CN102391955A - 一种dha产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，通过制备DHA产生菌双鞭甲藻（Crypthecodinium.cohniiATCC30556）的原生质体，并对其进行紫外+LiCl、硫酸二乙酯的单一或复合诱变，同时结合代谢调控发酵育种的基本思路，采用含丙二酸和/或高糖的抗性平板进行定向筛选，并以红四氮唑（TTC）的固体培养基进行初筛，有效提高筛选效率，减少筛选环节和工作量。初筛获得的菌株经摇瓶复筛和遗传稳定性验证，发现诱变后菌株生长活性提高，与出发菌株相比，YVD-4诱变株的DHA生物合成量提高了4.7倍，达到45.3g/L，具备优异的工业化生产前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法。
背景技术
DHA（二十二碳六烯酸）是一种具有特殊结构（非共轭体系的6个顺式构型双键）的多烯脂肪酸，根据其甲基端最后一个双键的位置它属于ω-3系列的典型长链高度不饱和脂肪酸。人体内的DHA主要分布于大脑灰质、视网膜细胞外节、神经***、母乳、心肌、嗜酸性白细胞、***等处，其生理作用有：抑制血小板凝集；降低血液中中性脂质；降低极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的胆固醇及升高高密度脂蛋白胆固醇；降低血液粘度；补脑健脑，预防老年性痴呆症；提高视力，防治近视；通过对DNA聚合酶和DNA拓扑异构酶的抑制效应达到预防癌症效果等。
传统从鱼油提取的DHA，数量有限，难以满足不断增长的市场需求。因此，DHA生产研究逐渐向利用生物技术合成方向发展。利用生物技术合成DHA具有周期短，脂肪酸构成简单及有较大的生产潜力等优点，而且不受原料的限制，微生物发酵法生产的DHA没有从鱼油中提取的DHA的鱼腥味，更有利于DHA的应用。
常用的微生物包括破囊壶菌、裂殖壶菌和海洋微藻等。与其它微生物相比，海洋微藻是最为理想的 DHA来源，培养藻类生产 DHA的产率比利用真菌和细菌培养高出 1~2 个数量级。海洋微藻所含有的独特的生理活性物质使得它们具有多种药用价值和保健功能，利用海洋微藻生产多不饱和脂肪酸尤其是 DHA 的研究，已成为各国科研人员研究开发的热点。双鞭甲藻（Crypthecodinium. cohnii ATCC30556）的DHA含量达30%以上，它高生物量、高生长速率、高DHA含量、异养培养生长良好，且不含有EPA（二十碳五烯酸），是DHA的较好产生菌之一。目前公开的利用海洋微藻生产DHA的专利中，DHA油脂的产量均不高，原因与所用菌种及采用的发酵培养工艺有关。因此，如何选育出更优良的双鞭甲藻品系和优化该菌的培养工艺，以提高市场竞争力成为科研工作者研究的课题之一。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，它摒弃现有技术的缺陷，采用原生质体诱变技术，并结合代谢调控发酵育种的基本思路，定向选育出DHA含量较高的双鞭甲藻菌株，并对该菌株的培养工艺进一步优化，获得高产量的正变株。
本发明是这样实现的，所述一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其步骤如下：
（1）种子的培养
将双鞭甲藻（Crypthecodinium. cohniiATCC30556）接种于种子培养基中，接种量体积百分比为5~10%，培养温度为26~30℃，摇床转速160~200r/min，培养24~48h至对数期；
（2）种子液的预处理
取步骤1培养至对数期的细胞，4000 r/min转速下离心5~10min，0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗涤2~3次，稀释40~80倍后，经无菌玻璃珠打散，6 层无菌纱布过滤得单细胞悬浮液；
（3）原生质体的制备及紫外诱变处理
将适量的原生质体化反应液，即步骤2单细胞悬浮液、酶液及渗透压调节剂按1：1~4：20~35比例组成的混合液，在25~30℃条件下处理20~30 min；酶解液过滤，离心分离，洗涤并稀释至106个/mL，得原生质体纯化液；
该原生质体纯化液先以0.8% LiCl进行预处理，然后置于有磁力搅拌棒的无菌培养皿中，菌液厚度不超过2mm，加盖，开紫外灯预热20min，在15W~30W紫外灯下，距离30cm处的磁力搅拌器上，放置培养皿，缓慢搅拌，打开皿盖进行紫外照射5~30 min，取出培养皿，梯度稀释，整个过程在红光下操作；26~30℃培养4~7d；
（4）硫酸二乙酯诱变处理
取步骤3得到的原生质体纯化液加体积百分数为10%的硫酸二乙酯，于160~200r/min振荡混合处理5~10min，加入1mL 25%的硫代硫酸钠终止反应；将反应液稀释500~1000倍并于添加了氧化还原剂红四氮唑（TTC）的固体培养基上，26~30℃培养4~7d；
（5）耐丙二酸和高糖菌株的筛选
挑选TTC活性最强，即生长速度较快，染色较深、较大的菌落作为初筛获得的菌株，这些菌株DHA的积累量相对较多，将这些正变株重新活化后，制备单细胞悬液，并分别涂布于含0.05%丙二酸平板和/或高糖平板培养基上26~30℃培养4~7d；
（6）摇瓶复筛
将上述抗性平板上生长较快、较大的菌落接种于种子培养基中进行传代培养，然后分别进行摇瓶发酵，在发酵培养基中，26~30℃培养3~5d；测定发酵液中菌体的脂肪酸含量和DHA含量，并以此作为筛选指标，获得较高产量的正变株。
本发明步骤1中所述种子培养基组成：葡萄糖40~80 g/L，NaCl 15~25g/L，MgSO4.7H2O 4~8 g/L，KH2PO4 0.5~1.0 g/L，KNO3 1~5 g/L，酵母粉 2 ~8 g/L，(NH4)2SO4 0.2~0.5 g/L，NaHCO3 0.08~0.12 g/L，MnSO4 0.5~1.0 μg/L，维生素B1 0.01~0.04mg/L，维生素B6 0.001~0.006mg/L，初始pH6.0~7.0。
本发明步骤4所述固体培养基组成：葡萄糖40~100 g/L，NaCl 15~25g/L，MgSO4.7H2O 4~8 g/L，KH2PO4 0.5~1.0 g/L，KNO3 1~5 g/L，酵母粉 2 ~8 g/L，(NH4)2SO4 0.2~0.5 g/L，NaHCO3 0.08~0.12 g/L，MnSO4 0.5~1.0 μg/L，维生素B1 0.01~0.04mg/L，维生素B6 0.001~0.01mg/L，琼脂粉20 g/L，初始pH6.0~7.0。
本发明步骤5所述高糖平板培养基组成：NaCl 10~30g/L，MgSO4.7H2O 5~10 g/L，KH2PO4 0.2~0.8 g/L，(NH4)2SO4 0.2~1.0 g/L，NaHCO3 0.1~0.5 g/L，维生素B1 0.01~0.1mg/L，维生素B6 0.001~0.01mg/L，KNO3 0.5~1.5 g/L，葡萄糖200~350 g/L，酵母粉 1~5 g/L，琼脂粉 20 g/L。
本发明步骤6所述发酵培养基组成：葡萄糖40~100 g/L，NaCl 15~25g/L，MgSO4.7H2O 4~8 g/L，酵母粉 2~8 g/L，KNO3 1~5 g/L，KH2PO4 0.5~1.0 g/L，(NH4)2SO4 0.2~0.5 g/L，CaCO3 8~10 g/L，NaHCO3 0.08~0.12 g/L，MnSO4 0.5~1.0 μg/L，维生素B1 0.01~0.04mg/L，维生素B6 0.001~0.01mg/L，初始pH6.0~7.0。
本发明的有益效果是，通过制备DHA产生菌双鞭甲藻（Crypthecodinium. cohniiATCC30556）的原生质体，并对其进行紫外+LiCl、硫酸二乙酯的单一或复合诱变，同时结合代谢调控发酵育种的基本思路，采用含丙二酸和/或高糖的抗性平板进行定向筛选，并以红四氮唑（TTC）的固体培养基进行初筛，有效提高筛选效率，减少筛选环节和工作量。初筛获得的菌株经摇瓶复筛和遗传稳定性验证，发现诱变后菌株生长活性提高，与出发菌株相比，YVD-4诱变株的DHA生物合成量提高了4.7倍，达到45.3 g/L，具备优异的工业化生产前景。
具体实施方式
本发明所述一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其步骤如下：
1、种子的培养和种子液的预处理
将双鞭甲藻（Crypthecodinium. cohniiATCC30556）接种于种子培养基中，接种量体积百分比为10%，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养36h至对数期。
取2.5 mL上述培养至对数期的细胞，4000 r/min转速下离心10min，0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，并稀释50倍后，经无菌玻璃珠打散，6 层无菌纱布过滤得单细胞悬浮液。
2、原生质体的制备及紫外诱变处理
原生质体化反应液为5 mL，其中包括0.2 mL的单细胞悬浮液、0.2 mL 蜗牛酶酶液及4.6 mL 的渗透压调节剂。在25℃条件下处理30 min。酶解液过滤，离心分离，洗涤并稀释至106个/mL，得原生质体纯化液。
该纯化液先以0.8% LiCl进行预处理，然后置于有磁力搅拌棒的无菌培养皿中，菌液厚度不超过2mm，加盖，开紫外灯预热20min，在15W紫外灯下，距离30cm处的磁力搅拌器上，放置培养皿，缓慢搅拌，打开皿盖进行紫外照射5、10、15、20、25 min，取出培养皿，梯度稀释，整个过程在红光下操作。26℃培养6d。得到15株待筛选菌株。
3、硫酸二乙酯诱变处理
取5mL得到的原生质体纯化液加体积百分数为10%的硫酸二乙酯，于180r/min振荡混合处理8min，加入1mL 25%的硫代硫酸钠终止反应。将反应液稀释1000倍，以确保诱变反应完全终止，然后再依次梯度稀释，并于添加了氧化还原剂红四氮唑（TTC）的固体培养基上26℃培养4d。得到15株待筛选菌株。
4、原生质体的紫外、硫酸二乙酯复合诱变处理
在红光下取5mL紫外处理过的原生质体纯化液加体积分数为10%的硫酸二乙酯，于160r/min振荡混合处理5min，加入1mL 25%的硫代硫酸钠终止反应。将反应液稀释1000倍，以确保诱变反应完全终止，然后再依次梯度稀释并涂布于添加了红四氮唑（TTC）的固体培养基，26℃培养4d。得到63株待筛选菌株。
5、平板初筛及摇瓶复筛
（1）将步骤2得到的菌株，红光条件下梯度稀释，涂布在添加了1.5% TTC的固体培养基上，培养3d后，挑取35株长势较好、TTC染色较深、较大的菌株以待复筛。
（2）将通过初筛的35株菌株转至添加了0.05%丙二酸和/或20%~35%葡萄糖的高糖平板上26℃培养4d。观察平板，挑选20株生长速度较快、菌落较大的菌株，分别接种至种子培养液中，备用。
（3）将抗性平板筛选获得的菌株分别接种至发酵培养基中，26℃发酵培养3d至糖耗为0，分别测定细胞干重、脂肪酸含量及DHA含量，通过各指标的比较分析，获得4株DHA产量较高的菌株，分别命名为YV-1、YV-2、YV-3、YV-4。
按照（1）~（3）的处理步骤处理步骤3、步骤4得到的菌株，分别各获得5株DHA产量较高的菌株，各自分别命名为YD-1、YD-2、YD-3、YD-4、YD-5和YVD-1、YVD-2、YVD-3、YVD-4、YVD-5。
6、摇瓶发酵
对筛选获得的14株DHA产量较高的菌株分别进行遗传稳定性考察，经10代连续培养，菌株的生物量、油脂含量和DHA含量三个指标没有发生明显的变化，均显示较稳定的发酵性能。从中选取两株产量较高的YD-1和YVD-4接种到种子培养液中，26℃，200r/min培养36h。培养到期的种子液以10%的接种量转接至发酵培养基，26℃，200r/min继续发酵培养72h。同时做原始菌株的对照试验。发酵结果如表1：
表1 DHA高产突变株与出发菌株的对比
| 菌株 | 生物量（g/L） | 油脂含量（%） | DHA含量（%） | DHA产量（g/L） |
| 原始菌株 | 58.2 | 30.6 | 35.4 | 9.6 |
| YD-1 | 76.8 | 48.1 | 49.7 | 39.4 |
| YVD-4 | 79.6 | 50.2 | 53.6 | 45.3 |
发酵对比实验表明：诱变后菌株生长活性提高，与出发菌株相比YD-1诱变株的DHA生物合成量约提高了4.1倍，达到39.4 g/L，YVD-4诱变株的DHA生物合成量则提高了约4.7倍，达到45.3 g/L。
用到的培养基如下：
种子培养基组成：葡萄糖 50g/L，NaCl 25g/L，MgSO4.7H2O 6 g/L，KH2PO4 0.5g/L，KNO3 2 g/L，酵母粉 5 g/L，(NH4)2SO4 0.2 g/L，NaHCO3 0.08 g/L，MnSO4 0.5μg/L，维生素B1 0.01mg/L，维生素B6 0.003mg/L，初始pH6.0~7.0。
固体培养基组成：葡萄糖40~100 g/L，NaCl 15~25g/L，MgSO4.7H2O 4~8 g/L，KH2PO4 0.5~1.0 g/L，KNO3 1~5 g/L，酵母粉 2 ~8 g/L，(NH4)2SO4 0.2~0.5 g/L，NaHCO3 0.08~0.12 g/L，MnSO4 0.5~1.0 μg/L，维生素B1 0.01~0.04mg/L，维生素B6 0.001~0.01mg/L，琼脂粉20 g/L，初始pH6.0~7.0。
高糖平板培养基组成：NaCl 25g/L，MgSO4.7H2O 5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，(NH4)2SO4 0.2 g/L，NaHCO3 0.1 g/L，维生素B1 0.01mg/L，维生素B6 0.001mg/L，KNO3 1 g/L，葡萄糖200~350 g/L，酵母粉 2 g/L，琼脂粉 20 g/L。
发酵培养基组成：葡萄糖 60g/L，NaCl 15g/L，MgSO4.7H2O 4g/L，酵母粉 5g/L，KNO3 2 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，(NH4)2SO4 0.2g/L，CaCO3 8 g/L，NaHCO3 0.08 g/L，MnSO4 1.0 μg/L，维生素B1 0.01mg/L，维生素B6 0.01mg/L，初始pH6.0~7.0。
Claims (5)
1.一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其步骤如下：
（1）种子的培养
将双鞭甲藻（Crypthecodinium. cohniiATCC30556）接种于种子培养基中，接种量体积百分比为5~10%，培养温度为26~30℃，摇床转速160~200r/min，培养24~48h至对数期；
（2）种子液的预处理
取步骤1培养至对数期的细胞，4000 r/min转速下离心5~10min，0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗涤2~3次，稀释40~80倍后，经无菌玻璃珠打散，6 层无菌纱布过滤得单细胞悬浮液；
（3）原生质体的制备及紫外诱变处理
将适量的原生质体化反应液，即步骤2单细胞悬浮液、酶液及渗透压调节剂按1：1~4：20~35比例组成的混合液，在25~30℃条件下处理20~30 min；酶解液过滤，离心分离，洗涤并稀释至106个/mL，得原生质体纯化液；
该原生质体纯化液先以0.8% LiCl进行预处理，然后置于有磁力搅拌棒的无菌培养皿中，菌液厚度不超过2mm，加盖，开紫外灯预热20min，在15W~30W紫外灯下，距离30cm处的磁力搅拌器上，放置培养皿，缓慢搅拌，打开皿盖进行紫外照射5~30 min，取出培养皿，梯度稀释，整个过程在红光下操作；26~30℃培养4~7d；
（4）硫酸二乙酯诱变处理
取步骤3得到的原生质体纯化液加体积百分数为10%的硫酸二乙酯，于160~200r/min振荡混合处理5~10min，加入1mL 25%的硫代硫酸钠终止反应；将反应液稀释500~1000倍并于添加了氧化还原剂红四氮唑（TTC）的固体培养基上，26~30℃培养4~7d；
（5）耐丙二酸和高糖菌株的筛选
挑选TTC活性最强，即生长速度较快，染色较深、较大的菌落作为初筛获得的菌株，这些菌株DHA的积累量相对较多，将这些正变株重新活化后，制备单细胞悬液，并分别涂布于含0.05%丙二酸平板和/或高糖平板培养基上26~30℃培养4~7d；
（6）摇瓶复筛
将上述抗性平板上生长较快、较大的菌落接种于种子培养基中进行传代培养，然后分别进行摇瓶发酵，在发酵培养基中，26~30℃培养3~5d；测定发酵液中菌体的脂肪酸含量和DHA含量，并以此作为筛选指标，获得较高产量的正变株。
2.根据权利要求1所述一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其特征是：步骤1中所述种子培养基组成：葡萄糖40~80 g/L，NaCl 15~25g/L，MgSO4.7H2O 4~8 g/L，KH2PO4 0.5~1.0 g/L，KNO3 1~5 g/L，酵母粉 2 ~8 g/L，(NH4)2SO4 0.2~0.5 g/L，NaHCO3 0.08~0.12 g/L，MnSO4 0.5~1.0 μg/L，维生素B1 0.01~0.04mg/L，维生素B6 0.001~0.006mg/L，初始pH6.0~7.0。
3.根据权利要求1所述一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其特征是：步骤4所述固体培养基组成：葡萄糖40~100 g/L，NaCl 15~25g/L，MgSO4.7H2O 4~8 g/L，KH2PO4 0.5~1.0 g/L，KNO3 1~5 g/L，酵母粉 2 ~8 g/L，(NH4)2SO4 0.2~0.5 g/L，NaHCO3 0.08~0.12 g/L，MnSO4 0.5~1.0 μg/L，维生素B1 0.01~0.04mg/L，维生素B6 0.001~0.01mg/L，琼脂粉20 g/L，初始pH6.0~7.0。
4.根据权利要求1所述一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其特征是：
步骤5所述高糖平板培养基组成：NaCl 10~30g/L，MgSO4.7H2O 5~10 g/L，KH2PO4 0.2~0.8 g/L，(NH4)2SO4 0.2~1.0 g/L，NaHCO3 0.1~0.5 g/L，维生素B1 0.01~0.1mg/L，维生素B6 0.001~0.01mg/L，KNO3 0.5~1.5 g/L，葡萄糖200~350 g/L，酵母粉 1~5 g/L，琼脂粉 20 g/L。
5.根据权利要求1所述一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其特征是：步骤6所述发酵培养基组成：葡萄糖40~100 g/L，NaCl 15~25g/L，MgSO4.7H2O 4~8 g/L，酵母粉 2~8 g/L，KNO3 1~5 g/L，KH2PO4 0.5~1.0 g/L，(NH4)2SO4 0.2~0.5 g/L，CaCO3 8~10 g/L，NaHCO3 0.08~0.12 g/L，MnSO4 0.5~1.0 μg/L，维生素B1 0.01~0.04mg/L，维生素B6 0.001~0.01mg/L，初始pH6.0~7.0。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120328 |