CN101709297A - 一种花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法。在对高山被孢霉发酵生产AA过程中的微生物糖酵解途径、三羧酸转运体系和脂肪酸合成途径及其它相关途径进行分析后，选用了碘乙酸、乙酰水杨酸作为筛选剂，经过种子的活化、种子的培养、种子液的预处理、种子处理液进行诱变、初筛、复筛、再筛等几个步骤，能得到花生四烯酸生长速率快、发酵周期短、花生四烯酸产量提高幅度很高的菌株，是一种很理想的菌种理性选育技术，具有很高的经济效益和社会效益，工业化前景看好。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是高山被孢霉发酵法生产花生四烯酸的领域，具体涉及获得一株高产量高山被孢霉的诱变筛选方法。
背景技术
花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)是属于ω-6系列的重要不饱和脂肪酸，是人体***素合成的重要前体物质，也是人体中含量最高，分布最广的一种多不饱和脂肪酸。它在降血脂、抑制血小板聚集、抗炎症、抗癌、抗脂质氧化、促进脑组织发育等方面具有独特的生物活性，因此应用领域十分广泛，引起了人们极大的兴趣。花生四烯酸广泛而少量地存在于动物体和微生物中，目前，商业化花生四烯酸主要来源于动物脂质或深海鱼油。但是由于资源有限，而且所提取的产品中花生四烯酸含量很低，不仅产品质量不能满足人们的消费需求，而且成本一直居高不下，不适合于大规模生产，因而长期以来其研究和应用一直受到限制。利用微生物发酵法生产花生四烯酸由于具有不受原材料和气候限制、生产周期短、成本较低、产物含量高、分离提取容易等优点，已成为当前的研究热点。
花生四烯酸的生产菌种主要是霉菌，以被孢霉为最。一个好的菌种是发酵工业的核心，近年来，世界各国相继对菌种选育进行了研究。1987年Yamada等从土壤中分离得到多株AA产生菌，经自然选育获得一株高产菌Mortierella elongata IS-5，利用葡萄糖作碳源进行发酵生产，AA产量为4.3g/L。2000年，姚建铭等利用离子束注入生物技术对Mortierella alpine进行诱变，筛选得到一株高产菌，每升培养液可得生物量30.80g，干菌体油脂含量为25.8％，花生四烯酸的含量占总脂的45.37％。2004年，Eiji等MNNG诱变M.alpina 1S-4得到了ω-3脱氢酶活性低的突变株Y11，其AA产量可达到4.97g/L。2008年，赵沫等以轮梗霉紫外诱变突变株A1.13为出发菌株，制备其原生质体并连续采用紫外线、微波及硫酸二乙酯作为诱变剂进行多轮诱变，通过15℃低温和0.12g/mL乙酰水杨酸初筛及摇瓶发酵复筛，得到花生四烯酸产量提高的突变株MW40+DES20 II-4，其花生四烯酸占总脂肪酸的含量提高到15.098％。从国内外文献总结发现，目的都是为了提高花生四烯酸最终产量，但是很多菌种选育手段较繁琐，过程冗长，且较盲目，随机性较大，耗费了大量的人力和物力。
在本发明申请之前，也有一些关于花生四烯酸菌种选育相关专利的报道(公开号有CN1362522A，CN1587378A)。其中在CN1362522A中，以高山被孢霉为出发菌株，通过N+离子注入诱变，得到一株活性较好的诱变菌，经过发酵，生物量可达到30g/L，油脂10.8g/L，花生四烯酸产率4.65g/L，该专利缺点一方面是离子注入与霉菌相互作用的机理研究不够完善，另一方面是花生四烯酸产量较低，难以抵制外界同行竞争者带来的压力。公开号CN1587378A中，公开了一种花生四烯酸高产菌的分离筛选方法，效果明显，但这仅仅只是一种自然选育的过程，AA产量不能得到大幅度的提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单易于实现的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法。
为解决上述技术问题，本发明的思路主要基于代谢途径的理性选育技术，通过对花生四烯酸生物合成代谢网络分析，选择了合适的筛选剂，选择筛选剂的出发点是通过对花生四烯酸合成代谢途径进行分析，对关键中间代谢产物进行调控来获得花生四烯酸产量较高的菌株。
具体的技术方案如下：
一种花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，包括如下步骤：
(1)种子的活化；
(2)种子的培养；
(3)种子液的预处理：
(3a)种子液经无菌生理盐水稀释、震荡、过滤后得到分散均匀的菌悬液；
(3b)将菌悬液中加入氯化锂，震荡处理1～6h；
(4)对步骤(3b)得到的种子处理液进行诱变；
(5)筛选：
(5a)初筛：将步骤(4)得到的诱变后的菌悬液涂布于含有EMP途径抑制剂和***素合成酶抑制剂的平板上，挑出最先长出且直径较大的单菌落；
(5b)复筛：将挑出的单菌落转接斜面，待斜面长满后，再进行摇瓶培养，向种子液中加入红四氮唑染色剂，通过观察，挑选出变色时间最短、颜色最深的菌落；
(5c)再筛：将复筛挑出的种子液进行摇瓶发酵培养，以生物量、油脂产量、花生四烯酸产量为最终筛选指标，挑出花生四烯酸生长能力最强的菌株。
步骤(1)中，种子的活化方法为：将菌丝体接种于PDA斜面或添加了营养因子的PDA斜面25～28℃培养5～7天，其中，所述的营养因子为酵母膏、蛋白胨和牛肉膏中的任意一种或几种的混合物，营养因子的添加量为1～5g/L。
步骤(2)中，种子的培养方法为：活化好的菌丝体斜面用5～10mL的无菌水将菌丝体洗下来，然后将菌丝体接入摇瓶种子培养基中，接种量10～20％(v/v)，20～28℃培养48～72h，待种子生长至对数生长期。
步骤(3a)中，种子液接入已经灭菌处理过的铺有玻璃珠的凹槽三角瓶中，用体积为种子液的8～10倍、浓度为0.9g/100mL的无菌生理盐水稀释，25℃，250rpm震荡处理25～30min，用无菌的2～8层纱布或脱脂棉过滤，得到分散均匀的菌悬液；
步骤(3b)中，菌悬液加入装有体积与菌悬液相同、浓度为0.6～2.0g/100mL的氯化锂的生理盐水液的三角瓶中(浓度为0.6～2.0g/100mL的氯化锂的生理盐水液的配制方法为：先配制0.9g/100mL的无菌生理盐水，再溶入0.6～2.0g/100mL的氯化锂)，将三角瓶置于震荡培养箱中20～28℃，转速100～150r/m处理1～6h。
步骤(4)中，所述的诱变方法为紫外复合氯化锂诱变法，即将步骤(3b)得到的加入了氯化锂的菌悬液置于15～30W紫外灯下，照射距离20～35cm，照射时间为60～80s。
步骤(5a)中，所述的EMP途径抑制剂为碘乙酸，加入量为0.03～0.075g/L；所述的***素合成酶抑制剂为乙酰水杨酸，加入量为0.1～0.4g/L。本发明通过对高山被孢霉发酵生产花生四烯酸过程中的微生物糖酵解途径、三羧酸转运体系和脂肪酸合成途径及其它相关途径进行分析，发现：a，碘乙酸通过降低3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性，抑制了EMP途径，相应强化HMP途径，从而产生较多的NADPH，而NADPH的大量供应正是花生四烯酸合成的关键点，能够有效地促进花生四烯酸的合成；b，乙酰水杨酸能通过对***素合成酶的氨基末端的乙酰化来抑制***素合成过程中的氧化反应，从而乙酰水杨酸会抑制花生四烯酸的生物合成，筛选对乙酰水杨酸具有抗性的菌株，也可以提高花生四烯酸的生成。因此，本发明选用了碘乙酸和乙酰水杨酸作为“筛子”。
步骤(5b)中，所述的红四氮唑染色剂为浓度为2～4g/L的红四氮唑水溶液，红四氮唑水溶液的加入体积与种子液体积比为1∶0.25～2。
其中，所述种子培养基配方为：葡萄糖20～60g/L，酵母膏3～6g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，硝酸钠2～5g/L，七水硫酸镁0.3～1g/L，其余为水，pH6.0～8.5。
其中，所述发酵培养基配方为：葡萄糖60～150g/L，酵母膏5～12g/L，磷酸二氢钾2～6g/L，硝酸钠2～6g/L，七水硫酸镁0.5～1g/L，其余为水。
其中，碘乙酸的预处理方法为去离子水溶解后再利用0.22μm或0.44μm无菌水膜过滤，避光保存；乙酰水杨酸的预处理方法为无水乙醇溶解后再利用0.22μm或0.44μm无菌有机膜过滤，避光保存。
有益效果：本发明在对高山被孢霉发酵生产AA过程中的微生物糖酵解途径、三羧酸转运体系和脂肪酸合成途径及其它相关途径进行分析后，选用了碘乙酸、乙酰水杨酸作为筛选剂，经过初筛、复筛、再筛等几个步骤，能得到花生四烯酸生长速率快、发酵周期短、花生四烯酸产量提高幅度很高的菌株，是一种很理想的菌种理性选育技术，可以实现花生四烯酸产生菌高山被孢霉的高通量筛选，具有很高的经济效益和社会效益，工业化前景看好。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的首选培养基配方如下：
种子培养基：葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硝酸钠3g/L，七水硫酸镁0.6g/L，其余为水。
固体培养基：PDA+PE+BE：土豆汁200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1.5g/L，牛肉膏1.5g/L，琼脂20g/L(如未说明，均为PDA)。
发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硝酸钠6g/L，七水硫酸镁1g/L，其余为水。
实施例1：
①种子的活化：
将高山被孢霉菌种ATCC 16266接种于PDA+PE+BE斜面28℃培养5天。
②种子的培养：
待①斜面长满后，用10mL无菌水洗下菌丝，接种于种子培养基中，接种量20％(v/v)，25℃培养60小时，此时种子已生长至对数生长期。
③种子液的预处理：
预处理方法：②所得的种子液5mL，接入已经灭菌处理过的铺有玻璃珠的250mL凹槽三角瓶中，加入0.9g/100mL的无菌生理盐水45mL，25℃，250r/m震荡处理30min，用灭过菌的4层纱布过滤，所得到的菌悬液取5mL加入装有5mL浓度为0.6～2.0g/100mL的LiCl的生理盐水液的无菌三角瓶中，将三角瓶置于震荡培养箱中25℃、转速120r/m处理2h。
④种子液的诱变：
将③所得种子处理液注入置有磁力搅拌棒的无菌空白培养皿中，菌液厚度2mm，黑暗条件下进行紫外诱变。诱变条件：紫外灯30W，照射距离30cm，照射时间为75s。红灯条件下，取出培养皿，用0.9g/100mL的生理盐水稀释后进行平板涂布。
⑤筛选：
a，将④得到的种子液在红灯条件下用生理盐水稀释10倍，涂布在含有0.075g/L碘乙酸和0.2g/L乙酰水杨酸的固体平板上，黑暗培养2天，挑出最先长出的，菌落直径大的菌株30株。
b，将挑出的30株菌株转接PDA斜面，再进行种子摇瓶培养。取种子液2mL于试管中，28℃保温平衡后，加入2滴3g/L红四氮唑水溶液(约1mL)，摇匀，计时，挑出颜色较深，变色时间最短的菌株10株。
c，将挑出的10株菌株种子液接种至发酵培养基中，接种量为10％(v/v)，发酵至糖耗为零，时间6.5-7天，分别测定生物量、油脂产量及花生四烯酸产量，进行对照比较，得到5株生物量、油脂产量、AA产量均比原始菌株高许多的菌株，分别命名为HM-1，HM-2，HM-3，HM-4，HM-5。
实施例2：遗传稳定性考察。
将实施例1得到的5株高产菌株进行遗传稳定性考察，传代10次，每传代1次均进行摇瓶发酵实验，测定其生物量、油脂产量和AA产量。实验证明，经过多次传代并发酵验证，生物量、油脂产量和AA产量均与活化一次的发酵水平相当，其中AA产量最高和生长活力最强的是HM-5，在初糖浓度为60g/L条件下，生物量稳定在35g/L左右，油脂产量维持在18g/L左右，AA产量维持在9g/L左右。
实施例3：菌株诱变前后发酵性能比较。
将菌株HM-5进行实验室50mL摇瓶发酵培养，温度25℃，转速120rpm，初始糖浓度60g/L，发酵7天。对比诱变前后发酵结果，见表1。
表1菌株诱变前后发酵结果对比
| 生物量(g/L) | 总油脂(g/L) | AA产量(g/L) | 发酵时间(h) | AA产率(g/L·h) | |
| 原始菌株 | 25.0 | 13.0 | 5.1 | 168 | 0.03 |
| HM-5 | 35 | 18 | 9 | 156 | 0.058 |
由上表得，诱变后菌株生长活性增高，发酵时间明显缩短，AA产率由0.03g/L·h增长至0.058g/L·h。
实施例4：
同实施例1的方法，所不同的是步骤⑤中，碘乙酸加入量为0.03g/L；所述的***素合成酶抑制剂为乙酰水杨酸，加入量为0.4g/L。
Claims (10)
1.一种花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)种子的活化；
(2)种子的培养；
(3)种子液的预处理：
(3a)种子液经无菌生理盐水稀释、震荡、过滤后得到分散均匀的菌悬液；
(3b)将菌悬液中加入氯化锂，震荡处理1～6h；
(4)对步骤(3b)得到的种子处理液进行诱变；
(5)筛选：
(5a)初筛：将步骤(4)得到的诱变后的菌悬液涂布于含有EMP途径抑制剂和***素合成酶抑制剂的平板上，挑出最先长出且直径较大的单菌落；
(5b)复筛：将挑出的单菌落转接斜面，待斜面长满后，再进行摇瓶培养，向种子液中加入红四氮唑染色剂，通过观察，挑选出变色时间最短、颜色最深的菌落；
(5c)再筛：将复筛挑出的种子液进行摇瓶发酵培养，以生物量、油脂产量、花生四烯酸产量为最终筛选指标，挑出花生四烯酸生长能力最强的菌株。
2.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(1)中，种子的活化方法为：将菌丝体接种于PDA斜面或添加了营养因子的PDA斜面25～28℃培养5～7天，其中，所述的营养因子为酵母膏、蛋白胨和牛肉膏中的任意一种或几种的混合物，营养因子的添加量为1～5g/L。
3.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(2)中，种子的培养方法为：活化好的菌丝体斜面用5～10mL的无菌水将菌丝体洗下来，然后将菌丝体接入摇瓶种子培养基中，接种量10～20％(v/v)，20～28℃培养48～72h，待种子生长至对数生长期。
4.根据权利要求3所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于所述的种子培养基配方为：葡萄糖20～60g/L，酵母膏3～6g/L，磷酸二氢钾2～5g/L，硝酸钠2～5g/L，七水硫酸镁0.3～1g/L，其余为水，pH6.0～8.5。
5.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(3a)中，种子液接入已经灭菌处理过的铺有玻璃珠的凹槽三角瓶中，用体积为种子液的8～10倍、浓度为0.9g/100mL的无菌生理盐水稀释，25℃，250rpm震荡处理25～30min，用无菌的2～8层纱布或脱脂棉过滤，得到分散均匀的菌悬液。
6.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(3b)中，菌悬液加入装有体积与菌悬液相同、浓度为0.6～2.0g/100mL的氯化锂的生理盐水液的三角瓶中，将三角瓶置于震荡培养箱中20～28℃、转速100～150r/m处理1～6h。
7.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(4)中，所述的诱变方法为紫外复合氯化锂诱变法，即将步骤(3b)得到的加入了氯化锂的菌悬液置于15～30W紫外灯下，照射距离20～35cm，照射时间为60～80s。
8.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(5a)中，所述的EMP途径抑制剂为碘乙酸，加入量为0.03～0.075g/L；所述的***素合成酶抑制剂为乙酰水杨酸，加入量为0.1～0.4g/L。
9.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(5b)中，所述的红四氮唑染色剂为浓度为2～4g/L的红四氮唑水溶液，红四氮唑水溶液的加入体积与种子液体积比为1∶0.25～2。
10.根据权利要求1所述的花生四烯酸产生菌高山被孢霉的诱变筛选方法，其特征在于步骤(5c)中，所述的发酵培养，其培养基配方为：葡萄糖60～150g/L，酵母膏5～12g/L，磷酸二氢钾2～6g/L，硝酸钠2～6g/L，七水硫酸镁0.5～1g/L，其余为水。
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