CN103911333B - 一株产高产苯丙氨酸的菌株及其生产苯丙氨酸的方法 - Google Patents
一株产高产苯丙氨酸的菌株及其生产苯丙氨酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株产L-苯丙氨酸菌株，其分类命名为大肠杆菌WR1001（<i>Escherichia？coli</i><i></i>WR1001），已于2013年7月7日保存于中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号：CCTCC？NO:？M？2013319。本发明还提供该菌株的诱变筛选方法及利用该菌株生产L-苯丙氨酸的方法。该菌株通过发酵产L-苯丙氨酸高达15g/L，并且通过8次传代后，含量无显著差别，遗传稳定性较好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株生产L-苯丙氨酸的菌株和利用该菌株生产L-苯丙氨酸的方法。
背景技术
L-苯丙氨酸(L-Phe)是人体内必需的但无法自行合成的八种必需氨基酸之一，其在自然界中普遍存在，却含量较少。L-苯丙氨酸在医疗药品、化妆品、食品及其添加剂领域得到了广泛的应用。尤其是，在甜味剂阿斯巴甜的应用日益广泛，而作为合成甜味剂阿斯巴甜的原料之一的L-苯丙氨酸的市场需求迅速扩大。目前，L-苯丙氨酸的生产方法一般有天然蛋白质水解法、发酵法、酶法、化学合成法。水解法提取的L-苯丙氨酸含量较低、加工处理复杂、分离提纯较困难，生产成本高；化学合成法生产L-苯丙氨酸路线冗长，产品大多是消旋体，分离纯化较繁琐，污染较大；酶法具有产物浓度高、纯化步骤少、产能力强等优点，但不足之处是原料成本高；发酵法因原料易得且便宜，可以大规模生产，被认为是最经济的方法，被人们广泛使用。
微生物大多数具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对菌种进行NTG、紫外和离子束等诱变，可以筛选出多种营养缺陷型或抗反馈抑制菌株，从而切断代谢调控中的不必要途径和反馈抑制。L-酪氨酸和L-色氨酸是L-苯丙氨酸代谢支路的主要副产物，对目标产物L-苯丙氨酸合成存在底物竞争性抑制作用。为了解除这种抑制作用，提高L-苯丙氨酸合成效率，Maiti和Chatterjee以谷氨酸生产菌Arthrobacterglobiformis为出发菌株，通过NTG诱变获得L-酪氨酸和L-色氨酸的双重营养缺陷型菌株TT-39，该菌株以葡萄糖为底物可产生L-苯丙氨酸2.6g/L。由于细菌中L-色氨酸合成量本身就很少，所以目前L-苯丙氨酸生产菌株大多为L-酪氨酸营养缺陷型菌株。例如，中国专利CN102212569A公开了一种利用L-酪氨酸营养缺陷型的大肠杆菌生产L-苯丙氨酸的方法。
发明内容
本发明的第一目的是提供一株简单、高效、安全生产L-苯丙氨酸的菌株。
本发明的第二目的是提供一种上述菌株的获取方法。
本发明第三目的是提供一种利用上述菌株生产L-苯丙氨酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案如下：
一、一株产L-苯丙氨酸的菌株，其特征在于，其分类命名为大肠杆菌WR1001（EscherichiacoliWR1001）已于2013年7月7日保存于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNO:M2013319。
本发明菌株的形态学及生理生化特征如下：
菌落颜色：乳白色偏黄。
菌体形态：圆形菌落，有金属光泽。
革兰氏染色：阴性。
菌落大小：0.2-0.8×1-4μm。
需氧方式：好氧生长。
适宜生长温度：35-40℃。
适宜生长pH:6.5-7.5。
二、上述大肠杆菌WR1001的获取方法，是以E.coliW3110为出发菌株，通过紫外-氯化锂诱变，离子束注入诱变，初、复筛选得到。
所述的大肠杆菌WR1001的获取方法，具体包括如下步骤：
（1）菌悬液制备
E.coliW3110与添加氯化锂的无菌水混合制成菌悬液，细菌浓度为106个/mL；
（2）紫外-氯化锂复合诱变
将步骤（1）的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在100-150rpm搅拌速度下，进行紫外照射诱变，后取菌悬液涂布于添加氯化锂的完全培养基中，37℃下避光倒置培养1d得到的菌株分别点印于基本培养基、筛选培养基中，培养1d后，挑选仅筛选培养基中生长良好而在基本培养基中不生长的菌株，其菌落形态为圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；
（3）低能离子注入诱变
将步骤（2）中培养后的菌株用无菌水洗涤，菌悬液涂布于无菌空平皿上，制成单层菌液，吹干后，注入氮离子，后洗脱、涂布到完全培养基上。37℃下避光倒置培养1d得到的菌株分别点印于筛选培养基中，培养1d后，挑选生长良好的菌株，其菌落形态为圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；
（4）初筛
将步骤（3）培养得到的单菌落在LB斜面培养基上培养16h，活化的菌株在种子培养基搅拌培养8-12h后按一定接种量转入发酵培养基中，发酵48h后检测发酵液中L-苯丙氨酸含量，初筛出L-苯丙氨酸含量大于5g/L的菌落；
（5）复筛
将步骤（4）初筛得到的单菌落接种经斜面活化、种子培养后，按一定接种量分别接种至5L发酵罐中，初始发酵液体积为1.5L，搅拌发酵72h；检测发酵液中L-苯丙氨酸含量，筛选出L-苯丙氨酸产量高的菌落；
重复步骤（1）至步骤（5），最终筛选出发酵液中L-苯丙氨酸含量稳定在15g/L的目标菌株E.coliWR1001。
上述大肠杆菌WR1001的获取方法中，所述步骤（1）中氯化锂的添加量为无菌水质量的3-5%。
所述步骤（2）中完全培养基平板中氯化锂质量浓度为3-5%；紫外诱变条件为15W，30cm；培养皿中的菌悬液在紫外灯下关盖照射30-60s，再开盖照射30-60s。
所述步骤（3）中，菌液吹干后，在能量10keV，剂量为3×1015、6×1015、9×1015、12×1015ions/cm2条件下进行氮离子注入实验。
所述步骤（4）中，种子培养的条件是温度37℃、搅拌速度200rpm、接种量是5%-10%（v/v）。
所述步骤（5）中，发酵培养条件温度37℃、搅拌速度200-800rpm、接种量是5%-10%（v/v）、通气量1-3vvm、溶氧10%以上。
本发明中所述完全培养基组成为葡萄糖2g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，pH7.0，固体培养基加琼脂15g/L；
所述基本培养基组成为葡萄糖20g/L、柠檬酸钠5g/L、K2HPO47g/L、KH2PO47g/L、MgSO40.1g/L、(NH4)2SO42g/L，pH7.0，固体培养基加琼脂15g/L；
所述筛选培养基为在基本培养基中添加40μg/mL酪氨酸；
所述LB斜面培养基/种子培养基为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，pH7.0，固体培养基加琼脂15g/L；
所述发酵培养基为葡萄糖25g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO43g/L、MgSO43g/L、NaCl1g/L、柠檬酸钠1.5g/L,CaCl2·2H2O0.015g/L、FeSO4·7H2O0.1125g/L、L-Tyr0.3g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、维生素B10.075g/L、TES1.5mL/L，其中TES含有:Al2(SO4)3·18H2O2g/L、CoSO4·7H2O0.75g/L、CuSO4·5H2O0.25g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4·7H2O24g/L、Na2MoO4·2H2O3g/L、NiSO4·6H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O15g/L。当葡萄糖耗完后，补加700g/L的葡萄糖；当发酵22h后，以0.06g/h的速度流加10g/L的L-酪氨酸。发酵过程中用氨水和2mol/L盐酸控制发酵液pH。
三、一种利用大肠杆菌WR1001生产L-苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：
（1）斜面培养
将实施例1获取的大肠杆菌WR1001接种到LB斜面培养基中，在37℃下培养1d。
（2）种子培养
按接种量5%-10%（v/v），将大肠杆菌WR1001接种于种子培养基中，37℃、200rpm培养12h。
（3）发酵培养
将步骤（2）培养后的种子液接入发酵培养基，培养条件如下：温度37℃、搅拌速度200-800rpm、接种量是5-10%（v/v）、通气量1-3vvm、溶氧10%以上。
在利用大肠杆菌WR1001生产L-苯丙氨酸中，所述步骤（1）、（2）和（3）的培养基成分同上述获得大肠杆菌WR1001方法中所用的LB斜面培养基、种子培养基和发酵培养基。
本发明有益效果：
本发明采用将低能氮离子注入和紫外-氯化锂复合诱变相结合，最终筛选获得一株生产L-苯丙氨酸的大肠杆菌WR1001，利用该菌株生产L-苯丙氨酸，发酵液中L-苯丙氨酸含量为15g/L左右，大幅度提高了发酵产物中L-苯丙氨酸含量，同时，该菌株连续传代8次后，无显著变化，遗传稳定性好。
附图说明
图1为大肠杆菌WR1001筛选流程。
本发明所述的生物材料，其分类命名为大肠杆菌WR1001（EscherichiacoliWR1001），已于2013年7月7日保存于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址是：中国.武汉.武汉大学）保藏，保藏编号：CCTCCNO:M2013319。
具体实施方式
下面列举实施例对本发明进行进一步说明，但并不因此限制本发明的内容。
实施例1本实施例说明将E.coliW3110作为出发菌诱变筛选大肠杆菌E.coliWR1001的方法。
本实施例中：
1）完全培养基组成为：葡萄糖2g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，pH7.0，固体培养基加琼脂15g/L；
2）基本培养基组成为：葡萄糖20g/L、柠檬酸钠5g/L、K2HPO47g/L、KH2PO47g/L、MgSO40.1g/L、(NH4)2SO42g/L，pH7.0，固体培养基加琼脂15g/L；
3）筛选培养基为：在基本培养基中添加40μg/mL酪氨酸；
4）LB斜面培养基/种子培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，pH7.0，固体培养基加琼脂15g/L；
5）发酵培养基为：葡萄糖25g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO43g/L、MgSO43g/L、NaCl1g/L、柠檬酸钠1.5g/L,CaCl2·2H2O0.015g/L、FeSO4·7H2O0.1125g/L、L-Tyr0.3g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、维生素B10.075g/L、TES1.5mL/L，其中TES含有:Al2(SO4)3·18H2O2g/L、CoSO4·7H2O0.75g/L、CuSO4·5H2O0.25g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4·7H2O24g/L、Na2MoO4·2H2O3g/L、NiSO4·6H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O15g/L。当葡萄糖耗完后，补加700g/L的葡萄糖；当发酵22h后，以0.06g/h的速度流加10g/L的L-酪氨酸。发酵过程中用氨水和2mol/L盐酸控制发酵液pH。
以大肠杆菌E.coliW3110（岳芳芳等，中国酿造，2010年第2期，25-28）为出发菌株。该出发菌株系申请人拥有的在先公开文献公开的菌株，由申请人自行保藏，申请人在此声明从本专利申请日起免费发送该出发菌株。
如图1所示，获取大肠菌WR1001的具体步骤如下：
（1）菌悬液制备
E.coliW3110与添加氯化锂的无菌水混合制成菌悬液，氯化锂的添加量为无菌水质量的5%，细菌浓度为106个/mL；
（2）紫外-氯化锂复合诱变
将步骤（1）的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在150rpm搅拌速度下，进行紫外照射诱变，紫外诱变条件为15W,30cm；培养皿中的菌悬液在紫外灯下关盖照射30s,再开盖照射30s；后取菌悬液涂布于添加5%氯化锂的完全培养基中，37℃下避光倒置培养1d得到的菌株分别点印于基本培养基、筛选培养基中，培养1d后，挑选仅筛选培养基中生长良好而在基本培养基中不生长的菌株，其菌落形态为圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；
（3）低能离子注入诱变
将步骤（2）中培养后的菌株用无菌水洗涤，菌悬液涂布于无菌空平皿上，制成单层菌液，吹干后，在能量10keV，剂量为3×1015ions/cm2条件下进行氮离子注入实验，后洗脱、涂布到完全培养基上。37℃下避光倒置培养1d得到的菌株分别点印于基本培养基、筛选培养基中，培养1d后，挑选筛选培养基中生长良好的菌株，其菌落形态为圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；
（4）初筛
将步骤（3）培养得到的单菌落在LB斜面培养基上培养16h，以接种量5%（v/v），将活化的菌株接入种子培养基，在37℃下搅拌200rpm培养8h，后按5%（v/v）接种量转入发酵培养基中，发酵48h后检测发酵液中L-苯丙氨酸含量，初筛出L-苯丙氨酸含量大于5g/L的菌落；
（5）复筛
将步骤（4）初筛得到的单菌落接种经斜面活化、种子培养后，按一定接种量分别接种至5L发酵罐中，初始发酵液体积为1.5L，搅拌发酵72h；发酵培养条件为温度37℃、搅拌速度200rpm、接种量是5%（v/v）、通气量1-3vvm、溶氧10%以上；检测发酵液中L-苯丙氨酸含量，筛选出L-苯丙氨酸产量高的菌落；
重复步骤（1）至步骤（5），最终筛选出发酵液中L-苯丙氨酸含量稳定在15g/L的目标菌株E.coliWR1001。
实施例2
按照实施例1的方法获取大肠杆菌WR1001
其中氯化锂质量浓度为3%;15W紫外灯下照射120s;离子束在能量10keV，剂量为9×1015ions/cm2条件下进行。
实施例3
按照实施例1的方法获取大肠杆菌WR1001
其中氯化锂质量浓度为3.5%;离子束在能量10keV，剂量为6×1015ions/cm2条件下进行。
上述实施例1-3获得导入大肠杆菌WR1001的形态学及生理生化特征如下：
菌落颜色：乳白色偏黄。
菌体形态：圆形菌落，有金属光泽。
革兰氏染色：阴性。
菌落大小：0.2-0.8×1-4μm。
需氧方式：好氧生长。
适宜生长温度：37℃左右。
适宜生长pH:7.0左右。
实施例1-3的大肠杆菌WR1001的遗传稳定性测试，菌株传代发酵实验如表1所示。
表1为大肠杆菌WR1001的遗传稳定性测试
从实验上看出，经过8次传代，该基因工程菌的L-苯丙氨酸产量稳定，具有很好的传代稳定性。
实施例4本实施例说明大肠杆菌WR1001生产L-苯丙氨酸的方法。
本实施例所用的培养基配方如下：
LB斜面/种子培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L,pH7.0,固体培养基加琼脂15g/L;
发酵培养基为：葡萄糖25g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO43g/L、MgSO43g/L、NaCl1g/L、柠檬酸钠1.5g/L,CaCl2·2H2O0.015g/L、FeSO4·7H2O0.1125g/L、L-Tyr0.3g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、维生素B10.075g/L、TES1.5mL/L，其中TES含有:Al2(SO4)3·18H2O2g/L、CoSO4·7H2O0.75g/L、CuSO4·5H2O0.25g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4·7H2O24g/L、Na2MoO4·2H2O3g/L、NiSO4·6H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O15g/L。当葡萄糖耗完后，补加700g/L的葡萄糖；当发酵22h后，以0.06g/h的速度流加10g/L的L-酪氨酸。
(1)斜面培养
将实施例1获取的大肠杆菌WR1001接种到LB斜面培养基中，在37℃下培养1d。
（2）种子培养
将步骤（1）培养的菌，按接种量8%（v/v），接入种子培养基中，在37℃、200rpm下培养12h。
（3）发酵培养
将步骤（2）培养后的种子液，按接种量5%（v/v），接入发酵培养基，培养条件如下：温度37℃、搅拌速度400rpm、通气量3vvm、溶氧控制在10%。发酵初始装液量1.5L,发酵过程中用氨水和2mol/L盐酸控制发酵液的pH，经过高效液相测定L-苯丙氨酸含量为16g/L。
实施例5本实施例说明大肠杆菌WR1001生产L-苯丙氨酸的方法。
本实施例所用的培养基配方如下：
LB斜面培养基/种子培养基为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L,琼脂15g/L，pH7.0;
发酵培养基为葡萄糖25g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO43g/L、MgSO43g/L、NaCl1g/L、柠檬酸钠1.5g/L,CaCl2·2H2O0.015g/L、FeSO4·7H2O0.1125g/L、L-Tyr0.3g/L、玉米浆5.75g/L、酵母粉5g/L、维生素B10.075g/L、TES1.5mL/L，其中TES含有:Al2(SO4)3·18H2O2g/L、CoSO4·7H2O0.75g/L、CuSO4·5H2O0.25g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4·7H2O24g/L、Na2MoO4·2H2O3g/L、NiSO4·6H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O15g/L。当葡萄糖耗完后，补加700g/L的葡萄糖；当发酵22h后，以0.06g/h的速度流加10g/L的L-酪氨酸。
（1）斜面培养
将实施例1获取的大肠杆菌WR1001接种到LB斜面培养基中，在37℃下培养1d；
（2）种子培养
将步骤（1）培养的菌，按接种量10%（v/v），接入种子培养基中，在37℃、200rpm下培养10h；
（3）发酵培养
将步骤（2）培养后的种子液，按接种量10%（v/v），接入发酵培养基，培养条件如下：温度37℃、搅拌速度800rpm、通气量3vvm、溶氧控制在20%。发酵初始装液量1.5L，终止装液量3L，发酵过程中用氨水和2mol/L盐酸控制发酵液的pH，经过高效液相测定L-苯丙氨酸含量为15g/L。
实施例6本实施例说明大肠杆菌WR1001生产L-苯丙氨酸的方法。
本实施例所用的培养基配方如下：
LB斜面/种子培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L,pH7.0,固体培养基加琼脂15g/L;
发酵培养基为：葡萄糖25g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO43g/L、MgSO43g/L、NaCl1g/L、柠檬酸钠1.5g/L,CaCl2·2H2O0.015g/L、FeSO4·7H2O0.1125g/L、L-Tyr0.3g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、维生素B10.075g/L、TES1.5mL/L，其中TES含有:Al2(SO4)3·18H2O2g/L、CoSO4·7H2O0.75g/L、CuSO4·5H2O0.25g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4·7H2O24g/L、Na2MoO4·2H2O3g/L、NiSO4·6H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O15g/L。当葡萄糖耗完后，补加700g/L的葡萄糖；当发酵22h后，以0.06g/h的速度流加10g/L的L-酪氨酸。
(1)斜面培养
将实施例1获取的大肠杆菌WR1001接种到LB斜面培养基中，在37℃下培养1d。
（2）种子培养
将步骤（1）培养的菌，按接种量5%（v/v），接入种子培养基中，在37℃、200rpm下培养12h。
（3）发酵培养
将步骤（2）培养后的种子液，按接种量8%（v/v），接入发酵培养基，培养条件如下：温度37℃、搅拌速度400rpm、通气量1vvm、溶氧控制在15%。发酵初始装液量1.5L,发酵过程中用氨水和2mol/L盐酸控制发酵液的pH，经过高效液相测定L-苯丙氨酸含量为15g/L。
Claims (4)
1.一株产L-苯丙氨酸的菌株，其特征在于，其为大肠杆菌（Escherichiacoli）WR1001，已于2013年7月7日保存于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNO:M2013319。
2.一种利用权利要求1中所述的大肠杆菌WR1001生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）斜面培养
将大肠杆菌WR1001接种到LB斜面培养基中，在37℃下培养1d；
（2）种子培养
按步骤（1）所得的菌株接种量体积比5%-10%接种于种子培养基中，37℃、200rpm培养12h；
（3）发酵培养
将步骤（2）培养后的种子液接入发酵培养基，培养条件如下：温度37℃、搅拌速度200-800rpm、接种量是体积比5%-10%、通气量1-3vvm、溶氧10%-20%。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌WR1001生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述LB斜面培养基/种子培养基配方为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，pH7.0，LB斜面培养基加琼脂15g/L。
4.根据权利要求2所述的大肠杆菌WR1001生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为葡萄糖25g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO43g/L、MgSO43g/L、NaCl1g/L、柠檬酸钠1.5g/L,CaCl2·2H2O0.015g/L、FeSO4·7H2O0.1125g/L、L-Tyr0.3g/L、蛋白胨5g/L或者玉米浆5.75g/L、酵母粉5g/L、维生素B10.075g/L、TES1.5mL/L；其中TES组成为:Al2(SO4)3·18H2O2g/L、CoSO4·7H2O0.75g/L、CuSO4·5H2O0.25g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4·7H2O24g/L、Na2MoO4·2H2O3g/L、NiSO4·6H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O15g/L；当葡萄糖耗完后，补加700g/L的葡萄糖；当发酵22h后，以0.06g/h的速度流加10g/L的L-酪氨酸。
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