL)中的溶液中，加入作为指示剂的甲基橙，使溶液为黄色；慢慢地加入1NHCl水溶液(7.5mL)，以保持溶液为橙色。然后将混合物于室温搅拌过夜。加入水，并且将混合物用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机相用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并且浓缩。将剩余物由用在己烷中的0-40％乙酸乙酯洗脱的快速色谱纯化，得到5-(4-氯-苄氧基)-2-甲基-苯酚。(产量0.43g)。
步骤3
将5-(4-氯-苄氧基)-2-甲基-苯酚(95.6mg，0.384mmol)和碳酸钾(58.2mg，0.421毫摩尔)的混合物于室温搅拌30分钟，之后加入3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(90.1mg，0.344毫摩尔，实施例5)。将反应物于室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩，以除去二甲基甲酰胺。将剩余物溶解于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化，得到纯的4-氯-3-[5-(4-氯-苄氧基)-2-甲基-苯氧基甲基]-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶，为白色固体。(产量38.0mg)。
实施例19
3-[5-(4-氯-苄氧基)-2-甲基-苯氧基甲基]-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺
将氨气鼓泡通过4-氯-3-[5-(4-氯-苄氧基)-2-甲基-苯氧基甲基]-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(37.0mg，实施例18)在2-丙醇(11mL)中的悬浮液15分钟。然后，将混合物在微波条件下于130℃加热1小时，之后在减压下除去溶剂。将剩余物由快速色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，99/1至95/5)纯化，得到3-[5-(4-氯-苄氧基)-2-甲基-苯氧基甲基]-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺。(产量25.0mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C21H20ClN5O2+H[(M+H)+]计算值：410.1379。实测值：410.1379。
实施例20
4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶
步骤1
将3-羟基-4-甲基苯甲酸(25.42g，167mmol，TCIUS)和浓硫酸(3mL)在无水乙醇(180mL)中的混合物加热回流20小时。冷却后，加入固体碳酸氢钠(10g)，以中和酸。将混合物在二***(2X400mL)和水(2X300mL)之间分配。将有机层用盐水(300mL)洗涤，合并，干燥(MgSO4)，过滤并且浓缩。将剩余物从己烷中重结晶，得到两批3-羟基-4-甲基-苯甲酸乙酯，为白色晶体。(产量29.14g)。
步骤2
将3-羟基-4-甲基苯甲酸乙酯(3.60g，20mmol)在无水肼(10mL，318mmol)(Aldrich)中的悬浮液加热回流(150℃浴温)3小时。在冷却至室温之后，将混合物在减压下浓缩，得到干燥固体。将其悬浮于二甲苯(50mL)中，并且在减压下浓缩。将得到的固体悬浮于原乙酸三乙酯(35mL，191mmol)(Aldrich)中，并且加热回流(150℃浴温)20小时，以除去乙醇。冷却后，加入二氯甲烷，并且通过过滤收集固体，得到2-甲基-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-苯酚，为灰白色晶体物质。(产量2.28g)。
将来自上述的滤液由快速色谱(Biotage40L，在二氯甲烷中的10％，然后40％乙酸乙酯，作为溶剂)纯化，得到第二批的2-甲基-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-苯酚，为白色晶体物质。(产量0.99g)。
步骤3
将2-甲基-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-苯酚(73.3mg，0.385mmol)和碳酸钾(60.9mg，0.432毫摩尔)的混合物于室温搅拌30分钟，之后加入3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(89.6mg，0.343毫摩尔，实施例5)。将反应物于室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩，以除去二甲基甲酰胺。将剩余物溶解于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物或者直接用于下一步骤或者由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化，得到纯的4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶，为白色固体。(产量34.9mg)。
实施例21
1-甲基-3-[2-甲基-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺
将氨气鼓泡通过4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(34.5mg，实施例20)在2-丙醇(11mL)中的悬浮液15分钟。然后将混合物在微波条件下于130℃加热1小时，之后在减压下除去溶剂。将剩余物由快速色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，99/1至95/5)纯化，得到1-甲基-3-[2-甲基-5-(5-甲基-[1，3，4]噁二唑-2-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-基胺。(产量15.0mg)。
实施例22
N-(3-氯-4-氟-苯基)-3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯甲酰胺
步骤1：
在磁力搅拌并且在冰-水浴中冷却的情况下，将3-氯-4-氟苯甲酰氯(21.23g，110mmol，Avocado)在四氢呋喃(50mL)中的溶液滴加到5-氨基-邻-甲酚(6.16g，50mmol，Aldrich)和三乙胺(17.5mL，125mmol，Aldrich)和四氢呋喃(50mL)的溶液中。当加入完成时，将混合物温热至室温并搅拌16小时。然后将混合物用水(125mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(125mL)稀释。在搅拌另外30分钟之后，收集沉淀物，得到粗制的3-氯-4-氟-苯甲酸5-(3-氯-4-氟-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯酯，为灰白色粉末。(产量21.83g，101％)。
将3-氯-4-氟-苯甲酸5-(3-氯-4-氟-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯酯(3.93g，9mmol)溶解于四氢呋喃(25mL)，甲醇(50mL)和1N氢氧化钠水溶液(9mL，9mmol)的混合物中。将混合物于室温搅拌18小时，然后在减压下浓缩，以除去大部分有机溶剂。将得到的悬浮液用水(45mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)稀释。在静置30分钟之后，将沉淀物收集，用水洗涤并且干燥，得到粗制的3-氯-4-氟-N-(3-羟基-4-甲基-苯基)-苯甲酰胺，为白色粉末。(产量2.59g，103％)。
步骤2：
将3-氯-4-氟-N-(3-羟基-4-甲基-苯基)-苯甲酰胺(105.9mg，0.379mmol)和碳酸钾(59.6mg，0.431mmol)在二甲基甲酰胺中的混合物于室温搅拌30分钟，之后加入3-溴甲基-4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶(90.7mg，0.347mmol，实施例5)。将反应物于室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩，以除去二甲基甲酰胺。将剩余物溶解于乙酸乙酯，用水洗涤，干燥并且浓缩。将粗制产物或者直接用于下一步骤或者由快速色谱(硅胶，己烷-乙酸乙酯，90/10至50/50)纯化，得到纯的3-氯-N-[3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-4-氟-苯甲酰胺，为白色固体。(产量35.5mg)。
实施例23
3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-N-(3-氯-4-氟-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺
将氨气鼓泡通过3-氯-N-[3-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-4-氟-苯甲酰胺(34.5mg，实施例22)在2-丙醇(11mL)中的悬浮液15分钟。然后将混合物在微波条件下于130℃加热1小时，之后在减压下除去溶剂。将剩余物由快速色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，98/2至90/10)纯化，得到3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-3-氯-4-氟-苯甲酰胺，为白色固体。(产量25.6mg)。
HRMS(ES+)m/z对于C21H18ClFN6O2+H[(M+H)+]计算值：441.1235。实测值：441.1237。
实施例24
下面证明本发明化合物的抗增殖活性。这些活性表明本发明的化合物可以用于治疗癌症，特别是实体瘤如乳腺肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、***肿瘤和黑素瘤。
激酶抑制分析(IC50)
用6H-MEK作为底物的c-RafHTRF分析(剂量响应)
分析原则：
分析利用6H-MEK作为底物。通过c-Raf磷酸化，磷酸化的6H-MEK用兔抗-磷酸基-MEK1/2，Eu-标记的抗兔和APC-标记的抗-6H抗体检测。
试剂和仪器：
酶：具有EE-标记的克隆人c-Raf；磷酸化的(与杆状病毒Hi5细胞中的v-src-FLAG共表达的)，0.2mg/mL(2.74μM，假定73kD分子量)，贮存于-15℃。
底物：WT全长6H-MEK，4.94mg/mL(154.4μM，假定32kD的MW)，贮存于-15℃。
抗体：兔(α-P-(Ser217/221)-MEK-1/2Ab(获自CellSignaling，Cat.#9121B，Lot14)Eu-(α-兔IgG(获自Wallac，Cat.#AD0083，Lot318663，710ug/mL，4.4μM)；(α-6H-SureLight-APC(获自Martek，Cat.#AD0059H，LotE012AB01，3.03μM)。
读数器：PerkinElmer的Envision，用412反射镜的HTRF读数模式。
分析板：基片全黑聚丙烯板(Cat.#4344)。
其它：复合板用Weidman384聚丙烯板(REMP)。
分析程序：
制备激酶分析缓冲液(KAB)：50mMHEPES(HyClone)pH7，10mMMgCl2，1mMDTT，0.1mMNa3V2O4，和0.3mg/mLBSA。
制备在KAB中的6H-MEK(150nM)。加入12μl/孔到分析板中。
制备在KAB中的ATP(66μM)。
在DMSO中，将化合物稀释到2.4mM并且将任何阳性对照稀释到480μM。在DMSO中进行10点3x稀释。撤回2.5μl/孔的DMSO溶液，并且加入到(3)中的27.5μl/孔ATP溶液中。
混合，然后将(4)中的6μl/孔的溶液加入到分析板中，对于在MEK磷酸化过程中的DMSO浓度为2.1％。
制备在KAB中的c-Raf(12nM)。
在柱1-2中，加入6μL/孔的KAB，并且在柱3-24中，加入6μL/孔的c-Raf。
于37℃温育30min。
制备在AB1中的兔(α-P-(Ser217/221)-MEK-1/2Ab(来自贮液的1∶240)：50mMHEPESpH7，0.2mg/mLBSA，和43mMEDTA。
为了停止反应，将来自(9)的6μL/孔的溶液加入到分析板中，并且于37℃温育30min。
制备在AB2中的Eu-(α-兔IgG(9nM)和(α-6H-SureLight-APC(120nM)：50mMHEPESpH7和0.2mg/mLBSA。
将来自(11)的6μL/孔的溶液加入到分析板中。
为了测定光谱干扰因子，按照步骤(1)至(10)制备两个样品。对于空白样品，加入6μL/孔的AB2。对于干扰因子样品，加入6μL/孔的Eu-抗兔IgG(9nM)。
于室温温育1.5小时。
在Envision上读出于615nm和665nm的HTRF信号。在光谱干扰校正后，标准化HTRF信号。
c-Raf的表达和纯化
在High-5细胞中表达N末端EE-标记的c-Raf。将5升培养物用EE-c-Raf和FLAG-vSrc为1∶2比率的病毒共转染，并且在48小时后收获。将细胞块在含有5mMEDTA，50mMKF，20mM焦磷酸钠，20mMβ-甘油磷酸酯，0.5mMNaVO3，1％NP-40(w/v)和CompleteProteaseTablets的TBS中裂解。将裂解产物于20,000xg离心1小时。将上清液与8mL的抗-EE标记-G蛋白琼脂糖于4℃温育2小时。然后，将树脂用30体积的上述缓冲液洗涤。将c-Raf蛋白通过与含有100mg/mL的EE肽的上述缓冲液于4℃温育1小时而洗脱。使用具有YM10膜的AmiconStirCell浓缩蛋白。将浓缩的蛋白相对于含有1mMDTT和30％甘油的TBS透析。由BioRadDC方法测定蛋白浓度。
6H-MEK1(62-393)的纯化
将含有用于表达6H-MEK1(62-393)的质粒的大肠杆菌细胞在RichMedia中生长，并且用1mMIPTG于22℃诱导24小时。将细胞块重新悬浮于50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0，300mMNaCl，5mMMgCl2，10mMCHAPS，2mMTCEP和CompleteProteaseInhibitorTablets中。由超声波破坏细胞。将裂解产物通过于13,000xg离心45分钟而清除。将上清液用50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0，10mM咪唑，4mMTCEP，300mMNaCl，10mMCHAPS，2mM吡咯-2-羧酸酯，和100mMZnCl2以1∶1稀释，然后与TALON金属亲和性树脂于4℃温育1小时。
将树脂用10体积的50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0，5mM咪唑，2mMTCEP，300mMNaCl，10mMCHAPS，1mM吡咯-2-羧酸酯，和50mMZnCl2洗涤。蛋白通过与5体积的20mMHEPES，pH8.0，100mMEDTA，2mMTCEP，10％v/v甘油于4℃温育1小时而洗脱。使用具有10KdMW截止膜(cutoffmembrane)的AmiconUltra15装置浓缩洗脱的材料。然后将样品在Superdex20026/60柱上进行尺寸排阻色谱。将6H-MEK1Peak汇集并且如上所述浓缩。由BioRad方法测定蛋白。
用6H-MEK作为底物的b-Raf野生型HTRF分析(剂量响应)
分析原则：
分析利用6H-MEK作为底物。通过b-RafWT磷酸化，磷酸化的6H-MEK用兔抗-磷酸基-MEK1/2，Eu-标记的抗兔和APC-标记的抗-6H抗体检测。
试剂和仪器：
酶获自Upstate的具有N-末端GST-标记的重组人b-Raf残基416-端(由在Sf21昆虫细胞中的杆状病毒表达)，0.26mg/mL(3.87μM，假定67.2kD的分子量)Cat.#14-530M，Lot#25502AU，贮存于-80℃。
底物：WT全长6H-MEK，4.94mg/mL(154.4μM，假定32kD的MW)，贮存于-15℃。
抗体：兔(α-P-(Ser217/221)-MEK-1/2Ab(获自CellSignaling，Cat.#9121B，Lot14)Eu-(α-兔IgG(获自Wallac，Cat.#AD0083，Lot318663，710ug/mL，4.4μM)；(α-6H-SureLight-APC(获自Martek，Cat.#AD0059H，LotE012AB01，3.03μM)。
读数器：PerkinElmer的Envision，用412反射镜的HTRF读数模式。
分析板：基片全黑聚丙烯板(Cat.#4344)。
其它：复合板用Weidman384聚丙烯板(REMP)。
分析程序：
制备激酶分析缓冲液(KAB)：50mMHEPES(HyClone)pH7，10mMMgCl2，1mMDTT，0.1mMNa3V2O4，和0.3mg/mLBSA。
制备在KAB中的6H-MEK(150nM)。加入12μL/孔到分析板中。
制备在KAB中的ATP(66μM)。
在DMSO中，将化合物稀释到2.4mM并且将任何阳性对照稀释到480μM。在DMSO中进行10点3x稀释。撤回2.5μL/孔的DMSO溶液，并且加入到(3)中的27.5μL/孔ATP溶液中。
混合，然后将(4)中的6μL/孔的溶液加入到分析板中，对于在MEK磷酸化过程中的DMSO浓度为2.1％。
制备在KAB中的b-RafWT(100pM)。
在柱1-2中，加入6μL/孔的KAB，并且在柱3-24中，加入6μL/孔的b-RafWT。
于37℃温育30min。
制备在AB1中的兔(α-P-(Ser217/221)-MEK-1/2Ab(来自贮液的1∶200)：50mMHEPESpH7，0.2mg/mLBSA，和43mMEDTA。
为了停止反应，将来自(9)的6μL/孔的溶液加入到分析板中，并且于37℃温育30min。
制备在AB2中的Eu-(α-兔IgG(9nM)和(α-6H-SureLight-APC(180nM)：50mMHEPESpH7和0.2mg/mLBSA。
将来自(11)的6μL/孔的溶液加入到分析板中。
为了测定光谱干扰因子，按照步骤(1)至(10)制备两个样品。对于空白样品，加入6μL/孔的AB2。对于干扰因子样品，加入6μL/孔的Eu-抗兔IgG(9nM)。
于室温温育1.5小时。
在Envision上读出于615nm和665nm的HTRF信号。在光谱干扰校正后，标准化HTRF信号。
用6H-MEK作为底物的b-RafV600E突变型HTRF分析(剂量响应)
分析原则：
分析利用6H-MEK作为底物。通过b-RafV600E磷酸化，磷酸化的6H-MEK用兔抗-磷酸基-MEK1/2，Eu-标记的抗兔和APC-标记的抗-6H抗体检测。
试剂和仪器：
酶：获自Upstate的具有N-末端GST-标记的含V600E突变的重组人b-Raf残基416-端；(由在Sf21昆虫细胞中的杆状病毒表达)，0.26mg/mL(7.49μM，假定67.3kD的分子量)Cat.#14-5M，Lot#25633AU，贮存于-80℃。
底物：WT全长6H-MEK，4.94mg/mL(154.4μM，假定32kD的MW)，贮存于-15℃。
抗体：兔(α-P-(Ser217/221)-MEK-1/2Ab(获自CellSignaling，Cat.#9121B，Lot14)Eu-(α-兔IgG(获自Wallac，Cat.#AD0083，Lot318663，710ug/mL，4.4μM)；(α-6H-SureLight-APC(获自Martek，Cat.#AD0059H，LotE012AB01，3.03μM)。
读数器：PerkinElmer的Envision，用412反射镜的HTRF读数模式。
分析板：基片全黑聚丙烯板(Cat.#4344)。
其它：复合板用Weidman384聚丙烯板(REMP)。
分析程序：
(1)制备激酶分析缓冲液(KAB)：50mMHEPES(HyClone)pH7，10mMMgCl2，1mMDTT，0.1mMNa3V2O4，和0.3mg/mLBSA。
(2)制备在KAB中的6H-MEK(150nM)。加入12μL/孔到分析板中。
(3)制备在KAB中的ATP(66μM)。
(4)在DMSO中，将化合物稀释到2.4mM并且将阳性对照稀释到480μM。在DMSO中进行10点3x稀释。撤回2.5μL/孔的DMSO溶液，并且加入到(3)中的27.5μL/孔ATP溶液中。
(5)混合，然后将(4)中的6μL/孔的溶液加入到分析板中，对于在MEK磷酸化过程中的DMSO浓度为2.1％。
(6)制备在KAB中的b-RafV600E(100pM)。
(7)在柱1-2中，加入6μL/孔的KAB，并且在柱3-24中，加入6μL/孔的b-RafV600E。
(8)于37℃温育30min。
(9)制备在AB1中的兔α-P-(Ser217/221)-MEK-1/2Ab(来自贮液的1∶200)：50mMHEPESpH7，0.2mg/mLBSA，和43mMEDTA。
(10)为了停止反应，将来自(9)的6μL/孔的溶液加入到分析板中，并且于37℃温育30min。
(11)制备在AB2中的Eu-α-兔IgG(9nM)和α-6H-SureLight-APC(180nM)：50mMHEPESpH7和0.2mg/mLBSA。
(12)将来自(11)的6μL/孔的溶液加入到分析板中。
(13)为了测定光谱干扰因子，按照步骤(1)至(10)制备两个样品。对于空白样品，加入6μL/孔的AB2。对于干扰因子样品，加入6μL/孔的Eu-抗兔IgG(9nM)。
(14)于室温温育1.5小时。
(15)在Envision上读出于615nm和665nm的HTRF信号。在光谱干扰校正后，标准化HTRF信号。
分析数据
表1：激酶酶抑制分析(IC50)
实施例 cRaf IC50(μM) bRaf野生 型 IC50(μM) bRaf(V600E) IC50(μM)
9 ＜10 ＜10 ＜10
17 ＜10 ＜10 ＜10
23 ＜10 ＜10 ＜10
13 ＜10 ＞10 ＞10
11 ＜10 ＜10 ＜10
15 ＜10 ＜10 ＜10
7 ＜10 ＞10 ＞10
19 ＜10 ＜10 ＜10
21 ＜10 ＞10 ＞10

Claims (17)

1.化合物，其是根据式(I)的一种化合物：
其中
R是低级烷基；
环A选自：
苯基；和
被1至4个取代基取代的苯基，所述的取代基独立地选自：低级烷基；低级烷氧基；和被低级烷氧基取代的低级烷氧基；
环B选自：
吡咯基，唑基，二唑基，噻唑基，咪唑，***基和四唑基；
被1至5个取代基取代的杂芳基，所述的取代基选自：低级烷基；氟化(C1-7)烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；和-NR1R2，其中所述杂芳基选自吡咯基，唑基，二唑基，噻唑基，咪唑，***基和四唑基；
苯基；和
被1至5个取代基取代的苯基，所述的取代基选自：低级烷基；氟化(C1-7)烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；和-NR1R2；
R1和R2各自独立地选自：氢；低级烷基；和被羟基或低级烷氧基取代的低级烷基；和
L选自：键，-OCH2-，-CH2O-，-NHCO-，-CONH-，-O-，-OCH2CH2-，-CH2OCH2，-CH2CH2O-，-NH-，-NHCH2-，-CH2NH-，-SCH2-，-CH2S-，-S-，和低级烷基；
条件是，当L是键时，环B是被1至4个取代基取代的唑，所述的取代基选自：低级烷基；氟化(C1-7)烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；和-NR1R2；
或根据式(I)的化合物的药用盐，
其中低级烷基是(C1-6)烷基，
低级烷氧基是(C1-6)烷基连接到氧原子上的基团，
唑是指5-元芳族单环基团，含有至少一个杂原子氮。
2.根据权利要求1的化合物，其中L是键，并且环B是被1至4个取代基取代的唑，所述的取代基选自：低级烷基；氟化(C1-7)烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；和-NR1R2；并且所述唑选自：1,3,4-二唑，1,2,4-二唑，1,2,3-***，1,2,4-***和四唑。
3.根据权利要求2的化合物，其中环B是1,3,4-二唑。
4.根据权利要求1的化合物，其中环A是被甲基在相对于1-烷基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基甲氧基是邻位的位置取代的苯基。
5.根据权利要求1的化合物，其中R是甲基。
6.根据权利要求1的化合物，其中L选自：-CH2O-，-NHCO-和-CONH-。
7.根据权利要求1的化合物，其中：
环A选自：苯基和被甲基取代的苯基；
L是键；并且
环B是被1至4个取代基取代的唑，所述的取代基选自：低级烷基；氟化(C1-7)烷基；羟基；低级烷氧基；被羟基或低级烷氧基取代的低级烷氧基；卤素；和-NR1R2。
8.根据权利要求7的化合物，其中所述唑选自：1,3,4-二唑；1,2,4-二唑；1,2,3-***；1,2,4-***；和四唑。
9.根据权利要求1的化合物，其中
R是(C1-6)烷基；
环A是未取代的或被(C1-6)烷基取代一次的苯基；
L是–CH2-O-，-O-CH2-，-C(O)-NH-或-NH-C(O)-；
环B是苯基，所述苯基是未取代的或被取代基取代1或2次的，所述的取代基独立地选自：
卤素，或
-NH-(CH2)2-OH；
或
L是键，并且
环B是3-甲基-[1,2,4]二唑-5-基。
10.根据权利要求1的化合物，所述的化合物选自：
3-(3-苄氧基-苯氧基甲基)-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基胺；
N-[3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-3-氯-4-(2-羟基-乙基氨基)-苯甲酰胺；
N-[3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-4-甲基-苯基]-3-氯-苯甲酰胺；
4-氯-1-甲基-3-[2-甲基-5-(3-甲基-[1,2,4]二唑-5-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶；
3-(5-苄氧基-2-甲基-苯氧基甲基)-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基胺；
3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-N-(4-氯-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺；
3-[5-(4-氯-苄氧基)-2-甲基-苯氧基甲基]-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基胺；
1-甲基-3-[2-甲基-5-(5-甲基-[1,3,4]二唑-2-基)-苯氧基甲基]-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基胺；
3-(4-氨基-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基甲氧基)-N-(3-氯-4-氟-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺；和
上述化合物中任何一种的药用盐。
11.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1的化合物和载体。
12.一种单位剂量制剂，其包含治疗有效量的根据权利要求1的化合物和载体。
13.根据权利要求1至10中任何一项的化合物在制备药剂中的应用，所述的药剂用于治疗增殖性疾病。
14.根据权利要求1至10中任何一项的化合物在制备药剂中的应用，所述的药剂用于治疗癌症。
15.根据权利要求14的应用，所述的药剂用于治疗实体瘤。
16.根据权利要求14的应用，所述的药剂用于治疗乳腺肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、***肿瘤和黑素瘤。
17.一种用于制备根据权利要求1的化合物的方法，其中
a)将下式的1-低级烷基-3-溴甲基-4-氯-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物
与式(II)化合物反应
得到相应的式(III)化合物
和
b)将所述的式(III)化合物进一步与氨反应，得到相应的根据权利要求1的式(I)化合物；其中所有取代基具有权利要求1中给出的含义。
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