CN105483171B - 一种提高辅酶q10工业产量的生产方法 - Google Patents

一种提高辅酶q10工业产量的生产方法 Download PDF

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Abstract

一种提高辅酶Q10工业产量的生产方法，包括：将保藏号为CGMCC No.5997、CGMCC No.5998或CGMCC No.5999的菌株依次经复苏和种子培养基扩培后筛选得到发酵种子，将所得发酵种子扩培后接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得辅酶Q10，种子培养基中Fe2+的浓度为0.1～0.5mol/L。本发明解决了现有发酵法生产辅酶Q10工业产量不高的技术问题。

Description

一种提高辅酶Q10工业产量的生产方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种能促进类球红细菌 Rhodobactersphaeroides产辅酶Q10菌株活性及产量的特有培养方法。
背景技术
辅酶Q10(Coenzyme Q10)又称泛醌(Ubiquinone，缩写UQ)，是一种存在于自然界的脂溶性醌类化合物，是生物体内电子传递链上重要的递氢体。在人类身体细胞内参与能量制造及活化，是预防动脉硬化形成最有效的抗氧化成份。辅酶Q10能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能，医学上广泛用于心血管***疾病，国内外广泛将其用于营养保健品及食品添加剂。
辅酶Q10的制备方法主要有三种：动植物组织细胞提取法、化学合成法和微生物发酵法。动植物细胞提取法由于生产效率较低，工艺落后，目前在工业化生产中已基本不用。例如，公开号为CN 102391093A的中国发明专利申请公开了一种从烟草中提取辅酶Q10的方法，其工艺流程是：将已与培养液分离的烟草悬浮培养细胞或烟草悬浮培养组织块和75～85％乙醇-石油醚溶液混合匀浆5～10分钟，匀浆结束后上述匀浆混合物过滤，静置分层，上层溶液浓缩后即得辅酶Q10的粗提物。
用化学合成法生产辅酶Q10，例如，公开号为CN 1931818的中国发明专利申请公开了一种合成辅酶Q10的方法。该方法是以辅酶Q0氢醌和含量不低于95％的异癸十异戊二烯基醇为原料,经脱水后,在无氧环境中经三氟甲磺酸及其金属盐催化,室温条件下缩合反应,得到辅酶Q10氢醌,。化学合成法产率相对较低，且用茄呢醇制得的烯丙基化试剂是顺、反异构体的混合物，活性不强，需要分离，因此这种方法的应用受到了限制。
微生物发酵法是近几年全球开发的热点，被认为是最有前途的生产方式。利用微生物发酵法生产辅酶Q10，无论是从产品的质量和安全性方面，都有较大的竞争优势，适用于大规模的工业化生产。
例如公开号为CN 101024849的中国发明专利申请公开了一种辅酶 Q10的光合细菌发酵法：利用DNA重组技术构建、筛选高产辅酶Q10光合细菌菌株，同时，采用化学物质或紫外线致突变，利用类胡萝卜素合成抑制剂和生长抑制剂筛选高产辅酶Q10光合细菌突变体，实现高产辅酶Q10菌株的选育和培育。公开号为CN 1884562的中国发明专利申请公开了一种生产辅酶Q10的方法，采用发酵方法生产，发酵所采用的菌种为农杆菌 LQ10。
现有的微生物发酵法尤其是采用工程菌时都存在辅酶Q10工业产量不高的问题。
发明内容
本发明提供一种提高辅酶Q10工业产量的生产方法，解决了现有发酵法生产辅酶Q10工业产量不高的技术问题。
一种提高辅酶Q10工业产量的生产方法，包括：将保藏号为CGMCC No.5997、CGMCCNo.5998或CGMCC No.5999的菌株依次经复苏和种子培养基扩培后筛选得到发酵种子，将所得发酵种子扩培后接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得辅酶Q10，种子培养基中Fe2+的浓度为0. 1～0.5mol/L。
保藏号为CGMCC No.5997的菌株为类红球细菌，拉丁文学名为 rhodobactersphaeroides，命名为NHU-ZUB菌株。
CGMCC No.5998的菌株为类红球细菌，拉丁文学名为rhodobacter sphaeroides，命名为NHU-ZDD菌株。
CGMCC No.5999的菌株为类红球细菌，拉丁文学名为rhodobacter sphaeroides，命名为NHU-ZAA菌株。
以上菌株均为申请人在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏并存活的菌株。
在微生物发酵生产中，菌种的优良是整批发酵生产产量高低的关键，在菌株接入大罐之前，选择优秀的菌株是高产的保证，菌种筛选是提高菌种质量、稳定发酵水平的重要手段。而适宜的生长环境是菌株快速生长的保证，给予菌株充足的需求，才能让菌株不受短板效应的限制，最大程度地为生产服务。
辅酶Q10是生物体内电子传递链上重要的递氢体，因而增强电子传递链强度有利于辅酶Q10的积累。其中，铁离子是电子传递链中铁硫蛋白、细胞色素以及生物体内血红蛋白的重要辅基。
本发明研究人员研究中发现，目前已公开的报道中，铁离子用做培养基的微量促进剂使用，而鲜见利用培养基中添加铁离子浓度来筛选适用工业生产使用的菌种，尤其适合经基因工程改造后的菌种。
本发明在保持辅酶Q10发酵原有品质的前提下，根据辅酶Q10生产菌的生理特性，通过大量的摇瓶工艺优化实验，以有效提高菌株活性和辅酶 Q10产量为目的，建立一种有效可行的培养筛选方法，找到了一种能有效提高辅酶Q10生产菌株菌体活性和生产产量的发酵培养方法，并在生产中实现了扩大，有效提高了生产产量。
优选地，所述种子培养基中Fe2+的浓度为0.1～0.3mol/L；更进一步优选地，种子培养基中Fe2+的浓度为0.3mol/L。
进一步优选地，种子培养基中扩培的培养条件为：30～32℃避光培养 22～24h。灭菌温度121℃，灭菌时间20min。
优选地，所述复苏依次在平板培养基和斜面培养基中进行，平板培养基和种子培养基中Fe2+的浓度均为0.1～0.5mol/L。
进一步优选地，所述平板培养基中Fe2+的浓度为0.1～0.3mol/L；更进一步优选地，所述平板培养基中Fe2+的浓度为0.3mol/L。
进一步优选地，所述斜面培养基中Fe2+的浓度为0.1～0.3mol/L；更进一步优选地，所述斜面培养基中Fe2+的浓度为0.3mol/L。
进一步优选地，斜面培养基中的培养条件为30～32℃避光培养 60～80h。灭菌温度121℃，灭菌时间20min。
优选地，Fe2+以氯化铁、硫酸亚铁和柠檬酸铁中的至少一种化合物形式添加到培养基中。
更优选地，平板培养基、斜面培养基和种子培养基中Fe2+的浓度均为 0.1～0.3mol/L；最优选地，平板培养基、斜面培养基和种子培养基中Fe2+的浓度均为0.3mol/L。
本发明所用平板培养基和斜面培养基为类红球菌常用培养基，包括碳源、氮源、无机盐、维生素等常规成分。
优选地，平板培养基(每100mL)成分为：葡萄糖0.3g，酵母提取物 0.8g，氯化钴0.003g，氯化钠0.2g，硫酸锰0.0001g，磷酸氢二钾0.13g，硫酸镁0.025g，维生素B10.1ug，维生素K 0.1ug，维生素A 0.15ug，琼脂粉1.5g，再添加0.1～0.5mol/L的Fe2+。pH为7.2，灭菌条件可以为118℃， 10min。
斜面培养基的成分(每100mL)为：葡萄糖0.3g，酵母提取物0.8g，氯化钴0.003g，氯化钠0.2g，硫酸锰0.0001g，磷酸氢二钾0.13g，硫酸镁0.025g，维生素B10.1ug，维生素K0.1ug，维生素A 0.15ug，琼脂粉 1.2g；再添加0.1～0.5mol/L的Fe2+。pH为7.2，灭菌条件可以为118℃， 10min。
种子培养基(每100mL)成分为：硫酸铵0.25g，玉米浆0.05g，葡萄糖0.3g，酵母提取物0.14g，氯化钴0.003g，氯化钠0.2g，硫酸锰0.0001g，磷酸氢二钾0.05g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.1g，碳酸钙0.8g，维生素 B10.1ug，维生素K 0.1ug，维生素A 0.15ug，再添加0.1～0.5mol/L的Fe2+。 pH为7.2，灭菌条件可以为118℃，10min。
本发明的菌种筛选过程具体包括以下步骤：
1)菌种的初筛(复苏)：采用平板单菌落挑斑接种小试管斜面培养基，培养一段时间后接种发酵摇瓶测样筛选；
2)菌种的复筛(扩培)：从初筛获得的结果挑选优秀菌株，冷冻管接小母瓶然后接发酵瓶测样复筛；
3)菌种的保藏：对复筛获得的菌株进行涂茄子瓶斜面，培养后添加甘油保藏；
4)菌株的生产使用：将复筛获得的优秀菌株接种大母瓶，培养后作为一级发酵母种，扩培后接种至发酵罐中培养。
筛选步骤(1)和(2)中发酵瓶培养时间为31℃避光培养48h，灭菌温度121℃，灭菌时间20min。
筛选步骤(3)中，茄子瓶斜面培养时间为31℃避光培养3天，灭菌温度121℃，灭菌时间20min。
上述筛选过程中检测效价所用发酵培养基为本发明所用菌株常用发酵培养基，包括碳源、氮源、无机盐、维生素等常规成分。
优选地，所述发酵培养基(每100mL)：硫酸铵0.3g，葡萄糖4g，味精0.3g，氯化钴0.005g，氯化钠0.28g，碳酸钙0.6g，磷酸氢二钾0.15g，硫酸镁0.63g，硫酸亚铁0.12g，玉米浆0.4g维生素B10.1ug，维生素K 0.1ug，维生素A 0.15ug，pH为7.2，灭菌条件可以为118℃，10min。
检测效价时的发酵培养条件为：在26～34℃、200rpm～250rpm避光培养48～96小时，提取发酵液检测效价。搅拌的目的是为发酵过程供氧，调整转速以达到调整供氧浓度的目的，在本发明菌株筛选的基础上再结合发酵过程中的供氧，可以进一步提高辅酶Q10产量。
本发明中筛选得到的菌种在生产使用时的扩培过程如下：
(1)斜面培养：将保存的甘油管接到茄型瓶斜面上，在31℃培养3 天。
(2)种子培养：用无菌水洗涤培养好的斜面，制成108～109个细胞每毫升的菌悬液，移取10ml到装量500ml/1000ml的种子瓶中，30℃、 180～250rpm的条件下培养22-26小时得到种子液。
上述步骤(2)所得种子液可直接接种至发酵罐中发酵培养，接种量 10％，发酵中发酵培养基的成分优选为：所述发酵培养基成分为：葡萄糖 1.8-2.5g/L，酵母膏7.5～8.5g/L，氯化钠2.5～3g/L，磷酸氢二钾0.5～0.8g/L，硫酸镁0.2～0.3g/L，硫酸铵2.5～3.5g/L，pH为6.5～7.0。
进一步优选为：葡萄糖1.8-2.5g/L，酵母膏8g/L，氯化钠2.8g/L，磷酸氢二钾0.6g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸铵3g/L，pH为6.8。发酵罐中培养条件为：培养温度29-33℃、罐内压力0.03～0.05Mpa、空气流量5～6L/min、搅拌转速为500-700rpm。
发酵过程中根据菌体生长情况调整工艺参数以及开始连续补加葡萄糖。
本发明首次在辅酶Q10整个发酵生产流程中采用了特有的筛选培养方法，并使用添加合适浓度的铁的不同化合物来提高菌株活性和产量的各种培养基，优选添加铁离子浓度0.1～0.5mol/L。铁是细胞生长必须的元素，适量添加铁离子能促进细胞的正常生长。铁离子是电子传递链中铁硫蛋白、细胞色素以及生物体内血红蛋白的重要辅基。以往的生产中，对铁离子的关注不够，往往只是在培养基中少量添加单一铁的化合物，限制了细胞的快速生长，本发明通过大量实验验证了在培养基中添加不同种类及配比的铁的化合物，能提高菌株生长活性以及产辅酶Q10的能力。
由此可见，本发明相比以前的发酵工艺具备以下优点：①菌种细胞的生长活力强，耐受性强，在发酵罐中容易生产；②生理状态稳定，保持稳定的生产能力；③菌株产量稳定并能缓慢提高产量，在优胜劣汰中保证生产能力。
本发明首次在辅酶Q10发酵生产中使用添加合适浓度不同铁的化合态的培养基来进行筛选和培养同时进行的发酵培养方法，优选添加铁离子浓度0.1～0.5mol/L，并应用于中试与大试发酵中，取得理想的发酵结果。
附图说明
图1为添加不同铁的化合物对辅酶Q10合成影响对比图。
图2为不同硫酸亚铁浓度对辅酶Q10合成影响对比图。
图3为添加铁离子在不同转速对辅酶Q10合成影响对比图。
具体实施方式
(1)平板培养基基础成分(每100mL)：葡萄糖0.3g，酵母提取物 0.8g，氯化钴0.003g，氯化钠0.2g，硫酸锰0.0001g，磷酸氢二钾0.13g，硫酸镁0.025g，维生素B10.1ug，维生素K 0.1ug，维生素A 0.15ug，琼脂粉1.5g，pH为7.2，灭菌条件可以为118℃，10min。
(2)斜面培养基基础成分(每100mL)：葡萄糖0.3g，酵母提取物 0.8g，氯化钴0.003g，氯化钠0.2g，硫酸锰0.0001g，磷酸氢二钾0.13g，硫酸镁0.025g，维生素B10.1ug，维生素K 0.1ug，维生素A 0.15ug，琼脂粉1.2g，pH为7.2，灭菌条件可以为118℃，10min。
(3)种子培养基基础成分(每100mL)：硫酸铵0.25g，玉米浆0.05g，葡萄糖0.3g，酵母提取物0.14g，氯化钴0.003g，氯化钠0.2g，硫酸锰 0.0001g，磷酸氢二钾0.05g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.1g，碳酸钙0.8g，维生素B10.1ug，维生素K 0.1ug，维生素A 0.15ug，pH为7.2，灭菌条件可以为118℃，10min。
(4)发酵培养基(每100mL)：硫酸铵0.3g，葡萄糖4g，味精0.3g，氯化钴0.005g，氯化钠0.28g，碳酸钙0.6g，磷酸氢二钾0.15g，硫酸镁 0.63g，玉米浆0.4g，FeSO40.12g，维生素B10.1ug，维生素K 0.1ug，维生素A 0.15ug，pH为7.2，灭菌条件可以为118℃，10min。
(5)发酵罐培养基：葡萄糖1.8-2.5g/L，酵母膏8g/L，氯化钠2.8g/L，磷酸氢二钾0.6g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸铵3g/L，pH为6.8，灭菌条件可以为118℃，10min。
以下给出发酵液目的产物辅酶Q10采用液相检测条件：
色谱柱：C18，4.6*150mm,5um；
检测波长：275nm；
流动相：乙醇：甲醇＝1:1；
流速：1.5ml/min；
柱温：35℃。
实施例1：添加铁的不同化合物与不添加摇瓶辅酶Q10发酵的比较。
摇瓶初筛育种发酵流程：平板单菌落→小试管斜面→发酵瓶→液相检测Q10效价→甘油管。具体过程如下：
选择在平板上培养7天左右单菌落，对应挑入小试管斜面中，31℃避光培养3天后用4mL水洗，吸取1mL菌液至装50ml发酵培养基的250mL 摇瓶，31℃，230r/min避光培养48h，提取发酵液检测效价，剩余菌液冰箱保存待用。将测得结果优秀菌株菌液添加相同体积40％甘油保种。
摇瓶复筛育种发酵流程：初筛甘油管→小母瓶→发酵瓶→液相检测 Q10效价→茄子瓶斜面扩培并用于生产。具体过程如下：
选取初筛得到甘油管接入装50ml种子培养基的250mL摇瓶，31℃， 230r/min避光培养23h，吸取1mL菌液至装50ml发酵培养基的250mL摇瓶，31℃，230r/min避光培养48h、96h，分别提取发酵液检测效价。选择优秀菌株冷冻管涂茄子瓶斜面扩培，扩培出的菌株接种子瓶应用大生产。
在平板、斜面和种子培养基中添加0.1mol/L铁的化合物于不添加的摇瓶实验结果对比如表1，表1：添加铁的不同化合物与不添加的发酵结果。
结果表明：培养基中添加铁的化合物体现以下优点：
①平板上单菌落生长快，菌落色泽光鲜饱满；
②种子瓶中菌株个体大小生长快，形态圆润，整体菌浓较高；
③发酵瓶中菌株生长较快，效价较高。以添加硫酸亚铁更优。
实施例2：培养基中添加不同梯度的硫酸亚铁浓度摇瓶辅酶Q10发酵的比较。
摇瓶初筛育种发酵流程：平板单菌落→小试管斜面→发酵瓶→液相检测Q10效价→甘油管。具体过程如下：
选择在平板上培养7天左右单菌落，对应挑入小试管斜面中，31℃避光培养3天后用4mL水洗下，吸取1mL菌液至装50ml发酵培养基的 250mL摇瓶，31℃，230r/min避光培养48h，提取发酵液检测效价，剩余菌液冰箱保存待用。将测得结果优秀菌株菌液添加相同体积40％甘油保种。
摇瓶复筛育种发酵流程：初筛甘油管→小母瓶→发酵瓶→液相检测 Q10效价→茄子瓶斜面扩培并用于生产。具体过程如下：
选取初筛得到甘油管接入装50ml种子培养基的250mL摇瓶，31℃， 230r/min避光培养23h，吸取1mL菌液至装50ml发酵培养基的250mL摇瓶，，31℃，230r/min避光培养48h、96h，分别提取发酵液检测效价。选择优秀菌株冷冻管涂茄子瓶斜面扩培，扩培出的菌株接种子瓶应用大生产。
在平板、斜面和种子培养基中添加不同梯度的硫酸亚铁浓度，筛选得到的菌种在摇瓶实验结果对比如表2：
表2：添加不同梯度硫酸亚铁发酵实验对比结果：
结果表明，在平板和种子培养基中添加硫酸亚铁浓度0.1～0.5mol/L选育后，效果尤为明显。
实施例3：添加铁离子后在不同供氧条件下的摇瓶发酵辅酶Q10比较。
摇瓶初筛育种发酵流程：平板单菌落→小试管斜面→发酵瓶→液相检测Q10效价→甘油管。具体过程如下：
选择在平板上培养7天左右单菌落，对应挑入小试管斜面中，31℃避光培养3天后用4mL水洗下，吸取1mL菌液至装50ml发酵培养基的 250mL摇瓶，31℃，230r/min避光培养48h，提取发酵液检测效价，剩余菌液冰箱保存待用。将测得结果优秀菌株菌液添加相同体积40％甘油保种。
摇瓶复筛育种发酵流程：初筛甘油管→小母瓶→发酵瓶→液相检测 Q10效价→茄子瓶斜面扩培并用于生产。具体过程如下：
选取初筛得到甘油管接入装50ml种子培养基的250mL摇瓶，31℃， 230r/min避光培养23h，吸取1mL菌液至装50ml发酵培养基的250mL摇瓶，31℃，230r/min避光培养48h、96h，分别提取发酵液检测效价。选择优秀菌株冷冻管涂茄子瓶斜面扩培，扩培出的菌株接种子瓶应用大生产。
在通过添加0.3mol/L硫酸亚铁平板选育和添加了0.3mol/L硫酸亚铁的种子培养基扩培后的种子，接到发酵摇瓶中，在同等条件下，不同转速下，比较不同供氧条件下辅酶Q10发酵效果。
表3：不同转速条件下摇瓶辅酶Q10发酵结果
结果表明，增加供氧条件下，添加铁离子可以更好促进辅酶Q10的合成。
实施例4：添加铁离子后在不同菌株的发酵罐发酵辅酶Q10结果比较。
发酵罐考察流程：甘油管→斜面培养→母瓶种子→发酵罐，具体流程如下；
(1)斜面培养：将保存的甘油管接到茄型瓶斜面上，在31℃培养3 天。
(2)种子培养：用无菌水洗涤培养好的斜面，制成108～109个细胞每毫升的菌悬液，移取10ml到装量500ml/1000ml的种子瓶中，30℃、 180～250rpm的条件下培养22-26小时得到种子液。
(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液接种到10升发酵罐，接种量10％，培养温度29-33℃，罐内压力0.03～0.05Mpa，供氧采取分阶段控制策略，接种后初始搅拌转速500rpm，空气流量6L/min，接种后，随着生长延滞期结束，菌体开始快速生长进入对数生长期，OUR快速上升， 24小时，并维持在30-50mmol/L·h，转速500-700rpm，罐内残留葡萄糖控制在0.5-2.0％之间，培养110小时左右。过程中根据菌体生长情况调整工艺参数以及开始连续补加葡萄糖。
比较斜面、种子母瓶中添加与不添加在不同菌株间的发酵结果情况：
结果表明，在斜面培养基与母瓶培养基中增加铁离子，在相同发酵条件下，辅酶Q10产量均有一定幅度的增长。

Claims (7)

1.一种提高辅酶Q10工业产量的生产方法，包括：将保藏号为CGMCC No.5997、CGMCCNo.5998或CGMCC No.5999的菌株依次经复苏和种子培养基扩培后筛选得到发酵种子，将所得发酵种子扩培后接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得辅酶Q10，其特征在于，所述复苏依次在平板培养基和斜面培养基中进行；平板培养基和种子培养基中Fe2+的浓度均为0.1～0.5mol/L；斜面培养基中Fe2+的浓度为0.1～0.3mol/L；
所述发酵培养基的成分为：葡萄糖1.8-2.5g/L，酵母膏7.5～8.5g/L，氯化钠2.5～3g/L，磷酸氢二钾0.5～0.8g/L，硫酸镁0.2～0.3g/L，硫酸铵2.5～3.5g/L，pH为6.5～7.0。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述种子培养基中Fe2+的浓度为0.1～0.3mol/L。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，种子培养基中扩培的培养条件为：30～32℃避光培养22～24h。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述平板培养基中Fe2+的浓度为0.1～0.3mol/L。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，斜面培养基中的培养条件为30～32℃避光培养60～80h。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，Fe2+以氯化铁、硫酸亚铁和柠檬酸铁中的至少一种化合物形式添加到培养基中。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，发酵培养时发酵罐中培养温度29-33℃、罐内压力0.03～0.05Mpa、空气流量5～6L/min、搅拌转速为500-700rpm。
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