CN102864111B - 一株产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株 - Google Patents
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Abstract
一株产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株，属于生物工程技术领域。本发明菌株分类命名为蛞蝓型裂殖壶菌（Schizochytriumlimacinum）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2012074。该菌株由通过对山东省青岛市黄海水域的水样进行分离筛选，得到了性状稳定，产二十二碳六烯酸(DHA)的裂殖壶菌菌株，可通过液态或固态发酵在25-30℃下高产二十二碳六烯酸。
Description
技术领域
一株产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株，属于生物工程技术领域。本发明涉及一种高产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株，该菌株生长速度快、产量高、对于二十二碳六烯酸的工业化生产有着重要意义。
背景技术
二十二碳六烯酸英文简称DHA，是n-3系列多不饱和脂肪酸中的重要一员，***名为全顺式△-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸。由于含有五个不饱和键的特殊结构，DHA对于人体的健康具有特殊的作用和重要的影响。DHA主要存在于人体的大脑皮层和视网膜中。研究表明：DHA在预防脑血栓、促进婴儿的大脑合成、婴幼儿的智力发育、抗炎、增强人体免疫力、抗心律失常等方面具有重要作用，此外目前已有学者致力于DHA抗癌的研究，有报道称DHA可以诱导癌细胞凋亡，在抗癌药物研发的进程中具有广阔的应用前景。基于二十二碳六烯酸的这些重要作用，它已经广泛应用于食品、医药、饲料等方面。DHA主要分布在海洋生物中，尤其是生活在水温较低海域的鱼类。人体不能通过自身合成DHA，只能通过膳食补充或者通过α-亚麻酸衍生而得，但是由于人体碳链延长酶和去饱和酶的缺乏，这一转化过程十分缓慢且效率很低。目前工业化的DHA主要是从深海鱼油中提炼所得，但是从鱼油中提取DHA具有诸多弊端例如腥味重、胆固醇含量高、受气候和位置变化的影响，鱼油中DHA的含量不稳定。此外鱼油中DHA往往与EPA同在，分离过程复杂，提取成本较高。这些缺点严重阻碍了DHA的工业化发展。由于利用发酵法生产DHA具有含量高、产品质量和产量稳定、脂肪酸组成简单、不含鱼腥味、提取容易等优点，备受国内外学者关注。DHA广泛存在于细菌、真菌和微藻中。由于产DHA细菌都是从极地或者深海水域分离获得，其嗜高压、低温，且细菌DHA产量低，提取困难，研究较少。目前研究较多的是真菌以及藻类，真菌的水霉目、虫霉目、毛霉目，微藻的硅藻类、金藻类、绿藻类、甲藻类、隐甲藻类、蓝藻类均能发酵生产DHA。裂殖壶菌（Schizochytrium）是隶属于真菌门（Eumycota）、卵菌纲（Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、破囊壶菌科（Thraustochytriaceae）的一类海洋真菌，由于其具有生长迅速、DHA含量高、易于培养等优点是目前研究DHA发酵的最佳菌株。国外用裂殖壶菌（Schizochytrium）进行DHA的研究较早，早在1991年美国的omega生物技术公司就已经使用裂殖壶菌（Schizochytrium）进行DHA的工业化生产。日本Nagase Biochemicals有限公司（《Optimization of docosahexaenoic acid productionby Schizochytrium limacinum SR21》，Applied Microbiology and Biotechnology,1998, 49,72-76)通过优化菌株Schizochytrium limacinum SR21的培养条件，最终菌体量达到59.2g/L，DHA产量达到15.5g/L。近年来国内的研究机构和高校也开始了裂殖壶菌（Schizochytrium）发酵生产DHA的研究，但是产量与品质和发达国家相比仍然有较大差距。厦门大学Zhou.L（《Enhanced production of docosahexaenoic acid using Schizochytrium sp by optimization of medium components》，Journal of chemical engineering of Japan,2007,40(12),1093-1100）通过对菌株Schizochytrium sp进行培养基组成优化，DHA最终产量能达到13.8g/L，福建师范大学张娟梅等（《裂殖壶菌Schizochytriumsp.FJU-512细胞油脂的研究》，2007,23(2),75-80）利用松花粉垂钓技术成功分离出一株DHA高产菌Schizochytriumsp.FJU-512，在1000L发酵罐中采用高密度培养，DHA最高产量可达5.42g/L。
二十二碳六烯酸(DHA)结构式
专利US6607900公开了一种采用两步发酵法生产DHA的方法，采用分批发酵法培养Schizochytrium sp，并在培养过程中通过添加玉米糖浆维持恒定的糖浓度。在细胞增长阶段使氧浓度维持在高水平，在脂质积累阶段将氧浓度维持在低水平，最终生物量可达200g/L，DHA产量高达40-45g/L。
专利CN101892160A公开了从辽宁省盘锦市大洼县赵圈河乡红海滩采集的腐土里筛选得到一株DHA高产菌株裂殖壶菌LX0809，通过补料发酵100小时后，裂殖壶菌LX0809细胞干重可达到72.5g/L，DHA的产量达到15.3g/L。
专利CN1916156A公开了一种裂殖壶菌WZU4771及其在制备DHA粉末和DHA油脂中的应用。通过优化后培养5天，菌体生物量达到42.5g/L，DHA产量为14.1g/L。
本发明从山东省青岛市黄海水域中筛选得到了性状稳定、发酵周期短、在25-30℃可高产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168。具有很好的工业应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一株产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株，得到了性状稳定，产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株，可通过固态或液态发酵生产二十二碳六烯酸。
本发明的技术方案：一株产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株，分类命名为蛞蝓型裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012074。
该菌株主要代谢产物为二十二碳六烯酸（DHA）。其18S rDNA序列为：
SEQ ID NO：1。
该菌株可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉中的一种或几种。
该菌株可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或几种。
于山东省青岛市黄海水域采集海水样品，用过滤除菌的方式除去细菌，将除去细菌后的海水样品置于事先灭好菌的培养皿中，向其中加入经紫外灭菌的松花粉作为诱饵，25℃培养3d，用接种环蘸取富集了海洋生物的花粉进行平板划线，放置在25℃的生化培养箱中培养直至有菌落产生，挑取单菌落反复进行平板划线，直至获得颜色、形态一致的纯培养物。分离用培养基为：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏5g、琼脂20g、海水晶20g、蒸馏水1000mL、青霉素20mg，pH7.0。将获得的纯培养物进行摇瓶培养。收获摇瓶培养的菌丝体抽滤，冷冻干燥至恒重，研磨菌丝体，用索式提取法提取油脂，对提得的油脂进行MS-GS联用分析脂肪酸组成。反复采用以上的方法，经过多次筛选得到二十二碳六烯酸高产的裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168。本发明涉及到的菌种有如下特征：
1.裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168培养条件
该菌种的培养常规条件是好气培养。用于培养菌种的糖质原料可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉。培养用的氮源可以是无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆。该菌株的生长温度范围为10℃-35℃，二十二碳六烯酸最佳积累温度为25℃，菌株在pH为2-9范围内能生长且代谢产二十二碳六烯酸，二十二碳六烯酸最佳积累pH为6.0。
2.裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168的形态描述
利用扫描电镜和透视电镜观察到的菌株显微形态特征如下：营养细胞椭圆形，单核，直径8-15cm，在液体培养基上细胞聚集成簇，菌落中间细胞圆形，边缘可见少许拉长的不规则细胞。细胞壁由紧密的鳞片构成。从外质网形成体形成放射状的外质网。对裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168进行连续观察记录可知：接种到新鲜培养基上的裂殖壶菌营养细胞进化连续的二等***，细胞质***紧接着细胞核***，形成四倍体细胞。在***末期形成游动孢子的孢子囊，继而孢子囊壁开始变松，释放游动孢子，孢子卵圆形，具有两条横向***的鞭毛。前部长鞭毛具有管状毛，每根毛都具有底座、管状轴、端丝。管状轴平滑没有侧丝。
3. 裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168的18S rDNA分子生物学特征
见序列表SEQ ID NO：1。
4.可采用常规的液态发酵方法，利用上述菌种生产。培养基可用含不同碳源、氮源、无机离子等普通培养基。
培养基中也可添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物，一般情况，这些营养物存在于上述的天然营养源中。
该菌株在液态发酵过程中24小时后开始产二十二碳六烯酸，72小时后二十二碳六烯酸产量达到最大值。
本发明的有益效果：裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168主要代谢产物为二十二碳六烯酸，菌丝内二十二碳六烯酸含量达50%以上，副产物更少。
培养基中也可添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物，一般情况，这些营养物存在于上述的天然营养源中。
该菌株液态发酵产二十二碳六烯酸的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨。用该培养基在25-30℃下二十二碳六烯酸的产量可达23g/L。
该菌株液态发酵过程中，24小时后开始产生二十二碳六烯酸，72小时后二十二碳六烯酸产量达到最大。
生物材料样品保藏：一株产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株，分类命名为蛞蝓型裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168，已保藏与中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2012074，保藏日期为2012年03月10日。
具体实施方式
实施例1
裂殖壶菌脂肪酸组成分析
发酵菌株为裂殖壶菌Schizochytrium limacinum JN168，采用液态发酵，培养基组成为：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏5g、海水晶20g、蒸馏水1000mL、pH7.0。发酵温度25℃，5天后发酵结束。抽滤收集菌丝体，冷冻干燥至恒重，用研钵将菌丝体磨碎。取0.1g左右烘干的菌丝体，加入到有盖的试管中。向其中加入0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液5mL,在50℃水浴中保持1h，再向其中加入5mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，在50℃水浴中保持1h，加入5mL正己烷抽提，最后加入2mL饱和氯化钠溶液水洗，移取上层溶液采用GC-MS联用检测。
色谱条件：Finnigan Trace MS（美国）气相色谱-质谱仪。采用DB-MAX毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。起始柱温180℃，保持1min，以5℃/min升高到230℃，保持8min。进样口温度260℃，载气为氦气，流速为0.8ml/min，分流比为10︰1。
质谱检测条件：EI+（70Ev），发射电流200μA，离子源温度350℃，接口温度260℃。
表1脂肪酸组成
| 名称 | C16:0 | C18:0 | C18:1 | C18:2 | C20:4 | C20:5 | C22:5 | C22:6 | 其它 |
| 占脂肪酸组成比例（%） | 35.3 | 1.36 | 0.64 | 0.17 | 0.29 | 0.70 | 9.4 | 50.1 | 2.04 |
实施例2
最佳碳源的确定
将保存在-70℃的菌种转接到含有适量海水的平板上，加入适量的紫外灭菌的松花粉，25℃培养4天。取3mL活化后的菌液，接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，25℃、200r/min摇床培养2天。以4%接种量将种子液接种到发酵培养基中，25℃、200r/min摇床培养72小时。使用单因素考察二十二碳六烯酸积累的最佳碳源，分别使用果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉替代基本发酵培养基中的葡萄糖进行液态发酵，测量干重和二十二碳六烯酸产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖90，酵母粉10，海水晶20，pH7.0，115℃灭菌20min。从表2可以看出菌株发酵产二十二碳六烯酸的最佳碳源为葡萄糖。
表2 不同碳源下的二十二碳六烯酸生产情况
| 碳源种类 | 葡萄糖 | 果糖 | 麦芽糖 | 蔗糖 | 乳糖 | 甘油 | 可溶性淀粉 |
| 菌体干重（g/l) | 59.4 | 50.0 | 48.7 | 36.7 | 35.5 | 29.8 | 37.3 |
| 产量(g/l) | 13.50 | 11.23 | 11.08 | 8.11 | 8.56 | 7.84 | 9.30 |
实施例3
最佳氮源的确定
将保存在-70℃的菌种转接到含有适量海水的平板上，加入适量的紫外灭菌的松花粉，25℃培养4天。取3mL活化后的菌液，接入到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，25℃，200r/min摇床培养2天。以4%接种量将种子液接种到发酵培养基中，25℃，200r/min摇床培养72小时。使用单因素考察二十二碳六烯酸积累的最佳氮源，分别使用硫酸铵、硝酸铵、酵母膏、蛋白胨、玉米浆替代基本发酵培养基中的酵母粉进行液态发酵，测量干重和二十二碳六烯酸产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖90，酵母粉10，海水晶20，pH7.0，115℃灭菌20min。从表3可以看出菌株发酵产二十二碳六烯酸的最佳氮源为蛋白胨。
表3 不同氮源下的花二十二碳六烯酸生产情况
| 氮源种类 | 硫酸铵 | 硝酸铵 | 酵母粉 | 酵母膏 | 蛋白胨 | 玉米浆 |
| 菌体干重（g/l) | 38.3 | 24.5 | 58.5 | 59.0 | 67.7 | 49.0 |
| 产量(g/l) | 8.75 | 5.69 | 13.42 | 12.73 | 15.71 | 10.63 |
实施例4
最佳pH的确定
将保存在-70℃的菌种转接到含有适量海水的平板上，加入适量的紫外灭菌的松花粉，25℃培养4天。取3mL活化后的菌液，接入到装有50mL种子培养基的250ml摇瓶中，25℃，200r/min摇床培养2天。以4%接种量将种子液接种到发酵培养基中，25℃，200r/min摇床培养72小时。使用单因素考察二十二碳六烯酸积累的最佳pH，将发酵pH调整到4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0测量干重和二十二碳六烯酸产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖90，蛋白胨10，海水晶20，115℃灭菌20min。 从表4可以看出菌株发酵产二十二碳六烯酸的最佳pH为6.0。
表4 不同pH值下的二十二碳六烯酸生产情况
| pH | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 | 8.0 | 9.0 |
| 菌体干重(g/l) | 48.9 | 59.5 | 70.4 | 68.4 | 53.4 | 38.2 |
| 产量(g/l) | 9.77 | 13.15 | 16.54 | 15.63 | 12.55 | 8.60 |
实施例5
温度对二十二碳六烯酸的影响
表4 不同温度下的二十二碳六烯酸的产量
| 温度℃ | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 |
| 菌体干重g/L | 35.2 | 51.3 | 71.3 | 72.2 | 63.1 |
| 产量(g/L) | 10.22 | 15.33 | 16.21 | 16.74 | 9.31 |
将保存在-70℃的菌种转接到含有适量海水的平板上，加入适量的紫外灭菌的松花粉，30℃培养4天。取3mL活化后的菌液，接入到装有50mL种子培养基的250ml摇瓶中，pH=7，30℃，200r/min摇床培养2天。以4%接种量将种子液接种到发酵培养基中，pH=7，200r/min摇床培养72小时。使用单因素考察二十二碳六烯酸积累的最佳温度，将发酵温度调整到15，20，25，30，35℃测量干重和二十二碳六烯酸产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖90，蛋白胨10，海水晶20，115℃灭菌20min。 从表5可以看出菌株在25-30℃发酵产二十二碳六烯酸的情况最好。
实施例6
发酵罐放大实验
用5L发酵罐对裂殖壶菌进行放大实验。取裂殖壶菌的保藏斜面，加入5mL无菌水，轻轻刮取菌苔，吸取2.5mL菌液加入到装有50ml种子培养基的250mL摇瓶中，25℃、200r/min培养8h，取10mL活化后的菌液加入到装有100mL新鲜种子培养基的500mL摇瓶培养32h，种子液及发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖90，蛋白胨10，海水晶20，pH6.0，115℃灭菌20min。以1%接种量将种子液接种到5L发酵罐中。罐压：0.55kg/m3,通气量：4L/min。用转速调节溶氧饱和度40%，发酵到48小时后控制溶氧饱和度为25%，使用2mol/L HCL或2mol/L NaOH调节pH值稳定在6.0，当发酵液中葡萄糖浓度降到15g/L左右，开始流加90g/L的葡萄糖溶液，使葡萄糖浓度维持在15g/L左右，发酵72小时后停止。生物量达到100g/L，二十二碳六烯酸产量高达22.9g/L。
实施例7
采用固态发酵，培养基组成（重量%）：30目的玉米粉35，30目的小麦粉35，麸皮8.7，米糠20，葡萄糖1，KH2PO4 0.25，MgSO4·7H2O 0.05；加水拌料润湿，装入广口瓶中，0.1MPa灭菌45-60min，冷却后接入液体种子拌均。发酵温度30℃，pH7，7天发酵结束后，发酵培养基中二十二碳六烯酸的含量为7.3%。
<110> 江南大学
<120> 一株产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株
<160>1
<210>1
<211>1683
<212>DNA
<213>裂殖壶菌（Schizochytriumlimacinum）JN168
<400>1
ccaacctggt tgatcctgcc ccagctccag tgctcgtctc aaagattaag ccatgcatgt 60
gtaagtataa gcgattgtac tgtgagactg cgaccggctt attatatcag taataatttc 120
ttcggtagtt tcttttatat ggatacctgc agtaattctg gaaataatac atgctgtaag 180
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ccactgtgga ctccacgagg tagtgacgag aaatttcggt gcgaagcgtg tatgcgtttt 480
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atggtcgcaa ggctgaaact taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg agtggagcct 1140
gcggcttaat ctgtgatgcc accgaaaaac ttaccaggtc cagacatagg taggattgac 1200
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agtgatttgt ctggttaatt ccgttaacga acgggacctc ggcctactaa atagtgcgtg 1320
gtatggcaac atagtacgtt tttaacttct tagagggaca tgtccggttt acgggcagga 1380
agttcgaggc tataacaggt cttagatgtt ctgggccgca cgcgcgctac ttgactcaac 1440
actgatgggt tcatcgggtt ttatttctgt ttttatggaa ttgagtgctt ggtcggaagg 1500
cctggctaat ccttggaacg ctcatcgtgc tggggctaga tttttgcaat tattaatctc 1560
caacgaggaa ttcctagtaa acgcaagtca tcagcttgca ttgaatacgt ccctgccctt 1620
tgtacacacc gcccgtcgca cctaccgatt gaacggtccg atgaaaccat gggatgtttc 1680
tgt 1683
Claims (2)
1.一株产二十二碳六烯酸DHA的裂殖壶菌菌株，其分类命名为蛞蝓型裂殖壶菌（Schizochytrium limacinum）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012074。
2.权利要求1所述的裂殖壶菌菌株的应用，其特征在于所述菌株用于发酵产生二十二碳六烯酸，发酵用碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉中的一种或几种，发酵用氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或几种。
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