CN103436451B - 一株产红色素青钱柳内生菌及其发酵产红色素方法 - Google Patents
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Abstract
刺盘孢属（ Colletotrichum ）CHSS-1，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2013年6月2日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo.M2013241。本发明从植物青钱柳叶中分离筛选出产红色素的内生真菌CHSS-1，这为天然色素的提取和应用提供了一种微生物菌株；利用马铃薯和葡萄糖等原料为发酵基质进行发酵，产生的天然***素，具有色泽自然鲜亮、稳定性强的特点，满足了市场的需求。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株青钱柳的刺盘孢属（Colletotrichum sp.）内生菌CHSS-1及该菌株的发酵和红色素制备方法。
背景技术
植物体内存在大量内生真菌，是一种新的微生物资源，近年来通过内生菌途径得到的活性物质种类繁多，还发现了许多未开发的新化合物，其中一些在抗菌、抗肿瘤、抗病毒等方面有较高的活性；青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Batal)Ijinskaja]是我国特产，目前属国家重点保护的濒危植物之一，广泛分布于我国的江西、湖北等地。通过动物和临床试验证实，青钱柳具有丰富的生物活性成分，其中的黄酮类、三萜类、皂苷、甾醇、有机酸、生物碱和多糖等物质具有较高的医疗价值，已引起国内外学者的关注，极具开发前景。上世纪末以来，植物内生真菌已引起了微生物学家、生态学家、医学专家等的广泛兴趣，逐渐成为国内外研究的热点。目前，微生物色素的研究和开发十分活跃，但微生物资源极其应用潜力尚没有得到充分的发挥，植物内生真菌正是这样一类有待开发的新型微生物资源。
目前，色素的来源主要是天然色素和合成色素，由于合成色素具有色泽鲜艳、稳定性好、成本低等优势，所以受到许多厂家青睐，但是不少合成色素具有慢性毒性和致癌性，在商品尤其是食品的应用中，已慢慢被天然色素取代。
利用微生物资源生产天然色素，则具有周期短、便于生产和低毒等优点。
本发明从青钱柳中分离到一株产红色素的内生菌，并对该菌株发酵产生的红色素的稳定性进行了研究。该发明为微生物色素的进一步研制和开发提供了优良的出发菌株。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种可产红色素的刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichumsp.CHSS-1）；本发明的另一目的是提供其红色素的发酵生产方法和稳定性测试结果。
技术方案：刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1），该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2013年6月2日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No.M2013241。
本发明刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1），其固体培养特征为：菌落在PDA平板上28℃培养6-7d扩张至直径7cm，初期白色稀疏，菌丝沿培养基表面匍匐生长，中间绿色，边缘灰白色，所产红色素覆盖整个固体培养基，为酒红色。显微形态特征：分生孢子梗为淡褐色，圆柱形，不分枝；分生孢子器散生或聚生，封闭呈球形，表面多刚毛，刚毛暗褐色。
所述的刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）在产红色素中的应用。
利用刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）发酵产红色素的方法，步骤为：种子培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g，加水1000mL煮沸，取上清液，葡萄糖20g，琼脂15g，配制得1000mL培养基；将分离保存的刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichumsp.CHSS-1）菌种移至固体平板上，在28℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径10mm的打孔器打孔获得菌饼，供接种用；发酵培养液为马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200g，加水1000mL煮沸，取上清液，葡萄糖20g，配制得1000mL发酵培养液；将3片刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）菌饼接种到100mL培养基中，pH4.0～6.0，在180r/min条件下避光摇培5～7d；发酵结束后，发酵液经细胞破碎，后经4000r/min离心后获得上清液，经真空浓缩、冷冻干燥后获得红色素。
一种红色素，由刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）发酵制备而得。
有益效果：
一是本发明从植物青钱柳叶中分离筛选出产红色素的内生真菌刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1），这为天然色素的提取和应用提供了一种微生物菌株；
二是利用马铃薯和葡萄糖等原料为发酵基质进行发酵，产生的天然***素，具有色泽自然鲜亮、稳定性强的特点，满足了市场的需求。
附图说明
图1为刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）的菌落形态特征照片；
其中：a显示菌落正面，b显示菌落背面；
图2为刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）菌株在电镜下观察的形态图；
其中：a显示孢子特征，b显示菌丝特征；
图3为本发明刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）与GenBank中收录的相近菌株的16SrDNA所构建的***发育树；
图4温度对红色素稳定性的影响；
图5pH对红色素稳定性的影响；
图6光照对红色素稳定性的影响；
图7食品添加剂对红色素稳定性的影响。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）的分离与筛选
本发明于2011年8月在江苏镇江扬子江林业科技公司苗圃采集青钱柳叶片，经表面消毒、内生真菌分离、培养、发酵等筛选步骤，从中获得产色素的刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichumsp.CHSS-1）菌株，并保存，保藏日期为2013年6月2日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No.M2013241。刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）发酵产红色素
（1）菌种的活化培养：将分离保存的刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）菌种移至PDA固体平板上（马铃薯200g，加水1000mL煮沸，取上清液，葡萄糖20g，琼脂15g，配制得1000mL培养基），在28℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径10mm的打孔器打孔获得菌饼，供接种用；
（2）发酵培养：发酵培养液为马铃薯葡萄糖液体培养基，马铃薯200g，加水1000mL煮沸，取上清液，葡萄糖20g，配制得1000mL发酵培养液；每250mL三角瓶装发酵液100mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下，挑取3片直径10mm的菌饼，在28℃条件下，摇床转速180r/min，发酵培养7d；
（3）红色素的提取：发酵完毕，发酵液用超声细胞破碎仪进行细胞破碎后经4000r/min离心，将发酵液和菌丝分离，并取上清液，经真空浓缩、冷冻干燥后获得一种红色素。
刺盘孢属CHSS-1（Colletotrichum sp.CHSS-1）发酵产红色素稳定性研究
（1）温度对色素稳定性的影响：各取5mL色素原液分别置于20℃、40℃、60℃、80℃和100℃不同温度中水浴加热1h，且避光处理，1h后取出迅速冷却至室温，另外取5mL色素原液放置4℃中避光处理1h。取1mL色素溶液用7mL蒸馏水稀释，在506nm处测定吸光度（图4）。
（2）pH值对色素稳定性的影响：各取5mL色素原液，用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠将色素溶液pH调至1～13共9个梯度，室温避光放置1h，取1mL色素溶液用7mL蒸馏水稀释，在506nm处测定吸光度（图5）。
（3）光照对色素稳定性的影响：各取10mL色素原液4组，用培养皿盛装，并用保鲜膜封口。分别置于暗室、室内散光、日光、紫外光下8h，每2h时测一次吸光度（图6）。
（4）食品添加剂对色素稳定的影响：分别配制质量浓度为0.00%、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%的柠檬酸钠、山梨酸钾、维生素C、甜蜜素溶液。各取1mL各浓度溶液加入5mL色素原液，室温避光放置2h，取1mL色素溶液用7mL蒸馏水稀释，在506nm处测定吸光度。（图7）
（5）氧化剂还原剂对色素稳定性的影响：分别配制质量浓度为0%、1.0%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、30.0%的双氧水和质量浓度为0%、0.06%、0.12%、0.25%、0.50%、1.00%、10.00%的亚硫酸钠溶液，然后各取1mL加入5mL色素原液，室温避光放置2h，取1mL色素溶液用7mL蒸馏水稀释，在506nm处测定吸光度。（表1和表2）
表1双氧水对红色素稳定性的影响
表2亚硫酸钠对红色素稳定性的影响
（6）金属离子对色素稳定性的影响：分别配制含Mg2+、Zn2+、Na+、K+、Ca2+、Al2+、Cu2+和Fe2+的溶液，浓度分别为0.005mol/L、0.05mol/L和0.1mol/L，取5mL色素原液，分别加入500μL各种金属离子溶液，相同条件下放置3h，取1mL色素溶液用7mL蒸馏水稀释，在506nm处测定吸光度（表3）。
表3各金属离子对红色素稳定性的影响
| 金属离子 | 离子浓度（mol/L） | 3h后的吸光度A506 | 颜色变化 | 沉淀情况 |
| 镁离子 | 0.005 | 0.785±0.003 | 红色 | 无 |
| 0.05 | 0.772±0.004 | |||
| 0.1 | 0.769±0.006 | |||
| 锌离子 | 0.005 | 0.766±0.002 | 红色 | 无 |
| 0.05 | 0.743±0.005 | |||
| 0.1 | 0.725±0.003 | |||
| 铜离子 | 0.005 | 0.820±0.003 | 棕色 | 无 |
| 0.05 | 1.486±0.005 | |||
| 0.1 | 1.920±0.007 | |||
| 亚铁离子 | 0.005 | 0.871±0.004 | 棕绿色 | 绿色沉淀 |
| 0.05 | 3.913±0.006 | |||
| 0.1 | 3.971±0.006 | |||
| 钠离子 | 0.005 | 0.804±0.003 | 红色 | 无 |
| 0.05 | 0.798±0.005 | |||
| 0.1 | 0.794±0.002 | |||
| 钾离子 | 0.005 | 0.799±0.005 | 红色 | 无 |
| 0.05 | 0.796±0.007 | |||
| 0.1 | 0.792±0.003 | |||
| 铝离子 | 0.005 | 0.723±0.004 | 浅棕红色 | 无 |
| 0.05 | 0.634±0.005 | |||
| 0.1 | 0.652±0.003 | |||
| 钙离子 | 0.005 | 0.810±0.006 | 红色 | 无 |
| 0.05 | 0.808±0.007 | |||
| 0.1 | 0.805±0.006 | |||
| 空白对照 | 0.756±0.003 | 红色 | 无 |
上述制得的红色素具有以下性质：该色素溶液对温度、光照、还原剂、大部分金属离子及食品添加剂有较好稳定性；对氧化剂和少部分金属离子（Cu2+、Fe2+）的稳定性较差；不同pH下色调有一定变化，强酸或强碱中会有剧烈的颜色变化。
Claims (4)
1.刺盘孢属（Colletotrichum）CHSS-1，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2013年6月2日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No.M2013241。
2.权利要求1所述的刺盘孢属（Colletotrichum）CHSS-1在产红色素中的应用。
3.利用权利要求1所述刺盘孢属（Colletotrichum）CHSS-1发酵产红色素的方法，其特征在于步骤为：种子培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，加水1000 mL煮沸，取上清液，葡萄糖20 g，琼脂15g，配制得1000 mL培养基；将分离保存的CHSS-1菌种移至固体平板上，在28℃条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径10 mm的打孔器打孔获得菌饼，供接种用；发酵培养液为马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200 g，加水1000 mL煮沸，取上清液，葡萄糖20 g，配制得1000 mL发酵培养液；将3片刺盘孢属（Colletotrichum）CHSS-1菌饼接种到100 mL培养基中，pH4.0~6.0，在180 r/min条件下避光摇培5~7d；发酵结束后，发酵液经细胞破碎，后经4000 r/min离心后获得上清液，经真空浓缩、冷冻干燥后获得红色素。
4.一种红色素，其特征在于由权利要求1所述刺盘孢属（Colletotrichum）CHSS-1发酵制备而得。
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