CN103468575B - 一株高产dha的寇氏隐甲藻突变株及发酵方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产DHA的寇氏隐甲藻突变株及发酵方法和应用，ATCC30772寇氏隐甲藻藻株经60Co-γ射线辐照诱变，筛选出了一株高产DHA的寇氏隐甲藻突变株，寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）2.4K-2A2-5 2.4K-2A2-5，CCTCC NO:M2012151。该株的油脂质量和含油率分别比出发株提高了51.66%和66.37%，平均DHA含量达到39.04%，比出发株提高了3.39%，其DHA产量按g/L发酵液计，比出发株提高了56.92%。该寇氏隐甲藻ATCC30772突变株发酵生产的DHA具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和生物工程和油脂工程，具体涉及一株高产DHA的寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii(seligo)JavoruicKy）的突变株，还涉及该突变株的制备方法，还涉及该突变株在制备DHA中的应用。
背景技术
脂类是人体必不可少的组成部分，具有许多重要的生理功能，脂肪酸又是脂类的关键成分，根据双键存在与否，分饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs）；据双键离甲基端的位置，又分为ω-3，ω-6，ω-9等不饱和脂肪酸。1971年，丹麦科学家Dyeherg J.在格陵兰岛发现爱斯人少患心血管疾病，这可能是由于食用了含有DHA等ω-3的PUFAs。DHA因其对人体的特殊功能，被科学家誉为“脑黄金”而倍受青睐。开发利用DHA资源已成为全世界生物学家、营养学家、油脂学家、医学学家等研究的热门方向之一。
目前市场上销售的DHA产品大多来自深海鱼油。由于鱼油中含有难以除去的胆固醇或二噁英、联苯等有毒物质和鱼腥味，导致纯化成本极高或质量不能达标。因为鱼油中的DHA不是鱼自身合成的，而是鱼食用了含有DHA的藻类、细菌等因素在脂肪中积累的，故鱼油中的DHA含量受到环境、季节、鱼饵料、气候、温度等的极大影响，这就限制人从鱼油中提取的DHA在食品行业和医药行业中的应用。利用微生物生产DHA，尤其是利用寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii(seligo)JavoruicKy）（Seligo,A,1985,Beitraege Biol.Pflanzen4:145-180.）可进行发酵生产DHA，且具有脂肪酸组成简单，DHA含量高，没有鱼腥味，也没有杀虫剂有机氯化物和金属离子的活性等优点。上世纪九十年代起，世界各地兴起了利用微生物发酵法生产多不饱和脂肪酸的研究、生产和应用。
DHA具有健脑益智的作用，DHA是大脑的主要组成成分之一，约占脑细胞脂肪酸的10%左右。在胎儿期，DHA必须从人体获得，如母体摄入DHA量不足，会导致胎儿脑细胞发育和生长不正常，严重的会导致弱智。婴幼儿期，DHA促进大脑生长发育，摄食富含DHA的食物，可以促进思维敏捷，增强语言能力和学习能力。青少年学生期，多多摄入DHA，可增强记忆力，改善注意力。对成年人而言，DHA也是维系脑功能必不可少的脂肪酸。否则，尤其是老年人可能会发生心情抑郁，注意力不集中和办事效率低下，甚至导致老年痴呆症等。因而DHA脂肪酸对人的一生是不可缺的，称其为人体的“脑黄金”一点也不过分。
DHA具有抗凝血，抑制血小板聚集和血栓形成，从而预防和治疗心血管疾病的作用。DHA在人的视网膜中含量丰富，如长期缺乏DHA，人的视力会降低。DHA能明显抑制肿瘤的发生、成长和转移。大量临床和实验研究表明ω-3系列（DHA）长链不饱和脂肪酸与有促进癌细胞生长的ω-6系列长链不饱和脂肪酸形成竞争吸收，对癌症有抑制作用。而且ω-3与ω-6的比率是控制癌细胞发展的一个重要指标。因而，DHA在癌症的预防和治疗工作中具有重要的作用。
除上述作用外，DHA还有增强机体免疫作用和抗炎症等功能。
一般认为，除了鱼类和一些海产品含有DHA外，牛、猪、禽肉以及蛋、谷物、水果、蔬菜中不含DHA。传统的鱼油是DHA的主要来源，但从鱼油中提取DHA工艺复杂，成本高，资源减少，除去腥味和胆固醇的难度较大并且含有污染物，鱼油中DHA又因季节、环境、气候、摄食种类不同的鱼而有很大差异，而且鱼类本身不合成DHA，而是鱼类摄食了能合成DHA而积累于体内的藻类和浮游植物等水生物。而获得的科学家研究发现浮游植物和藻类中，DHA含量占总脂肪酸的12-34%，其中研究最多的是海洋微藻——寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii(seligo)JavoruicKy）（Seligo,A,1985,Beitraege Biol.Pflanzen4:145-180.）。
自然条件下，寇氏隐甲藻多以一个物种的综合体的形式出现，它经常寄生于其它藻类中。它分布广泛，海洋、红树林、污染的含盐的河流和湖泊，甚至冷冻的港湾都是其栖息地，然而分布在不同的地区的寇氏隐甲藻，基因并不完全相同。它尽管能游动，但1Km/年的游动速度表明它的自身的游动只是决定其分布广泛的次要因素，主要因素是其随海洋环流和大型藻类的移动而移动（Beam Camd Himes M,1982,J.Protozool29:8-15）,这就决定了不同研究人员从不同地区分离纯化出来的寇氏隐甲藻藻种不尽相同。
寇氏隐甲藻以游动细胞和孢囊的两种形式存在（Bhaudy and almon JM,1991,J.Cell Sci100:675-682）孢囊形式的寇氏隐甲藻比游动细胞具有更高的油脂和DHA含量（Ratledge,2003,GB Patent103301），但各地的分离株，其油脂和DHA含量也不尽相同。C.Cohnii在实验室中已有相当长时间的研究历史，可追溯到1908年，大量的研究报告从未显示这种藻类具有致病性或毒性（张秋会、马莺，2003，西部粮油科技（6）：32-34）。
在研究实践中，因为寇氏隐甲藻常常是大孢囊和小孢囊混为一体，很难将其纯化分离成单一体，大小孢囊体总是在同一藻落中生长，但只有大孢囊才具有高的脂肪酸和DHA含量，因而在发酵生产中造成很大的技术难题，致使产量低，成本高。为了解决这些技术难题，我们想通过诱变育种技术提高大孢囊体的脂肪酸和DHA含量，同时减少小孢囊在混合体中的比例，以提高DHA和油脂产量，降低成本，实现DHA工业化生产和商业化生产。
由于不同的藻种不但生长速度不同，而且组成成分也有一定差异。在微藻生产中，不仅要获得高产量，还要提高微藻产品质量，也就是提高有经济价值的生物活性物质的含量。因此必须对微藻藻种进行改良已培养出高产生物量、高油脂和高DHA的新品种，以满足人们对藻油和DHA的日益增长的要求。
1998年，汪志明、徐步进（浙江农业大学学报，1998，24（2）：121-121），采用60Co-γ射线辐照不同品系和形状的螺旋藻，结果表明，采用低剂量辐照能够可刺激藻细胞生长，并得到细胞低温下能良好生长的突变体。60Co-γ射线是产生于原子核的高能量电磁辐射，诱变强度较大，可以大大的提高藻株突变率，还可以省去传统育种方法的烦琐程序，大大的减轻了工作量，加快育种进程。
在80年代中期，我国创立了低能量离子生物学，它具有能量、动量、质量和电荷的中和与交换的各种作用于一体，同时具有集束性好，射程可控以及质量、能量、动量和电荷等组合的特点，其结果是突变率高和突变谱广。姚建铭，余增亮等（生物工程学报，2000,16（4）：478-481）和袁成凌等人（高技术通讯，2003，（6）：22-42），利用低能离子束生物技术对产ARA（Arachidionic Acid,ARA）的高山被孢霉（Mortierella alpina,N7）进行诱变，获得了高产ARA的突变株L49-N18，该突变株产ARA高达4.66g/L，比出发菌株产ARA提高126.2%，在50吨的发酵罐中产ARA平均达到5,11g/L。2001年，古绍彬等，（中江水产科学，2002,9（3）：13-15），以对等鞭金藻（Isochrysis galbana3011）为材料，进行离子束注入诱变，对离子束引入藻类诱变育种中确定注入条件，注入剂量与微藻存活的关系的研究有非常重要的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高产DHA的寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii(seligo)JavoruicKy）的藻株。该藻株已于2012年5月2日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5Crypthecodinium cohnii2.4K-2A2-5，保藏编号：CCTCCNO:M2012151地址：中国武汉武汉大学。该藻株的发酵产物可用于食品工业、婴幼儿食品和奶类制品、保健品及医药品。同时藻体用作家禽、畜和水产品饲料，也可以用于制备生物柴油。
本发明的另一个目的在于提供一种寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5的发酵方法，方法简单，易行，设备简单，适用于规模化的DHA的生产。
本发明的最后一个目的在于提供了一种寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5在制备DHA中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
用来作为诱变出发藻种是从广东微生物菌种保藏中心购买的ATCC30772，该株具有典型的寇氏隐甲藻的特征，原始藻株引自美国典型培养物种保藏中心（American Type CultureCollection）该藻属于隐甲藻类，它是异氧隐甲藻，在它的细胞中产生很高的DHA而无其它的多不饱和脂肪酸（Van pettetal,1999,J.Lipid.Res.40:1501-1505）。
经60Co-γ射线辐照诱变的突变株藻号Crypthecodinium cohnii ATCC307722.4K-2A2-5，简称C.Cohnii2.4K-2A2-5,中文名寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5突变株。
寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5突变株经活化，斜面培养孢囊细胞，接种于一级液体种子培养基中，培养24～48hr，转接二级液体种子培养基中，培养36～48h，接种于液体发酵培养基中，摇荡培养6～7天，离心收集培养物，进行后处理，获得油脂和DHA。
一种高产DHA的寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5，其筛选过程如下（图6）：
1.藻种活化
从广东微生物菌种保藏中心购买ATCC30772寇氏隐甲藻藻株，经琼脂平板活化和液体摇瓶培养活化，两种方法均成功通过显微镜检查，比对寇氏隐甲藻的典型特征，获得的培养物即为ATCC30772藻株（图2A）。
2.藻种诱变预试验
将实验室保存的寇氏隐甲藻，经不同剂量的60Co-γ射线分别辐照诱变，经分离培养获得了不同诱变剂量下藻种的致死率，并对它们的生长时间，生长速度以及生物量进行了比较，以确定最佳诱变条件。实验结果表明：1.2KGy、1.8KGy、2.4KGy、3.0KGy、4.2KGy和5.4KGy，在3.0KGy～5.4KGy剂量下致死率从99.03%～99.9999%，在1.8KGy剂量下获得的突变株开始培养36hr后，生长量达到32.979g/L，而对照株即诱变出发株仅为21.23g/L，这为下步正式研究试验提供了可靠的科学依据。
3.藻种诱变
在上述1.和2.的基础上，将ATCC30772活化，液体摇瓶培养至对数旺盛期（2～3）天。经检查，无污染。将培养液连续稀释105、106、107三个稀释度，平板计数，每个稀释度三个平皿，计数结果为cfu=22×105。将此原藻液分装于9个离心管中，每管装入5ml,每3个为一组分别于0.8KGy、1.6KGy、2.4KGy的剂量下辐射后，用黑布包多层，带回实验室分离纯化。
4.诱变菌株的筛选
4.1ATCC30772出发株经60Co-γ射线0.8KGy、1.6KGy、2.4KGy的剂量辐射后，进行连续稀释，取稀释度10-1～10-7浓度，并每个稀释度各取0.2ml涂平板，在27±1℃，湿度80～90%时培养2天，计数藻落数，0.8KGy处理组为cfu=40×102,1.6KGy为cfu=33×102,2.4KGy为cfu=41×10个，致死率分别为99.8095%、99.8429%和99.9804%。
从各处理组平板中随机测量10个藻落，测定其直径大小，0KGy（出发株）、0.8KGy、1.6KGy、2.4KGy的测量结果（平均值）分别为3.44mm、6.3mm、6.55mm、6.60mm.。说明在同一条件下经60Co-γ射线辐照的藻株生长速率快于出发株。
4.2将从0.8KGy、1.6KGy、2.4KGy三个处理组中各选出的个10个藻落分别转接于装有3ml培养液的试管中，每个三支，培养3天后经显微镜检查，证明为纯培养时，转喷涂于平板上培养。从生长出的藻株中观察藻落大小、形状、颜色、光泽等指标，并涂片镜检。记录藻落生长情况及镜检结果，从中选20个单藻株继续研究。
4.3将选出的20株藻突变株，每株分别接入装有5ml培养液的试管5支，共100支试管于摇床振荡培养8天后，涂片镜检，检查其有无污染，培养物大小，纯度，藻典型性状等指标，从中选出0.8KGy处理的8株,1.6KGy中的10株,2.4KGy9株共27株。
4.4将选出的27株进行液体发酵培养，每株接8瓶摇瓶（每瓶100ml培养液），在培养中，每隔48小时涂片观察，检查其生长及是否污染，培养7天后，用苏丹黑B染色镜检，均显示出脂肪。放瓶测出生物量（g/L），油重（g/L），和含油量（%）等指标，从中选出下列藻株（见表1）。
表1筛选出6株寇氏隐甲藻突变株
| 试验号 | 藻株号 |
| 14 | 2.4K-1A1-3 |
| 16 | 2.4K-8B1-4 |
| 20 | 1.6K-5A2-3 |
| 21 | 1.6K-5A2-5 |
| 23 | 1.6K-5B1-3 |
| 24 | 2.4K-2A2-5 |
| 7 | 出发株(ATCC30772) |
将上述7株再经摇瓶发酵，每株8瓶，共重复三次，用涂片观察，苏丹黑B染色镜检,测定生物量（g/L），油重（g/L），和含油量（%）等指标，经统计分析从中选出下列三株突变株，继续研究（见表2）。
表2筛选出3株寇氏隐甲藻突变株
| 试验号 | 藻突变株号 |
| 16 | 2.4K-8B1-4 |
| 23 | 1.6K-5B1-3 |
| 24 | 2.4K-2A2-5 |
| 7 | 出发株(ATCC30772) |
将上一轮筛选出的3株寇氏隐甲藻ATCC30772突变株和出发株，共4株藻株，进行三批次连续发酵试验，将收集的藻体分别浸出提油，出发株及3株突变株浸提藻油如图1所示。分别测得各藻株生物量、油脂质量、含油率和DHA含量等，寇氏隐甲藻ATCC30772出发株及3株突变株连续发酵培养三批次结果见表3。
表3寇氏隐甲藻ATCC30772出发株及3株突变株连续发酵培养三批次结果
从表3可以看出，三个突变株藻体生物量与出发株（对照株）基本相近，而突变株的油脂质量和含油率均比对照株有大的提高。24号突变株2.4K-2A2-5、23号突变株1.6K-5B1-3、16号突变株2.4K-8B1-4的油脂质量比出发株分别提高了51.66%、41.04%和37.31%；含油率比出发株分别提高了66.37%、46.84%和50.93%；DHA含量比出发株分别提高了3.39%、3.89%和2.30%。通过以上计算及表4.3数据综合比较分析，将三株突变株按最优、较优、优的顺序进行排列，依次为24号2.4K-2A2-5、23号1.6K-5B1-3和16号2.4K-8B1-4。其中24号突变株2.4K-2A2-5的油脂质量、含油率和DHA含量三个指标均为最高。因此，最终将24号突变株2.4K-2A2-5确定为高产DHA的适宜突变株。
至此得到了一株高产DHA的寇氏隐甲藻，该突变株已于2012年5月2日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5Crypthecodinium cohnii2.4K-2A2-5，保藏编号：CCTCC NO:M2012151地址：中国武汉武汉大学。
寇氏隐甲藻归类为蜂窝状的单细胞原生动物，1952年Biecherer将此作为一个单一种类的隐藻进行描述，它的细胞形态与隐藻非常相似。UcKo(1997,Eur.J.Phycol,32,133-140)报道一种沟鞭藻纲的隐甲藻，在培养紫球藻的商用池塘中出现，1996年，Brrow等报道了用扫描电镜研究的半咸水鱼缸里培养的异养型的甲藻，它与Biccheler（1952,Bull Biol.Fr.Belg,35s1-s14），UcKo(1997,Eur.J.Phycol,32,133-140)等报道的描述相符，这就为寇氏隐甲藻提供了首个明确的实证。
寇氏隐甲藻具有两种不同大小的形态：游动细胞和孢囊细胞（Bhaud etal,1991,J.Cellsa,100:675-682）。游动细胞较小，孢囊细胞较大。这个原始出发株和诱变株均可明显的看出并出现我们的研究中。并且很难将它们纯化成单一菌株。但原始出发株经60Co-γ射线辐照后，孢囊细胞大为增加，游动细胞减少。因为只有大的孢囊细胞在生长发育及代谢合成中积累油脂，（Ratledge etal,2003,Nutr Res.Rev.18:113-119）。寇氏隐甲藻原始出发株与我们的诱变株都是采用二***生长繁殖（图3B），在光学显微镜下很容易看到藻细胞的***生长繁殖。
寇氏隐甲藻是一种专性异氧海洋甲藻，这表明它能在黑暗中持续生长和细胞***，它们需要的生长能和细胞碳源都能从有机碳基的新陈代谢中获得，这就为人工培养基培养隐甲藻提供了依据和条件。
Kyle（1996,Technol,8:107-110）报道，20世纪初期就在实验室开始培养隐甲藻的研究。我们现在所用的寇氏隐甲藻原出发株和诱变株都是能够在合成培养液和固体培养基中培养生长繁殖的物种。
寇氏隐甲藻原出发株和诱变株都能在含有葡萄糖，酵母膏，谷氨酸钠，多种维生素，多种微量元素等的培养基中生长、发育、繁殖、新陈代谢和生物合成脂肪酸。而在果糖、麦芽糖、鼠李糖、***乳糖等糖中不能生长。它们也能在以豆油、棉籽油、鱼油等脂肪为碳源的培养基中生长。
寇氏隐甲藻原出发株和诱变株在多种氮源中均能生长，包括无机氮的谷氨酸钠、氯化铵、硝酸钾、尿素、硫酸铵等；并能在大多数有机氮源中生长，如蛋白胨、酵母膏、废糖浆、玉米浆、肉汁、肉酪蛋白等。寇氏隐甲藻原出发株和诱变株都需要许多种无机盐提供微量元素，这些无机盐包括各种钠盐、磷酸盐、镁盐、钾盐、硼酸盐、碳酸盐以及已知的人工海水。在微量元素中，除常用的铁、锰等外，还必须添加钴、锌等微量元素。
寇氏隐甲藻原出发株和诱变株生长温度在15～30℃，低于14℃和高于31℃，细胞生长受到抑制。寇氏隐甲藻生长培养中，需要充足的氧气，因而我们的通气量较大（1:0.8～1.5，v/v），搅拌速度80～120转/分，在此条件下，寇氏隐甲藻诱变株生长良好。
综上所述，寇氏隐甲藻原出发株和诱变株的形态特征，生长特性，利用糖、氮、脂肪、维生素、无机盐等具有相同性。因而寇氏隐甲藻诱变株能够在含有廉价营养物的培养基中生长繁殖，生物合成油脂并积累于细胞内。这也利用它为工业发酵生产油脂和DHA奠定了基础，换句话说，我们可以用发酵工业和油脂工业的技术和设备来生产出DHA。
一种寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5的发酵方法，其过程是：
将寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5在含有糖、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等的培养基中发酵培养。
所述的培养基配方为（g/L）：
表4培养基所用原料及用量
将发酵培养基配制好，调pH6.0～7.0，灭菌，冷却。10L的发酵罐，发酵液装6-8L，种子液107-108个细胞/ml，按5-15%v/v的接种量接入液体种子培养基，25～30℃,120～250rpm，通气量：1:0.8-1.5，培养5～7天，培养3天后，每隔一天取样测pH，涂片苏丹黑B染色镜检，放罐后测定生物量，提取油脂及检测。
一种寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5在制备DHA中的应用，其应用过程是：
将发酵液经5000～10000rmp离心收集藻体，30～50℃低温干燥，将干藻体用有机溶剂正己烷）浸提15～30h，获得藻油毛油，将其经过脱胶脱色精炼得到精藻油。
另一种方法是离心收集的湿藻体冷冻后，加入藻重的1～3倍的自来水，搅拌成悬浊液，加0.1～0.8%碱性蛋白酶和0.1～0.3%的纤维素酶在40～60℃温度下搅拌4～10h，加入95%（v/v）乙醇脱水20～40min后加入正己烷浸提静置于分液漏斗或锥形容器中，待水相油相分层后，取出正己烷油相，旋转蒸发干燥，获得藻毛油，经精炼收集精藻油。产脂率（%）26.21～40.65和DHA（%）38.0～39.3，质量比。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明所述的寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5，用于培养发酵，工艺简单可控，所用物料来源丰富，容易操作，经济指标好和制剂性能稳定的亮黄色至金黄色的油脂，无异味，适合于液体发酵大规模批量生产。该产品具有质量可控，使用安全的食品添加剂；可以添加到包括婴幼儿奶粉等婴幼儿食品，老年人、孕妇、癌症患者等特殊人群以及学生、青年和中年人群的食品中，因此，该寇氏隐甲藻ATCC30772突变株发酵生产的DHA具有广阔的市场前景。
利用初筛选出的27株较好的突变株，通过摇瓶培养及连续发酵试验进行复筛。结果表明：2.4KGy的辐照剂量下获得了高产DHA的寇氏隐甲藻ATCC30772最佳突变株2.4K-2A2-5，该株的油脂质量和含油率分别比出发株提高了51.66%和66.37%，平均DHA含量达到39.04%，比出发株提高了3.39%，其DHA产量按g/L发酵液计，比出发株提高了56.92%。
附图说明
图1为寇氏隐甲藻ATCC30772出发株及3株突变株浸提藻油示意图。
图2A为一种寇氏隐甲藻ATCC30772的琼脂平板生长的藻落图。
图2B为一种寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5的琼脂平板生长的藻落图。
图3A为一种寇氏隐甲藻ATCC30772的显微镜下的形态图。
图3B为一种寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5的显微镜下处于生长***期的形态图。
图4A为一种寇氏隐甲藻ATCC30772的苏丹黑B染色镜检图。
图4B为一种寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5的苏丹黑B染色镜检图。
图5为一种寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5的气相层析的脂肪酸的色谱图。
图6为一种寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5筛选流程图。
具体实施方式
结合实施方案和实例对本发明做进一步详细描述。实施中的技术方法，如未特别说明，均为常规技术方案，参考了微生物学和藻类学及其方法，生物技术，生物工艺学，工业微生物学，油脂化学，油脂工艺学，食品科学等教材、资料、已发表的论文，国家有关标准制定的方法。下面进行了实施方式的详细描述。
实施例1：
预实验
从本实验室保存的寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii(seligo) JavoruicKy）中先进行6 0Co-γ射线的预实验，通过每管装5ml培养的藻液，经1.2KGy、1.8KGy、2.4KGy、3.0KGy、4.2KGy和5.4KGy的60Co-γ射线辐射诱变处理。将处理的藻液经稀释分离和活菌数计数，获得单藻株和致死率（表5）
表5寇氏隐甲藻6号经不同剂量60Co-γ射线辐照的死亡率
| 处理（KGY） | 活藻数（个） | 致死率（%） |
| 0 | 1.108×109 | 0 |
| 1.2 | 1.075×107 | 99.02978 |
| 1.8 | 2.220×106 | 99.78000 |
| 2.4 | 2.425×104 | 99.99780 |
| 3.0 | 7.000×103 | 99.99936 |
| 4.2 | 2.200×102 | 99.99998 |
| 5.4 | 3.170×101 | 99.99999 |
实施例2：
藻株活化
将ATCC30772经液体培养基及琼脂平板活化后，挑取纯培养中藻落大，典型特征、镜检确定的ATCC30772株。将5个单株分别接入装有100ml培养液的500ml三角瓶中，16～200rpm，24～28℃培养7天，从5瓶镜检合格者选取生长快、生物量大、苏丹黑B染色深的最佳者，装入12支无菌管中，每管装5ml,其中3支管作为对照（出发株）,其它9支分为三组，每组3支,送湖北省农科院辐照中心进行60Co-γ射线辐射。
实施例3：
辐射诱变
将预制好的三组9支藻液管，分别在0.8KGy、1.6KGy、2.4KGy的剂量辐射后，用黑布包多层，以免接触光线。即去实验室中进行连续稀释。CK株取10-5、10-6、10-7稀释度，0.8KGy处理组取10-5、10-6、10-7稀释度，1.6KGy处理组取10-2、10-3、10-4稀释度，2.4KGy处理组取10-1、10-2、10-3稀释度每种稀释度分别喷涂四个平板，置24-28℃，RH60-90%的恒温恒湿箱喷培养1-3天。
实施例4：
诱变第一轮筛选
从各种处理组的平板中，随意测量10个单株的藻落（mm），0KGY（出发株），0.8KGy、1.6KGy、2.4KGy的平均直径为3.44mm、6.3mm、6.55mm、6.60mm.。同时计算出60Co-γ射线辐射各剂量对出发株的致死率分别为99.8277%、99.8649%和99.9968%。另在每个处理组中各挑选10个藻落直径大于5.0mm单株，加入到9ml无菌水，用移液枪制成悬浮液，再吸1ml喷涂于平板上，每个藻液喷涂5个平板，置恒温恒湿箱中培养3天。
实施例5：
诱变第二轮筛选
从诱变第一轮筛选培养后的平板中，选出0.8-1（0.8KGy-1，下同）、0.8-2、0.8-4，0.8-8、0.8-9、1.6-1、1.6-2、1.6-3、1.6-4、1.6-5、2.4-1、2.4-2、2.4-3、2.4-5和2.4-8的平板选出共60个单株，测量藻落大小，观察形状，颜色，光滑或皱折等特征，选出0.8KGy处理组的6株,1.6KGy中的6株,2.4KGy中的8株。将此20株加上CK，分别接入装5ml培养液的试管5支共100支试管，置24～28℃,160～200rpm，培养5～7天，摇床振荡培养7天，经涂片镜检和苏丹黑B染色镜检，从中选出0.8KGy处理的8株,1.6KGy中的10株,2.4KGy中的9株，共27株突变株。
实施例6：
诱变第三轮筛选
1.发酵培养。将上述的27株诱变突变株加上CK共28株藻株，分别按照琼脂平板→一级种子液→二级种子液→摇瓶发酵的程序发酵培养。每株接8瓶装有100ml培养基的三角瓶培养，共800ml，在每次转接前，须确证种子纯培养及生长旺盛正常后，才能转入下一步程序。在发酵过程中，从培养2天起每天涂片镜检和苏丹黑B染色镜检，判断发酵正常与否，掌握藻生长情况，油脂含量等，以确定放瓶收获。
2.后处理。第一种方法：将各组8瓶发酵液每瓶取10ml共800ml经5000rmp离心20分钟，收集沉淀物，30～50℃低温干燥，测生物量。每组剩余的藻液经5000rmp离心20分钟，弃去上清液，沉淀物加1～5倍纯清水或蒸馏水，搅拌成悬浊液，加碱性蛋白酶和纤维素酶在55～60℃温度下搅拌6～10h，再加入无水乙醇脱水30～60min，离心静置，使藻泥与乙醇-水相分离，弃去乙醇-水相，将藻泥加正己烷处理，充分搅拌，置于分液漏斗中充分分层后，取出上层正己烷油相，旋转蒸发、干燥，获得藻毛油。
第二种方法是将离心获得的藻泥30-50℃低温干燥，藻体按索氏抽提法提取油脂，旋转蒸发、干燥，获得藻毛油。
将上述两种方法提取的藻毛油经纯化精炼（脱胶、脱味）后得到藻精油。
3.结果
本轮筛选获得结果见表6
表6寇氏隐甲藻ATCC30772的27株突变株的发酵培养结果
实施例7：
诱变第四轮筛选
将从第三轮筛选获得的下列6株突变株进行第四轮研究，发酵培养方法和后处理技术方法均同于第三轮筛选的技术方法，获得结果见表7.
表7寇氏隐甲藻ATCC30772的6株突变株的发酵培养结果
| 试验号 | 藻株号 | 干重（g/L） | 油重（g/L） | 含油量（%） | DHA（%） |
| 7 | 出发株 | 58.83 | 14.37 | 24.43 | 37.0 |
| 14 | 2.4K-1A1-3 | 56.29 | 15.70 | 22.89 | 37.9 |
| 16 | 2.4K-8B1-4 | 57.00 | 17.16 | 30.11 | 38.4 |
| 20 | 1.6K-5A2-3 | 56.14 | 16.57 | 29.56 | 37.9 |
| 21 | 1.6K-5A2-5 | 57.29 | 16.59 | 28.96 | 38.0 |
| 23 | 1.6K-5B1-3 | 62.57 | 16.59 | 26.51 | 39.0 |
| 24 | 2.4K-2A2-5 | 56.57 | 16.69 | 29.50 | 38.7 |
实施例8：
诱变第五轮筛选
从上述6株突变株中，选出三株突变株加上CK共四株进入第五轮筛选，发酵培养方法和后处理技术方法均同于第三轮筛选的技术方法，连续发酵培养三批的结果见表8.
表8寇氏隐甲藻ATCC30772的3株突变株三批连续发酵培养的结果
上述结果结合第三轮、第四轮诱变筛选的研究结果，从中选出2.4K-2A2-5突变株作5L罐的发酵研究。寇氏隐甲藻出发株ATCC30772与2.4K-2A2-5的琼脂平板生长的藻落图见图2A、B；寇氏隐甲藻出发株ATCC30772与2.4k-2A2-5显微镜下的形态图见图3A、B；寇氏隐甲藻出发株ATCC30772与2.4K-2A2-5的苏丹黑B染色镜检图见图4A、B；寇氏隐甲藻2.4k-2A2-5的气相层析的脂肪酸的色谱图见图5。突变株2.4K-2A2-5已于2012年5月2日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5Crypthecodiniumcohnii2.4K-2A2-5，保藏编号：CCTCC NO:M2012151地址：中国武汉武汉大学。
实施例9：
10L罐的发酵
将2.4K-2A2-5突变株经一级种子液→二级种子液→摇瓶发酵的程序进行10L罐的发酵，一级种子培养液，二级种子培养液都为常用的海水单胞藻培养液，107-108个细胞/ml，接种量为10%，8L发酵液，发酵培养温度25～30℃，转速160rpm，通气量1.2，培养7天，在培养中72h、120h、168h取样观察生长情况，涂片镜检藻细胞囊生长发育和苏丹黑B染色镜检着色程度，共培养5批。
表4发酵培养基所用原料及用量
| 名称 | 用量（g/L） | 名称 | 用量（g/L） |
| 葡萄糖 | 40～120 | NaCl | 15～30 |
| 谷氨酸钠 | 10～40 | MgSO4·7H2O | 0.1～0.3 |
| 酵母浸膏 | 2～12 | Na2SO4 | 2.0～5.0 |
| 维生素B1(VB1) | 0.05～0.15 | CaCl2 | 0.6～1.5 |
| 维生素B2(VB2) | 0.0001～0.0009 | H3BO3 | 0.02～0.04 |
| 维生素B12(VB12) | 0.0001～0.0009 | SrCl2 | 0.2～0.6 |
| 维生素H(VH) | 0.0001～0.0009 | FeCl3·6H2O | 0.005～0.015 |
| 维生素E(VE) | 0.0001～0.0005 | 甘油磷酸钠 | 0.09～0.19 |
| 棉籽油 | 5～10 | K2HPO4 | 0.05～0.16 |
| CoCl2·6H2O | 0.05-0.15 | ZnSO4 | 3.0～8.0 |
| MnCl2 | 3.0～8.0 |
实施例10：
寇氏隐甲藻突变株在制备DHA中的应用，其应用过程是：
将实施例9中获得的的五批发酵液，其中两批将发酵液经8000rmp离心收集藻体40℃低温干燥，将干藻体用有机溶剂正己烷浸提25h，获得藻油毛油，将其经过脱胶脱色精炼得到精藻油。
另三批离心收集的湿藻体，加入藻重的1～3倍的自来水，搅拌成悬浊液，加0.1～0.8%碱性蛋白酶和0.1～0.3%的纤维素酶在40～60℃温度下搅拌8h，加入95%（v/v）乙醇脱水30min后加入正己烷浸提静置于分液漏斗或锥形容器中，待水相油相分层后，取出正己烷油相，旋转蒸发干燥，获得藻毛油，经精炼收集精藻油。(5批次具体接种量和加入助剂量如表9)。检测分析，获得结果于表10。
所述的发酵培养基的配方为：
表9寇氏隐甲藻2.4k-2A2-5的五批次加入量
表10寇氏隐甲藻2.4K-2A2-5的五批次发酵结果
说明：1.镜检：包括眼观生长良好，发酵液浓稠，无异味，无异色泽。
2.苏丹黑B镜检：主要藻体内的脂肪被苏丹黑B染色的深浅程度。
3.生物量：每升发酵液含有藻体的干重（g/L）。
4.油重：每升发酵液藻体提取的油量（g/L）。
5.含油量：每克干菌体所含油量的百分数（%）。
6.DHA：每克藻油中所含DHA的百分数（%）
7.DHA：每升发酵液所含DHA的产量（g/L）。
Claims (1)
1.一种寇氏隐甲藻突变株在制备DHA中的应用，其应用过程如下：
将寇氏隐甲藻突变株经一级种子液→二级种子液→摇瓶发酵的程序进行10L罐的发酵，一级种子培养液，二级种子培养液都为常用的海水单胞藻培养液，107-108个细胞/ml，接种量为10％，8L发酵液，发酵培养温度25～30℃，转速160rpm，通气量1.2v/v，培养7天；所述的发酵液的配方如下：
所述的寇氏隐甲藻突变株为：寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)2.4K-2A2-5，保藏编号：CCTCC NO:M2012151。
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