CN113308387A - 联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用 - Google Patents
联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113308387A CN113308387A CN202110345911.8A CN202110345911A CN113308387A CN 113308387 A CN113308387 A CN 113308387A CN 202110345911 A CN202110345911 A CN 202110345911A CN 113308387 A CN113308387 A CN 113308387A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rhodosporidium toruloides
- culture
- fermentation
- strain
- carotenoid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 title claims abstract description 20
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 title claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 8
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 42
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 42
- 241000221523 Rhodotorula toruloides Species 0.000 claims abstract description 41
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 36
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 239000003925 fat Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 3
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 12
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 6
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 abstract description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 abstract description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 abstract description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 abstract 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract 1
- 235000005473 carotenes Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- -1 vitamin carotene Chemical class 0.000 abstract 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 4
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 4
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 4
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 4
- QPJVMBTYPHYUOC-UHFFFAOYSA-N methyl benzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1 QPJVMBTYPHYUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 108010027322 single cell proteins Proteins 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229940095102 methyl benzoate Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 108010001949 Algal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000132092 Aster Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000019784 crude fat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 235000004280 healthy diet Nutrition 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005468 ion implantation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用，所述菌株分类命名为圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）Z11，保藏编号为CCTCC NO：M 2021226。本发明通过离子束诱变，得到的突变菌株以葡萄糖为唯一碳源，在摇瓶发酵中油脂含量和类胡萝卜素产量分别达到了66%和13.5mg/g，分别是同等条件培养的出发菌株的2.12倍和12.85倍；其稳定性高、产物产量高、重复性好，是一株适合作为动物饲料的优良菌种。其富含大量蛋白质和一定量的维生素类胡萝卜素，作为动物添加剂制备工艺简单，生产原料来源广，有利于实现大规模生产，解决了微生物油脂提取后剩余的菌渣不合适动物消化吸收问题，同时也降低了微生物油脂的生产成本，促进资源之间的综合利用。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用。
背景技术
如今随着经济的发展，导致人类生活质量大步提高，更加提倡健康饮食，使得畜牧业和养殖业得到了快速进步，如若依靠传统的方式进行饲养，得到的蛋白达不到优质等级，因此尝试使用菌体蛋白作为替代品来解决蛋白饲料供应的不足之处。
菌体蛋白又称之为微生物蛋白，通常是指通过培养单细胞微生物而获得的菌体蛋白质，它是由许多工农业废料以及石油废料人工培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯质蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。单细胞蛋白中重要的是酵母蛋白、细菌蛋白和藻类蛋白，它们的化学组成一般以蛋白、脂肪为主。其中蛋白质含量可高达50％～80％，因此将单细胞蛋白应用在饲料中，具有很高的应用价值。
单细胞蛋白中一大重要成分是维生素，维生素是人和动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。它的作用只要是参与机体代谢的调节。但其与蛋白质、脂类和糖类不同。人和动物体内不能自主合成，必须从食物中获得，如若缺乏维生素对于机体的新陈代谢、生长、发育、健康都有一定的影响。
在我国，可产油微生物有细菌类、酵母菌类、霉菌类和微藻类等，微生物在一定条件下其利用碳水化物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂和另一些有商业价值的脂质。其中如若在胞内积累的油脂是其生物总量20％(w/w)，称其为产油微生物。其中在真核微生物中，某些产油种属能在胞内累计到其生物总量的70％(w/w)的油脂含量。这些油脂主要以脂肪酸甘油三酯的形式存在于胞内，其组成与一般的动植物油脂相似，因此将微生物油脂发酵应用在工业化生产生物柴油和生物饲料方面，具有重要的研究意义。
由于微生物油脂是胞内产物，在获取油脂的同时将伴随着大量的菌体残渣。由于不论是原核微生物还是真核微生物，提取油脂后剩下的残余物用作饲料蛋白的潜在来源。尤其是高产油脂的酵母、霉菌和微藻等，因其油脂含量和生物安全性均较高，近年来备受瞩目。利用这些产油微生物发酵各种非粮作物、农林业废弃物、工业废液以及工业废弃物等生产微生物油脂的研究越来越多。
工业上常用的微生物油脂提取法包括压榨法、浸出法以及超临界流体萃取法。并且对于提取油脂的前处理也至关重要，针对不同的生产菌种也常采用不同的菌种前处理法，例如将菌体干燥后进行高温处理，或者进行酶解，物理破碎或者化学法处理等方法将细菌壁进行破解。这些破壁的方法，有些只适用于实验室少量的破碎油脂提取，如若进行大量的工业化生产，经济成本是不可忽视是一大因素，有些虽然达到了细菌壁破碎的效果，但是其化学试剂残留在菌体上，导致菌渣的再利用价值被大大折扣。因此想要将菌体大批量的提取油脂，针对不同的菌种采取合适的油脂提取方法、菌渣后期处理方法，是非常重要的。这不但有利于加快微生物油脂及生物柴油等产业的工业化生产进程，更能促进资源综合利用，解决菌体蛋白生产原料的供应短缺问题。
微生物油脂发酵菌渣中含有大量的蛋白和细胞壁成分。通常情况下，对菌体进行压榨或者超临界流体萃取法得到的菌渣中无溶剂残留，可以直接作为菌体蛋白饲料使用。因此要达到高产量类胡萝卜素的工艺同时，还要考虑提取油脂对于菌渣再利用率问题，最终实现大规模工业化生产。
发明内容
本发明旨在提供联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一株联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株，其分类命名为圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)Z11，保藏编号为CCTCC NO：M 2021226。
本发明的另一目的在于提供所述圆红冬孢酵母在生产油脂中的应用。
具体的，将所述圆红冬孢酵母发酵培养后的发酵液冷冻干燥后，采用有机溶剂萃取获得。
本发明的又一目的在于提供所述圆红冬孢酵母在生产类胡萝卜素中的应用。
本发明的再一目的在于提供所述圆红冬孢酵母在制备动物饲料添加剂中的应用。
具体的，将所述圆红冬孢酵母发酵培养后的发酵液冷冻干燥后，采用有机溶剂萃取油脂，经水解处理后，制成总固形物浓度为10％～90％w/w的液态添加剂成品或在20℃～100℃下干燥制得固态添加剂成品。
所述圆红冬孢酵母发酵培养的方式如下：
1)平板培养：将圆红冬孢酵母接种至平板培养基培养，培养温度28℃～30℃，培养时间24～30h；
2)种子培养：将平板培养的圆红冬孢酵母接种到种子培养基中培养，培养温度28℃～30℃，培养时间24～30h；
3)发酵培养：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量10～12％v/v，发酵温度28℃～30℃，发酵培养时间为100～120h。
进一步的，所述圆红冬孢酵母在好氧条件下发酵培养。
进一步的，所述圆红冬孢酵母以葡萄糖为碳源发酵培养。
进一步的，圆红冬孢酵母发酵培养的培养基以质量含量计，配方为：葡萄糖、K2HPO40.04％、NaH2PO40.1％、MgSO4·H2O 0.15％、酵母提取物0.175％，其中微量元素为：ZnSO4、CaCl2、MnCl2、CuSO4分别为0.192×10-7g/L、0.167g/L、0.54×10-4g/L、0.16×10-4g/L。
本发明采用离子束诱变圆红冬孢酵母，利用平板筛选具有较强的耐受性、并能产类胡萝卜素产量高的菌株。利用本发明的菌株和工艺进行发酵，以葡萄糖作为碳源，在摇瓶发酵产物中油脂含量和类胡萝卜素产量分别达到了66％和13.5mg/g，分别是同等条件培养的出发菌株的1.57倍和12.85倍，并且通过对油脂成分分析发现，其中的亚油酸和棕榈酸占总油比分别高达68％和22％，可用于联产亚油酸和棕榈酸；具有重大的社会意义和经济价值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明所述的生物材料，其分类命名为圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)Z11，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2021226，保藏日期为2021年03月15日，保藏地址：中国武汉。
实施例1：本实施例说明将圆红冬孢酵母的筛选方法。
圆红冬孢酵母原始菌株为在南京工业大学西苑食堂附近的湖泊采集的土壤中筛选的野生菌；
具体的，以YPD平板作为培养基，在好氧、30℃条件下进行培养，培养2-4天，进行划线纯化5-7次，最终能在平板上生长的菌株进行验证，并将其发酵，考察其发酵产物和性能，发现该菌株可以利用很多碳源进行生长，并且可以产生微量的类胡萝卜素。将此菌株为出发菌株进行菌株改造。
进行第一步离子束诱变的方法如下：
用将圆红冬孢酵母原始菌株活化培养，培养温度30℃，100mL摇瓶装液量20mL，培养时间24～30h，得到处于对数生长期的菌液；取新鲜培养的细胞用生理盐水稀释至细胞浓度OD600＝0.6，取10微升菌液铺开在小铁片上，无菌空气吹干；用10KeV注入1.6×1016ions/cm2剂量，脉冲方式每次注入5s，间隔15s。离子注入诱变后，将菌膜洗脱下来。
对诱变菌株进行进一步筛选，方法如下：
其中，所使用的培养基配方(％为质量百分比)：
(1)固体平板培养基：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，其余为水，pH6。
(2)摇瓶发酵筛选培养基：葡萄糖8％、K2HPO4 0.04％、NaH2PO4 0.1％、MgSO4·H2O0.15％、酵母提取物0.075％，添加不同的碳源(蛋白胨、谷氨酸、冰醋酸、硫酸铵)，pH为6.0，115℃，高压灭菌20min。注：除冰醋酸外、MgSO4·H2O均为过滤除菌。
(3)磷酸盐缓冲溶液：0.2M NaH2PO4溶液，直至pH为6.0，121℃高压灭菌20min。
筛选步骤：
1、平板筛选
用生理盐水洗出经离子束诱变的菌株，稀释成不同浓度涂布于常规YPD固体培养基平板上，在28～30℃温度下好氧培养30h，挑选可以在筛选平板上生长、菌落较大的菌落几株。
2、平板复筛
将筛选的菌株接种于100mL的三角瓶装液量20mL，28～30℃好氧培养24～30h，无菌生理盐水制成浓度OD600＝0.6的菌悬液，吸取2uL点滴培养基平板上，在28～30℃温度下好氧培养12～24h，挑选出菌落显大于出发菌的菌落。
最终菌株Z11和Z12产出了最大量类胡萝卜素。
3、摇瓶发酵筛选
将菌株Z11、Z12和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度30℃，250mL的三角瓶装液量50mL，培养时间24h。然后再以发酵培养基好氧发酵，接种量10％(v/v)，发酵温度30℃，500mL三角瓶装液量100mL，发酵时间120h后检测各菌株的类胡萝卜素产量如表1所示：
表1筛选培养基中Z11、Z12和原始菌发酵结果
经过平板组合筛选获得的两株突变株在发酵过程中类胡萝卜素产量和油脂含量均明显高于出发菌株，其中Z11具有最高的产量。这与组合平板筛选的结果一致。
实施例2：本实施例说明突变株Z11和Z12的传代稳定性。
在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测突变株Z11和Z12的传代稳定性。菌株Z11和Z12传代发酵试验结果如表2所示：
表2菌株Z11和Z12传代发酵试验结果
从实验结果可知，经过7次连续传代，两株突变株的类胡萝卜素产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例3：本实施例说明圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)Z11发酵生产类胡萝卜素的工艺。
本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：
平板培养基：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂2％，其余为水，pH 6。
种子培养基：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，其余为水。
发酵培养基：葡萄糖8％、K2HPO4 0.04％、NaH2PO40.1％、MgSO4·H2O 0.15％、酵母提取物0.175％，其中微量元素为：ZnSO4、CaCl2、MnCl2、CuSO4分别为0.192×10-7g/L、0.167g/L、0.54×10-4g/L、0.16×10-4g/L。
将圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)Z11接种至平板培养基好氧培养，培养温度30℃，培养时间26h。将平板培养的Z11接种到种子培养基中，250mL三角瓶装液量50mL，培养温度30℃，培养时间26h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10％(v/v)，发酵温度28℃～30℃，500mL三角瓶装液量100mL，好氧发酵培养120h后，检测类胡萝卜素达到了13.5mg/g，比同等条件培养的出发菌株提高了12.85倍。
实施例4：本实施说明圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)Z11部分油脂含量稳定并且高产。
将发酵结束的菌液(Z11、Z12)全部收集并冷冻干燥48h后，称取20mg的菌株冻干粉于15mL玻璃管中，加入1.5mL的正己烷、0.5mL、2mg/mL的苯甲酸甲酯溶于正已烷，并加入2mL的15％H2SO4(酯化)甲醇中。
将预处理好的样品置于100℃环境下连续摇动2h。随后置于冰上冷却10min，加入1mL ddH2O，转速在2500rpm下离心5min。制得上清液(脂肪酸甲酯提取物)，置于GC瓶中，进行气相检测。检测到各菌株总油脂含量及棕榈酸和亚油酸的含量如下表所示：
表3菌株Z11和Z12传代发酵试验结果
从实验结果所知，菌株Rhodosporidium toruloides Z11总油脂含量达到了66％，是同等培养条件下出发菌株总油脂含量的提高了2.12倍，其中油脂含量中的棕榈酸和亚油酸占总油比22％和68％，是其他圆红冬孢酵母产同类不饱和脂肪酸的20-30倍。
实施例5：本实施例说明圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)Z11制得固体菌渣用作动物饲料。
采用实施例4的方法本实施发酵培养将圆红冬孢抱酵母Rhodosporidiumtoruloides Z11后，将发酵液冷冻干燥得到含油量为66％的干菌体58.5g。在研磨机中将干菌体研磨成粉末，按50g菌粉加入0.1L正己烷进行萃取，超声波震荡5-15min，6000rpm离心10min，得到上层混合油，将混合油进行蒸煮取得到酵母油脂39g，再进行脱溶处理，回收固体菌渣。将前述菌渣与适量水混合调节到总固形物浓度为90％，用硫酸调节pH值在3.0-4.5范围内，在90℃温度下连续摇晃20分钟后，冰上冷却到室温，用4M NaOH溶液中和至pH 5.5～6.0。继续添加水，调节到总固形物浓度为30％，得液态动物饲料添加剂成品130mL。该成品为褐色悬浊液，略带香味，含粗脂肪5.2％，粗蛋白12％，粗纤维4％，灰分2.3％。
Claims (10)
1. 一株联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株，其特征在于，其分类命名为圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）Z11，保藏编号为CCTCC NO：M 2021226。
2.权利要求1所述的圆红冬孢酵母在生产油脂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述圆红冬孢酵母发酵培养后的发酵液冷冻干燥后，采用有机溶剂萃取获得。
4.权利要求1所述的圆红冬孢酵母在生产类胡萝卜素中的应用。
5.权利要求1所述的圆红冬孢酵母在制备动物饲料添加剂中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述圆红冬孢酵母发酵培养后的发酵液冷冻干燥后，采用有机溶剂萃取油脂，经水解处理后，制成总固形物浓度为10%〜90% w/w的液态添加剂成品或在20℃〜100℃下干燥制得固态添加剂成品。
7.根据权利要求2~6任一项所述的应用，其特征在于，所述圆红冬孢酵母发酵培养的方式如下：
1）平板培养：将圆红冬孢酵母接种至平板培养基培养，培养温度28℃~30℃，培养时间24～30 h；
2）种子培养：将平板培养的圆红冬孢酵母接种到种子培养基中培养，培养温度28℃~30℃，培养时间24～30h；
3）发酵培养：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量10～12% v/v，发酵温度28℃~30℃，发酵培养时间为100~120h。
8.根据权利要求2~6任一项所述的应用，其特征在于，所述圆红冬孢酵母在好氧条件下发酵培养。
9.根据权利要求2~6任一项所述的应用，其特征在于，所述圆红冬孢酵母以葡萄糖为碳源发酵培养。
10. 根据权利要求2~6任一项所述的应用，其特征在于，所述圆红冬孢酵母发酵培养的培养基以质量含量计，配方为：葡萄糖、K2HPO4 0.04%、NaH2PO40.1%、MgSO4·H2O 0.15%、酵母提取物0.175%，其中微量元素为：ZnSO4、CaCl2、MnCl2、CuSO4分别为0.192×10-7g/L、0.167g/L、0.54×10-4g/L、0.16×10-4g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110345911.8A CN113308387B (zh) | 2021-03-31 | 2021-03-31 | 联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110345911.8A CN113308387B (zh) | 2021-03-31 | 2021-03-31 | 联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113308387A true CN113308387A (zh) | 2021-08-27 |
| CN113308387B CN113308387B (zh) | 2023-01-03 |
Family
ID=77371956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110345911.8A Active CN113308387B (zh) | 2021-03-31 | 2021-03-31 | 联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113308387B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113755438A (zh) * | 2021-10-11 | 2021-12-07 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用 |
| CN114085882A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-02-25 | 南京工业大学 | 利用廉价碳源糖蜜生产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的方法 |
| CN114921504A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-08-19 | 南京工业大学 | 变温发酵生产微生物油脂和类胡萝卜素的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103589650A (zh) * | 2005-03-18 | 2014-02-19 | 米克罗比亚公司 | 产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生 |
| CN105950494A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-09-21 | 福建师范大学 | 生产亚油酸和亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法 |
| CN110495520A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-11-26 | 福建师范大学 | 茶渣发酵液及其制备方法和用途 |
-
2021
- 2021-03-31 CN CN202110345911.8A patent/CN113308387B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103589650A (zh) * | 2005-03-18 | 2014-02-19 | 米克罗比亚公司 | 产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生 |
| CN105950494A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-09-21 | 福建师范大学 | 生产亚油酸和亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法 |
| CN110495520A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-11-26 | 福建师范大学 | 茶渣发酵液及其制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 孙磊: "圆红冬孢酵母突变菌株产油脂和类胡萝卜素的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》 * |
| 张超蕾等: "圆红冬孢酵母类胡萝卜素合成突变菌株的筛选", 《大连工业大学学报》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113755438A (zh) * | 2021-10-11 | 2021-12-07 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用 |
| CN113755438B (zh) * | 2021-10-11 | 2023-08-08 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用 |
| CN114085882A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-02-25 | 南京工业大学 | 利用廉价碳源糖蜜生产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的方法 |
| CN114921504A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-08-19 | 南京工业大学 | 变温发酵生产微生物油脂和类胡萝卜素的方法 |
| CN114921504B (zh) * | 2022-02-11 | 2023-07-07 | 南京工业大学 | 变温发酵生产微生物油脂和类胡萝卜素的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113308387B (zh) | 2023-01-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113308387B (zh) | 联产不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的菌株及其应用 | |
| JP6807329B2 (ja) | ω−７脂肪酸合成物、及び黄緑色藻を培養して該合成物を生産する方法と応用 | |
| CN102888347B (zh) | 小球藻突变株及其应用 | |
| WO2009105927A1 (zh) | 一种利用异养小球藻高密度发酵产生生物柴油的方法 | |
| Lin et al. | Microbial lipid production by oleaginous yeast in D-xylose solution using a two-stage culture mode | |
| Yen et al. | The growth of oleaginous Rhodotorula glutinis in an internal-loop airlift bioreactor by using mixture substrates of rice straw hydrolysate and crude glycerol | |
| CN111334407B (zh) | 一种深度发酵酵母制备酵母培养物的工艺技术及工艺设备 | |
| CN102268385B (zh) | 一种用于发酵生产环磷酸腺苷的节杆菌及其应用 | |
| WO2021254076A1 (zh) | 一种产油酵母及其应用 | |
| CN102864188A (zh) | 一种木质纤维素生产生物柴油的方法 | |
| CN103602591B (zh) | 一种裂殖壶菌及用于生产二十二碳六烯酸油脂的方法 | |
| CN101974574B (zh) | 一种以木薯淀粉原料生产微生物油脂的补料分批发酵工艺 | |
| KR20220088761A (ko) | 모르테에렐라 알피나 및 그 응용, Sn-2 ARA가 풍부한 미생물 유지 및 그것의 제조 방법과 응용 | |
| CN105349588B (zh) | 利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法 | |
| CN103352016B (zh) | 利用Alteromonas colwelliana A321发酵浒苔制备生物肥 | |
| CN101613724A (zh) | 重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法 | |
| CN101805760A (zh) | 一种生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法 | |
| CN105368885A (zh) | 一种强化圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的方法 | |
| CN107988104B (zh) | 一株产单细胞油脂的隐球菌及粗甘油培养产油脂的方法 | |
| CN105400835A (zh) | 一种利用豆渣制备dha的方法和dha | |
| Peng et al. | Microbial Lipid Production by Co‐Fermentation with Mortierella alpina Obtained by Ion Beam Implantation | |
| CN111411141B (zh) | 一种菌酶共酵玉米秸秆生产微生物油脂的方法 | |
| CN112779295B (zh) | 一种产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基 | |
| CN102399832B (zh) | 利用深黄被孢霉固态发酵玉米淀粉和麸皮生产饲用油脂的方法 | |
| CN103849575A (zh) | 一种单细胞蛋白的生产方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240514 Address after: Room 302, Building A, Fenghuang Technology Entrepreneurship Park, No. 14 Fenghuang Avenue, Fenghuang Town, Zhangjiagang City, Suzhou City, Jiangsu Province, 215000 Patentee after: Zhangjiagang Heli Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 211816 Puzhu South Road, Pukou District, Nanjing, Jiangsu Province, No. 30 Patentee before: NANJING University OF TECHNOLOGY Country or region before: China |