CN105420143A - 一种东方醋杆菌及其生产黄芪多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种东方醋杆菌，所述东方醋杆菌的保藏名称为Acetobacter？orientalis，于2015年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO:？M？2015455，本发明提供的东方醋杆菌具有良好的稳定性，代谢能力高，安全性高，具有良好的药用价值，一种东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，经发酵培养获得的黄芪多糖的含量不低于30%。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种东方醋杆菌及其生产黄芪多糖的方法。
背景技术
东方醋杆菌来自于青藏高原特有的一种酸奶，菌落颜色呈乳白色，培养后期菌落颜色变黄，菌落呈圆点状，中间凸起边缘整齐，表面光滑湿润，有特殊的酸味，革兰氏反应呈阳性，光学显微镜下观察呈短杆状。
黄芪多糖具有增强动物免疫力，诱导动物干扰素产生的能力，具有明显的耐低温作用，能延长正常小鼠以及虚损小鼠的抗生存时间，具有双向调节血糖的作用，可降低葡萄糖负荷后小鼠的血糖水平，具有类似激素的作用，延长小鼠的发情期，对小鼠的发育有良好的影响。
基于黄芪多糖的药理作用和临床价值，现在市场上对于黄芪多糖的需求越来越大，然而从黄芪中直接提取黄芪多糖的方法，存在提取率低，稳定性差，纯化难度大，操作步骤复杂，周期长等问题。
通过微生物发酵黄芪，不仅可以提高黄芪多糖的得率，同时在发酵过程中伴随的某些成分的分解或转化可能产生影响黄芪药理作用的新的有效成分，达到增效减毒的作用；利用东方醋杆菌的生物学特性及生长繁殖的特点，对其进行分离纯化选育出优良的菌种，并对其的生长条件进行优化，将其用于发酵黄芪多糖具有重要的经济意义和社会意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种东方醋杆菌及其生产黄芪多糖的方法。
本发明采用的技术方案为：
一种东方醋杆菌，所述东方醋杆菌的保藏名称为Acetobacterorientalis，于2015年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015455。
一种如权利要求1所述的东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，包括以下步骤：
（1）取1ml青藏高原酸奶进行10倍系列梯度稀释至10-6，再取稀释后的菌液50ul于含MRS琼脂培养基的培养皿中，用涂布棒涂布均匀，置于培养箱中在37℃±1℃培养48h～72h，获得单菌落；
（2）将单菌落接种于斜面培养基，将含有斜面培养基的试管置于培养箱37℃±1℃培养48h～72h，获得斜面菌种；
（3）将斜面菌种接种于摇瓶培养基，将摇瓶培养基放置于摇床中培养，摇床温度37℃±1℃，转速100r/min～120r/min，24h～28h后获得摇瓶菌液；
（4）将得到的菌液接种于液体培养基中，将含有液体培养基的发酵罐置于杀菌锅中经121℃高温高压灭菌30min后，放于摇床中培养，摇床温度为37℃±1℃，转速为100r/min～120r/min，培养48h～52h后放罐，获得发酵液；
（5）所得发酵液经过1500r/min离心10min，取其上清，上清经过浓缩得到黄芪多糖溶液。
所述步骤（2）中的斜面培养基为MRS改良培养基，包括如下质量分数的组分：0.5%-1%的鱼肉蛋白胨，0.5%-1%的酵母提取物，0.5%-1%的胰蛋白胨，0.2%-0.4%的柠檬酸氢二胺，0.2%-0.4%的磷酸氢二钾，0.5%-1%的乙酸钠，0.02%-0.05%的四水合硫酸镁，0.3%-0.5%的碳酸钙，0.1%-0.2%的吐温-80，0.02%-0.05%的七水合硫酸镁，0.8%-1.5%的葡萄糖，其余为蒸馏水。
所述步骤（3）中摇瓶培养基包括以下质量分数的组分：0.5%-1%的鱼肉蛋白胨，1%-2%的乳糖，1%-2%的酵母膏，0.25%-0.4%的磷酸氢二钾，0.25%-0.4%的磷酸二氢钾，其余为蒸馏水。
所述步骤（3）中摇瓶培养基的pH为6.5。
所述步骤（4）中液体培养基包括以下质量分数的组分：0.5%-1%的氮源，1%-2%的碳源，0.25%-0.4%的磷酸氢二钾，0.25%-0.4%的磷酸二氢钾，8%-10%的黄芪粉，其余为蒸馏水。
所述碳源为乳糖或葡萄糖，氮源为鱼肉蛋白胨、胰蛋白胨或酵母膏中的至少一种。
所述步骤（4）中菌液与液体培养基的体积比为1:50。
本发明的有益效果是：本发明提供的东方醋杆菌具有良好的稳定性，代谢能力高，安全性高，具有良好的药用价值，经发酵培养获得的黄芪多糖的含量不低于30%。
保藏说明：
菌种名称：东方醋杆菌；
拉丁名：Acetobacterorientalis；
菌株编号：T1-1；
保藏编号：CCTCCNO:M2015455；
保藏机构：中国典型培养物保藏中心；
保藏机构简称：CCTCC；
地址：中国，武汉大学；
保藏日期：2015年7月16日。
具体实施方式
一种东方醋杆菌，所述东方醋杆菌的保藏名称为Acetobacterorientalis，于2015年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015455。
一种如权利要求1所述的东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，包括以下步骤：
（1）取1ml青藏高原酸奶进行10倍系列梯度稀释至10-6，再取稀释后的菌液50ul于含MRS琼脂培养基的培养皿中，用涂布棒涂布均匀，置于培养箱中在37℃±1℃培养48h～72h，获得单菌落；
（2）将单菌落接种于斜面培养基，将含有斜面培养基的试管置于培养箱37℃±1℃培养48h～72h，获得斜面菌种；
（3）将斜面菌种接种于摇瓶培养基，将摇瓶培养基放置于摇床中培养，摇床温度37℃±1℃，转速100r/min～120r/min，24h～28h后获得摇瓶菌液；
（4）将得到的菌液接种于液体培养基中，将含有液体培养基的发酵罐置于杀菌锅中经121℃高温高压灭菌30min后，放于摇床中培养，摇床温度为37℃±1℃，转速为100r/min～120r/min，培养48h～52h后放罐，获得发酵液；
（5）所得发酵液经过1500r/min离心10min，取其上清，上清经过浓缩得到黄芪多糖溶液。
所述步骤（2）中的斜面培养基为MRS改良培养基，包括如下质量分数的组分：0.5%-1%的鱼肉蛋白胨，0.5%-1%的酵母提取物，0.5%-1%的胰蛋白胨，0.2%-0.4%的柠檬酸氢二胺，0.2%-0.4%的磷酸氢二钾，0.5%-1%的乙酸钠，0.02%-0.05%的四水合硫酸镁，0.3%-0.5%的碳酸钙，0.1%-0.2%的吐温-80，0.02%-0.05%的七水合硫酸镁，0.8%-1.5%的葡萄糖，其余为蒸馏水。
所述步骤（3）中摇瓶培养基包括以下质量分数的组分：0.5%-1%的鱼肉蛋白胨，1%-2%的乳糖，1%-2%的酵母膏，0.25%-0.4%的磷酸氢二钾，0.25%-0.4%的磷酸二氢钾，其余为蒸馏水。
所述步骤（3）中摇瓶培养基的pH为6.5。
所述步骤（4）中液体培养基包括以下质量分数的组分：0.5%-1%的氮源，1%-2%的碳源，0.25%-0.4%的磷酸氢二钾，0.25%-0.4%的磷酸二氢钾，8%-10%的黄芪粉，其余为蒸馏水。
所述碳源为乳糖或葡萄糖，氮源为鱼肉蛋白胨、胰蛋白胨或酵母膏中的至少一种。
所述步骤（4）中菌液与液体培养基的体积比为1:50。
实施例1
一种如权利要求1所述的东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，包括以下步骤：
（1）取1ml青藏高原酸奶进行10倍系列梯度稀释至10-6，再取稀释后的菌液50ul于含MRS琼脂培养基的培养皿中，用涂布棒涂布均匀，置于培养箱中在37℃±1℃培养48h～72h，获得单菌落；
（2）取一个完整的单菌落通过划线的方法接种于18*18装有10ml培养基的斜面上，然后将含有斜面培养基的试管置于培养箱37℃±1℃培养48h～72h，获得斜面菌种，保存于4℃冰箱备用；
（3）取菌龄短，长势好的斜面菌种接种于摇瓶培养基，将摇瓶培养基放置于摇床中培养，摇床温度37℃±1℃，转速100r/min～120r/min，48h后获得摇瓶菌液；
（4）将得到的菌液接种于液体培养基中，将含有液体培养基的发酵罐置于杀菌锅中经121℃高温高压灭菌30min后，放于摇床中培养，摇床温度为37℃±1℃，转速为100r/min～120r/min，培养48h后放罐，获得发酵液；
（5）所得发酵液倒入离心杯，然后放入离心机中离心，离心机的转速为1500r/min，离心10min结束后，取上清液置于4℃冰箱保存备用，沉淀部分水煮后再离心，将两次离心的上清液合并、浓缩后测量黄芪多糖的含量；测量黄芪多糖的含量的方法是采用硫酸锌和亚铁***处理发酵产物，用苯酚-硫酸法在490nm波长下测定。
步骤（1）中MRS琼脂培养基的制备方法：先配置MRS肉汤培养基：酪蛋白酶消化物10份、牛肉膏粉10份、酵母粉4份、柠檬酸三铵2份、乙酸钠5份、七水合硫酸镁0.2份、葡萄糖20份、四水合硫酸锰0.05份、吐温-801.08份；再称取MRS肉汤培养基54g，加20g琼脂到1000ml水中溶解。
所述步骤（2）中的斜面培养基为MRS改良培养基，包括如下质量分数的组分：0.5%的鱼肉蛋白胨，0.5%的酵母提取物，0.5%的胰蛋白胨，0.2%的柠檬酸氢二胺，0.2%的磷酸氢二钾，0.5%的乙酸钠，0.02%的四水合硫酸镁，0.3%的碳酸钙，0.1%的吐温-80，0.02%的七水合硫酸镁，0.8%的葡萄糖，其余为蒸馏水。
所述步骤（3）中摇瓶培养基包括以下质量分数的组分：0.5%的鱼肉蛋白胨，1%的乳糖，1%的酵母膏，0.25%的磷酸氢二钾，0.25%的磷酸二氢钾，其余为蒸馏水，pH为6.5。
所述步骤（4）中液体培养基包括以下质量分数的组分：乳糖1%，鱼肉蛋白胨0.5%，酵母膏1%，磷酸氢二钾0.25%，磷酸二氢钾0.25%、黄芪粉8%，其余为蒸馏水。
所述步骤（4）中菌液与液体培养基的体积比为1:50。
本实验所需的实验试剂及实验设备，均为常规的分析纯、化学纯、生物纯试剂和常规的生物发酵设备，易在市场上获得。
本发明的东方醋杆菌保存于4℃冰箱，长期保存需要液体石蜡封存。
本发明提供的东方醋杆菌经液体发酵后，发酵液的pH为3.5-4.5，黄芪多糖的质量不低于所加黄芪的30%，高于普通的水提法。
经过处理的发酵液即提取黄芪多糖后的黄芪残渣和东方醋杆菌可用于饲料添加剂、药品和微生物制剂。
Claims (8)
1.一种东方醋杆菌，其特征在于：所述东方醋杆菌的保藏名称为Acetobacterorientalis，于2015年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015455。
2.一种如权利要求1所述的东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）取1ml青藏高原酸奶进行10倍系列梯度稀释至10-6，再取稀释后的菌液50ul于含MRS琼脂培养基的培养皿中，用涂布棒涂布均匀，置于培养箱中在37℃±1℃培养48h～72h，获得单菌落；
（2）将单菌落接种于斜面培养基，将含有斜面培养基的试管置于培养箱37℃±1℃培养48h～72h，获得斜面菌种；
（3）将斜面菌种接种于摇瓶培养基，将摇瓶培养基放置于摇床中培养，摇床温度37℃±1℃，转速100r/min～120r/min，24h～28h后获得摇瓶菌液；
（4）将得到的菌液接种于液体培养基中，将含有液体培养基的发酵罐置于杀菌锅中经121℃高温高压灭菌30min后，放于摇床中培养，摇床温度为37℃±1℃，转速为100r/min～120r/min，培养48h～52h后放罐，获得发酵液；
（5）所得发酵液经过1500r/min离心10min，取其上清，上清经过浓缩得到黄芪多糖溶液。
3.根据权利要求2所述的一种东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的斜面培养基为MRS改良培养基，包括如下质量分数的组分：0.5%-1%的鱼肉蛋白胨，0.5%-1%的酵母提取物，0.5%-1%的胰蛋白胨，0.2%-0.4%的柠檬酸氢二胺，0.2%-0.4%的磷酸氢二钾，0.5%-1%的乙酸钠，0.02%-0.05%的四水合硫酸镁，0.3%-0.5%的碳酸钙，0.1%-0.2%的吐温-80，0.02%-0.05%的七水合硫酸镁，0.8%-1.5%的葡萄糖，其余为蒸馏水。
4.根据权利要求2所述的一种东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤（3）中摇瓶培养基包括以下质量分数的组分：0.5%-1%的鱼肉蛋白胨，1%-2%的乳糖，1%-2%的酵母膏，0.25%-0.4%的磷酸氢二钾，0.25%-0.4%的磷酸二氢钾，其余为蒸馏水。
5.根据权利要求2所述的一种东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤（3）中摇瓶培养基的pH为6.5。
6.根据权利要求2所述的一种东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤（4）中液体培养基包括以下质量分数的组分：0.5%-1%的氮源，1%-2%的碳源，0.25%-0.4%的磷酸氢二钾，0.25%-0.4%的磷酸二氢钾，8%-10%的黄芪粉，其余为蒸馏水。
7.根据权利要求6所述的一种东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，其特征在于：所述碳源为乳糖或葡萄糖，氮源为鱼肉蛋白胨、胰蛋白胨或酵母膏中的至少一种。
8.根据权利要求2所述的一种东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤（4）中菌液与液体培养基的体积比为1:50。
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