CN106834125A - 一种用于快速筛选产多不饱和脂肪酸丝状真菌的培养基及其用途 - Google Patents

一种用于快速筛选产多不饱和脂肪酸丝状真菌的培养基及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种快速筛选产油丝状真菌的方法。本发明以脂肪酸合酶抑制剂浅蓝菌素为抗性筛选因子，以表征脱氢酶活性的氯化三苯基四氮唑为筛选指示剂，建立了一种从环境中快速、高效筛选高产多不饱和脂肪酸丝状真菌的方法。本发明过程简单、快速，并高效地筛选到了高产脂丝状真菌，为产油丝状真菌的筛选研究提供了极大方便。同时，本发明为实现利用微生物发酵生产多不饱和脂肪酸提供了高效的筛选方法及一批有效的出发菌株。

Description

一种用于快速筛选产多不饱和脂肪酸丝状真菌的培养基及其 用途
【技术领域】
本发明涉及一种用于快速筛选产多不饱和脂肪酸丝状真菌的培养基，以及采用所述培养基快速筛选产油丝状真菌的方法。
【背景技术】
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸，在机体内具有广泛的生理功能和生物学效应。在生物分子类二十烷酸化合物、***素、凝血黄素、白三烯等的合成中，PUFAs是极其重要的前体物质。PUFAs也是构成诸如细胞膜磷脂等生物结构的重要成分，并参与调控与生物膜相关的生理代谢过程，如细胞识别与免疫反应、低温适应性等，对人类健康以及预防和治疗慢性疾病具有极其重要的作用。
随着市场对PUFAs需求的日益增长，供求平衡已被打破，人们开始寻找新的替代资源。产油微生物作为一种新型油脂来源，具有油脂含量高、生产周期短、生产成本低等优点，是植物油和鱼油的理想替代资源。目前虽然已分离到一些有价值的产油丝状真菌，但尚不足以满足工业化生产的需要。同时，产油丝状真菌种类还不够丰富，目前只有产ARA的菌株实现工业化生产，而产EPA、DHA菌株尚未实现，因此，筛选优良的产油丝状真菌具有重要的现实意义。
然而，选育适于工业化生产的菌株是一项十分艰巨和繁重的工作，大多数研究多采用传统方法筛选产油真菌，如脂肪粒计数法、苏丹黑B染色法、碳饥饿检出法等。脂肪粒计数法单纯根据脂肪粒数目来判定菌体含油量的高低，当所含的脂肪粒数目较多时，脂肪粒之间相互重叠会引起较大误差；苏丹黑B染色法需要对每个菌进行染色脱色，根据染色后的颜色来判断产脂率的高低，此方法虽较为准确，但需要使用显微镜观察，十分耗时，不适合大批量筛选；碳饥饿检出法是当微生物处于碳饥饿状态时，细胞内的脂肪粒作为碳源储藏体被微生物降解用作生长碳源，因此，根据油脂含量越高的微生物在缺碳培养基上越具生长优势，就可以检出产脂能力强的微生物，但此方法操作过于繁琐、费时。由此可见，传统筛选方法存在诸多弊端，无法做到快速、高效的定向筛选产油微生物。
氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)因可表征细胞内脱氢酶的活性而被用作产油菌株的筛选指示剂。作为一种氧化剂，TTC溶于水时为无色溶液，被还原后生成红色的三苯基甲臢(triphenyl formazan，TF)，根据反应前后颜色转化速度及颜色深浅的不同，可以初步判定细胞内脱氢酶的活性。朱敏等人通过研究Mortierellaalpina的TTC染色程度与菌体油脂中花生四烯酸含量关系的发现TTC对菌体的染色程度与菌体油脂中的ARA含量具有正相关性(朱敏,余龙江,肖靓,马德松.高山被孢霉的红四氮唑染色程度与菌体油脂中花生四烯酸含量的关系.生命科学研究,2004,04:339-343)。此外，Zhu等人利用TTC对菌丝进行染色，成功地从众多野生型产油菌株中分离到高产ARA的菌株(Zhu,M.,et al.,Isolating Mortierella alpina strains of high yield ofarachidonic acid.Lett Appl Microbiol,2004.39(4):p.332-5.)。这些研究表明，TTC作为一种表征细胞内脱氢酶活性的指示剂在快速筛选高产PUFAs菌株中的成功应用为其作为筛选指示剂直接用于传统筛选高产多不饱和脂肪酸的产油微生物提供了可能性。在早前研究中，没有直接将TTC添加到筛选培养基中筛选野生型高产多不饱和脂肪酸产油真菌的先例，但有筛选ARA高产突变株的研究(李翔宇.花生四烯酸高产菌株的诱变选育及发酵条件研究[D].江南大学,2015.)，因此，TTC在筛选高产ARA突变株方面的成功应用为TTC直接加入筛选培养基，通过平板上长出菌落的颜色及大小直观判断野生型菌株是否高产多不饱和脂肪酸及菌株生长性能提供了一种新的筛菌思路。然而TTC自身在光照下容易被还原，因此在培养过程中应避光培养。
抗性筛选法通常是筛选耐受性菌株及高产菌株的一种方法，通过向培养基中添加筛选压力，从而快速筛选到目标菌。浅蓝菌素(Cerulenin)作为一种真菌抗生素，它可以干扰正常的脂质代谢，通过与脂肪酸合酶(FAS)中的β-酮酯酰-ACP合酶末端丝氨酸上的-SH基共价结合，形成羟基内酰胺环而使之失活。因此，浅蓝菌素作为一种筛选抑制剂被用到筛选高产多不饱和脂肪酸的突变株中，只有脂肪酸合酶活性高的突变株才能在培养基上正常进行油脂积累代谢，形成正常的菌落，菌落越大，代表生长代谢能力越强，相应的FAS活性越高。当前，有研究将浅蓝菌素作为抑制剂成功用于高产脂突变株的筛选，李仁民等采用添加了浅蓝菌素的培养基对诱变后的产油酵母进行初筛，通过磷酸香草醛反应法对初筛菌体油脂含量进行定量分析，成功筛选出2株含油量高于对照90％以上的突变株(李仁民,王菊芳,马爽,等.利用脂肪酸合成酶抑制剂和磷酸香草醛反应筛选高产油脂酵母.微生物学通报,2008,35(4):545-549.)。李翔宇等人也利用分步筛选策略将浅蓝菌素及TTC分别添加到筛选培养基中，成功筛选到高产ARA的高山被孢霉突变株((李翔宇.花生四烯酸高产菌株的诱变选育及发酵条件研究[D].江南大学,2015.)。上述研究中浅蓝菌素(cerulenin)的成功应用表明，浅蓝菌素作为筛选抑制剂用于抗性筛选高产脂突变菌株是可行的。但是，将其做为筛选因子直接添加于初筛培养基筛选野生型产油菌的研究尚未有报道。基于浅蓝菌素成功用于筛选高产脂突变株研究的基础，为其作为抗性筛选剂直接用于快速筛选高产脂菌株提供了理论依据。
目前，关于TTC在产油微生物方面的研究多是将菌丝经过染色后根据着色程度筛选高产ARA菌株，而有关浅蓝菌素的研究主要集中在高产油突变菌株的筛选中，直接用于自然界中野生型产油菌株筛选的研究鲜有报道，并且将二者结合用于传统野生型产油微生物筛选的研究尚未有报道。基于两者分别在产油微生物筛选方面的成功应用，将抗性筛选因子以及筛选指示剂相结合，利用浅蓝菌素抑制低脂肪酸合酶活性的菌株以及TTC表征脱氢酶活性的显色反应建立一种高效、定向筛选产油微生物的方法，通过对菌落颜色及生长速度的直观判断，高效、快速地将产脂性能优良的菌株从所在微生物菌群中分离出来，这不仅对产油微生物育种具有重要意义，也可以为工业化生产功能性脂质以及生物能源转化提供优良菌株。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种快速筛选产多不饱和脂肪酸丝状真菌的培养基，以及所述培养基的用途。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于快速筛选产多不饱和脂肪酸菌株的培养基，其特征在于所述培养基的组成为：葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L，琼脂20g/L，添加浅蓝菌素1×10-7mol/L，氯化三苯基四氮唑0.5-2g/L，链霉素30mg/L，余量为水。
在本发明中，优选地，培养基中的氯化三苯基四氮唑浓度为0.5g/L。
本发明还提供一种快速筛选产多不饱和脂肪酸菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备前述的用于快速筛选高产多不饱和脂肪酸丝状真菌的培养基；
(2)采集待筛选样品，置于4℃保存；
(3)将步骤(2)的样品用0.9％生理盐水进行适当梯度稀释后，在步骤(1)的平板培养基上进行涂布，将涂布好的平板分别放置在4℃、16℃、28℃培养箱，避光培养；所述平板培养基的组成是：葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L，琼脂20g/L，浅蓝菌素1×10-7mol/L，氯化三苯基四氮唑0.5g/L，链霉素30mg/L，余量为水；
(4)每天观察步骤(3)的平板上菌落的生长情况，根据其生长速度以及菌落颜色深浅，选择生长速度快、呈红色的菌落(即排除小菌落、未变红菌落)，采用菌丝边缘纯化法将其转接到PDA培养基平板上，置于28℃培养箱培养3天，然后继续分离纯化长出的菌株，直至将得到的纯培养物作为待确认菌株；所述PDA培养基的组成为：葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L，琼脂20g/L，余量为水；
(5)进行菌体发酵后收集菌体，所得菌体经干燥并提取脂肪酸后经GC-MS定量分析其脂肪酸组成，通过脂肪酸组成得到高产多不饱和脂肪酸菌株。
在本发明中，所述菌株可以是丝状真菌或酵母菌。
根据一种优选的实施方式，步骤(5)的菌体发酵是分别在种子培养基和摇瓶发酵培养基中里进行的，所述种子培养基的组成为：葡萄糖20g/L,酵母提取物5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4.7H2O 0.25g/L，KNO3 10g/L，余量为水；所述摇瓶发酵培养基的组成为：葡萄糖50g/L,酵母提取物5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4.7H2O 0.25g/L，KNO3 10g/L，余量为水；所述发酵是将步骤(4)的所述待确认菌株按1％接种量在种子培养基中在28℃、200rpm下活化36h，然后将活化后的菌体用无菌打碎头打碎，按1％接种量转接到新的种子培养基中，在28℃、200rpm下培养36h，传代两次后将所得菌体打碎，再按1％接种量将打碎的菌体接入摇瓶发酵培养基中，然后在28℃、200rpm条件下摇瓶发酵培养7天。
优选地，步骤(5)中，所述菌体冻干并磨碎后用酸热破壁法提取脂肪酸，通过重量体积比为10％盐酸甲醇(g/ml,盐酸/甲醇)甲酯化得到脂肪酸甲酯，然后进行GC-MS定量分析脂肪酸组成，确认为高产菌株。
本发明是以脂肪酸合酶抑制剂——浅蓝菌素(Cerulenin)和可以表征脱氢酶活性的氯化三苯基四氮唑(TTC)作为初筛因子，通过菌落直径和菌落颜色(红色)深浅作为初筛指标，从环境中快速、定向筛选高产多不饱和脂肪酸丝状真菌，然后对目标菌进行发酵培养，收集湿菌体，冻干后磨碎，采用酸热破壁法提取脂肪酸并甲酯化，用气相色谱(gaschromatography,GC)和质谱(mass spectroscophy,MS)对脂肪酸组成进行定量分析。为了筛选产多不饱和脂肪酸菌株特别是丝状真菌，传统的染色法利用脂溶性染料对每个菌落的菌丝体进行染色，然后观察脂滴的大小及着色程度来初步判断菌株产脂性能，费时费力。
而本发明的方法筛选产多不饱和脂肪酸微生物简单、快速、可定向，通过肉眼观察即可排除大部分的非高产多不饱和脂肪酸菌株，经过快速初步筛选后，只有少数初步筛选出的变红的菌落进一步用GC-MS等方法定量分析其产脂性能即可确认为产多不饱和脂肪酸菌株，极大地简化了产多不饱和脂肪酸丝状真菌和产油酵母菌的筛选过程，提高了筛选效率，突破了传统筛选方法耗时费力却不易取得结果的不足。
【附图说明】
图1为不同浓度TTC染色效果；
其中，A.0；B.0.5g/L；C.1g/L；D.1.5g/L；E.2g/L
图2为TTC染色效果；
其中，图2A为TTC染色菌落；图2B为TTC染色脂滴；
图2C为未染色基内菌丝；图2D为TTC染色基内菌丝；
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，“份”均为重量份，“％”均为重量百分百。
在本发明中，Broth培养基的组成为：葡萄糖20g/L,酵母提取物5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4.7H2O 0.25g/L，KNO3 10g/L；余量为水。
发酵培养基的组成为：葡萄糖50g/L,酵母提取物5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4.7H2O0.25g/L，KNO3 10g/L；余量为水。
实施例1产多不饱和脂肪酸丝状真菌高效筛选方法的建立
(1)菌株的选择：实验室野生型产油丝状真菌高山被孢霉(Mortierella alpinaATCC 32222)；
(2)筛选方法的建立：以PDA培养基为基础筛选培养基，以本实验室已有产油丝状真菌高山被孢霉(Mortierella alpina ATCC 32222)作为试验菌。其中，筛选培养基的组成为：葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L，琼脂20g/L，链霉素30mg/L，浅蓝菌素1×10-7mol/L，TTC添加浓度0.5—2.0g/L。28℃下避光培养3-7天时间。
(3)产多不饱和脂肪酸丝状真菌的初筛：制备新鲜Mortierella alpina ATCC32222孢子液，用0.9％生理盐水进行适当梯度稀释后，进行平板涂布(平板培养基的组成为：葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L，琼脂20g/L，浅蓝菌素1×10-7mol/L，氯化三苯基四氮唑0.5—2g/L，链霉素30mg/L)，将涂布好的平板分别放置在4℃、16℃、28℃培养箱，避光培养。
不同浓度的TTC对Mortierella alpina ATCC 32222染色的影响如图1所示。
图1表明，经过不含TTC的培养基中的菌落呈白色；当TTC浓度为0.5、1.0、1.5、2.0g/L时，菌落分别由浅到深呈红色。因此，根据实验结果，在保证一定显色效果的基础上选择最低TTC浓度为0.5g/L。
图2显示TTC对高产多不饱和脂肪酸菌株菌体Mortierella alpina ATCC 32222的染色效果。其中，图2A为TTC染色菌落：菌体产多不饱和脂肪酸含量越高，其菌落颜色(红色)越深；图2B为TTC染色脂滴，染色后脂滴呈红色。图2C为未染色基内菌丝：培养基中未添加TTC，因此颜色未变红；图2D为TTC染色基内菌丝，培养基中添加了TTC，因此菌丝体呈红色，能够肉眼辨别。
(4)产多不饱和脂肪酸丝状真菌的纯化及保藏：每天观察步骤(4)的平板上菌落的生长情况，根据其生长速度以及菌落颜色深浅，选择生长速度快，呈红色的菌落(排除小菌落、未变红菌落)，采用菌丝边缘纯化法将其转接到PDA平板上(培养基组成为：葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L，琼脂20g/L)，置于28℃培养箱培养3天，然后继续分离纯化长出的菌株，最后依据菌落形态、菌丝形态、孢子形态将得到的纯培养物进行形态学鉴定，将其作为待确认产多不饱和脂肪酸菌株,纯化好的菌株用GY固体斜面培养基保藏。
(5)产脂性能评估：将纯化好的待确认菌株在种子培养基(即Broth培养基)中进行活化，传代两次后按1％接种量将菌体接入摇瓶发酵培养基，然后28℃，200rpm，摇瓶发酵培养7天，收集菌体。
所得菌体冻干磨碎后用酸热破壁法提脂，用10％(w/v)盐酸甲醇甲酯化得到脂肪酸甲酯，最后GC-MS定量分析脂肪酸组成，确认高产菌株。
菌株GC-MS分析脂肪酸组成的测定条件：
岛津气相色谱仪(GC 2010plus)，气相柱Rt-wax(30m×0.25mm×0.25μm)，质谱仪(岛津Ultra QP2010)。程序升温条件：初始40℃，保持3min；以40℃/min的速率升温至120℃；以35℃/min升温至190℃，保持5min；以5℃/min升温至220℃，保持16min。采用分流进样，进样量为1μL，分流比为10∶1，氦气作为载气。进样器温度和检测器温度均为250℃。离子源220℃，强度为70eV。
实施例2：自然环境中产多不饱和脂肪酸丝状真菌的筛选
从青海-甘肃交界祁连山牧区草地地带采集土样，用清洁工具铲去除表层土，取5-10cm处土壤约150g装在灭菌离心管里。
与实施例1相同，通过稀释涂布法，利用本发明的添加有1×10-7mol/L的浅蓝菌素和0.5g/L的氯化三苯基四氮唑(TTC)的培养基分离产油丝状真菌，避光培养，待长出菌落后，根据生长速度以及菌落颜色(红色)深浅，选取生长速度快、菌落直径大、菌落呈红色的菌株作为目标菌，采用菌丝边缘纯化法将目标菌转接至PDA培养基平板上纯化，将纯化好的菌进行斜面4℃保藏。共分离纯化得到丝状真菌15株。
将所得15株丝状真菌在Broth液体培养基里摇瓶培养，传两代后按百分之一接种量接种发酵培养基，28℃，200rpm，发酵7d，收集菌体。
将湿菌体真空冷冻干燥后磨碎，酸热法破壁，提取脂肪酸，用10％盐酸甲醇甲酯化，用气相色谱(gas chromatography,GC)和质谱(mass spectroscophy,MS)对脂肪酸组成进行分析。分析结果显示：15株菌种，其中6株菌脂质含量达20％以上，确认为产油菌株，分别为QL-3、QL-5、、QL-9、QL-11、QL-15和QL-17。结果见表1。
实施例3：自然环境的产多不饱和脂肪酸丝状真菌的筛选
从内蒙古农业大学校园林地采集土样，用清洁工具铲去除表层土，取5-10cm处土壤约150g装在灭菌离心管里。
与实施例1相同，通过稀释涂布法，利用添加有1×10-7mol/L的浅蓝菌素和0.5g/L的氯化三苯基四氮唑(TTC)的培养基分离产油丝状真菌，避光培养，待长出菌落后，根据生长速度以及菌落颜色(红色)深浅，采用菌丝边缘纯化法将颜色深红的目标菌转接至PDA培养基平板上纯化，将纯化好的菌进行斜面4℃保藏。共分离纯化得到丝状真菌5株。
将筛选到的5株丝状真菌在Broth液体培养基里摇瓶培养，传两代后按百分之一接种量接种发酵培养基，28℃，200rpm，发酵7d，收集菌体。
将湿菌体真空冷冻干燥后磨碎，酸热法破壁，提取脂肪酸，10％盐酸甲醇甲酯化，用气相色谱(gas chromatography,GC)和质谱(mass spectroscophy,MS)对脂肪酸组成进行分析。分析结果显示：5株丝状真菌中的3株菌(N-1、N-4、N-5)脂质含量达20％以上，结果见表1。进一步表明本发明方法能够用于筛选环境产油微生物并具有高效性。
实施例4：自然环境的产多不饱和脂肪酸丝状真菌的筛选
从甘肃省秦安县山顶果园采集土样，用清洁工具铲去除表层土，取5-10cm处土壤约150g装在灭菌离心管里。
与实施例1相同，通过稀释涂布法，利用添加有1×10-7mol/L的浅蓝菌素和0.5g/L的氯化三苯基四氮唑(TTC)的培养基分离产油丝状真菌，避光培养，待长出菌落后，根据生长速度以及菌落颜色(红色)深浅，采用菌丝边缘纯化法将目标菌转接至PDA培养基平板上纯化，将纯化好的菌进行斜面4℃保藏。共分离纯化得到丝状真菌6株。
将筛选到的6株丝状真菌在Broth液体培养基里摇瓶培养，传两代后按百分之一接种量接种发酵培养基，28℃，200rpm，发酵7d，收集菌体。
将湿菌体真空冷冻干燥后磨碎，酸热法破壁，提取脂肪酸，10％盐酸甲醇甲酯化，用气相色谱(gas chromatography,GC)和质谱(mass spectroscophy,MS)对脂肪酸组成进行分析。分析结果显示：5株菌(ZS-5、TSM-2、TSM-3、TSM-4、TSM-5)脂质含量达25％以上。确认为高产油菌株，结果见表1。
实施例5：自然环境的产多不饱和脂肪酸丝状真菌的筛选
从四川省凉山采集土样，用清洁工具铲去除表层土，取5-10cm处土壤约150g装在灭菌离心管里。
与实施例1相同，通过稀释涂布法，利用添加有1×10-7mol/L的浅蓝菌素和0.5g/L的氯化三苯基四氮唑(TTC)的培养基分离产油丝状真菌，避光培养，待长出菌落后，根据生长速度以及菌落颜色(红色)深浅，采用菌丝边缘纯化法将目标菌转接至PDA培养基平板上纯化，将纯化好的菌进行斜面4℃保藏。共分离纯化得到丝状真菌5株。
将筛选到的5株丝状真菌在Broth液体培养基里摇瓶培养，传两代后按百分之一接种量接种发酵培养基，28℃，200rpm，发酵7d，收集菌体。
将湿菌体真空冷冻干燥后磨碎，酸热法破壁，提取脂肪酸，10％盐酸甲醇甲酯化，用气相色谱(gas chromatography,GC)和质谱(mass spectroscophy,MS)对脂肪酸组成进行分析。分析结果显示：其中2株菌(SL-2和SL-4)脂质含量分别达26％及30％，与ATCC32222相比具有更高的生物量，确认为高产多不饱和脂肪酸菌株。结果见表1
表1菌株的生物量、总脂及脂肪酸组成(％总脂)
从以上筛选到菌株的生物量、总脂及脂肪酸组成可以看出，以实验室已有菌株高山被孢霉(Mortierella alpine ATCC 32222)为对照，与本发明的培养基及快速筛选方法得到的产油丝状真菌在相同培养条件下传代、发酵培养，最后经GC-MS定量分析它们的脂肪酸组成，结果证明本发明能够简单、快速、有效地实现从环境中快速筛选产油丝状真菌。经过此方法初筛得到的产油微生物与传统方法初筛得到的产油微生物相比，其产油微生物所占比例大幅度提高，省略了传统方法中间经脂溶性染料对脂滴进行染色从而初步判定产脂率高低的步骤，节省了很多时间，为筛选优势产油工程菌株提供了极大方便。

Claims (7)

1.一种用于快速筛选产多不饱和脂肪酸菌株的培养基，其特征在于所述培养基的组成为：葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L，琼脂20g/L，浅蓝菌素1×10-7mol/L，氯化三苯基四氮唑0.5-2g/L，链霉素30mg/L，余量为水。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述氯化三苯基四氮唑浓度为0.5g/L。
3.一种快速筛选产多不饱和脂肪酸菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备权利要求1所述的培养基；
(2)采集待筛选样品，置于4℃保存；
(3)将步骤(2)的样品用0.9％生理盐水进行适当梯度稀释后，在步骤(1)的平板培养基上进行涂布，将涂布好的平板分别放置在4℃、16℃、28℃培养箱，避光培养；
(4)每天观察步骤(3)的平板上菌落的生长情况，根据其生长速度以及菌落颜色深浅，选择生长速度快、呈红色的菌落，采用菌丝边缘纯化法将其转接到PDA培养基平板上，置于28℃培养箱培养3天，然后继续分离纯化长出的菌株，直至将得到的纯培养物作为待确认菌株；所述PDA培养基的组成为：葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L，琼脂20g/L，余量为水；
(5)将纯化好的菌株进行摇瓶发酵，菌体发酵完成后收集湿菌体，所得湿菌体经真空冷冻干燥后磨碎，提取其脂肪酸，然后通过GC-MS定量分析其脂肪酸组成，得到高产多不饱和脂肪酸菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述菌株为丝状真菌或酵母菌。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(5)的菌体发酵是依次在种子培养基和摇瓶发酵培养基中里进行的，所述种子培养基的组成为：葡萄糖20g/L,酵母提取物5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4.7H2O 0.25g/L，KNO3 10g/L，余量为水；
所述摇瓶发酵培养基的组成为：葡萄糖50g/L,酵母提取物5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4.7H2O 0.25g/L，KNO3 10g/L，余量为水；
所述发酵是将步骤(4)的所述待确认菌株挑取菌丝接种在种子培养基中在28℃、200rpm下活化36h，然后将活化后的菌体用无菌打碎头打碎，按1％接种量转接到新的种子培养基中，在28℃、200rpm下培养36h，传代两次后将所得菌体打碎，再按1％接种量将打碎的菌体接入摇瓶发酵培养基中，然后在28℃、200rpm条件下摇瓶发酵培养7天。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中，所述菌体干燥并磨碎后用酸热破壁法提取脂肪酸，通过重量体积比为10％的盐酸甲醇甲酯化得到脂肪酸甲酯，然后进行GC-MS定量分析脂肪酸组成。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)中，所述干燥是通过菌体真空冷冻干燥实现的。
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