CN102827780B - 一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株 - Google Patents
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Abstract
一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，属于生物工程技术领域。本发明菌株分类命名为高山被孢霉（Mortierellaalpina）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012073。该菌株由通过对江苏省无锡市惠山树林中的土壤进行分离筛选，得到了性状稳定，高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，可通过发酵法生产花生四烯酸。
Description
技术领域
一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，属于生物工程技术领域。本发明涉及一种高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，该菌株生长速度快、产量高，对于花生四烯酸的工业化生产有着重要意义。
背景技术
花生四烯酸***名为全顺式△-5,8,11,14-二十碳四烯酸，属于n-6系列的多不饱和脂肪酸，是该系列多不饱和脂肪酸的代谢枢纽。作为人体中含量最多、分布最广的多不饱和脂肪酸，花生四烯酸具有显著的生理药理作用。研究表明：花生四烯酸在促进脑部发育、降血脂、抗炎和抗脂质氧化等方面具有很好的生物活性。基于花生四烯酸的这些重要作用，它已经广泛应用于食品、医药等方面。近年来又有人指出：花生四烯酸的代谢产物在预防、***方面也具有广泛的应用前景。花生四烯酸广泛的存在于动物、微生物中。目前花生四烯酸的主要来源包括深海鱼油、动物组织等，但是其含量低、提取成本高严重阻碍了花生四烯酸的工业化生产。利用发酵法生产花生四烯酸具有含量高、周期短、提取容易的优点，受到国内外学者的青睐。据文献报道1979年Lizuka（《Production of arachidonic acid
by a hydrocarbon-utilizing strain of Penicillium
cyaneum》，Applied
Microbiology and Biotechnology,1979, 2(7),173-180）最先利用Penicillium cyaneu 进行了微生物发酵生产花生四烯酸的研究。后经研究发现显微藻类、部分细菌、酵母菌和藻状菌纲中的耳霉属（Conidiobolus），被孢霉属（Mortierella），毛霉属（Mucor），根霉属（Rhizopus），枝霉属（Diasporangium）等都能发酵生产花生四烯酸，尤其以高山被孢霉研究最多（《微生物发酵生产花生四烯酸的研究进展》，中国油脂，2004,9(29),7-40）。丝状真菌高山被孢霉菌丝体内富含花生四烯酸等多不饱和脂肪酸，其花生四烯酸含量高、提纯方便，被公认为是生产花生四烯酸的优良菌株。
花生四烯酸结构式
专利CN101113410A介绍了一种高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株及其应用。专利JP2008113671、专利US5658767A、沈以凌（《高山被孢霉发酵生产花生四烯酸条件的研究》，食品科技，2009，2(34),35-38）和Totani（《The
filamentous fungus Mortierellaalpina, high in arachidonic acid》，Lipids,
1987, 22，1060–1062）等也报道了利用高山被孢霉发酵产生花生四烯酸的研究。
但在已有的报道中，由于受菌种优劣、发酵条件、提取方式等因素的影响，花生四烯酸的产量良莠不齐，发酵周期也不尽相同。1997年chen（《Optimization of Arachidonic
Acid Productionby Mortierella
alpinaWuji-H4 Isolate》，Journal of the
American Oil Chemists' Society,1997,5(74),569-578）等经低温筛选得到一株花生四烯酸产生菌alpina Wuji-H4，摇瓶发酵5天后其花生四烯酸产量达到3.9g/L。专利CN101113410A，提供了一株高山被孢霉ME-AA01，其通过摇瓶发酵6.5天后，花生四烯酸产量提高到10g/L。Jin等（《A novel two-step
fermentation process for improved arachidonic acid
production by Mortierella alpina》，Biotechnol
Lett,2008，30(6)，1087–1091）利用菌株M. alpina ME-1采用乙醇胁迫及两步发酵法生产花生四烯酸，经5L发酵罐发酵7天后，花生四烯酸产量可达19.8g/L。
本发明从江苏省无锡市惠山树林的土壤中筛选得到了性状稳定、发酵周期短、30℃下可高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株（Mortierella alpina）JN168。具有很好的工业应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，得到了性状稳定，产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，可通过固态或液态发酵生产花生四烯酸。
本发明的技术方案：一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，命名为高山被孢霉（Mortierella alpina）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012073。其18S rDNA序列为 SEQ ID NO：1。
该菌株主要代谢产物为花生四烯酸。
该菌株可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或马铃薯淀粉。
该菌株可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。
于江苏省无锡市惠山树林，选取落叶覆盖较密的土地，去除表层土，用取样铲垂直铲取10厘米深处土壤装入取样盒。称取1g左右土样于50mL离心管中加入9mL去离子水溶解，取1mL溶解液加入到装有9mL去离子水的离心管中，依次类推制成10-1,10-2,10-3,10-4各种梯度的菌悬液，取10-2，10-3，10-4三个梯度进行平板涂布，放置在30℃的生化培养箱中倒置培养。分离用培养基为：马铃薯200g、葡萄糖10g、琼脂20g、水1000mL、青霉素20mg，pH自然。30℃恒温。待单菌落长出后，挑取单菌落用苏丹黑B染色，脂肪颗粒被染成蓝紫色，挑选脂肪颗粒多且染色较深的菌株进行摇瓶复筛。收获摇瓶培养的菌丝体抽滤，冷冻干燥至恒重，研磨菌丝体，用索式提取法提取油脂，对提得的油脂进行MS-GS联用分析脂肪酸组成。反复采用以上的方法，经过多次筛选得到花生四烯酸高产菌株Mortierella alpina JN168。
本发明涉及到的菌种有如下特征
1、高山被孢霉Mortierella alpina JN168培养条件
该菌种的培养常规条件是好气培养。用于培养菌种的糖质原料可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或马铃薯淀粉。培养用的氮源可以是无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。该菌株的生长温度范围为5℃-35℃，花生四烯酸最佳积累温度为30℃，菌株在pH为2-9范围内能生长且代谢产花生四烯酸，花生四烯酸最佳积累pH为6.5。在菌种的培养过程中添加醋酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸镁、磷酸二氢钾等无机盐对花生四烯酸的产量有促进作用。
2、高山被孢霉Mortierella alpina JN168的形态描述
平板培养形态：Mortierella alpina JN168培养2天后，平板上出现质地较薄的白色菌落，菌落呈圆形。5天之后菌落开始层层扩展，形成类似花瓣状的形态。菌落正面白色，背面浅黄色。在含有Triphenyltetrazolium chloride （氯化三苯基四氮唑，TTC）的平板上，菌落呈现红色。用苏丹黑B染色后，在显微镜下可见菌丝体内蓝紫色脂肪颗粒。
3、高山被孢霉Mortierella alpina JN168的18S rDNA分子生物学特征见序列表。
4、可采用常规的液态发酵方法，利用上述菌种生产花生四烯酸。培养基可用含不同碳源、氮源、无机离子等普通培养基。
培养基中也可添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物，一般情况，这些营养物存在于上述的天然营养源中。
该菌株在液态发酵过程中24小时后开始产花生四烯酸，80小时后花生四烯酸产量达到最大值。
本发明的有益效果：Mortierella alpina JN168的主要代谢产物为花生四烯酸，菌丝内花生四烯酸含量达50%以上，副产物更少。花生四烯酸最佳积累温度为30℃，与其它菌种相比有着较高的发酵温度，因此发酵时间缩短为80小时，发酵过程更易控制。
培养基中也可添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物，一般情况，这些营养物存在于上述的天然营养源中。
该菌株液态发酵产花生四烯酸的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母粉。用该培养基在30℃下花生四烯酸的产量可达13.0g/L。
该菌株液态发酵过程中，24小时后开始产生花生四烯酸，80小时后花生四烯酸产量达到最大。
生物材料样品保藏：高山被孢霉（Mortierella alpina）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2012073，保藏日期为2012年03月10日。
具体实施方式
实施例1
高山被孢霉脂肪酸组成分析
发酵菌株为高山被孢霉Mortierella alpina JN168，采用液态发酵，采用标准PDA培养基。发酵温度30℃，7天后发酵结束。抽滤收集菌丝体，冷冻干燥至恒重，用研钵将菌丝体磨碎。取0.1g左右烘干的菌丝体，加入到有盖的试管中。向其中加入0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液5mL，在50℃水浴中保持1h，再向其中加入5mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，在50℃水浴中保持1h，加入5mL正己烷抽提，最后加入2mL饱和氯化钠溶液水洗，移取上层溶液采用GC-MS联用检测。分析结果如表1所示。结果表明该菌产生的油脂中以花生四烯酸为主。
色谱条件：Finnigan Trace MS（美国）气相色谱-质谱仪。采用DB-MAX毛细管柱（30m×0.25mm×0.25µm）。起始柱温180℃，保持1min，以5℃/min升高到230℃，保持8min。进样口温度260℃，载气为氦气，流速为0.8mL/min，分流比为10︰1。
质谱检测条件：EI+（70Ev），发射电流200µA，离子源温度350℃，接口温度260℃。
表1脂肪酸组成
| 名称 | C16:0 | C16:1 | C18:1 | C18:2 | C18:3 | C20:3 | C20:4 | 其它 |
| 占总脂肪酸比例（%） | 5.2 | 5.8 | 9.3 | 8.1 | 10.2 | 2.3 | 58.4 | 0.7 |
实施例2
最佳碳源的确定
将保存在斜面上的高山被孢霉Mortierella alpina JN168菌株接种到固体PDA培养基中，30℃活化直至孢子成熟，用无菌水冲洗斜面，制成106个/mL的孢子悬液，以2%接种量接种到液体种子培养基中，30℃培养1天。以10%接种量接种到发酵培养基中，30℃培养80小时。使用单因素考察花生四烯酸积累的最佳碳源，分别使用果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或马铃薯淀粉替代基本发酵培养基中的葡萄糖进行液态发酵，测量干重和花生四烯酸产量。液体种子培养基和基本发酵培养基组成均为（w/v、下同）：葡萄糖80，硫酸铵5，硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5，磷酸二氢钾1.5，pH 6.0，115℃灭菌20min。从表2可以看出菌株发酵产花生四烯酸的最佳碳源为葡萄糖。
表2 不同碳源下的花生四烯酸生产情况
实施例3
最佳氮源的确定
将保存在斜面上的高山被孢霉Mortierella alpina JN168菌株接种到固体PDA培养基中，30℃活化直至孢子成熟，用无菌水冲洗斜面，制成106个/mL的孢子悬液，以2%接种量接种到液体种子培养基中，30℃培养1天。以10%接种量接种到发酵培养基中，30℃培养80小时。使用单因素考察花生四烯酸积累的最佳氮源，分别使用硝酸铵、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉替代基本发酵培养基中的硫酸铵进行液态发酵，测量干重和花生四烯酸产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖80，硫酸铵5，硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5，磷酸二氢钾1.5，pH 6.0，115℃灭菌20min。从表3可以看出菌株发酵产花生四烯酸的最佳氮源为酵母粉。
表3 不同氮源下的花生四烯酸生产情况
| 氮源种类 | 硫酸铵 | 硝酸铵 | 酵母粉 | 酵母膏 | 蛋白胨 | 花生粉饼 | 豆饼粉 |
| 菌体干重g/L | 28.7 | 26.1 | 36.6 | 35.7 | 35.9 | 34.1 | 33.0 |
| 花生四烯酸产量g/L | 8.84 | 6.90 | 10.63 | 9.54 | 9.62 | 10.03 | 8.42 |
实施例4
最佳温度的确定
将保存在斜面上的高山被孢霉Mortierella alpina JN168菌株接种到固体PDA培养基中，30℃活化直至孢子成熟，用无菌水冲洗斜面，制成106个/mL的孢子悬液，以2%接种量接种到液体种子培养基中，30℃培养1天。以10%接种量接种到发酵培养基中，培养80小时。使用单因素考察花生四烯酸积累的最佳温度，分别将发酵温度调整到15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，测量干重和花生四烯酸产量。发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖80，硫酸铵5，硫酸镁(MgSO4·7H2O)
0.5，磷酸二氢钾1.5，pH
6.0，115℃灭菌20min。从表4可以看出菌株发酵产花生四烯酸的最佳温度为30℃。
表4 不同温度下的花生四烯酸生产情况
| 温度 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 |
| 菌体干重g/L | 28.0 | 30.5 | 33.7 | 36.0 | 32.9 |
| 花生四烯酸产量g/L | 6.30 | 7.63 | 9.77 | 10.47 | 9.53 |
实施例5
最佳pH的确定
将保存在斜面上的高山被孢霉Mortierella alpina JN168菌株接种到固体PDA培养基中，30℃活化直至孢子成熟，用无菌水冲洗斜面，制成106个/mL的孢子悬液，以2%接种量接种到液体种子培养基中，培养1天。以10%接种量接种到发酵培养基中，30℃培养80小时。使用单因素考察花生四烯酸积累的最佳pH，分别将发酵pH调整到4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5测量干重和花生四烯酸产量。发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖80，硫酸铵5，硫酸镁(MgSO4·7H2O)
0.5，磷酸二氢钾1.5，115℃灭菌20min。从表5可以看出菌株发酵产花生四烯酸的最佳pH为6.5-7.5。
表5 不同pH值下的花生四烯酸生产情况
| pH | 4.5 | 5.0 | 5.5 | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 |
| 菌体干重g/L | 27.1 | 29.6 | 32.3 | 36.5 | 41.4 | 40.7 | 39.9 |
| 花生四烯酸产量g/L | 6.91 | 8.24 | 9.02 | 10.27 | 13.0 | 11.8 | 11.5 |
实施例6
发酵菌株为（Mortierella alpina）JN168，采用固态发酵，培养基组成（重量%）：30目的玉米粉68.7，麸皮8，米糠20，葡萄糖1，KH2PO4 0.25，MgSO47H2O 0.05；加水拌料润湿，装入广口瓶中，0.1MPa灭菌45-60min，冷却后接入液体种子拌均。发酵温度30℃，pH 7，6天发酵结束后，发酵培养基中花生四烯酸的含量为6.4%。
<110> 江南大学
<120>
一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株
<160> 1
<210> 1
<211> 609
<212> DNA
<213> 高山被孢霉(Mortierella
alpina) JN168
<400> 1
tccgtaggtg
aacctgcgga aggatcatta ccaagagaaa tctttcaaca ctgaaagatc 60
tgctggcttt
gaccgtatgt aattttggga aaaacaatat ctttaaaatg gttcgcaagg 120
gccggtccca
ttttcctttg atcatcctta tctgaacaat taaacaaatg attttaataa 180
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catttgctcc acaactttca acaacggatc tcttggttct cgcatcgatg 240
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cgaaatgcga tacgtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 300
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cctaaccttt gggtttatgg cgtggaattg gaatgcgccg actgtcatgg 420
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609
Claims (5)
1.一株产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，其分类命名为高山被孢霉（Mortierella alpina）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012073。
2.根据权利要求1所述的高山被孢霉菌株，其18S rDNA序列为 SEQ ID NO：1。
3.根据权利要求1所述的高山被孢霉菌株，其特征在于能代谢产生花生四烯酸。
4.根据权利要求1所述的高山被孢霉菌株，其特征在于可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、可溶性淀粉或马铃薯淀粉。
5.根据权利要求1所述的高山被孢霉菌株，其特征在于可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。
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| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130717 Termination date: 20140925 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |