CN101616933A - 用于治疗癌症的新型抗-cd38抗体 - Google Patents

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Abstract

特异性结合CD38的抗体、人源化抗体、表面重建抗体、抗体片段、衍生抗体及其与细胞毒性剂的缀合物，能够通过凋亡、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖型细胞毒性(CDC)杀死CD38+细胞。所述抗体及其片段能够用于治疗表达CD38蛋白的肿瘤，例如多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病或急性淋巴细胞白血病或治疗自体免疫和炎性疾病例如***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、红斑狼疮和哮喘。所述衍生抗体可以用于诊断和成像表达高水平CD38的肿瘤。还提供了包含细胞结合剂以及细胞毒性剂的细胞毒性缀合物，包含该缀合物的治疗组合物，使用该缀合物抑制细胞生长和治疗疾病的方法，包含该细胞毒性缀合物的试剂盒。特别的，细胞结合剂是识别并结合CD38蛋白的单克隆抗体、其表位结合片段。

Description

用于治疗癌症的新型抗-CD38抗体
发明背景
CD38是45kD的II型跨膜糖蛋白，具有长C-末端胞外结构域和短N-末端胞质结构域。CD38蛋白是双功能胞外酶，其能够催化NAD+转化成环腺苷二磷酸核糖(cADPR)，还催化将cADPR水解成ADP-核糖。在个体发育的过程中，CD38出现在CD34+定向干细胞和淋巴细胞、红细胞和骨髓细胞的谱系定向祖细胞。在T细胞和B细胞发育的不同阶段，CD38的表达在大部分淋巴细胞谱系中以不同的表达水平得到持续。
在许多造血***恶性肿瘤和来自各种造血***恶性肿瘤的细胞系中，CD38得到上调，所述造血***恶性肿瘤包括非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)(NHL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)(BL)、多发性骨髓瘤(MM)、B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B和T急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓细胞性白血病(AML)、多毛细胞白血病(HCL)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma)(HL)以及慢性骨髓细胞性白血病(CML)。另一方面，造血***的大部分原始多能性干细胞是CD38-。造血***恶性肿瘤中的CD38表达及其与疾病进展的关联使CD38成为抗体治疗的吸引人的靶。
CD38已经被报道参与Ca2+迁移(M.Morra等人，1998，FASEB J.，12：581-592；M.T.Zilber等人，2000，Proc Natl Acad Sci U S A，97：2840-2845)以及在淋巴细胞和骨髓细胞或细胞系中参与通过多种信号传递分子酪氨酸磷酸化的信号传导，其中所述信号传递分子包括磷脂酶C-γ、2AP-70、syk和c-cbl(A.Funaro等人，1993，Eur J Immunol，23：2407-2411；M.Morra等人，1998，FASEB J.，12：581-592；A.Funaro等人，1990，J Immunol，145：2390-2396；M.Zubiaur等人，1997，JImmunol，159：193-205；S.Deaglio等人，2003，Blood 102：2146-2155；E.Todisco等人，2000，Blood，95：535-542；M.Konopleva等人，1998，J Immunol，161：4702-4708；M.T.Zilber等人，2000，Proc Natl AcadSci U S A，97：2840-2845；A.Kitanaka等人，1997，J Immunol，159：184-192；A.Kitanaka等人，1999，J Immunol，162：1952-1958；R.Mallone等人，2001，Int Immunol，13：397-409)。在这些观察的基础上，CD38被提议为淋巴细胞和骨髓细胞在它们正常发育过程中成熟和活化的重要信号传递分子。
CD38在信号传导和造血作用中的具体作用还不清楚，特别是因为大部分这些信号传导研究一直使用异常过表达CD38的细胞系和非生理状态的配体抗-CD38单克隆抗体。因为CD38蛋白具有产生cADPR的酶促活性，其中cADPR是能够诱导Ca2+迁移的分子(H.C.Lee等人，1989，J Biol Chem，264：1608-1615；H.C.Lee and R.Aarhus，1991，Cell Regul，2：203-209)，因此已经提议单克隆抗体连接CD38能够通过提高淋巴细胞中cADPR的产量而激发Ca2+迁移和信号传导(H.C.Lee等人，1997，Adv Exp Med Biol，419：411-419)。与该假设相反，CD38的截短和点突变分析显示其胞质尾部和其酶促活性对于抗-CD38抗体所介导的信号传递都不是必要的(A.Kitanaka等人，1999，JImmunol，162：1952-1958；F.E.Lund等人，1999，J Immunol，162：2693-2702；S.Hoshino等人，1997，J Immunol，158，741-747)。
CD38功能的最佳证据来自于CD38-/-敲除小鼠，该小鼠在它们的先天免疫中具有缺陷，以及具有由于树突状细胞迁移缺陷所引起的T细胞依赖性激素应答的降低(S.Partida-Sanchez等人，2004，Immunity，20：279-291；S.Partida-Sanchez等人，2001，Nat Med，7：1209-1216)。然而，不清楚是否CD38在小鼠中的功能与在人中的功能一致，因为在造血作用的过程中CD38的表达模式在人和小鼠之间存在显著不同：a)与人中的不成熟祖干细胞不同，小鼠中的类似祖干细胞表达高水平的CD38(T.D.Randall等人，1996，Blood，87：4057-4067；R.N.Dagher等人，1998，Biol Blood Marrow Transplant，4：69-74)，b)尽管在人B细胞发育的过程中，在滤泡中心B细胞和浆细胞中发现了高水平的CD38表达(F.M.Uckun，1990，Blood，76：1908-1923；M.Kumagai等人，1995，J Exp Med，181：1101-1110)，但在小鼠中，CD38在相应细胞中的表达水平低(A.M.Oliver等人，1997，J Immunol，158：1108-1115；A.Ridderstad and D.M.Tarlinton 1998，J Immunol，160：4688-4695)。
在文献中已经描述了许多抗-人CD38抗体，其对各种肿瘤细胞和细胞系具有不同的增殖特性。例如，具有小鼠Fab和人IgG1 Fc的嵌合OKT10抗体在存在来自MM患者或正常个体的外周血单核效应细胞时，介导非常有效地针对淋巴细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(F.K.Stevenson等人，1991，Blood，77：1071-1079)。CDR-嫁接的人源化版本抗-CD38抗体AT13/5已经被报道显示具有针对CD38-阳性细胞系的有效ADCC活性(US 09/797,941 A1)。人单克隆抗体抗-CD38抗体已经显示介导通过ADCC和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)体外杀死CD38-阳性细胞系，以及延迟携带MM细胞系RPMI-8226(WO2005/103083 A2)的SCID小鼠中的肿瘤生长。另一方面，许多抗-CD38抗体，IB4、SUN-4B7和OKT10而不是IB6、AT1或AT2诱导来自正常个体的外周血单核细胞(PBMC)的增殖(C.M.Ausiello等人2000，Tissue Antigens，56：539-547)。
现有技术中的某些抗体已经显示能够在CD38+B细胞中激发凋亡。然而，它们仅在存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时能够这样。抗-CD38拮抗抗体(IB4)已经被报道防止人滤泡中心(GC)B细胞的凋亡(S.Zupo等人1994，Eur J Immunol，24：1218-1222)，诱导KG-1和HL-60 AML细胞的增殖(M.Konopleva等人1998，J Immunol，161：4702-4708)，但诱导Jurkat T成淋巴细胞的凋亡(M.Morra等人1998，FASEB J，12：581-592)。另一种抗-CD38抗体T16诱导不成熟淋巴细胞以及以及来自ALL患者的白血病成淋巴细胞的凋亡(M.Kumagai等人1995，J Exp Med，181：1101-1110)，以及来自SML患者的白血病成淋巴细胞的凋亡(E.Todisco等人2000，Blood，95：535-542)，但是T16仅在存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子(IL-7、IL-3、干细胞因子)时诱导凋亡。
另一方面，某些现有技术抗体在交联后诱导凋亡，但在单独孵育时完全没有任何凋亡活性(WO 2006/099875)。
因为CD38是各种造血***恶性肿瘤的抗体治疗的吸引人的靶，我们生成和筛选大量的抗-人CD38抗体得到在针对CD38-阳性恶性造血***的下列3种细胞毒性中的高潜力：诱导凋亡、ADCC和CDC。本发明描述了新型的抗-CD38抗体，其能够杀死CD38+细胞，通过三种不同的细胞毒性基质：诱导凋亡，ADCC和CDC。引人注目的是，本发明首次公开了抗-CD38抗体，其能够直接诱导CD38+细胞的凋亡，甚至在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时。
发明概述
本发明的目的是提供特异性结合CD38并能够通过凋亡杀死CD38+细胞的抗体。尽管，某些现有技术抗体仅能够在交联时才能够激发凋亡，而在其他情况下没有任何凋亡活性，但本发明的抗体能够即使在被单独孵育时也能够诱导CD38+细胞的凋亡性细胞死亡。在本发明的一个方面中，本发明的抗体能够通过ADCC或CDC杀死CD38+B细胞。在另一个方面中，本发明的抗体能够通过前面所提到机制即凋亡、ADCC和CDC的至少两种杀死CD38+细胞。引人注目的是，本发明的抗体是首次被证明通过所有三种不同的机制：凋亡、ADCC和CDC杀死CD38+B细胞的抗-CD38抗体。在本发明的进一步的实施方式中，所述抗体即使在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时也能够通过凋亡杀死CD38+B细胞。
特别的，本发明的抗体能够杀死恶性CD38+B细胞，包括淋巴瘤细胞、白血病细胞和多发性骨髓瘤细胞。在某些实施方式中，CD38+B细胞是NHL、BL、MM、B-CLL、ALL、TCL、AML、HCL、HL或CML细胞。
在本发明的一个方面中，本发明的抗体能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死至少24％的Daudi淋巴瘤细胞和/或至少7％的Ramos淋巴瘤细胞和/或11％的MOLP-8多发性骨髓瘤细胞和/或36％的SU-DHL-8淋巴瘤细胞和/或62％的DND-41白血病细胞和/或27％的NU-DUL-1淋巴瘤细胞和/或9％的JVM-13白血病细胞和/或4％的HC-1白血病细胞。
本发明的抗体能够是多克隆或单克隆的。优选的是单克隆抗-CD38抗体。在更优选的实施方式中，提供了选自38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39的鼠抗体，其在本文中被完全表征了它们的轻链和重链可变区的氨基酸序列，轻链和重链可变区基因的cDNA序列，它们的CDR(互补性决定区)的鉴定，它们的表面氨基酸的鉴定以及它们以重组形式表达的手段。
本发明包括选自38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39的鼠抗-CD38单克隆抗体的嵌合版本。还包括38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体的表面重建(resurfaced)或人源化版本，其中轻链和重链二者中的抗体可变区框架的表面暴露残基或它们的表位结合片段被替换成更近似的已知人抗体表面。本发明的人源化抗体和其表位结合片段具有改进的性质，因为它们在它们被给药的人对象中的免疫原性比鼠版本低(或者完全没有免疫原性)。因此，本发明的人源化38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体及其表位结合片段的不同版本特异性识别CD38，而对人没有免疫原性。
本发明38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体的人源化版本在本文中充分表征了它们的各自轻链和重链可变区的氨基酸序列，轻链和重链可变区基因的DNA序列，互补性决定区(CDR)的鉴定、它们可变区框架表面氨基酸残基的鉴定，以及公开了它们以重组形式表达的手段。
本发明还考虑了细胞毒性缀合物之间的缀合物的应用，所述细胞毒性缀合物包括：(1)细胞结合剂，其识别和结合CD38；(2)细胞毒性剂。在细胞毒性缀合物中，细胞结合剂对CD38具有高亲和力，细胞毒性剂具有对表达CD38的细胞的高水平细胞毒性，以便本发明的细胞毒性缀合物形成有效的杀死剂。
在优选的实施方式中，细胞结合剂是抗-CD38抗体(例如38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39)或其表位结合片段，更优选人源化抗-CD38抗体(例如38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39)或其表位结合片段，其中细胞毒性剂被直接或通过可切割或不可切割连接物共价结合到所述抗体或其表位结合片段。在更优选的实施方式中，细胞结合剂是人源化38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体或其表位结合片段，细胞毒性剂是紫杉醇、类美登素(maytansinoid)、茅屋霉素(tomaymycin)衍生物、来普霉素(leptomycin)衍生物、CC-1065或CC-1065类似物。
更优选的，细胞结合剂是人源化抗-CD38抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39，细胞毒性剂是美登素(maytansine)化合物例如DM1或DM4。
本发明还包括保持结合CD38的能力的抗-CD38抗体的片段的应用。在本发明的另一个方面中，考虑了抗-CD38抗体的功能等同物的应用。
本发明还包括用于抑制表达CD38的细胞生长的方法。在优选的实施方式中，用于抑制表达CD38的细胞生长的方法是在体内发生的，并且导致细胞的死亡，尽管还包括体外和先体外后体内(ex vivo)的应用。
本发明还提供了治疗组合物，其包含抗-CD38抗体或抗-CD38抗体-细胞毒性剂缀合物，以及药物上可以接受的载体或赋形剂。在某些实施方式中，治疗组合物包含第二治疗剂。这种第二治疗剂可以选自包括下列的组：表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂，或者表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的受体(包括HER2受体、HER3受体、c-MET和其他受体酪氨酸激酶)的拮抗剂。这种第二治疗剂还可以选自包括下列的组：针对包括CD3、CD14、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD36、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138和CD152的分化簇(CD)抗原的抗体。这种第二治疗剂还可以选自化疗或免疫调节剂的组。
本发明还包括使用治疗组合物治疗患有癌症或炎性疾病(包括自体免疫疾病)的对象的方法。在某些实施方式中，所述癌症选自：NHL、BL、MM、B-CLL、ALL、TCL、AML、HCL、HL和CML。在另一个实施方式中，自体免疫疾病选自：***性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、强直性脊柱炎、丙型肝炎相关冷球蛋白血症血管炎、慢性局灶脑炎、大疱性类天疱疮、甲型血友病、膜性增生性肾小球肾炎、肖格伦氏综合症(Sjogren′s syndrome)、成人和少年型皮肌炎、成人多肌炎、慢性荨麻疹、夏科氏肝硬变(primary biliarycirrhosis)、特发性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、格雷夫氏甲状腺机能障碍性疾病(Graves′dysthyroid disease)、大疱性类天疱疮、膜性增生性肾小球肾炎、许尔-斯特劳斯综合症(Churg-Strauss syndrome)和哮喘。在优选的实施方式中，细胞毒性缀合物包括抗-CD38抗体和细胞毒性剂。在更优选的实施方式中，细胞毒性缀合物包括人源化的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体-DM1缀合物，人源化的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体-DM4，或人源化的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体-紫杉烷类化合物(taxane)缀合物，并将该缀合物连同药物上可以接受的载体或赋形剂进行给药。
在本发明的另一个方面中，抗-CD38抗体被用于检测生物样品中的CD38蛋白。在优选的实施方式中，所述抗体用于测定肿瘤组织中的CD38水平。
本发明还包括试剂盒，其包括抗-CD38抗体或抗-CD38抗体-细胞毒性剂缀合物，以及其使用说明书。在优选的实施方式中，抗-CD38抗体是人源化38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体，细胞毒性剂是美登素化合物，例如DM1或DM4，茅屋霉素衍生物，来普霉素衍生物或紫杉烷类化合物，以及在治疗患有癌症的个体中使用缀合物的说明书。该试剂盒还包括制备药物上可以接受的制剂以及用于给药该制剂时所必需的组分，例如如果缀合物是冻干状态或浓缩形式的稀释剂。
除非以其他方式说明，本文所引用的所有参考文献和专利被通过参照并入本文。
附图说明
图1A显示了纯化的鼠抗-CD38抗体、38SB13、38SB18、38SB19、38与表达人CD38的300-19细胞和CD38-阳性Ramos淋巴瘤细胞的特异性结合的FACS分析。
图1B显示纯化的鼠抗-CD38抗体、38SB30、38SB31、38SB39和对照抗-CD38抗体AT13/5与表达人CD38的300-19细胞和CD38-阳性Ramos淋巴瘤细胞的特异性结合的FACS分析。
图2显示使用Ramos细胞建立的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39的结合滴度曲线。
图3显示在与38SB13、38SB19或AT13/5(10nM)孵育24小时后经历凋亡的Ramos细胞的FACS点图(FL4-H；TO-PRO-3染色；y轴和FL1-H；膜联蛋白V-FITC染色；x-轴)。
图4A显示在与38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31、38SB39、38SB7、38SB23、IB4、AT13/5、OKT10或SUN-4B7孵育24小时后经历凋亡的Ramos细胞的平均百分比。对来自两份样品的膜联蛋白V-阳性细胞的平均百分比(y轴；包括TO-PRO-3阳性和阴性细胞二者)进行作图。
图4B显示在与图4A中相同的抗体组进行孵育24小时后经历凋亡的Daudi细胞的平均百分比。
图4C显示在与图4A中相同的抗体组进行孵育24小时后经历凋亡的Molp-8细胞的平均百分比。
图5A显示用于表达hu38SB19-LC的人表达载体的图谱。
图5B显示用于表达hu38SB19-HC的人表达载体的图谱。
图5C显示用于表达hu38SB19LC和hu38SB19HC二者的人表达载体的图谱。
图6A显示抗体ch38SB13、ch38SB18和ch38SB19所介导的对Ramos细胞的ADCC活性。
图6B显示抗体ch38SB30、ch38SB31和ch38SB39所介导的对Ramos细胞的ADCC活性。
图7A)显示抗体ch38SB18、ch38SB19、ch38SB31和非结合嵌合人IgG1对照抗体所介导的对LP-1多发性骨髓瘤细胞的ADCC活性。
图7B)比较了抗体ch38SB19和鼠38SB19所介导的对Daudi细胞的ADCC活性。
图8A显示ch38SB19抗体和非结合嵌合人IgG1对照抗体所介导的对NALM-6B-ALL细胞的ADCC活性。
图8B显示ch38SB19抗体和非结合嵌合人IgG1对照抗体所介导的对MOLT-4 T-ALL细胞的ADCC活性。
图9A显示抗体ch38SB13、ch38SB18、ch38SB19、ch38SB30和ch38SB39所介导的对Raji-IMG细胞的CDC活性。
Fig9B显示抗体ch38SB19和ch38SB31所介导的对Raji-IMG细胞的CDC活性。
图10显示抗体ch38SB18、ch38SB19、ch38SB31以及非结合嵌合人IgG1对照抗体所介导的对LP-1多发性骨髓瘤细胞的CDC活性。
图11A显示抗体ch38SB13、cch38SB19和ch38SB399所介导的对Daudi细胞的CDC活性。
图11B显示抗体ch38SB18和ch38SB30所介导的对Daudi细胞的CDC活性。
图11C显示抗体ch38SB19和ch38SB31所介导的对Daudi细胞的CDC活性。
图12A显示ch38SB19、hu38SB19 v1.00和hu38SB19 v1.20结合Ramos细胞的结合滴度曲线。
图12B显示了结合曲线，其比较ch38SB19、hu38SB19 v1.00和hu38SB19 v1.00它们与生物素化鼠38SB19抗体竞争结合Ramos细胞的能力。
图13显示在与ch38SB19、hu38SB19 v1.00或hu38SB19 v1.20抗体孵育24小时后经历凋亡的Daudi细胞的平均百分比。
图14显示抗体ch38SB19、hu38SB19 v1.00、hu38SB19 v1.20以及非结合嵌合人IgG1对照抗体所介导的对LP-1多发性骨髓瘤细胞的ADCC活性。
图15A显示抗体ch38SB19、hu38SB19 v1.00和hu38SB19 v1.20所介导的对Raji-IMG淋巴瘤细胞的CDC活性。
图15B显示抗体ch38SB19、hu38SB19 v1.00和hu38SB19 v1.20所介导的对LP-1多发性骨髓瘤细胞的CDC活性。
图15C显示抗体ch38SB19、hu38SB19 v1.00和hu38SB19 v1.20所介导的对DND-41 T-细胞急性成淋巴细胞白血病细胞的CDC活性。
图16显示在SU-DHL-8扩散大B细胞淋巴瘤细胞、NU-DUL-1B-细胞淋巴瘤细胞、DND-41T-细胞急性成淋巴细胞白血病细胞、JVM-13B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞和HC-1多毛细胞白血病细胞与hu38SB19 v1.00抗体孵育24小时后，膜联蛋白V阳性细胞的平均百分比。
图17显示携带建立的散布的人Ramos肿瘤的SCID小鼠的存活百分比。正如所显示的，使用鼠38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39抗体或PBS对小鼠进行处理。
图18显示携带建立的散布的人Daudi肿瘤的SCID小鼠的存活百分比。正如所显示的，使用hu38SB19或mu38SB19抗体或PBS对小鼠进行处理。
图19显示携带NCI-H929多发性骨髓瘤异种移植肿瘤的SCID小鼠的平均肿瘤体积。正如所显示的，使用hu38SB19、非结合对照IgG1抗体或PBS对小鼠进行处理。
图20显示携带MOLP-8多发性骨髓瘤异种移植肿瘤的SCID小鼠的平均肿瘤体积。正如所显示的，使用hu38SB19、mu38SB19、非结合对照IgG1抗体或PBS对小鼠进行处理。
发明的详细描述
本文提供了新型的抗体，其能够特异性结合CD38。特别地，本发明已经发现了新型的抗体，其能够特异性结合细胞表面上的CD38并且通过凋亡杀死CD38+细胞。在本发明的一个方面中，抗-CD38抗体还能够通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀死CD38+细胞。在另一个方面中，本发明的抗-CD38抗体能够通过补体依赖性细胞毒性(CDC)杀死CD38+细胞。在另一个方面中，本发明的抗-CD38抗体能够通过上述机制(即凋亡、ADCC和CDC)的至少两种杀死CD38+细胞。特别地，在优选实施方式中，本发明的抗-CD38抗体能够通过凋亡、ADCC和CDC杀死CD38w细胞。因此，本发明首次提供了通过三种不同的机制杀死CD38+细胞的抗-CD38抗体。
之前已经描述了能够结合CD38和激发CD38+细胞中凋亡性细胞死亡的抗体(M.Kumagai等人，1995，J Exp Med，181：1101-1110；E.Todisco等人2000，Blood，95：535-542)，但本发明的抗体是首次被证明在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时有凋亡活性的抗体。本文所使用的术语“基质”是指肿瘤的非恶性支持组织，其包括***、血管和炎性细胞。基质细胞产生生长因子和其他物质，包括能够影响癌细胞行为的细胞因子。本文所使用的术语“细胞因子”是指分泌的小蛋白(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5和IL-6、IFNg、IL-3、IL-7和GM-CSF)，其介导和调节免疫性、炎症和造血作用。本文中显示，先有技术的抗体在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时时不能激发凋亡性细胞死亡。相反，本发明的抗-CD38抗体在相同的条件下显示有效的凋亡活性。
在另一个方面中，本发明的抗体能够以3×10-9M或更低的kD结合CD38蛋白。
本文所使用的术语“CD38”指的是II型跨膜蛋白，其包括例如Genbank索取号NP 001766中的氨基酸序列。“CD38+细胞”是表达CD38蛋白的细胞。优选CD38+细胞是哺乳动物细胞。
在本发明的一个实施方式中，CD38+细胞是恶性细胞。在另一个实施方式中，CD38+细胞是B细胞。在优选的实施方式中，CD38+细胞是来自造血***恶性肿瘤的肿瘤细胞。在更优选的实施方式中，CD38+细胞是淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。在进一步优选的实施方式中，CD38+细胞是NHL、BL、MM、B-CLL、ALL、TCL、AML、HCL、HL或CML细胞。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了抗-CD38抗体，其能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时杀死至少24％的Daudi淋巴瘤细胞。在另一个实施方式中，本发明的抗-CD38抗体能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时杀死至少7％的Ramos淋巴瘤细胞。在另一个实施方式中，本发明的抗-CD38抗体在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时能够杀死至少11％的MOLP-8多发性骨髓瘤细胞。在另一个实施方式中，本发明的抗-CD38抗体在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时能够杀死至少36％的SU-DHL-8淋巴瘤细胞。在另一个实施方式中，本发明的抗-CD38抗体在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时能够杀死至少27％的NU-DUL-1淋巴瘤细胞。在另一个实施方式中，本发明的抗-CD38抗体在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时能够杀死至少62％的DND-41白细胞细胞。在另一个实施方式中，本发明的抗-CD38抗体在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时能够杀死至少9％的JVM-13白血病细胞。在另一个实施方式中，本发明的抗-CD38抗体在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时能够杀死至少4％的HC-1白血病细胞。
抗体
术语“抗体”在本文中是以最宽的意义使用的，并且具体地覆盖任何同种型的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，多克隆抗体，多特异性抗体，嵌合抗体和抗体片段。通过重组方法能够产生与特异抗原反应的抗体，所述方法例如选择噬菌体或类似载体中的重组抗体库，或者通过使用抗原或编码抗原的核酸对动物进行免疫。
典型的IgG抗体包括通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。每条重链和重链都含有恒定区和可变区。每个可变区都含有被称作“互补性决定区(CDR)”或“多变区”的三个节段，其是结合抗原的表位的主要原因。通常它们从N-末端依次编号被称作CDR1、CDR2和CDR3。可变区中更高保守的部分被称作“框架区”。
本文所使用的“VH”或“VH”指抗体免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab′或F(ab′)2片段的重链。引用“VL”或“VL”指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab′或F(ab′)2片段的轻链。
“多克隆抗体”是作为一种或者多种其他不相同的抗体之一，或者在存在一种或者多种其他不相同的抗体时所产生的抗体。通常，多克隆抗体是在存在数种产生不相同抗体的B-淋巴细胞时，从B-淋巴细胞产生的。通常，多克隆抗体是直接从经免疫的动物获得的。
本文所使用的“单克隆抗体”是从一群基本上均一的抗体获得的抗体，即形成该群的抗体除了可能非常少量存在的天然突变外，基本上是相同的。这些抗体针对单一表位，因此是高度特异性的。
“表位”是抗原上抗体结合的位点。如果抗原是聚合物，例如蛋白质或多糖，那么表位可以是由连续的残基形成，或者由被抗原聚合物的折叠造成邻近的不连续残基形成。在蛋白质中连续氨基酸所形成的表位通常在暴露到变性溶剂时仍被保持，然而不连续氨基酸所形成的表位通常在所述暴露后会丧失。
本文所使用的术语“KD”指特定抗体/抗原相互作用的解离常数。
本发明是从新型的鼠抗-CD38抗体进行的，本文中为38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39，其被完全表征了它们轻链和重链的氨基酸序列，CDR的鉴定，表面氨基酸的鉴定以及它们以重组形式表达的手段。本文公开了抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39轻链和重链以及人源化版本的初级氨基酸和DNA序列。
产生38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39鼠抗-CD38抗体的杂交瘤细胞系已经于2006年6月21日被保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(10801University Bld，Manassas，VA，20110-2209，USA)，保藏号分别为PTA-7667、PTA-7669、PTA-7670、PTA-7666、PTA-7668和PTA-7671。
本发明的范围不限于包含这些序列的抗体和片段。而是，所有特异性结合CD38并能够通过凋亡、ADCC和/或CDC杀死CD38+细胞的所有抗体都落入本发明的范围中。因此，抗体和抗体片段可以在其支架、CDR、轻链和重链的氨基酸序列上与抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39或人源化衍生物上有区别，但仍然落入本发明的范围内。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体或其表位结合片段，其包含具有选自下列的氨基酸序列的一个或者多个CDR：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36。在优选的实施方式中，本发明的抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、25、26、27、31、32和33的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35和36的氨基酸序列。
在更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了38SB13抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：1、2和3构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：4、5和6构成的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了38SB18抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：7、8和9构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：10、11和12构成的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：13、14、15、16、17和18的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了38SB19抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：13、14和15构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：16、17和18构成的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了38SB30抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：19、20和21构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：22、23和24构成的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：25、26、27、28、29和30的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了38SB31抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：25、26和27构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：28、29和30构成的氨基酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，本发明的抗体包含三个CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：31、32、33、34、35和36的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了38SB39抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：31、32和33构成的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，所述CDR具有SEQ ID NO：34、35和36构成的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明的抗-CD38抗体包含VL，该VL具有选自SEQ ID NO：对于38、40、42、44、46和48的VL的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB13抗体，其包含VL，该VL具有由SEQ ID NO：38构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB18抗体，其包含VL，该VL具有由SEQ ID NO：40构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB19抗体，其包含VL，该VL具有由SEQ ID NO：42构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB30抗体，其包含VL，该VL具有由SEQ ID NO：44构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB31抗体，其包含VL，该VL具有由SEQ ID NO：46构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB39抗体，其包含VL，该VL具有由SEQ IDNO：48构成的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明的抗体包含VH，该VH具有选自SEQID NO：50、52、54、56、58和60的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB13抗体，其包含VH，该VH具有由SEQ ID NO：50构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB18抗体，其包含VH，该VH具有由SEQ ID NO：52构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB 19抗体，其包含VH，该VH具有由SEQ IDNO：54构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB30抗体，其包含VH，该VH具有由SEQ ID NO：56构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB31抗体，其包含VH，该VH具有由SEQ ID NO：58构成的氨基酸序列。在更优选的实施方式中，提供了38SB39抗体，其包含VH，该VH具有由SEQ ID NO：60构成的氨基酸序列。
嵌合和人源化38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体
本文所使用的“嵌合抗体”是一种抗体，其中其恒定区或其一部分被改变、替换或交换，以便可变区被连接到不同物种或者属于其他抗体类型或亚类的恒定区。“嵌合抗体”还指一种抗体，其中其可变区或其一部分被改变、替换或交换，以便恒定区被连接到不同物种或者属于其他抗体类型或亚类的可变区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如Morrison，1985，Science，229：1202；Oi等人，1986，Bio Techniques，4：214；Gillies等人，1989，J.Immunol.Methods，125：191-202；美国专利No.5,807,715、4,816,567和4,816,397，通过参照将其整体并入本文。
在本发明的一个实施方式中，提供了嵌合版本的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39。特别地，所述嵌合版本含有至少一个人的恒定区。在更优选的实施方式中，该人的恒定区是人IgG1/κ(Kappa)恒定区。
本文所使用的术语“人源化抗体”是指一种嵌合抗体，其含有最少的来自非人免疫球蛋白的序列。人源化的目的是降低异种抗体例如鼠抗体，用于引入到人类中时的免疫原性，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。可以使用许多技术例如表面重建和CDR嫁接法生产人源化抗体或适于被其他哺乳动物不排异的抗体。本文所使用的表面重建技术使用分子建模、统计分析以及诱变改变抗体可变区的非CDR表面以类似靶宿主的已知抗体表面的组合。CDR嫁接技术包括将例如小鼠抗体的互补性决定区替换成人的框架结构域，例如参见WO92/22653。优选，人源化嵌合抗体具有恒定区和可变区，其不同于基本上来自或完全来自对应人抗体区的互补性决定区(CDR)以及基本上来自或完全来自人以外哺乳动物的CDR。
用于抗体表面重建的策略和方法，以及用于降低抗体在不同宿主中免疫原性的其他方法被公开在美国专利5,639,641中，通过参照将其全部并入本文。简言之，在优选的方法中，(1)产生一组抗体重链和轻链可变区的位置比对，以提供一组重链和轻链可变区框架表面暴露位置，其中所有可变区的比对位置至少大约98％相同；(2)一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基，被限定成啮齿动物抗体(或其片段)；(3)一组重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基，其与所鉴定的啮齿动物表面暴露的氨基酸残基组几乎相同；(4)除了在所述啮齿动物抗体互补性决定区任意残基
Figure A20078003898300311
内的那些氨基酸以外，在步骤(2)中所限定的重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基组被在步骤(3)中所鉴定的重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基组所替代；以及(5)产生了具有结合特异性的人源化啮齿动物抗体。
能够利用各种其他的技术将抗体人源化，所述技术包括CDR-嫁接法(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利No.5,530,101；和5,585,089)，镶面法(veneering)或表面重建(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E.A.，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka G.M.等人，1994，Protein Engineering 7(6)：805-814；Roguska M.A.等人，1994，PNAS，91：969-973)和链重排(chain shuffling)(美国专利No.5,565,332)。可以通过本领域中各种已知的方法制备人抗体，其包括噬菌体展示法。同样参见美国专利No.4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；以及国际专利申请No.WO 98/46645，WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741(通过参照将所述参考文献全部并入本文)。
本发明提供了人源化抗体或其片段，其识别CD38并通过凋亡、ADCC和/或CDC杀死CD38+细胞。在进一步的实施方式中，人源化抗体或其表位结合片段具有通过所有三种机制杀死所述CD38+细胞的能力。在另一个进一步实施方式中，本发明的人源化抗体或其表位结合片段能够甚至不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死所述CD38+细胞。
这类人源化抗体的优选实施方式是人源化38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39抗体或其表位结合片段。
在更优选的实施方式中，提供了表面重建或人源化版本的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体，其中抗体或其片段的表面暴露残基在轻链和重链二者中都被替换成近似的已知人抗体表面。本发明人源化的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体或其表位结合位点具有改进的性质。例如，人源化38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体或其表位结合位点特异性识别CD38蛋白。更优选，人源化38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体或其表位结合位点具有通过凋亡、ADCC和/或CDC杀死CD38+细胞的额外能力。
人源化版本的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体也被充分表征了它们各自轻链和重链可变区二者的氨基酸序列，轻链和重链可变区基因的DNA序列，CDR的鉴定，它们表面氨基酸的鉴定，以及公开了它们以重组形式表达的手段。然而，本发明的范围不限于包含这些序列的抗体和片段。而是，所有特异性结合CD38并可通过凋亡、ADCC和/或CDC杀死CD38+细胞的抗体和片段都落入本发明的范围内。优选，这些抗体能够通过所有三种机制杀死CD38+细胞。因此，本发明的抗体和表位结合抗体片段可以在其支架、CDR和/或轻链和重链的氨基酸序列上与抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39或其人源化衍生物上有区别，但仍然落入本发明的范围内。
通过建模鉴定了38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体的CDR，并且已经预测了它们的分子结构。同样，尽管CDR对于表位识别是重要的，但它们对于本发明的抗体和片段不是必须的。因此，所提供的抗体和片段具有例如本发明抗体的亲和力成熟所产生的改进性能。
38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体的重链和轻链可变区的序列以及它们CDR的序列不是以前已知的，并且在本申请中被列出。这些信息可以用于产生人源化版本的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体。这些人源化抗-CD38抗体或它们的衍生物也可以用作本发明的细胞结合剂。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了人源化抗体或其表位结合片段，其包含一个或者多个CDR，该CDR包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列。在优选的实施方式中，本发明的人源化抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、25、26、27、31、32和33的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的CDR，该CDR具有选自SEQ ID NO：4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35和36的氨基酸序列。在进一步更优选的实施方式中，提供了人源化的38SB13抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：1、2和3表示的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：4、5和6表示的氨基酸序列。在另一个进一步优选的实施方式中，提供了人源化的38SB18抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：7、8和9表示的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：10、11和12表示的氨基酸序列。在另一个进一步优选的实施方式中，提供了人源化的38SB19抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ IDNOS：13、14和15表示的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：16、17和18构成的氨基酸序列。在另一个进一步优选的实施方式中，提供了人源化的38SB30抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：19、20和21表示的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：22、23和24表示的氨基酸序列。在另一个进一步优选的实施方式中，提供了人源化的38SB31抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：25、26和27表示的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQID NO：28、29和30表示的氨基酸序列。在另一个进一步优选的实施方式中，提供了人源化的38SB39抗体，其包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：31、32和33表示的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的互补性决定区，所述互补性决定区具有SEQ ID NO：34、35和36表示的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供了人源化抗体或其片段，其包含VH，该VH具有具有选自SEQ ID NO：66和72的氨基酸序列。在优选的实施方式中，提供了人源化的38SB19抗体，其包含VH，该VH具有SEQ ID NO：66所表示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方式中，提供了人源化的38SB31抗体，其包含VH，该VH具有SEQ ID NO：72所表示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了人源化抗体或其片段，其包含VL，该VL具有选自SEQ ID NO：62、64、68和70的氨基酸序列。在优选的实施方式中，提供了人源化的38SB19，其包含VL，该VL具有选自SEQ ID NO：62和64的氨基酸序列。在另一个优选的实施方式中，提供了人源化的38SB31抗体，其包含VL，该VL具有选自SEQ IDNO：68和70的氨基酸序列。
人源化的38SB19抗体和其表位结合片段还可以在轻链和/或重链氨基酸残基中在表1A和1B中灰色残基所限定的一个或者多个位点上包含取代，其代表鼠表面框架残基已经被从原始鼠残基变化为人抗体28E4中的相应框架表面残基。表1B中加星号(*)的残基对应人源化38SB19重链变体中的鼠回复突变(SEQ ID NO：65)。回复突变的残基接近CDR，并且根据在美国专利No.5,639,641中的描述进行选择，或者已经在之前人源化努力中进行的导致抗原结合亲和力的降低的残基选择(Roguska等人，美国专利申请公开2003/0235582和2005/0118183)。
类似的，本发明的人源化38SB13、38SB18、38SB30、38SB31和38SB39抗体和其表位结合片段还能够在轻链和/或重链氨基酸残基中包含取代。
多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明提供了编码抗-CD38抗体的核酸。在一个实施方式中，核酸分子编码抗-CD38免疫球蛋白的重链和/或轻链。在优选的实施方式中，单条核酸编码抗-CD38免疫球蛋白的重链，另一条核酸分子编码抗-CD38免疫球蛋白的轻链。
在本发明的另一个方面中，提供了提供了多核苷酸，其编码具有选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的氨基酸序列的多肽。在优选的实施方式中，本发明的多核苷酸选自SEQ ID NO：37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69和71。本发明不限于所述多核苷酸本身，还包括所有显示与所述多核苷酸至少80％同一性的多核苷酸。
本发明提供了含有本发明多核苷酸的载体。在一个实施方式中，该载体含有编码抗-CD38免疫球蛋白重链的多核苷酸。在另一个实施方式中，所述多核苷酸编码抗-CD38免疫球蛋白的轻链。本发明还提供了包含编码其融合蛋白、修饰的抗体、抗体片段及探针的多核苷酸分子的载体。
为了表达本发明抗-CD38抗体的重链和/或轻链，编码所述重链和/或轻链的多核苷酸被***到表达载体中，以便基因被可操作地连接到转录和翻译序列。表达载体包括质粒、YAC、粘粒(cosmid)、反转录病毒、EBV-衍生游离基因以及本领域技术人员能够知道如何便利确保所述重链和/或轻链表达的所有其他载体。本领域技术人员将意识到编码重链和轻链的多核苷酸能够被克隆到不同的载体中，或者在相同的载体中。在优选的实施方式中，所述多核苷酸被克隆在相同的载体中。
本发明的多核苷酸和包含这些分子的载体能够被用于转化适当的哺乳动物宿主细胞。可以通过将多核苷酸引入细胞宿主的任何已知方法进行转化。这些方法是本领域技术人员公知的，并且包括葡聚糖(dextran)-介导的转化、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电转、将多核苷酸封装在脂质体内、基因枪(biolistic)注射以及直接将DNA注射到细胞核中。
抗体片段
本发明的抗体包括上面所讨论的全长抗体以及表位结合片段。本文所使用的“抗体片段”包括保持结合全长抗体所识别表位的能力的任何抗体部分，通常被称作“表位结合片段”。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv(dsFv)和包含VL或VH区的片段。包括单链抗体的表位结合片段可以单独或者联合下列的整体或者一部分的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3区。
这些片段可以含有Fab片段或F(ab′)2片段之一或者二者。优选，抗体片段含有整个抗体的全部六个CDR，尽管含有少于全部这些区域的片段例如3个、4个或5个CDR也具有功能。进一步，这些片段可以是下列免疫球蛋白类型任一种的成员或与其组合：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类。
可以通过蛋白质水解切割(cleavage)产生Fab和F(ab′)2片段，其使用酶，诸如木瓜蛋白酶(Fab片段)或胃蛋白酶(F(ab′)2片段)。
“单链FV”(“scFv”)片段是含有连接到抗体轻链可变区(VL)的至少一个片段的抗体重链可变区(VH)的至少一个片段的表位结合片段。连接物可以是所选择的短、柔性肽用于确保(VL)和(VH)区一旦它们被连接时发生适当的三维折叠，以便维持单链抗体片段由此来源的整个抗体的靶分子结合特异性。VL或VH序列的羧基末端可以通过连接物共价连接到互补VL或VH序列的氨基酸末端。
本发明的单链抗体片段含有具有本发明公开所描述的整个抗体的可变区或互补性决定区(CDR)至少之一的氨基酸序列，但是缺少这些抗体的某些或者全部恒定区。这些恒定区对于抗原结合不是必要的，但是构成了整个抗体结构的主要部分。因此，单链抗体片段可以克服与使用含有部分或者全部恒定区相关的某些问题。例如，单链抗体片段倾向于不存在生物分子与重链恒定区之间的不期望相互作用，或者其他不期望的生物活性。另外，单链抗体片段显著地比整个抗体小，因此可具有比整个抗体大的毛细管渗透性，这使得单链抗体片段更有效地定位并结合到靶抗原-结合位点。还能够在原核细胞中以相对大规模生产抗体片段，因此促进了它们的生产。此外，单链抗体片段的相对小的尺寸使它们与整个抗体相比可能性更小地在受体中引发免疫应答。
可以通过分子克隆、抗体噬菌体展示库或本领域技术人员公知的类似技术生产单链抗体片段。可以在真核细胞或原核细胞包括细菌中生产这些蛋白质。也可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法生产本发明的表位结合片段。在噬菌体展示方法中，功能性抗体区被展示在噬菌体颗粒的表面，所述噬菌体颗粒携带编码功能性抗体区的多核苷酸序列。特别的，这些噬菌体可以被用于展示从所有组成部分(repertoire)或组合的抗体库(例如人或鼠)表达的表位结合区。可以利用抗体选择或者鉴定表达与目标抗原结合的表位结合区的噬菌体，例如使用标记的结合或捕获到固体表面或珠的抗原。在这些方法中所使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括fd和M13结合区，该结合区用Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体区由噬菌体表达，该抗体区被重组融合到噬菌体基因III或基因VIII蛋白质。
可以用于制备本发明的表位结合片段的噬菌体展示方法的例子包括在Brinkman等人，1995，J.Immunol.Methods，182：41-50；Ames等人，1995，J.Immunol.Methods，184：177-186；Kettleborough等人，1994，Eur.J.Immunol.，24：952-958；Persic等人，1997，Gene 187：9-18；Burton等人，1994，Advances in Immunology，57：191-280；WO/1992/001047；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中所公开的那些，通过参照均将其全部并入本文。
在噬菌体选择后，编码片段的噬菌体的区域能够被分离并用于通过所选择的宿主中表达产生表位结合片段，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，其使用重组DNA技术，例如下面详细描述的。例如，用于重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术也可以被采用，其使用本领域中已知的方法，例如在WO 92/22324；Mullinax等人，1992，BioTechniques，12(6)：864-869；Sawai等人，1995，AJRI，34：26-34；和Better等人，1988，Science，240：1041-1043所公开的；通过参照将所述参考文献全部并入本文。可以用于生产单链Fv和抗体的技术的例子包括在美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston等人，1991，Methods in Enzymology 203：46-88；Shu等人，1993，PNAS，90：7995-7999；Skerra等人，1988，Science，240：1038-1040中描述的。
功能等同物
本发明的范围内还包括抗-CD38抗体和人源化抗-CD38受体抗体的功能等同物。术语“功能等同物”包括具有同源序列的抗体、嵌合抗体、人工抗体和经修饰的抗体，例如其中每种功能等同物都被限定为其结合CD38蛋白的能力。本领域技术人员能够理解在被称作“抗体片段”的分子组和被称作“功能等同物”的分子组之间存在重叠。生产功能等同物的方法是本领域技术人员已知的，并被公开在例如WO93/21319，EP 239400；WO 89/09622；EP 338745；以及EP 332424中，分别通过参照将它们全部并入。
具有同源序列的抗体是氨基酸序列与本发明的抗-CD38抗体和人源化抗-CD38抗体氨基酸序列具有序列同源性的那些抗体。优选，同源性是与本发明抗-CD38抗体和人源化抗-CD38抗体的可变区的氨基酸序列。本文用于氨基酸序列的“序列同源性”被定义为与另一条氨基酸序列具有至少大约90％、91％、92％、93％或94％序列同源性的的序列，更优选至少大约95％、96％、97％、98％或99％序列同源性，其是通过例如根据Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：2444-2448的FASTA检索方法测定的。
人工抗体包括scFv片段、二聚抗体、三聚抗体、四聚抗体和mru(参见Winter，G.and Milstein，C，1991，Nature，349：293-299；Hudson，P.J.，1999，Current Opinion in Immunology，11：548-557所综述的)，均具有抗原-结合能力。在单链Fv片段(scFv)中，抗体的VH和VL区被通过柔性肽连接。典型地，该连接肽长度为大约15个氨基酸残基。如果连接物小得多，例如5个氨基酸，则形成二聚抗体，其为二价scFv二聚体。如果连接物减少到低于3个氨基酸残基，则形成被称作三聚抗体和四聚抗体的三聚体和四聚体结构。抗体的最小结合单位是CDR，典型地为重链的CDR2，其具有充分的特异性识别和结合，因此其能够独立使用。这种片段被称作分子识别单位或mru。某些这类mru能够与短连接肽连接在一起，因此形成人工结合肽，其具有比单个mru高的亲合力。
本发明的功能等同物还包括经修饰的抗体，例如通过将任何类型的分子共价结合到抗体而修饰的抗体。例如，经修饰的抗体包括已经通过例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白质水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接等进行修饰。共价结合不会防止抗体产生抗-独特型(anti-idiotypic)应答。可以通过已知的技术进行这些修饰，包括但不限于特异性的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等。另外，经修饰的抗体可以含有一种或者多种非典型氨基酸。
可以通过交换不同框架中不同链上的不同CDR而生产功能等同物。因此，例如对于给定的CDR组可以通过替代不同的重链而可能有不同类别的抗体，这样，例如可以产生IgG 1-4、IgM、IgA 1-2、IgD、IgE抗体类型和同种型。类似的，可以通过将给定的CDR组嵌入到完全合成的框架中而生产本发明范围内的人工抗体。
在特定CDR组的两侧使用多种本领域中已知的方法，可以通过可变区和/或恒定区序列中的突变、缺失和/或***而容易产生功能等同物。本发明的抗体片段和功能等同物包括那些与38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39抗体相比时具有可检测程度结合CD38的分子。可检测的结合程度包括鼠38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39抗体与CD38结合能力的至少10～100％，优选至少50％、60％或70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％。
改进的抗体
CDR对于表位识别和抗体结合是最重要的。然而，可以对包含CDR的残基进行改变，而不干扰抗体识别并结合其同类表位的能力。例如，可以进行不影响表位识别，但仍提高抗体对表位的结合亲和力的改变。
因此，同样包括在本发明范围内的是，鼠和人源化抗体二者的改进版本，其也会特异性识别和结合CD38，优选具有提高的亲和力。
已经进行了调研研究基于初级抗体序列的知识，在抗体序列中的多个位置处引入一个或多个氨基酸改变对于其性质例如结合和表达水平的影响。(Yang，W.P.等人，1995，J.Mol.Biol.，254：392-403；Rader，C.等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95：8910-8915；Vaughan，T.J.等人，1998，Nature Biotechnology，16：535-539)。
在这些研究中，已经产生了初级抗体的等同物，其通过改变在CDR1、CDR2、CDR3或框架区中的重链和轻链基因序列，使用诸如寡核苷酸介导的定点突变、盒突变、错误倾向PCR、DNA重排或大肠杆菌(E.coli)的突变株(Vaughan，T.J.等人，1998，Nature Biotechnology，16：535-539；Adey，N.B.等人，1996，Chapter 16，pp.277-291，in″PhageDisplay of Peptides and Proteins″，Eds.Kay，B.K.等人，Academic Press)的方法。这些改变初级抗体序列的方法已经导致二级抗体亲和力的改进(Gram，H.等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：3576-3580；Boder，E.T.等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97：10701-10705；Davies，J.and Riechmann，L，1996，Immunotechnolgy，2：169-179；Thompson，J.等人，1996，J.Mol.Biol.，256：77-88；Short，M.K.等人，2002，J.Biol.Chem.，277：16365-16370；Furukawa，K.等人，2001，J.Biol.Chem.，276：27622-27628)。
通过类似的定向改变抗体一个或者多个氨基酸残基的策略，在本发明中所描述的抗体序列可以用于开发具有改进的功能的抗-CD38抗体，包括改进的对CD38的亲和力。
优选的氨基酸取代是那些，其：(1)降低蛋白质水解敏感度，(2)降低氧化敏感度，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)提供或修饰这些类似物的其他物理化学或功能性能的取代。类似物可以包括除了天然存在的肽序列之外的各种序列的突变。例如，可以在天然存在的序列中(优选在形成分子间接触的区域之外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应该实质上改变亲代序列的结构特征(例如氨基酸替代不应该倾向破坏在亲代序列中存在的螺旋，或者表征破坏亲代序列的其他二级结构类型)。公认的多肽二级和三级结构的例子被描述在Proteins，Structuresand Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等人，1991，Nature，354：105中，均被通过参照并入本文中。
改进的抗体还包括具有改进特征的那些抗体，其是通过标准的动物免疫、杂交瘤形成和选择具有特异性特征的技术制备的那些抗体。
特别地，根据本发明的改进的抗体包括具有增强的功能性质的抗体。特别感兴趣的是，那些具有增强的介导细胞外细胞毒性效应功能例如ADCC的能力的抗体。可以通过在抗体的恒定框架中进行单个或多个取代而获得这些抗体，因此改变了其与Fc受体的相互作用。用于设计这些突变体的方法可以发现于例如Lazar等人(2006，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103(11)：4005-4010)和Okazaki等人(2004，J.Mol.Biol.336(5)：1239-49)中。还参见WO 03/074679、WO 2004/029207、WO2004/099249、WO2006/047350、WO 2006/019447、WO 2006/105338、WO 2007/041635。还可以使用被特异性改造产生改进的抗体的细胞系。特别地，这些细胞系具有改变的调节糖基化途径，导致了较少海藻糖基化或甚至完全去海藻糖基化的抗体。这些用于改造它们的这些细胞系和方法被公开在例如Shinkawa等人(2003，J.Biol.Chem.278(5)：3466-3473)，Ferrara等人(2006，J.Biol.Chem.281(8)：5032-5036；2006，Biotechnol.Bioeng.93(5)：851-61)，EP 1331266，EP 1498490，EP1498491，EP 1676910，EP 1792987和WO 99/54342中。
本发明还包括细胞毒性缀合物。这些细胞毒性缀合物包含两种主要组分，细胞结合剂和细胞毒性剂。
本文所使用的，术语“细胞结合剂”指特异性识别和结合细胞表面上的CD38蛋白的试剂。在一个实施方式中，细胞结合剂特异性识别CD38蛋白，以便其能够使缀合物以靶向模式发挥作用，而几乎没有因非特异性结合所引起的副作用。
在另一个实施方式中，本发明的细胞结合剂还特异性识别CD38蛋白，以便缀合物将与靶细胞接触持续充分的时间段以使得缀合物的细胞毒性药物部分对细胞发挥作用，和/或使得缀合物被细胞内化充分长的时间。
在优选的实施方式中，细胞毒性缀合物包含抗-CD38抗体作为细胞结合剂，更优选鼠38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39抗-CD38单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，细胞结合剂是所述抗-CD38的嵌合版本。在在更优选的实施方式中，细胞毒性缀合物包含人源化38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体或其表位结合片段。38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体能够特异性识别CD38，并将细胞毒性剂以靶向模式引导到异常细胞或组织例如癌细胞。
本发明细胞毒性缀合物的第二组分是细胞毒性剂。本文所使用的术语“细胞毒性剂”指降低或阻断细胞功能或生长和/或造成细胞破坏的物质。
在优选的实施方式中，细胞毒性剂是小分子药物、前药、紫杉醇类化合物(taxoid)、类美登素例如DM1或DM4、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物、CC-1065或CC-1065类似物。在优选的实施方式中，本发明的细胞结合剂被直接或者通过可切割的或非可切割的连接物共价结合到细胞毒性剂。
下面更详细讨论细胞结合剂、细胞毒性剂和连接物。
细胞结合剂
本发明的化合物作为治疗剂的效率依赖于仔细选择适当的细胞结合剂。细胞结合剂可以是任何目前已知的类型，或者成为已知的类型，并且包括肽和非肽。细胞结合剂可以是任何能够结合细胞的化合物，以特异性或非特异性方式。通常，这些能够是抗体(特别是单克隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素、营养素转运分子(例如转铁蛋白)或任何其他细胞结合分子或物质。
可以使用的细胞结合剂的更具体实施例包括：
·多克隆抗体；
·单克隆抗体；
·抗体片段，例如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fv(Parham，1983，J.Immunol.，131：2895-2902；Spring等人，1974，J.Immunol.，113：470-478；Nisonoff等人，1960，Arch.Biochem.Biophys.，89：230-244)。
特别地，选自38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39的抗-CD38单克隆抗体可以用作根据本发明的细胞结合剂。类似地，所述细胞结合剂可以是38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39单克隆抗体之一的嵌合版本。优选，人源化的抗-CD38抗体被用作本发明的细胞结合剂。更优选，人源化抗-CD38抗体选自人源化或表面重建的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体。
细胞毒性剂
在另一个实施方式中，人源化抗体或其表位结合片段可以缀合到药物例如类美登素上以形成前药，其通过将药物靶向CD38蛋白而对表达抗原的细胞具有特异细胞毒性。包含这类抗体以及小型、高毒性药物(例如类美登素、紫杉烷类化合物、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物和CC-1065类似物)的细胞毒性缀合物可以用作***例如淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤的治疗剂。
在本发明的细胞毒性缀合物中所使用的细胞毒性剂可以是任何引起细胞死亡或诱导细胞死亡或以某些方式降低细胞存活力的化合物。优选的细胞毒性剂包括例如下面所定义的类美登素和类美登素类似物、紫杉醇类化合物(taxoid)、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物、CC-1065和CC-1065类似物、海兔毒素(dolastatin)和海兔毒素类似物。这些细胞毒性剂被缀合到本文所公开的抗体、抗体片段、功能等同物、改进的抗体和它们的类似物。
可以通过体外方法制备细胞毒性缀合物。为了将药物或前药连接到抗体，使用连接基团。适当的连接基团是本领域中公知的，包括二硫基团、硫醚基团、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团和酯酶不稳定的基团。优选的连接基团是二硫基团和硫醚基团。例如，可以使用二硫化物交换反应或者通过在抗体和药物或前药之间形成硫醚键而构建缀合物。
类美登素
在细胞毒性剂(在本发明中可以用于形成细胞毒性缀合物)中，有类美登素和类美登素类似物。适当的类美登素的例子包括美登醇和美登醇类似物。类美登素是抑制微管形成的药物，其对哺乳动物细胞是高度毒性的。
适当的美登醇类似物的例子包括具有经修饰的芳香环的那些和在其他位置具有修饰的那些。这些适当的类美登素被公开在美国专利No.4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；和5,846,545中。
具有经修饰芳香环的美登醇的适当类似物的具体例子包括：
(1)C-19-去氯(美国专利No.4,256,746)(通过ansamytocin P2的LAH还原而制得)；
(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利No.4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)的去甲基化或者使用LAH的去氯化制备的)；和
(3)C-20-去甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-去氯(美国专利No 4,294,757)(通过使用酰氯的酰基化制备的)。
具有其他位置修饰的美登醇的适当类似物的具体实施例包括：
(1)C-9-SH(美国专利No.4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应制备的)；
(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利No.4,331,598)；
(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)(从诺卡氏菌(Nocardia)制备的)；
(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)(通过链霉菌(Streptomyces)转化美登醇而制备的)；
(5)C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和4,315,929)(从滑桃树(Trewia nudiflora)分离的)；
(6)C-18-N-去甲基(美国专利No.4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌(Streptomyces)对美登醇去甲基化而制备的)；以及
(7)4，5-去氧(美国专利No 4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇而制备的)。
在优选的实施方式中，本发明的细胞毒性缀合物利用含有硫醇的类美登素(DM1)，其正式命名为N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素作为细胞毒性剂。DM1是由下列结构式(I)表示的：
Figure A20078003898300451
在另一个优选实施方式，本发明的细胞毒性缀合物利用含有硫醇的类美登素，其正式命名为N2’-去乙酰基-N2’-(4-甲基4-巯基-1-氧代戊基)-美登素作为细胞毒性剂。DM4是由下列结构式(II)表示的：
Figure A20078003898300452
在本发明进一步的实施方式中，可以使用其他美登素，包括在携带硫原子的碳原子上携带单烷基或二烷基取代的含硫醇和二硫化物的类美登素。这些包括具有C-3、C-14羟甲基，C-15羟基或C-20去甲基，具有携带受阻巯基的酰基的酰基化氨基酸侧链的类美登素，其中携带硫醇官能团的酰基的碳原子具有一个或者两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基、杂环芳基或杂环烷基，进一步，其中取代基之一可以是H，其中酰基在羰基官能团与硫原子之间具有至少3个碳原子的直链长度。
这类其他的美登素包括由式(III)表示的化合物：
Figure A20078003898300461
其中：
Y’表示
(CR7R8)1(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中：
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
A、B和D分别独立地为具有3～10个碳原子的环烷基或环烯基，简单的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；
R3、R4、R5，R6、R7、R8、R9、R11和R12分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s和t分别独立地为0或者1～5的整数，条件是：l、m、n、o、p、q、r、s和t当中的至少两个不同时为零；以及
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、或者简单的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
式(III)的优选实施方式，包括一些式(III)的化合物，其中：
R1是H，R2是甲基，且Z是H。
R1和R2是甲基，且Z是H。
R1是H，R2是甲基，且Z是-SCH3。
R1和R2是甲基，且Z是-SCH3。
这些额外的美登素还包括式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D，L)所表示的化合物：
Figure A20078003898300471
其中Y代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中：
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
R3、R4、R5，R6、R7和R8分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m和n分别独立地为1～5的整数，另外n可以为0；
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的环烷基或烯基、或者简单的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；以及
May代表类美登素，其在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基上携带侧链。
式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)的优选实施方式包括一些式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)的化合物，其中：
R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，n是0，且Z是H。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8分别为H，l和m是1，n是0，且Z是H。
R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7、R8分别为H，l和m分别为1，n是0，且Z是-SCH3。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8分别为H，l和m是1，n是0，且Z是-SCH3。
优选地，细胞毒性剂是由(IV-L)表示的。
这些其他的美登素还包括由式(V)表示的化合物：
Figure A20078003898300481
其中Y代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ，
其中R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
R3、R4、R5，R6、R7和R8分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m和n分别独立地为1～5的整数，另外n可以为0；以及
Z是H、SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的环烷基或烯基、或者简单的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
式(V)的优选实施方式包括一些式(V)的化合物，其中：
R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，n是0，且Z是H。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m是1，n是0，且Z是H。
R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，n是0，且Z是-SCH3。
R1和R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m是1，n是0，且Z是-SCH3。
这些其他的美登素还包括由式(VI-L)、(VI-D)或(VI-D，L)表示的化合物：
Figure A20078003898300491
其中Y2代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2，
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
R3、R4、R5，R6、R7和R8分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m和n分别独立地为1～5的整数，另外n可以为0；
Z2是SR或COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的环烷基或烯基、或者简单的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；以及
May代表类美登素。
这些其他的美登素还包括由式(VII)表示的化合物：
Figure A20078003898300501
其中：
Y2’代表
(CR7R8)l(CR9＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2，
其中：
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
A、B和D分别独立地为具有3～10个碳原子的环烷基或环烯基，简单的或者被取代的芳基，或杂环芳基或杂环烷基；
R3、R4、R5，R6、R7、R8、R9、R11和R12分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m、n、o、p、q、r、s和t分别独立地为0或者1～5的整数，条件是：l、m、n、o、p、q、r、s和t当中的至少两个不同时为零；以及
Z2是SR或-COR，其中R是具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、或者简单的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基。
式(VII)的优选实施方式包括一些式(VII)的化合物，其中：R1是H，R2是甲基。
上述类美登素能够缀合到抗-CD38抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39或其同源物或片段，其中抗体连接到类美登素，其利用在酰基化氨基酸侧链的酰基基团上存在的硫醇或二硫化物官能团，其中所述酰基化氨基酸侧链是在类美登素C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基上存在的，其中酰基化氨基酸侧链的酰基具有位于具有一个或两个取代基的碳原子上的其硫醇或二硫化物，所述取代基是CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基，另外取代基之一可以是H，其中酰基在羰基官能团与硫原子之间具有至少3个碳原子的直链长度。
本发明优选的缀合物是一种缀合物，其包含缀合到式(VIII)的类美登素上的抗-CD38抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39或其同源物或片段：
Figure A20078003898300511
其中
Y1’代表
(CR7R8)l(CR8＝CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11＝CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2S-，
其中：
A、B和D分别独立地为具有3～10个碳原子的环烷基或环烯基，简单的或者被取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基；
R3、R4、R5，R6、R7、R8、R9、R11和R12分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；以及
l、m、n、o、p、q、r、s和t分别独立地为0或者1～5的整数，条件是：l、m、n、o、p、q、r、s和t当中的至少两个不同时为零。
优选地，R1是H，R2是甲基，或者R1和R2是甲基。
本发明更加优选的缀合物是一种缀合物，其包含缀合到式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D，L)的类美登素上的抗-CD38抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39或其同源物或片段：
其中：
Y1代表(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2S-，
其中：
R1和R2分别独立地为CH3、C2H5，具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基、杂环芳基或杂环烷基，另外，R2可以是H；
R3、R4、R5，R6、R7和R8分别独立地为H、CH3、C2H5、具有1～10个碳原子的直链烷基或烯基、具有3～10个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、被取代的苯基或杂环芳基或杂环烷基；
l、m和n分别独立地为1～5的整数，另外n可以为0；
以及
May代表类美登素，其在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基上携带侧链。
式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D，L)的优选实施方式包括一些式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D，L)的化合物，其中：
R1是H，且R2是甲基，或者R1和R2是甲基，
R1是H，R2是甲基，R5，R6，R7和R8分别为H；l和m分别为1；n是0，
R1和R2是甲基；R5、R6、R7和R8分别为H；l和m是1；n是0。
由式(IX-L)代表的细胞毒性剂是优选的。
本发明更加优选的缀合物是一种缀合物，其包含缀合到式(X)的类美登素上的抗-CD38抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39或其同源物或片段：
其中取代基是如上面对式(IX)所定义的。
特别优选的是任何上述化合物，其中R1是H，R2是甲基，R5、R6、R7和R8分别为H，l和m分别为1，且n是0。
进一步特别优选的是任何上述化合物，其中R1和R2是甲基，R5、R6、R7、R8分别为H，l和m分别为1，且n是0。
进一步，优选L-氨基酰基立体异构体。
在未决的于2004年5月20日提交的美国专利申请No.10/849,136中所教导的每种类美登素也可以用于本发明的细胞毒性缀合物中。通过参照将美国专利申请No.10/849,136的全部公开内容并入本文中。
含有二硫化物的连接基团
为了将类美登素连接到细胞结合剂例如38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39抗体，类美登素包含连接部分。连接部分在特定的位点含有允许释放完全活性类美登素的化学键。适当的化学键是本领域中公知的，并且包括二硫键、酸不稳定的键、光不稳定的键、肽酶不稳定的键和酯酶不稳定的键。优选的是二硫键。
连接部分还包含反应性化学基团。在优选的实施方式中，反应性化学基团可以通过二硫键连接部分共价结合到类美登素上。
特别优选的反应性化学基团是N-琥珀酰亚胺基酯和N-磺基琥珀酰亚胺基酯。
特别优选的包含含有反应性化学基团的连接部分的类美登素是美登醇的C-3酯及其类似物，其中连接部分含有二硫键，化学反应性基团包括N-琥珀酰亚胺基酯或N-磺基琥珀酰亚胺基酯。
类美登素上的许多位置能够作为化学连接部分的位置。例如，具有羟基的C-3位，被羟甲基修饰的C-14位，被羟基修饰的C-15位，具有羟基的C-20位都被认为是有用的。然而，C-3位是优选的，美登醇的C-3位是特别优选的。
尽管已经就含有二硫键的连接部分描述了具有连接部分的美登醇酯的合成，但本另一技术人员能够理解具有其他化学键的连接部分(上面所述的)也能够如同其他类美登素用于本发明。其他化学键的具体例子包括酸不稳定的键、光不稳定的键、肽酶不稳定的键和酯酶不稳定的键。本文所并入的美国专利No.5,208,020的公开内容教导了生产携带这类键的类美登素。
具有二硫化物部分的类美登素和类美登素衍生物的合成被描述在美国专利No.6,441,163和6,333,410以及美国专利申请No.10/161,651中，均通过参照并入本文中。
含有反应性基团的类美登素例如DM1与抗体反应，例如38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39抗体，以产生细胞毒性缀合物。可以通过HPLC或通过凝胶过滤纯化这些缀合物。
生产这类抗体-类美登素缀合物的某些优秀方案被提供在美国专利No.6,333,410和美国专利申请No.09/867,598、10/161,651和10/024,290中，均通过参照全部并入本文中。
通常，可以将抗体在含水缓冲液的溶液与摩尔过量的类美登素孵育，其中该类美登素具有携带反应性基团的二硫化物部分。可以通过加入过量的胺(例如乙醇胺、牛磺酸等)淬灭反应混合物。接着可以通过凝胶过滤纯化类美登素-抗体缀合物。
可以通过分光光度法测量252nm和280nm的吸光度值比例，测定每个抗体分子所结合的类美登素分子的数目。平均1～10个类美登素分子/抗体分子是优选的。
可以对抗体与类美登素药物的缀合物进行评价它们体外抑制各种不期望细胞系的增殖的能力。例如，细胞系诸如人淋巴瘤细胞系Daudi、人淋巴瘤细胞系Ramos、人多发性骨髓瘤细胞系MOLP-8和人急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4能够被容易地用于检验这些化合物的细胞毒性。可以将待评估的细胞暴露到化合物24小时，并通过已知的方法以直接检验测量存活的细胞分数。接着可以从检验的结果计算IC50值。
含PEG的连接基团
正如在美国申请No.10/024,290中所描述的，类美登素也可以被使用PEG连接基团连接到细胞结合剂。这些PEG连接基团可以溶解在水和非水溶剂中，并且可以用于将一种或者多种细胞毒性剂连接到细胞结合剂。示范性的PEG连接基团包括杂-双官能团PEG连接物，其在连接物的相对末端通过一端的功能团巯基或二硫化物基团以及在另一端的活性酯结合到细胞毒性剂和细胞结合剂。
作为使用PEG连接基团合成细胞毒性缀合物的通用例子，具体细节再次参照美国专利申请No.10/024,290。合成是从一种或者多种携带反应性PEG部分的细胞毒性剂与细胞结合剂的反应开始的，其结果是每个反应性PEG部分的末端活性酯被替代为细胞结合剂的氨基酸残基，以产生细胞毒性缀合物，该细胞毒性缀合物包含通过PEG连接基团共价键合到细胞结合剂的一种或者多种细胞毒性剂。
紫杉烷类化合物
在本发明的细胞毒性缀合物中所使用的细胞毒性剂也可以是紫杉烷或其衍生物。
紫杉烷类化合物是一种化合物家族，其包括一种细胞毒性自然产品帕利他西(紫杉醇)和一种半合成衍生物多西他赛(脱乙酰基紫杉醇)，两种化合物都被广泛用于癌症治疗中。紫杉烷类化合物是有丝***纺锤体毒剂，其抑制微管蛋白的解聚，引起细胞死亡。尽管多西他赛和帕利他西都是可以用于癌症治疗的试剂，但由于它们对正常细胞的非特异性毒性，因此它们的抗肿瘤活性是有限的。进一步，类似帕利他西和多西他赛它们的化合物不是充分有效以用于细胞结合剂的缀合物中。
用于制备细胞毒性缀合物的优选紫杉烷是式(XI)的紫杉烷：
Figure A20078003898300561
用于合成可以用于本发明细胞毒性缀合物的紫杉烷类化合物的方法，连同用于将紫杉烷类化合物缀合到细胞结合剂的方法被详细描述在美国专利No.5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931以及美国专利申请No.10/024,290、10/144,042、10/207,814、10/210,112和10/369,563中。
茅屋霉素衍生物
本发明的细胞毒性剂也可以是茅屋霉素衍生物。茅屋霉素衍生物是吡咯并[1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300562
(PBD)，一种已知的化合物类型，其通过共价结合到DNA小沟中鸟嘌呤的N2表现出生物性能。PBD包括一些小沟结合剂，例如安曲霉素、新安拉霉素和DC-81。
保持高细胞毒性并可以被有效连接到细胞结合剂的新型茅屋霉素衍生物被公开在国际申请No.PCT/IB2007/000142中，通过参照将其内容并入本文中。细胞结合剂-茅屋霉素衍生物复合物允许调节以靶向模式施加的茅屋霉素衍生物仅对不期望的细胞发挥细胞毒性作用，因此避免了由于对未靶向健康细胞的损伤而引起的副作用。
本发明的细胞毒性剂包含一种或者多种茅屋霉素衍生物，其通过连接基团连接到细胞结合剂例如38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39抗体。连接基团是通过传统方法共价结合到托马霉衍生物的化学部的一部分。在优选的实施方式中，该化学部可以通过二硫键共价结合到茅屋霉素衍生物。
可以用于本发明的茅屋霉素衍生物具有下面显示的式(XII)：
其中
----代表任选的单键；
Figure A20078003898300572
代表单键或双键；
如果在
Figure A20078003898300573
代表单键，U和U′相同或不同并独立地代表H，W和W’相同或不同并独立地选自OH，醚如-OR，酯(例如醋酸酯)如-OCOR，碳酸酯如-OCOOR，氨基甲酸酯如-OCONRR′，环氨基甲酸酯以便N10和C11是环的一部分，脲如-NRCONRR′，硫代氨基甲酸酯如-OCSNHR，环硫代氨基甲酸酯以便N10和C11是环的一部分，-SH，硫化物如-SR，亚砜如-SOR，砜如-SOOR，磺酸酯如-SO3-，磺酰胺如-NRSOOR，胺如-NRR′，任选地环胺以便N10和C11是环的一部分，羟胺衍生物如-NROR′，胺如-NRCOR，叠氮基如-N3，氰基，卤素，三烷基或三烷基鏻、氨基酸衍生基团；优选W和W’相同或不同并是OH、Ome、Oet、NHCONH2、SMe；
当
Figure A20078003898300574
代表双键时，U和U′不存在，W和W’代表H；
■R1、R2、R1′、R2′相同或不同并独立地选自卤化物或任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、芳基、Het、S(O)qR取代的烷基，或者R1和R2以及R1′和R2′分别共同形成含有基团＝B和＝B′的双键。
优选地，R1和R2以及R1′和R2′分别共同形成含有基团＝B和＝B′的双键。
■B和B′相同或不同并独立地选自任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、芳基、Het、S(O)qR取代的烯基，或者B和B′代表氧原子。
优选地，B＝B′。
更优选地，B＝B′＝＝CH2或＝CH-CH3，
■X、X′相同或不同并独立地选自一个或多个-O-、-NR-、-(C＝O)-、-S(O)q-。
优选地，X＝X′。
更优选地，X＝X′＝O。
■A、A′相同或不同并独立地选自任选含有氧、氮或硫原子的烷基或烯基，所述烷基或烯基分别任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、-S(O)q、芳基、Het、烷基、烯基取代。
优选地，A＝A′。
更优选地，A＝A′＝直链未取代的烷基。
■Y、Y′相同或不同并独立地选自H、OR；
优选地，Y＝Y′。
更优选地，Y＝Y′＝O烷基，更优选O甲基。
■T是-NR-、-O-、-S(O)q或者4～10元芳基、环烷基、杂环或杂芳基，所述基团分别任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、R、OR、S(O)qR和/或连接物(linker)取代，或者支链烷基，所述支链烷基任选地被一个或者多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、S(O)qR和/或连接物取代，或者直链烷基，所述直链烷基被一个或多个Hal、CN、NRR′、CF3、OR、S(O)qR和/或连接物取代。
优选地，T是4～10元芳基或杂芳基，更优选苯基或吡啶，其任选地被一个或者多个连接物取代。
所述连接物包含连接基团。适当的连接基团是本领域中公知的，并且包括硫醇、硫化物、二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团和酯酶不稳定的基团。优选的是二硫化物基团和硫醚基团。
如果连接基团是含有硫醇-、硫化物(或者所谓硫醚-S-)或二硫化物(-S-S-)-的基团，携带硫醇、硫化物或二硫化物基团的侧链可以是直链或支链、芳族或杂环的。本领域技术人员能够容易识别适当的侧链。
优选地，所述连接物是下式表示的：
-G-D-(Z)p-S-Z’
其中
G是单键或双键、-O-、-S-或-NR-；
D是单键或-E-、-E-NR-、-E-NR-F-、-E-O-、-E-O-F-、-E-NR-CO-、-E-NR-CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E-CO-F、-E-S-、-E-S-F-、-E-NR-C-S-、-E-NR-CS-F-；
其中E和F相同或不同且独立地选自直链或支链-(OCH2CH2)i烷基(OCH2CH2)j-、-烷基(OCH2CH2)i-烷基-、-(OCH2CH2)i-、-(OCH2CH2)i环烷基(OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i杂环(OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i芳基(OCH2CH2)j-、-(OCH2CH2)i杂芳基(OCH2CH2)j-、-烷基-(OCH2CH2)i烷基(OCH2CH2)j-、-烷基-(OCH2CH2)i-、-烷基-(OCH2CH2)i环烷基(OCH2CH2)j-、-烷基(OCH2CH2)i杂环(OCH2CH2)j-、-烷基-(OCH2CH2)i芳基(OCH2CH2)j-、-烷基(OCH2CH2)i杂芳基(OCH2CH2)j-、-环烷基-烷基-、-烷基-环烷基-、-杂环-烷基-、-烷基-杂环-、-烷基-芳基-、-芳基-烷基-、-烷基-杂芳基-、-杂芳基-烷基-；
其中，i和j相同或不同且是独立地选自0、1～2000的整数；
Z是直链或支链-烷基-；
p是0或1；
Z′代表H、硫醇保护基团例如COR、R20或SR20，其中R20代表H、甲基、烷基、任选被取代的环烷基、芳基、杂芳基或杂环，条件是：当Z′是H时，所述化合物与通过由于在PBD部分之一的亚胺键-NH＝上加入硫醇基团-SH而发生的分子内环化所形成的相应化合物平衡。
■n、n′相同或不同，并且是0或1。
■q是0、1或2。
■R、R′相同或不同，并且选自H、烷基和芳基，所述基团分别任选地被Hal、CN、NRR′、CF3、R、OR、S(O)qR、芳基、Het取代；
或者它们的药物上可以接受的盐、水合物或水合盐、或者这些化合物的多形态晶体结构或它们光学异构体、外消旋物、非对映异构体和对映异构体。
具有几何和立体异构体的通式(XII)的化合物也是本发明的一部分。
已知式(XII)的茅屋霉素衍生物的N-10、C-11双键在存在水、硫醇、伯胺或仲胺、脲、和其他亲核试剂时容易以可逆的方式被转化成相应的亚胺加成物。这种过程是可逆的，并且能够在存在脱水剂时在非质子有机溶剂中、在真空中或高温下容易再生相应的茅屋霉素衍生物(Z.Tozuka，1983，J.Antibiotics，36：276)。
因此通式(XIII)的茅屋霉素衍生物的可逆衍生物也可以用于本发明中：
Figure A20078003898300601
其中A、X、Y、n、T、A′、X′、Y′、n′、R1、R2、R1′、R2′是如上面在式(VII)中所定义的，W和W’相同或不同并独立地选自OH，醚如-OR，酯(例如醋酸酯)如-OCOR，-OCOOR，碳酸酯如-OCOOR，氨基甲酸酯如-OCONRR′，环氨基甲酸酯以便N10和C11是环的一部分，脲如-NRCONRR′，硫代氨基甲酸酯如-OCSNHR，环硫代氨基甲酸酯以便N10和C11是环的一部分，-SH，硫化物如-SR，亚砜如-SOR，砜如-SOOR，磺酸酯如-SO3-，磺酰胺如-NRSOOR，胺如-NRR′，任选地环胺以便N10和C11是环的一部分，羟胺衍生物如-NROR′，胺如-NRCOR，-NRCONRR′，叠氮基如-N3，氰基，卤素，三烷基或三烷基鏻、氨基酸衍生基团。优选地，W和W’相同或不同并是OH、Ome、Oet、NHCONH2、SMe；。
因此式(XIII)的化合物可以被认为是溶剂化物，在溶剂是水时包含水；这些溶剂化物可以是特别有用的。
在优选的实施方式中，本发明的茅屋霉素衍生物选自下列：
·8，8′-[1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300611
-5-酮]
·8，8′-[5-甲氧基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300612
-5-酮]
·8，8′-[1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300613
-5-酮]
·8，8′-[1，4-亚丁基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300614
-5-酮]
·8，8′-[3-甲基-1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300615
-5-酮]
·8，8′-[2，6-亚吡啶基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300616
-5-酮]
·8，8′-[4-(3-叔丁氧羰基氨基丙氧基)-2，6-亚吡啶基双-(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300617
-5-酮]
·8，8′-[5-(3-氨基丙氧基)-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300618
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-3-叔丁氧羰基氨基丙基)-1，3-亚苯基双-(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300619
-5-酮]
·8，8′-{5-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)丙氧基]-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)}-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A200780038983006110
-5-酮]
·8，8′-[5-乙酰基硫代甲基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A200780038983006111
-5-酮]
·双-{2-[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-5-氧代-1，3，，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A200780038983006112
-8-基氧基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯
·8，8′-[3-(2-乙酰基硫代乙基)-1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300621
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300622
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300623
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-亚苯基(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300624
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-亚苯基(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300625
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-(4-巯基-4-甲基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300627
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(4-(4-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300629
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A200780038983006210
-5-酮]
·8，8′-[(1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300631
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300632
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300633
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300634
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300635
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300636
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[甲基(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(1-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A20078003898300639
-5-酮]
以及相应的巯基衍生物或它们药物上可以接受的盐、水合物或水合物盐或者这些化合物的多形态晶体结构或它们光学异构体、外消旋物、非对映异构体和对映异构体。
优选的化合物是下列式表示的：
Figure A20078003898300641
其中X、X’、A、A’、Y、Y’、T、n、n’是如上所定义的。
可以根据本领域技术人员公知的许多方法制备式(XII)的化合物。可以通过采用或改变下面所描述的方法或本领域技术人员能够理解的其变化而合成这些化合物。适当的修饰和替代对于本领域技术人员是容易明白的、公知的或者通过科技文献是容易获得的。特别的，这些方法可以在R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，Wiley-VCH Publishers，1999中发现。
可以用于本发明的合成茅屋霉素衍生物的方法被描述在国际申请No.PCT/IB2007/000142中。可以通过多种合成路线制备本发明的化合物。试剂和原材料是商业上可以获得的，或者容易被本领域技术人员通过公知的技术合成的(参见例如WO 00/12508，WO 00/12507，W02005/040170，WO 2005/085260，FR1516743，M.Mori等人，1986，Tetrahedron，42：3793-3806)。
可以使用任何技术形成本发明的缀合物分子。本发明的茅屋霉素衍生物可以通过酸不稳定的连接物或光不稳定的连接物连接到抗体或其他细胞结合剂。这些衍生物可以与具有适当序列的肽缩合，并接着连接到细胞结合剂以生产肽酶不稳定的连接物。这些缀合物可以被制备成含有伯羟基(其可以被琥珀酰基化)，以产生可以被细胞内酯酶切割以释放自由衍生物的缀合物。优选地，这些衍生物被合成为含有自由或被保护的巯基基团，接着含有一个或者多个二硫化物或硫醇的衍生物可以被通过二硫键或硫醚键共价连接到细胞结合剂上。
在USP 5,416,064和USP 5,475,092中教导了许多缀合方法。茅屋霉素衍生物可以被修饰成产生游离氨基，接着通过酸不稳定的连接物或光不稳定的连接物连接到抗体或其他细胞结合剂。具有自由氨基或羧基的茅屋霉素衍生物可以与肽缩合，接着连接到细胞结合剂以生产肽酶不稳定的连接物。在连接物上具有自由羟基的茅屋霉素衍生物可以被琥珀酰基化，并连接到细胞结合剂以产生可以被细胞内酯酶切割以释放自由药物的缀合物。最优选地，对茅屋霉素衍生物进行处理以形成自由或被保护的巯基基团，接着将含有二硫化物-或硫醇的茅屋霉素二聚体通过二硫键连接到细胞结合剂。
优选地，单克隆抗体-或细胞结合剂-茅屋霉素衍生物缀合物是上面所讨论的通过二硫键连接的那些，其能够释放茅屋霉素衍生物。这些细胞结合缀合物是通过已知的方法制备的，例如通过使用琥珀酰亚胺基吡啶基-二硫代丙酸酯(SPDP)修饰单克隆抗体(Carlsson等人，1978，Biochem.J.，173：723-737)。接着通过使用含有硫醇的茅屋霉素衍生物处理将所得到的硫代吡啶基置换以产生二硫化物连接的缀合物。可替代地，在芳基二硫基-茅屋霉素衍生物的情况中，细胞结合缀合物的形成是通过直接将茅屋霉素衍生物的芳基-硫醇替代为之前引入到抗体分子的巯基而实现的。通过每种方法都容易制备含有通过二硫桥连接的1～10个茅屋霉素衍生物药物的缀合物。
更具体的，在含有2mM EDTA的0.05M pH 7.5磷酸钾缓冲液中浓度为2.5mg/ml的二硫代-硝基吡啶基修饰的抗体溶液被含有硫醇的茅屋霉素衍生物处理(1.3摩尔当量/二硫代吡啶基)。通过分光光度计在325nm监控从经修饰的抗体释放硫代硝基吡啶，并在大约16小时内完成。通过凝胶过滤通过Sephadex G-25或Sephacryl S300柱而对抗体-茅屋霉素衍生物进行纯化并且不含未处理的药物和其他低分子量材料。每个抗体分子结合的茅屋霉素衍生物部的数目可以被通过测量230nm和275nm的吸光度值比例而测定。通过该方法可以通过二硫键连接平均1-10茅屋霉素衍生物分子/抗体分子。
可以通过之前Liu等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93：8618-8623所描述的方法测定缀合物对针对表达抗原的细胞的结合亲和力的影响。根据在Goldmacher等人，1985，J.Immunol.，135：3648-3651中所描述的，可以通过细胞增殖曲线的反推法(back-extrapolation)测定茅屋霉素衍生物和它们抗体缀合物对细胞系的细胞毒性。根据在Goldmacher等人，1986，J.Cell Biol.，102：1312-1319中所描述的可以通过集落产生检验测定这些化合物对附着细胞系的细胞毒性。
来普霉素衍生物
本发明的细胞毒性剂还可以是来普霉素衍生物。根据本发明，“来普霉素衍生物”指在Kalesse等人(2002，Synthesis 8：981-1003)中所定义的来普霉素家族的成员，并且包括：来普霉素如来普霉素A和来普霉素B，Callystatins，Ratjadone如Ratjadone A和Ratjadone B，Anguinomycin如Anguinomycin A、B、C、D，春雷霉素(Kasusamycin)、Leptolstatin、Leptofuranin如Leptofuranin A、B、C、D。来普霉素A和B的衍生物是优选的。
更具体的，本发明的衍生物是式(I)表示的：
其中
Ra和Ra′是H或-Alk；优选地，Ra是-Alk，优选甲基，Ra′是H；
R17是烷基，所述烷基任选被OR、CN、NRR′、全氟烷基取代；优选R17是烷基，更优选是甲基或乙基；
R9是烷基，所述烷基任选被OR、CN、NRR′、全氟烷基取代；优选R9是烷基，更优选是甲基；
X是-O-或-NR-；优选地，X是-NR-；
Y是-U-、-NR-U-、-O-U-、-NR-CO-U-、-U-NR-CO-、-U-CO-、-CO-U-；
优选地，当X是-O-时，Y是-U-、-NR-U-、-U-NR-CO-；
其中U  选自直链或支链-Alk-、-Alk(OCH2CH2)m-、-(OCH2CH2)m-Alk-、-Alk(OCH2CH2)m-Alk-、-(OCH2CH2)m-、-环烷基-、-杂环-、-环烷基-Alk-、-Alk-环烷基-、-杂环-Alk-、-Alk-杂环-；
其中m是选自1～2000的整数；
优选地，U是直链或支链-Alk-，
Z是-Alk-；
n是0或1；优选地，n是0；
T代表H，硫醇保护基团例如Ac，R1或SR1，其中R1代表H、甲基、烷基、环烷基，任选地被取代的芳基或杂环，或T代表
Figure A20078003898300671
其中
Ra、Ra′、R17、R9、X、Y、Z、n是如上定义的；
优选地，T是H或SR1，其中R1代表烷基，更优选甲基；
R、R′相同或不同且为H或烷基；
Alk代表直链或支链烷基；优选烷基代表(-(CH2-q(CH3)q)p-，其中p代表1～10的整数；q代表0～2的整数；优选地，Alk代表-(CH2)-或-C(CH3)2-。
或者它们的药物上可以接受的盐、水合物或水合物盐、或者这些化合物的多形态晶体结构或它们光学异构体、外消旋物、非对映异构体和对映异构体。
优选的化合物可以选自：
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基硫基-乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸]的双-[(2-巯基乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基二硫基-乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-2-甲基-丙基)-酰胺
或者它们的药物上可以接受的盐、水合物或水合物盐、或者这些化合物的多形态晶体结构或它们光学异构体、外消旋物、非对映异构体和对映异构体。
为了将衍生物连接到细胞结合剂上，衍生物必须包含能够允许将该衍生物通过键连接到细胞结合剂的部分(连接基团)，其中所述键例如二硫键、硫键(或本文中称作硫醚)、酸不稳定的基团、光不稳定的基团或酯酶不稳定的基团。这些衍生物被制备成它们含有将来普霉素衍生物连接到细胞结合剂所必要的部分，例如通过二硫键、硫醚键、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团或酯酶不稳定的基团。为了进一步增强在水溶液中的溶解度，连接基团可以含有聚乙二醇间隔物。优选地，使用硫键或二硫键，因为靶细胞的还原环境会引起硫键或二硫化物的切割，并释放具有相关细胞毒性提高的衍生物。
可以通过多种合成路线制备本发明的化合物。试剂和原材料是商业上可以获得的，或者容易被本领域技术人员通过公知的技术合成的。用于合成可以用于本发明细胞毒性缀合物的来普霉素衍生物的方法以及用于将所述来普霉素衍生物缀合到细胞结合剂如抗体的方法被详细描述在欧洲专利申请No.06290948.6中，通过参照将其内容并入本文。
CC-1065类似物
在根据本发明的细胞毒性缀合物中所使用的细胞毒性剂也可以是CC-1065或其衍生物。
CC-1065是有效的抗-肿瘤抗生素，其是从链霉菌(Streptomyceszelensis)的培养液分离的。CC-1065在体外的效力是通常使用的抗癌药物如阿霉素、氨甲蝶呤和长春新碱的大约1000倍(B.K.Bhuyan等人，1982，Cancer Res.，42，3532-3537)。CC-1065及其类似物被公开在美国专利No.6,372,738、6,340,701、5,846,545和5,585,499中。
CC-1065的细胞毒性效力与其烷基化能力及其DNA-结合或DNA-***活性相关。这两种活性位于分子的不同部分。因此，烷基化活性包含在环丙基吡咯并吲哚(pyrroloindole)(CPI)亚基中，DNA-结合活性位于两个吡咯并吲哚亚基中。
尽管CC-1065在治疗用途中作为细胞毒性剂具有某些吸引人的特征，但其在治疗用途中有限制。将CC-1065给药给小鼠造成延迟的肝中毒，这导致在单次静脉剂量12.5μg/kg之后第50天死亡(V.L.Reynolds等人，1986，J.Antibiotics，XXIX：319-334)。这已经激发试图开发不会造成延迟毒性的类似物，以CC-1065为模型合成简单的类似物已经被描述(M.A.Warpehoski等人，1988，J.Med.Chem.，31：590-603)。
在另一系列类似物中，CPI部被替换为环丙苯并吲哚(CBI)部分(D.L.Boger等人，1990，J.Org.Chem.，55：5823-5833；D.L.Boger等人，1991，BioOrg.Med.Chem.Lett.，1：115-120)。这些化合物保持亲代药物的高体外效力，而没有在小鼠中引起延迟毒性。与CC-1065类似，这些化合物是烷基化剂，其以共价模式结合到DNA的小沟引起细胞死亡。然而对最有前途的类似物阿多来新(Adozelesin)和卡折来新(Carzelesin)的临床评估得到了令人失望的结果(B.F.Foster等人，1996，Investigational New Drugs，13：321-326；I.Wolff等人，1996，Clin.Cancer Res.，2：1717-1723)。这些药物显示治疗效果差，因为它们***毒性高。
通过经靶向递送到肿瘤位点改变体内分布引起对非靶组织的低毒性进而***毒性低，能够大大提高CC-1065类似物的治疗效力。为了达到该目标，CC-1065的类似物和衍生物与特异性靶向肿瘤细胞的细胞结合剂的缀合物已经被描述(美国专利5,475,092；5,585,499；5,846,545)。通常这些缀合物显示了体外的高靶特异性细胞毒性，以及在小鼠的人肿瘤异种移植物模型中表现出杰出的抗肿瘤活性(R.V.J.Chari等人，1995，Cancer Res.，55：4079-4084)。
最近已经描述了在水介质中溶解度增强的CC-1065类似物的前药(欧洲专利申请No.06290379.4).在这些前药中，分子的烷基化部分的酚基被官能团保护，该官能团使得药物在酸性水溶液中保存后仍稳定，并且为药物提供了与未保护的类似物相比提高的水溶性。保护基在体内生理pH下容易被切割以提供相应的活性药物。在EP 06290379.4中所描述的前药中，酚取代基被保护为含有磺酸的氨基甲酸苯酯，其在生理pH下具有电荷，因此具有增强的水溶性。为了进一步增强水溶性，可以将任选的聚乙二醇间隔物引入到吲哚亚基和可切割键如二硫化物基团之间的连接物中。这种间隔物的引入不会改变药物的效力。
合成可以用于本发明细胞毒性缀合物的CC-1065类似物的方法以及用于将这些类似物缀合到细胞结合剂例如抗体的方法被详细描述在EP 06290379.4(通过参照将其内容并入本文)和美国专利No.5,475,092、5,846,545、5,585,499、6,534,660和6,586,618以及美国申请No.10/116,053和10/265,452中。
其他药物
药物例如氨甲蝶呤、柔毛霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、瘤可宁、卡奇霉素(calicheamicin)、tubulysin和tubulysin类似物，duocarmycin和duocarmycin类似物、海兔毒素(dolastatin)和海兔毒素类似物也适于制备本发明的缀合物。药物分子也可以通过中间物载体分子例如血清白蛋白连接到抗体分子。Doxarubicin和Danorubicin类似物被描述在例如美国系列号09/740991也可以是有用的细胞毒性剂。
治疗组合物
本发明涉及治疗组合物用于治疗哺乳动物中过度增殖(hyperproliferative)异常或炎性疾病或自体免疫疾病，该组合物包含治疗有效量的本发明的化合物和药物上可以接受的载体。在一个实施方式中，所述药物用于治疗癌症，包括(但不限于)下列：癌，包括膀胱癌、乳癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、***、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞片状细胞癌；淋巴谱系的造血***肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)；骨髓谱系的造血***肿瘤，包括急性和慢性骨髓型白血病和前髓细胞肿瘤；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其他肿瘤，包括黑色素瘤、***瘤、tetratocarcinoma、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢神经***和外周神经***的肿瘤，包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和施旺细胞瘤；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、***瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌和其他被测定为主导表达CD38的癌症。在优选的实施方式中，本发明的药物组合物用于治疗CD38被表达的癌症，例如非何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、多毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病或急性淋巴细胞白血病，以及其他被测定为主导表达CD38的癌症。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物可以用于治疗自体免疫疾病，例如***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′sthyroiditis)、强直性脊柱炎、丙型肝炎相关冷球蛋白血症血管炎、慢性局灶脑炎、大疱性类天疱疮、甲型血友病、膜性增生性肾小球肾炎、肖格伦氏综合症(Sjogren′s syndrome)、成人和少年型皮肌炎、成人多肌炎、慢性荨麻疹、夏科氏肝硬变(primary biliary cirrhosis)、特发性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、格雷夫氏甲状腺机能障碍性疾病(Graves′dysthyroid disease)、大疱性类天疱疮、膜性增生性肾小球肾炎、许尔-斯特劳斯综合症(Churg-Strauss syndrome)和哮喘。在另一个实施方式中，所述药物组合物涉及其他异常，例如移植排异，例如肾移植排异、肝移植排异、肺移植排异、心脏移植排异和骨髓移植排异；移植物抗宿主病；病毒感染，如mV感染、HIV感染、AIDS等；和寄生虫感染，如贾第虫病、阿米巴病、血吸虫病以及其他本领域技术人员确定的。
本发明提供了药物组合物，其包含：
·有效量的本发明抗体、抗体片段或抗体缀合物，以及
·药物上可以接受的载体，其可以是惰性的或者生理活性的。
本文所使用的“药物上可以接受的载体”包括任何和所有生理上兼容的溶剂、分散液介质、涂覆剂、抗菌剂和抗真菌剂等。适当的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等的一种或者多种及其组合。在许多情况中，优选组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇或氯化钠。特别地，适当载体的相关实施例包括(1)Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水，pH～7.4，其含有或者不含有大约1mg/ml～25mg/ml的人血清白蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))和(3)5％(w/v)葡萄糖；并且还可以含有抗氧化剂，例如色胺和稳定剂，例如吐温20。
如果对于特定治疗的必要，本文的组合物还可以进一步含有治疗剂。优选，本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物以及补充活性化合物将具有补充活性，其不会相互有不利影响。在优选的实施方式中，进一步的治疗剂是表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂，或者表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的受体(包括HER2受体、HER3受体、c-MET和其他受体酪氨酸激酶)的拮抗剂。在优选的实施方式，进一步的治疗剂是针对分化簇(CD)抗原的制剂，其中所述CD包括CD3、CD14、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD36、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138和CD152。在优选的实施方式中，进一步的治疗剂是化疗或免疫调节剂。
本发明的组合物可以是各种形式的。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，但优选的形式依赖于所期冀的给药模式和治疗应用。典型的优选组合物是可注射或可灌注溶液的形式。优选的给药模式是肠胃外(例如静脉内、肌内、腹膜内、皮下)。在优选的实施方式中，本发明的组合物被作为快速浓注(bolus)静脉内给药，或者通过持续灌注一段时间静脉内给药。在另一个优选的实施方式中，可以通过肌内、皮下、关节内、肿瘤内、肿瘤周、损伤内、损伤周路线，以提供局部以及***性治疗效果。
能够通过将所需量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物加入到适当的溶剂中，接着通过微过滤进行灭菌而制备用于肠胃外给药的无菌组合物。作为溶剂或载体，可以使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。在许多情况中，优选组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇或氯化钠。这些组合物还可以含有佐剂，特别是湿润剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。用于肠胃外给药的无菌组合物也可以制备成无菌固体组合物的形式，其可以在使用时溶解在无菌水或其他可注射无菌介质中。
本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物也可以口服给药。作为口服给药的固体组合物，可以使用药片、药丸、粉末(明胶胶囊、香囊(sachet))或颗粒。在这些组合物中，本发明的活性成分与一种或者多种惰性稀释剂例如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅在氩气流下混合。这些组合物还可以包含稀释剂以外的物质，例如一种或者多种润滑剂，例如硬脂酸镁或云母、着色剂、涂覆剂(糖衣药片)或薄膜(glaze)。
作为口服给药的液体组合物，可以使用药物上可以接受的溶液、悬浮液、乳化液、糖浆、酏剂，其含有惰性稀释剂例如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油。这些组合物可以包含稀释剂以外的物质，例如湿润剂、甜味剂、增稠剂、调味剂或稳定剂产品。
剂量依赖于期望的效果、治疗持续时间和所使用的给药路线；通常对于成人它们在每日5mg和1000mg之间，单位剂量在1mg～250mg活性物质的范围内。通常，医生将根据待治疗的个体的年龄、体重和其他具体的因素确定适当的剂量。
治疗应用方法
在另一个实施方式中，本发明提供了一种杀死CD38+细胞的方法，其通过为有此需要的患者给药抗体，所述抗体结合所述CD38，并且能够通过凋亡、ADCC和/或CDC杀死所述CD38+细胞。治疗上可以使用任何类型的本发明的抗体、抗体片段或细胞毒性缀合物。因此，本发明包括了抗-CD38单克隆抗体、其片段或或细胞毒性缀合物作为药物的用途。
在优选的实施方式中，本发明的抗体、抗体片段或细胞毒性缀合物被用于治疗哺乳动物的增殖过度(hyperproliferative)异常或炎性疾病或自体免疫疾病。在更优选的实施方式中，上面所公开的含有本发明抗体、抗体片段或细胞毒性缀合物的药物组合物之一被用于治疗哺乳动物的增殖过度(hyperproliferative)异常。在一个实施方式中所述异常是癌症。特别地，癌症是转移癌。
因此，本发明的药物组合物可以用于治疗或防止多种癌症，其包括(但不限于)下列：癌，包括膀胱癌、乳癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、***、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞片状细胞癌；淋巴谱系的造血***肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)；骨髓谱系的造血***肿瘤，包括急性和慢性骨髓型白血病和前髓细胞肿瘤；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其他肿瘤，包括黑色素瘤、***瘤、tetratocarcinoma、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢神经***和外周神经***的肿瘤，包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和施旺细胞瘤；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、***瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌和其他被测定为主导表达CD38的癌症。优选，所述异常是CD38被表达的NHL、BL、MM、B-CLL、ALL、TCL、AML、HCL、HL或CML，以及其他被测定为主导表达CD38的癌症。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物可以用于治疗自体免疫疾病，例如***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、强直性脊柱炎、丙型肝炎相关冷球蛋白血症血管炎、慢性局灶脑炎、大疱性类天疱疮、甲型血友病、膜性增生性肾小球肾炎、肖格伦氏综合症(Sjogren′s syndrome)、成人和少年型皮肌炎、成人多肌炎、慢性荨麻疹、夏科氏肝硬变(primary biliarycirrhosis)、特发性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、格雷夫氏甲状腺机能障碍性疾病(Graves′dysthyroid disease)、大疱性类天疱疮、膜性增生性肾小球肾炎、许尔-斯特劳斯综合症(Churg-Strauss syndrome)和哮喘。在另一个实施方式中，所述药物组合物涉及其他异常，例如移植排异，例如肾移植排异、肝移植排异、肺移植排异、心脏移植排异和骨髓移植排异；移植物抗宿主病；病毒感染，如mV感染、HIV感染、AIDS等；和寄生虫感染，如贾第虫病、阿米巴病、血吸虫病以及其他本领域技术人员确定的。
类似地，本发明提供了抑制选定细胞群生长的方法，其包括将靶细胞或含有靶细胞的组织与有效量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物或者包含细胞毒性缀合物的抗体、抗体片段或治疗剂接触，单独或联合其他细胞毒性或治疗剂接触。在优选的实施方式中，进一步的治疗剂是表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂，或者表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的受体(包括HER2受体、HER3受体、c-MET和其他受体酪氨酸激酶)的拮抗剂。在优选的实施方式，进一步的治疗剂是针对分化簇(CD)抗原的制剂，其中所述CD包括CD3、CD14、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD36、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138和CD152的抗体。在优选的实施方式中，进一步的治疗剂是化疗或免疫调节剂。
可以在体外、体内或先体外后体内实施抑制选定细胞群生长的方法。本文所使用的“抑制生长”的意思是在短时间或长时间内使细胞的生长变慢，降低细胞活力，造成细胞死亡，裂解细胞和诱导细胞死亡。
体外应用的例子包括在移植到相同患者之前处理自体骨髓，以杀死患病的或恶性细胞；在移植之前处理骨髓以杀死活性T细胞病并防止移植物抗宿主病(GVHD)；处理细胞培养物以杀死除了期望的不表达目标抗原的变体外的全部细胞；或者杀死表达不期望抗原的变体。
非临床体外应用的条件容易被本领域技术人员确定。
临床的先体外后体内的应用是在癌症治疗或自体免疫疾病的治疗中在自体移植之前从骨髓除去肿瘤细胞或淋巴细胞，或者在移植之前从自体或异源骨髓或组织中除去T细胞和其他淋巴细胞，以防止移植物抗宿主病(GVHD)。如下进行处理。从患者或其他个体收获骨髓，接着孵育在含有血清的介质中，其中向介质中加入本发明的细胞毒性剂。浓度在大约10μM～1pM的范围内，在大约37℃下持续大约30分钟～大约48小时。本领域技术人员容易确定精确的浓度条件和孵育时间，即剂量。在孵育后，使用含有血清的介质清洗骨髓细胞，并根据已知的方法通过i.v.灌注返回到患者。在收获骨髓和重新灌注经处理的细胞之间的时间内，患者接受其他治疗例如常规化疗(ablativechemotherapy)或全身辐射的情况下，经处理的细胞被使用标准医学设备冷冻储藏在液氮中。
对于临床体内应用，本发明的抗体、表位结合抗体片段或细胞毒性缀合物将作为溶液提供，其被测试无菌性和内毒素水平。给药细胞毒性缀合物的适当规程的例子如下。每周作为i.v.丸药提供缀合物持续4周。丸药剂量是在50～100ml正常盐水中提供的，向该盐水中可以加入5～10ml人血清白蛋白。剂量将为每次给药i.v.10μg～100mg(每日100ng～1mg/kg的范围内)。更有选，剂量将在50μg～30mg的范围。最优选地，剂量将在1mg～20mg的范围内。治疗4周后，患者能够继续接受每周一次的治疗。关于给药路线、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等的具体临床规程能够被本领域技术人员根据临床状况许可来确定。
诊断
本发明的抗体或抗体片段也能够用于体外或体内检测生物样品中的CD38。在一个实施方式中，本发明的抗-CD38被用于测定组织或来自组织的细胞中CD38的水平。在优选的实施方式中，组织是患病组织。在方法的优选的实施方式中，组织是肿瘤或其活体样品。在方法的优选实施方式中，组织或其活体样品是首次从患者切离的，接着在利用本发明抗体或抗体片段的免疫检验中测定组织或活体样品中CD38的水平。在另一个实施方式中，在组织或其活体样品上测定CD38水平，该组织或其活体样品可以冷冻或固定。相同的方法可以用于测定CD38蛋白的其他性质，例如其细胞表面水平或细胞定位。
上述方法可以用于诊断已知或怀疑患有癌症的个体中的癌症，其中所述患者中所测量的CD38水平与正常参照对象或标准进行比较。接着，所述方法可以用于测定是否肿瘤表达CD38，这可以暗示肿瘤对利用本发明抗体、抗体片段或抗体缀合物的治疗充分应答。优选，所述肿瘤是CD38被表达的NHL、BL、MM、B-CLL、ALL、TCL、AML、HCL、HL或CML，以及其他被测定为主导表达CD38的癌症。
本发明还提供了单克隆抗体、人源化抗体和其表位结合片段，其被进一步标记以用于研究或诊断应用中。在优选的实施方式中，标记为放射性标记、荧光团、发光团、成像剂或金属离子。
还提供了用于诊断的方法，其中所述标记的抗体或其表位结合片段被给药给怀疑患有癌症的个体，并且测量或监控个体体内标记的分布。
试剂盒
本发明还包括试剂盒，例如包含所描述的细胞毒性缀合物和使用该细胞毒性缀合物杀死特定细胞类型的说明书。说明书可以包括体外、体内或先体外后体内使用细胞毒性缀合物的指导。
典型的，试剂盒将具有含有细胞毒性缀合物的隔间。细胞毒性缀合物可以是冻干形式、液体形式或其他适于包含在试剂盒中的形式。试剂盒还可以含有实施试剂盒的说明书中所描述方法需要的其他成分，例如用于重建冻干粉末的无菌溶液，用于在为患者给药之前与细胞毒性缀合物组合的其他试剂，以及辅助为患者给药缀合物的工具。
实施例
通过参考下面的实施例对本发明进行描述，其仅仅是说明性的，而不是为了限制本发明。
实施例1
小鼠CD38抗体
将稳定表达高水平人CD38的300-19细胞(来自Balb/c小鼠(M.G.Reth等人，1985，Nature，317：353-355的pre-B细胞系)用于对Balb/cVAF小鼠进行免疫。使用每2-3周每只小鼠大约5×106个表达CD38的300-19细胞通过ImmunoGen，Inc.所使用的标准免疫规程对小鼠进行皮下免疫。在处死用于产生杂交瘤之前，使用另一剂量的抗原对免疫的小鼠进行加强3天。根据标准动物规程从小鼠收集脾，并在两片无菌和毛面显微镜玻片之间磨碎，以获得RPMI-1640培养基中的单细胞悬浮液。将脾细胞沉淀、清洗并与通过使用聚乙二醇-1500(Roche 783641)与鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653细胞融合(J.F.Kearney等人，1979，J Immunol，123：1548-1550)。将所融合的细胞重悬浮在含有次黄嘌呤-氨喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)(Sigma H-0262)的RPMI-1640选择培养基中，并在37℃下(5％CO2)在96孔平底培养板中进行选择培养(Corning-Costar 3596，每孔200μL细胞悬浮液)。孵育5天后，从每个孔取出100μL培养上清液，并置换为100μL含有次黄嘌呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HT)补充物(Sigma H-0137)的RPMI-1640培养基。继续在37℃下(5％CO2)孵育，直到杂交瘤克隆备好进行抗体筛选。还可以使用其他的免疫和生产杂交瘤的技术，其包括在J.Langone和H.Vunakis(Eds.，Methods in Enzymology，Vol.121，″ImmunochemicalTechniques，Part I″；Academic Press，Florida)以及E.Harlow和D.Lane(″Antibodies：A Laboratory Manual″；1988；Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)中所描述的。
通过利用Becton Dickinson FACSCalibur或FACSArray设备的荧光激活细胞分选(FACS)，对来自杂交瘤的培养上清(使用FITC或PE-偶联的抗-小鼠IgG抗血清)进行筛选小鼠单克隆抗体的分泌，其中所述单克隆抗体结合表达CD38的300-19细胞，而不结合亲代300-19细胞。将经测试为阳性的杂交瘤克隆进行亚克隆，使用商业同种型分型试剂(Roche 1493027)对每种分泌的抗-CD38抗体进行同种型的鉴定。通过蛋白质A或G层析使用标准的规程纯化了对CD38结合为阳性的总共29种抗体，接着进一步进行鉴定。
实施例2
抗-CD38抗体的结合表征
图1显示了FACS直方图，其证明抗-CD38抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39与表达CD38的300-19细胞结合，而不与亲代300-19细胞结合。将38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39抗体(10nM)与表达CD38的300-19细胞或亲代300-19细胞(每个样品1-2×105个细胞)在100μL冰冷的补充2％正常山羊血清的RPM1-1640培养基中孵育3小时。接着将细胞沉淀、清洗并与FITC-偶联的山羊抗小鼠IgG-抗体在冰上孵育1小时(JacksonLaboratory，100μL，6μg/mL，在补充2％正常山羊血清的RPMI-1640培养基中)。再次沉淀细胞，清洗，重悬浮在200μL含有1％甲醛的PBS中，并使用FACSCalibur流式细胞仪利用CellQuest软件(BD Biosciences)进行分析。
与对应的阴性对照(仅与FITC-偶联的山羊抗-小鼠IgG-抗体孵育的细胞)相比，与38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39孵育的表达CD38的300-19细胞的FACS直方图显示强荧光移动(附图1)。同样，在将亲代300-19细胞与任何这些抗体孵育时，没有检测到显著的荧光移动。在使用阳性对照抗-CD38抗体AT13/5(Serotec，MCA1019)时获得了类似的结果。
在将Ramos(ATGC CRL 1596)淋巴瘤细胞与38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39孵育时也观察到了强荧光移动(图1)。从图2中所示FACS分析曲线评估8SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39与Ramos细胞结合的表观解离常数(KD)，其对S形曲线剂量应答曲线使用非线性回归方法(GraphPad Prizm，版本4，软件，San Diego，CA)。数值分别如下：0.10nM、0.10nM、0.12nM、0.16nM、0.11nM和3.03nM。
实施例3
38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗体诱 导Ramos和Daudi淋巴瘤细胞的凋亡
抗-CD38抗体38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39诱导Ramos和Daudi(ATCC CCL-213)淋巴瘤细胞系和MOLP-8多发性骨髓瘤细胞系(DSMZ ACC 569)的凋亡。在使用膜联蛋白V的FITC偶联物(Biosource PHN1018)以及使用TO-PRO-3(Invitrogen T3605)染色后通过FACS分析测量凋亡的程度。膜联蛋白V结合完整细胞的细胞膜双层外部的磷脂酰丝氨酸而不是内部上的磷脂酰丝氨酸。在健康的正常细胞中，磷脂酰丝氨酸表达在膜双层的内部，而磷脂酰丝氨酸从内部转变为质膜的外部叶(leaflet)是能够检测到的诱导凋亡的最早信号之一。因此，膜联蛋白V是诱导凋亡的信号。TO-PRO-3是单体花青核酸染料，其仅能够在凋亡较后期所发生的膜完整性被破坏时而渗入质膜。
将指数生长中的细胞在RMPI-1640培养基中以大约2×105个细胞/mL接种在24孔板中，该RMPI-1640培养基被补充了10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和50μg/mL庆大霉素(下面称作完全RMPI-1640培养基)。除非以其它方式说明，通常将细胞培养在完全RMPI-1640培养基中。将细胞在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中与抗-CD38抗体(10nM)孵育24小时。接着将细胞沉淀，并使用500μLPBS清洗两次，重悬浮在含有5μL膜联蛋白V-FITC的100μL结合缓冲液中(在膜联蛋白V-FITC试剂盒中提供)，并在冰上孵育15分钟。接着，向混合物中加入400μL结合缓冲液和TO-PR O-3(达到1μM的终浓度)，并立即通过FACS测量FITC和TO-PRO-3细胞相关的荧光。为每个样品收集4000个事件(events)。使用CellQuest软件产生TO-PRO-3(FL4-H；y-轴)荧光和膜联蛋白V-FITC(FL1-H；x-轴)荧光的点图。
结果显示在图3和4中。图3提供了在与各种抗-CD38抗体孵育24小时后Daudi细胞的点图。从这些图测定来自两份样品的膜联蛋白V-阳性细胞(包括TO-PRO-3阳性和阴性细胞)的平均百分比，并显示在图4中。出乎意料地，38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39显示了强凋亡活性。暴露到任何这些抗体的Daudi细胞中30％以上都是膜联蛋白V阳性的，而未处理细胞仅为大约6％(图3和4A)。38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39是以相同10nM浓度测试的现有技术鼠CD38抗体(AT13/5，OKT10，IB4，以及SUN-4B7，在减去未处理对照值后为低于10％膜联蛋白V-阳性)以及两种我们实验室所产生的其他抗-CD38抗体(38SB7和38SB23，不高于未处理的对照，即大约6％膜联蛋白V-阳性)所测试凋亡活性的至少2.4倍(减去未处理对照值后为24％)(图4A)。AT13/5是从Serotec(MCA1019)购买的，OKT10是从杂交瘤(ATCC CRL-8022)产生和纯化的。IB4和SUN-4B7是Prof.F.Malavasi，University of Turin，Italy惠赠的。类似地，38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗-CD38抗体展示了是现有技术鼠CD38抗体，AT13/5，OKT10，IB4和SUN-4B7或另外两种新抗-CD38抗体38SB7和38SB23(在减去未处理对照值为低于2％膜联蛋白V阳性)对另一种淋巴瘤细胞系Ramos的促凋亡活性的至少3.5倍(图4B)。最后，38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39抗-CD38抗体对多发性骨髓瘤细胞系MOLP-8展示强促凋亡活性(图4C)。大约50％被这些抗体处理的MOLP-8细胞是膜联蛋白V阳性的，而未处理的细胞为大约39％。相反，使用任何先有技术鼠CD38抗体，AT13/5，OKT10，iB4和SUN-4B7，或其他两种抗-CD38抗体38SB7和38SB23都没有导致凋亡细胞部分的提高。
实施例4
抗-CD38抗体38SB19抗体的轻链和重链的克隆和测序。
从产生38SB19抗体的杂交瘤制备RNA
使用Qiagen′s RNeasy miniprep试剂盒，从5×106个产生38SB19抗体的杂交瘤细胞获得总RNA。简言之，将5×106个细胞沉淀并重悬浮在350μL RLT缓冲液中(含有1％β-巯基乙醇)。
通过将悬浮液通过21.5规格针和注射器大概10-20次或者直到其不再粘性，对悬浮液进行匀浆。将乙醇(350μL的70％含水乙醇)加入到匀浆液，充分混合。将溶液转移到离心柱，置于2ml收集管中，并在＞8000xg下离心15秒钟。使用500μL RPE缓冲液对柱清洗两次，接着转移到新管中，并使用30μL无RNA酶的水中，离心1分钟。将洗脱液(30μL)放回株上进行第二次1分钟洗脱离心。使用水将一份30μL洗脱液稀释，并用于测量260nm处的UV吸收进行RNA定量。
使用反转录酶(RT)反应制备cDNA
使用Invitrogen′s Superscriptll试剂盒，从总RNA产生可变区38SB19抗体cDNA。密切遵循试剂盒规程，其利用最高达到来自Qianeasy微型制备的5μg总RNA。简言之，将RNA、1μL随机引物和1μL dNTP混合物使用无RNA酶无菌蒸馏水调至12μL，并在65℃下孵育5分钟。接着，将混合物置于冰上至少1分钟。接着，加入4μL5x反应缓冲液、2μL 0.1M DTT和1μL RNaseOUT，并将混合物在MJ研究型热循环仪(MJ research thermalcycler)中25℃下孵育2分钟。暂停热循环仪，以便能够加入1μL Superscriptll酶，接着重新启动在25℃下额外10分钟，之后转换成55℃50分钟。通过加热到70℃15分钟，并将反应热灭活，并通过加入1μL RNA酶H并在37℃下孵育20分钟，除去RNA。
简并PCR反应
对来自杂交瘤细胞的cDNA进行的第一轮简并PCR反应的程序是基于在Wang等人(2000)和Co等人(1992)中所描述的方法。这一轮的引物(表2)含有限制性位点以辅助克隆到pBluescriptll质粒中。
在冰上将PCR反应组分(表3)混合在薄壁PCR管中，接着转移到预热并暂停在94℃的MJ研究型热循环仪。使用如下得自Wang等人2000的程序进行这些反应：
名称：Wang45
94℃  3:00分钟
94℃  0:15秒
45℃  1:00分钟
72℃  2:00分钟
返回229次
72℃  6:00分钟
4℃   永久
结束
接着，在1％低熔点琼脂糖凝胶上运行PCR反应混合物，切出300～400bp带，使用Zymo DNA微型柱纯化，发送到Agencourt biosciences进行测序。将每种5’和3′PCR引物用作测序引物用于从两个方向得到38SB19可变区。
克隆5′末端序列
引用用于克隆38SB19可变区轻链和重链cDNA序列的简并引物改变了5′末端序列，因此需要额外的测序工作来破解完整的序列。将上述方法所得到的初步cDNA序列用于检索NCBI IgBlast位点(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)得到产生38SB19序列的鼠生殖系序列。PCR引物(表3)被涉及成与鼠抗体的前导序列(leader sequence)退火(anneal)，以便新的PCR反应能够产生完整的未被PCR引物改变的可变区cDNA。如上所述进行PCR反应、带纯化和测序。
肽分析进行序列确认
将可变区的cDNA序列信息与生殖系恒定区序列组合以获得全长抗体cDNA序列。接着计算重链和轻链的分子量，并与鼠38SB19抗体的LC/MS分析所获得的分子量进行比较。
表4给出了对38SB19 LC和HC，从cDNA序列计算的质量以及通过LC/MS测量的数值。对于38SB19轻链和重链，分子量测量与cDNA分析一致。
实施例5
hu38SB19抗体的重组表达
对hu38SB19的可变区序列进行密码子优化，并由Blue HeronBiotechnology进行合成。序列的两侧为限制性酶位点，用于与两个单条链和串联双链哺乳动物表达质粒中的各自恒定区序列符合阅读框地克隆。将轻链可变区克隆到ps38SB19LCZ v1.0与ps38SB19v1.00质粒的EcoRI和BsiWI位点中(图5A和5C)。将重链可变区克隆到ps38SB19LCZ v1.0与ps38SB19v1.00质粒的Hind III和Apa1位点(图5B和5C)。这些质粒可以用于以瞬时转染和稳定转染的方式在哺乳动物细胞中表达。将类似的表达载体构建体(construct)用于产生其他嵌合和人源化抗体。
使用来自BD bioscience的CaPO4试剂进行瞬时转染，以在HEK-293T细胞中表达hu38SB19。稍微对所提供的规程进行修改以增强表达产量。简言之，将2×106个HEK-293T细胞接种在10cm组织培养板上，其中在转染前24小时，将组织培养板涂覆聚乙烯亚胺(PEI)。通过使用PBS对细胞清洗，使用10mL具有1％ Ultra Low IgG FBS(Hyclone)的DMEM(Invitrogen)替换培养基。随着震荡，将溶液A(10μgDNA，86.8μL Ca2+溶液，并用H2O达到500μL)逐滴加入到溶液B中。将混合物在室温下孵育1分钟，并将1mL混合物逐滴加入到每个10cm板中。转染后大约16小时，将培养基替换为10mL具有1％ Ultra LowIgG FBS的新DMEM。大约24小时后，向每个10cm板加入2mM丁酸钠。4天后，收获转染物。
通过加入1/10体积的1M Tris/HCl缓冲液，pH 8.0，制备用于蛋白质A亲和层析的上清液。将经调节pH的上清液过滤通过0.22μm过滤膜，并上样到被结合缓冲液(PBS，pH 7.3)平衡的蛋白质A琼脂糖柱(HiTrap Protein A HP，1mL，Amersham Biosciences)。在样品上样过程中，将Q-Sepharose precolumn(10mL)连接到蛋白质A柱的上游以降低被细胞材料例如DNA的污染。在样品上样后，取出precolumn，并翻转蛋白质A柱反转进行清洗和洗脱。使用结合缓冲液清洗柱，知道在280nm没有吸收的稳定基线。使用含有0.15M NaCl，pH 2.8的0.1M醋酸缓冲液，以0.5mL/分钟的流速对抗体进行洗脱。收集大约0.25mL级分，并通过加入1/10体积1M Tris/HCI，pH 8.0而中和。对峰值级分对PBS进行过夜透析两次，并通过OD280处的吸收对纯化的抗体进行定量。也可以使用蛋白质G溶液以稍微不同的程序对人源化和嵌合抗体进行纯化。
以与上述类似的程序表达和纯化所有被描述的嵌合和人源化抗-CD38抗体。
实施例6
嵌合抗-CD38抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活 性
因为，之前某些抗-CD38抗体已经显示作为具有人IgG1恒定区的嵌合或人源化抗体具有ADCC和/或CDC活性(J.H.Ellis等人，1995，J Immunol，155：925-937；F.K.Stevenson等人，1991，Blood，77：1071-1079；WO 2005/103083)，因此制备了嵌合版本38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39(由鼠可变区和人IgG1/Igκ恒定区构成)，并测试了ADCC和/或CDC活性。首先对ch38SB13、ch38SB18、ch38SB19、ch38SB30、ch38SB31和ch38SB39测试ADCC，其使用Ramos细胞作为靶细胞，人自然杀死(NK)细胞作为效应细胞。使用乳酸盐脱氢酶(LDH)释放检验用于测量细胞裂解(R.L.Shields等人，2001，J Biol Chem，276：6591-6604)。
首先使用修改的NK Isolation Kit II(Miltenyi Biotech)规程，从人血(来自正常供体，从Research Blood Components，Inc.，Brighton，MA购买)分离NK细胞。将Hank′s平衡盐溶液(HBSS)将血液稀释2～3倍。将25mL稀释的血液仔细地在50mL圆锥管内的25mL Ficoll Paque上分层，并在19℃下400g离心45分钟。从界面收集外周血单核细胞(PBMC)，转移到新的50mL圆锥管中，使用HBSS清洗一次。将PBMC重悬浮在2mL NK分离缓冲液中，接着向细胞悬浮液中加入500μL生物素-抗体混合物(来自NK分离试剂盒，130-091-152，Miltenyi Biotech)。生物素-抗体混合物含有生物化抗体，其除了NK细胞外结合淋巴细胞。将混合物在4℃下孵育10分钟，接着加入1.5mL NK分离缓冲液(PBS，0.1％BSA，1mM EDTA)以及1mL抗-生物素微珠。在4℃下将细胞-抗体混合物再孵育15分钟。接着，使用50mL NK分离缓冲液将细胞清洗一次，接着重悬浮在3mL NK分离缓冲液中。接着，将MACS LS柱(MACS分离器，Miltenyi Biotech上)使用3mL NK分离缓冲液进行预清洗。接着，将细胞悬浮液应用到LS柱上。将洗脱液(具有未标记细胞的级分)收集到新的50mL锥形管中。使用3mLNK分离缓冲液清洗柱3次。将整个洗脱液收集到相同的管中，并使用50mL NK分离缓冲液清洗一次。将NK细胞接种到30mL补充了5％胎牛血清、50μg/mL庆大霉素的RPMI-1640中。
将补无0.1％BSA，20mM HEPES，pH 7.4和50μg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基(下面称作RHBP培养基)中的各种浓度的ch38SB13、ch38SB18、ch38SB19、ch38SB30、ch38SB31和ch38SB39抗体等分分配(50μL/孔)到圆底96孔板中。将Ramos靶细胞以106个细胞/mL重悬浮在RHBP培养基中，并加入到含有抗体稀释液的每个孔中(100μL/孔)。将含有靶细胞和抗体稀释液的板在37℃下孵育30分钟。接着向含有靶细胞的孔中加入NK(50μL/孔)，典型地以1个靶细胞：3～6个NK细胞的比例。将RHBP培养基(50μL/孔)加入到具有NK细胞的对照孔中。同样，将20μL Triton X-100溶液(RPMI-1640培养基，10％Triton X-100)加入到3个仅含有靶细胞而没有抗体的孔中，以测定可能最大的LDH释放。将混合物在37℃下孵育4小时，接着以1200rpm离心10分钟，并将100μL上清液仔细地转移到新平底96孔板。将来自Cytotoxicity Detection Kit(Roche 1 644 793)的LDH反应混合物(100μL/孔)加入到每个孔中，并在室温下孵育5～30分钟。在490nm下测量样品的光学密度(OD490)。通过将Trixon X-100处理的样品的OD490值设定为100％裂解，以及将未处理的仅含靶细胞的对照样品的OD490设定为0％裂解，而测定比裂解百分比。仅含有NK细胞的样品提供了可以忽略的OD490读数。
在使用Ramos靶细胞和NK效应细胞测试时，嵌合抗-CD38抗体显示了非常有效的ADCC活性(图6)。通过非线性回归方法利用S形曲线剂量应答曲线估计EC50值，发现如下：ch38SB13为0.0013μg/mL、ch38SB18为0.0013μg/mL、ch38SB19为0.0018μg/mL、ch38SB30为0.0022μg/mL、ch38SB31为0.0012μg/mL、ch38SB39为0.1132μg/mL。嵌合抗-CD38抗体还显示了对LP-1(DSMZ ACC 41)多发性骨髓瘤细胞的有效ADCC活性(EC50值：ch38SB18为0.00056μg/mL；ch38SB19为0.00034μg/mL；ch38SB31为0.00024μg/mL)(图7A)。ch38SB19还有效地通过ADCC杀死Daudi淋巴瘤细胞(图7B)、NALM-6B-ALL细胞(DSMZ ACC 128)(图8A)以及MOLT-4 T-ALL细胞(ATTC CRL-1582)(图8B)，这暗示具有不寻常有效凋亡活性的抗-CD38抗体对来自各种造血***恶性肿瘤的肿瘤细胞也具有有效的ADCC活性。同样，在相同的试验中，非结合IgG 1对照抗体(rituximab，Biogenldec)(图7A、8A和8B)或mu38SB19(图7B)没有显著的ADCC活性。
实施例7
嵌合抗-CD38抗体的CDC活性。
根据对(H.Gazzano-Santoro等人1997，J.Immunol Methods，202：163-171)进行修改的方法测量ch38SB13、ch38SB18、ch38SB19、ch38SB30、ch38SB31和ch38SB39的CDC活性。人补体是冻干的人补体血清(Sigma-Aldrich S1764)，根据制造商的说明，使用无菌纯化的水进行重建，接着在实验前立即使用RHBP培养基稀释五倍。将以106个细胞/mL悬浮在RHBP培养基中的靶细胞等份分配在平底96孔组织培养板的孔中(50μL/孔)。接着加入50μL RHBP培养基中各种浓度的抗-CD38抗体(10nM～0.001nM)(每个样品一种抗体)，接着加入50μL/孔的补体溶液。接着，将板在37℃下含有5％CO2的潮湿环境中孵育2小时，之后向每孔中加入50μL稀释在RHBP(10％终浓度)的40％Alamar Blue试剂(Biosource DAL1100)，以测量细胞的活力。AlamarBlue监控存活细胞的还原能力。在540/590nm测量荧光(以相对荧光单位，RFU)之前，将板在37℃下孵育5～18小时。通过首先从每个样品的RFU值减去背景RFU值(仅具有培养基而没有任何细胞的孔)而首先针对背景荧光矫正实验值，接着将矫正的RFU值除以未处理细胞样品的矫正值，对每个样品的比细胞活力百分比进行测定。
在使用终稀释浓度5％的人补体利用Raji-IMG细胞测试嵌合抗-CD38抗体样品的CDC活性时，嵌合抗-CD38抗体显示了非常有效的CDC活性(图9)。Raji-IMG是衍生自Raji细胞(ATCCCCL-86)的细胞，并且表达低水平的膜补体抑制剂CD55和CD59。从图8的S型曲线剂量应答曲线通过非线性回归法估计EC50值，结果如下：ch38SB13为0.005μg/mL、ch38SB18为0.0101μg/mL、ch38SB19为0.028μg/mL、ch38SB30为0.020μg/mL、ch38SB31为0.010μg/mL和ch38SB39为0.400μg/mL。嵌合抗-CD38抗体还显示针对LP-1多发性骨髓瘤细胞的有效CDC活性(EC50：ch38SB18为0.032μg/mL；ch38SB19为0.030μg/mL；ch38SB31为0.043μg/mL)，而非结合嵌合对照IgG1(rituximab，Biogenldec)没有任何CDC活性(图10)。在对Daudi淋巴瘤细胞测试嵌合CD38抗体时，不同的抗-CD38抗体的CDC活性不同(图11)。尽管在不存在补体时与1.25μg/mL  ch38SB19孵育后，Daudi细胞的比活力低于15％，但在存在补体时与ch38SB18或ch38SB39(1.25μg/mL或更高浓度)孵育之后，这些细胞的的比活力仅有少量降低(比活力分别为85％和91％)。同样，如果将Daudi细胞与1.25μg/mL或更高浓度的ch38SB13、ch38SB30和ch38SB31在存在补体时孵育，则观察到了Daudi细胞比活力的少量降低(比活力分别为65％、45％和53％)。
实施例8
人源化抗-CD38抗体的结合亲和力和凋亡、ADCC和CDC活性。
在利用Ramos细胞测试时，两种版本的人源化38SB19(hu38SB19v1.00和v1.20)以及嵌合38SB19显示了类似的结合亲和力，其KD值分别为0.23nM、0.25nM和0.18nM(图12A)。还在竞争结合检验中对嵌合和人源化38SB19抗体的结合亲和力进行比较，其他测量它们竞争结合生物素鼠38SB19抗体的能力。将生物素标记的鼠38SB19抗体(3×10-10M)与各种浓度的ch38SB19、hu38SB19 v1.00或hu38SB19 v1.20混合。将抗体混合物与Ramos细胞孵育，并利用FITC-偶联链霉素通过FACS分析测量与细胞结合的生物素化鼠38SB19的量。hu38SB19v1.00、hu38SB19 v1.20和ch38SB19同样地充分竞争结合生物素化38SB19(图12B)，再次说明结合亲和力不受到人源化的影响。在将ch38SB19、hu38SB19v1.00和hu38SB19 v1.20(10-8～10-11M)比较它们诱导Daudi细胞凋亡的能力时，它们显示了类似的凋亡活性(图13)。此外，hu38SB19 v1.00和v1.20还显示了与ch38SB19类似的在LP-1细胞中的ADCC(图14)，以及与ch38SB19在Raji-IMG和LP-1细胞中类似的CDC效力(图15)。hu38SB19 v1.00还显示了与ch38SB19在T细胞急性成淋巴细胞淋巴瘤细胞系DND-41(DSMZ 525)中的类似CDC活性(图15)。对hu38SB19 v1.00进一步测试了它们在多种细胞系组中诱导细胞凋亡的能力(图16)。利用hu38SB19 v1.00(10-8M)的处理导致在B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-8(DSMZ ACC 573)(未处理对照中的7％～hu38SB19-处理的细胞中的97％)以及NU-DUL-1(DSMZ ACC579)(未处理对照中的10％～hu38SB19-处理的细胞中的37％)以及T-ALL细胞系DND-41(未处理对照中的7％～hu38SB19-处理的细胞中的69％)中膜联蛋白V阳性细胞的显著提高。另外，利用hu38SB19v1.00(10-8M)处理，提高了B细胞淋巴细胞淋巴瘤细胞系JVM-13(DSMZ ACC 19)(未处理对照中的8％～hu38SB19处理的细胞中的17％)以及多毛细胞淋巴瘤细胞系HC-1(DSMZ ACC 301)(未处理对照中的6％～hu38SB19处理的细胞中的10％)中的膜联蛋白V阳性细胞部分。
类似的，在利用Ramos细胞测试时，两种版本的人源化38SB31(hu38SB31 v1.1和v1.2)以及嵌合38SB31显示了类似的结合亲和力，其中KD值分别为0.13nM、0.11nM和0.12nM。如上所述，在竞争结合检验中，还对嵌合和人源化38SB31抗体的结合亲和力进行比较，并充分等同地发挥作用。hu38SB31v1.1被进一步测试了它们在多种细胞系中诱导凋亡的能力。人源化抗体显示了与ch38SB31对Ramos、Daudi、Molp-8和SU-DHL-8细胞相似的凋亡活性。而且，hu38SB31 v1.1还显示了与ch38SB31在这些细胞系中类似的ADCC和CDC活性。
实施例9
38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39的体内 效力
在建立Ramos淋巴瘤细胞系的免疫缺陷小鼠(雌性CB.17 SCID)中的存活人异种移植肿瘤模型中研究38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31和38SB39的体内抗肿瘤活性。雌性CB.17SCID小鼠被通过侧面尾部静脉接种0.1ml无血清培养基中的2×106个Ramos细胞。接种肿瘤细胞后7天，根据体重，将小鼠随机分成7组。除了38SB31处理组具有6只小鼠，38SB39处理组具有8只小鼠外，每组具有10只小鼠。从接种细胞后第7天开始，在3个连续的星期中，每周两次，以40mg/kg的剂量为小鼠静脉提供抗体。如果后腿之一瘫痪或两条后腿都瘫痪，与预处理值相比体重损失超过20％，或者动物太不舒服而不能进食和进水，则将小鼠处死。与PBS-处理的小鼠相比，使用38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31或38SB39的处理显著地延长了小鼠的存活时间(图17)。PBS-处理的小鼠的中值存活时间是22天，而抗体处理的组为28～33天范围内。
进一步在免疫缺陷小鼠中的其他人异种移植肿瘤模型中研究了mu38SB19和hu38SB19的体内抗肿瘤活性。对于Daudi淋巴瘤存活模型，SCID小鼠被通过侧面尾部静脉接种0.1ml无血清培养基中的5×106个Daudi细胞。如上所述进行研究。与PBS处理的小鼠相比，使用mu38SB19或hu38SB19处理显著延长了小鼠的存活时间(图18)。PBS-处理的小鼠的中值存活时间是22天，而抗体处理的小鼠的中值存活时间是47天。
对于NCI-H929多发性骨髓瘤肿瘤模型，SCID小鼠被皮下接种107个细胞。如果第6天肿瘤明显时，根据体重，将动物随机分成10只动物的组，并开始处理。在3个连续的星期中，每周两次，以40mg/kg的剂量为小鼠静脉提供hu38SB19抗体、非结合嵌合IgG1对照抗体(rituximab，Biogenldec)。监控肿瘤体积，并如果肿瘤尺寸达到2000mm3或坏死，则将动物处死。PBS处理组在第89天达到了1000mm3的平均肿瘤体积，嵌合IgG1对照抗体组是在第84天(图19)。在所有10只动物中，使用hu38SB19的处理完全防止了肿瘤生长。相反，PBS处理组中仅两只动物和嵌合IgG1对照抗体中3只动物显示了肿瘤复原。
对于MOLP-8多发性骨髓瘤肿瘤细胞模型，将SCID小鼠皮下接种107个细胞。如果在第4天，肿瘤明显，则根据体重将动物随机分成10只动物的组，并开始抗体处理。在3个连续的星期中，每周两次，以40mg/kg的剂量为小鼠静脉提供hu38SB19和mu38SB19抗体或嵌合IgG1对照抗体。监控肿瘤体积，并如果肿瘤尺寸达到2000mm3或坏死，则将动物处死。PBS处理组在第22天达到了500mm3的平均肿瘤体积，而嵌合IgG1对照组则是在第23天(图20)。这些组中没有肿瘤被复原。相反，使用hu38SB19或mu38SB19的处理分别在10只动物中的8只，或者10只动物中的6只中引起了肿瘤复原。
表
表1A：
mu38SB19轻链框架表面残基和在人1.69抗体中相同Kabat位置的相应残基。灰色框中是不同进而在hu38SB19抗体中被改变的残基。加星号(*)的残基在一个或者多个hu38SB19变体中被回复突变成mu38SB19。
表1B
mu38SB19重链框架表面残基和在人1.69抗体中相同Kabat位置的相应残基。灰色框中是不同进而在hu38SB19抗体中被改变的残基。
Figure A20078003898300911
表2
除了HindKL是基于Co等人1992之外，用于简并PCR反应的引物是基于Wang等人，2000中的。混合碱基被定义为如下：H＝A+T+C、S＝g+C、Y＝C+T、K＝G+T、M＝A+C、R＝A+g、W＝A+T、V＝A+C+G。
  引物  序列
  BamlgG1(SEQ ID NO.73)  GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC
  IgG2Abam(SEQ ID NO.74)  GGAGGATCCCTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA
  EcoMH1(SEQ ID NO.75)  CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC
  EcoMH2(SEQ ID NO.76)  CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG
  SaclMK(SEQ ID NO.77)  GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA
  HindKL(SEQ ID NO.78)  TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC
表3
用于克隆28SB19可变区cDNA序列的轻链和重链PCR反应混合物。
 轻链反应混合物  重链反应混合物
 5μl 10×PCR反应缓冲液(Roche)4μl 10mM dNTP混合物(分别为2.5mM)2μl模板(RT反应)5μl 10μM SaclMK左引物5μl 10μM HindKL右引物5μl DMSO0.5μl Taq聚合酶(Roche)23.5μl无菌蒸馏H2O  5μl 10×PCR反应缓冲液(Roche)4μl 10mM dNTP混合物(分别为2.5mM)2μl模板(RT反应)2.5μl 10μM EcoMH1左引物2.5μl 10μM EcoMH2左引物5μl 10μM BamlgG1右引物5μl DMSO0.5μl Taq聚合酶(Roche)23.5μl无菌蒸馏H2O
 总计50μl  总计50μl
表4
用于38SB19第二轮PCR反应的5′末端鼠前导序列引物。3′末端引物与在第一轮反应中所使用的引物相同，因为它们引导各自的恒定区序列。
 引物   序列
 轻链38SB19 LC前导序列(SEQ ID NO.79)重链38-19HCLead1(SEQ ID NO.80) ATGGAGTCACAGATTCAGGTCTTTTGAATTCCAGTAACTTCAGGTGTCCACTC
表5
鼠38SB19抗体轻链和重链的cDNA计算和LC/MS测量分子量。
Figure A20078003898300931
序列表
<110>SANOFI-AVENTIS
<120>用于治疗癌症的新型抗-CD38抗体
<130>FR2006-043
<160>80
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>1
Ser Tyr Gly Met Asn
1               5
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>2
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1                5                    10                  15
Gly
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>3
Arg Gl y Phe Ala Tyr
1                 5
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>4
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ile Tyr Gly Asn Gly Phe Met Asn
1                5                    10                   15
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>5
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1                5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>6
Gln Gln Ile Asn Glu Asp Pro Phe Thr
1                5
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>7
Asn Ser Gly Met Asn
1                5
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>8
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1                5                    10                  15
Gly
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>9
Arg Gly Phe Val Tyr
1                5
<210>10
<211>15
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>10
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ala Ile Tyr Gly Asn Ser Phe Leu Lys
1                5                    10                  15
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>11
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1                5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>12
Gln Gln Ile Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1                5
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>13
Asp Tyr Trp Met Gln
1            5
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>14
Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Lys
1                5                    10                  15
Gly
<210>15
<211>11
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>15
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr
1                5                    10
<210>16
<211>11
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>16
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val Val Ala
1                5                    10
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>17
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile
1                5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>18
Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr Thr
1                5
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>19
Gly Ser Trp Met Asn
1                5
<210>20
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>20
Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Ile Tyr Asn Gly Asn Phe Arg
1                5                   10                   15
Asp
<210>21
<211>10
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>21
Trp Gly Thr Phe Thr Pro Ser Phe Asp Tyr
1                  5                  10
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>22
Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Thr Ala Val Ala
1                5                    10
<210>23
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>23
Ser Ala Ser His Arg Tyr Thr
1                5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>24
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Thr Thr
1                5
<210>25
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>25
Ser Tyr Thr Leu Ser
1                5
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>26
Thr Ile Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1                5                    10                  15
Gly
<210>27
<211>8
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>27
Asp Phe Asn Gly Tyr Ser Asp Phe
1                5
<210>28
<211>11
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>28
Lys Ala Ser Gln Val Val Gly Ser Ala Val Ala
1                5                    10
<210>29
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>29
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1                5
<210>30
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>30
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1                5
<210>31
<211>5
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>31
Asn Phe Gly Met His
1                5
<210>32
<211>17
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>32
Tyr Ile Arg Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys
1                5                    10                  15
Gly
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>33
Ser Tyr Tyr Asp Phe Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1                5                    10
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>34
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1                5                    10
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>35
Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser
1                5
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>36
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1                5
<210>37
<211>336
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
<400>37
aac att gtg ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct gtg tct ctt ggg    48
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt gtt gag att tat    96
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ile Tyr
            20                   25                   30
ggc aat ggt ttt atg aac tgg ttc cag cag aaa cca gga cag cca ccc    144
Gly Asn Gly Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                   40                   45
aaa ctc ctc atc tat cgt gca tcc aac cta gaa tct ggg atc cct gcc    192
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                   55                   60
agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gag ttc acc ctc acc att gat    240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65                   70                   75                  80
cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc tat tac tgt caa caa att aat    288
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn
                 85                  90                   95
gag gat cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg    336
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                 105                  110
<210>38
<211>112
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>38
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                     10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ile Tyr
             20                   25                   30
Gly Asn Gly Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                   40                   45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                   55                   60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65                   70                   75                   80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn
                 85                   90                   95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                   105                 110
<210>39
<211>336
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(336)
<400>39
gac att gta ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct gtg tct cta ggg         48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                  15
cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gag agt gtt gct att tat         96
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ala Ile Tyr
             20                  25                   30
ggc aat agt ttt ctg aaa tgg ttc cag cag aaa ccg gga cag cca ccc        144
Gly Asn Ser Phe Leu Lys Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                   40                   45
aaa ctc ctc atc tat cgt gca tcc aac cta gaa tct ggg atc cct gcc        192
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                   55                   60
agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc acc ctc acc att aat        240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                   70                   75                   80
cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc tat tac tgt cag caa att aat        288
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn
                 85               90                  95
gag gat ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg        336
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
      100                   105                   110
<210>40
<211>112
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>40
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1                5                    10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ala Ile Tyr
             20                  25                   30
Gly Asn Ser Phe Leu Lys Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                   40                   45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                   55                   60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                   70                   75                   80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn
                 85                   90                   95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                  105                   110
<210>41
<211>324
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>41
gac att gtg atg gcc cag tct cac aaa ttc atg tcc aca tca gtt gga         48
Asp Ile Val Met Ala Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1                5                    10                  15
gac agg gtc agc atc acc tgc aag gcc agt cag gat gtg agt act gtt         96
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
             20                  25                   30
gtg gcc tgg tat caa cag aaa cca gga caa tct cct aaa cga ctg att        144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile
         35                  40                   45
tac tcg gca tcc tat cgg tat att gga gtc cct gat cgc ttc act ggc        192
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
agt gga tct ggg acg gat ttc act ttc acc atc agc agt gtg cag gct        240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                   70                   75                   80
gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt cag caa cat tat agt cct ccg tac        288
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
                 85                  90                   95
acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg                        324
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                 105
<210>42
<211>108
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>42
Asp Ile Val Met Ala Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1                    5                10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
             20                  25                   30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile
         35                  40                   45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                   70                   75                   80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
                 85                  90                    95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105
<210>43
<211>324
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>43
gac att gtg atg acc cag tct cac aaa ttc ttg tcc aca tca gtt gga         48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1                5                   10                   15
gac agg gtc agt atc acc tgc aag gcc agt cag gat gtg gtt act gct        96
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Thr Ala
             20                  25                   30
gtt gcc tgg ttt caa cag aaa cca gga caa tct cca aaa cta ctg att       144
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                   40                   45
tat tcg gca tcc cac cgg tac act gga gtc cct gat cgc ttc act ggc       192
Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ttc acc atc atc agt gtg cag gct       240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ile Ser Val Gln Ala
65                   70                   75                   80
gaa gac ctg gca gtt tat tac tgt caa caa cat tat act act ccc acg       288
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Thr
                 85                   90                   95
acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gac ttc aga cgg                       324
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Phe Arg Arg
            100                   105
<210>44
<211>108
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>44
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1                5                    10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Thr Ala
             20                  25                   30
Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                    40                   45
Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ile Ser Val Gln Ala
65                   70                   75                   80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Thr
                 85                   90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Phe Arg Arg
            100                   105
<210>45
<211>324
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>45
gac act gtg atg acc cag tct cac aaa ttc ata tcc aca tca gtt gga         48
Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Ile Ser Thr Ser Val Gly
1                5                   10                   15
gac agg gtc agc atc acc tgc aag gcc agt cag gtt gtg ggt agt gct         96
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Val Val Gly Ser Ala
             20                  25                   30
gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tct cct aaa cta ctg att        144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                   40                   45
tac tgg gca tcc acc cgg cac act gga gtc cct gat cgc ttc aca ggc        192
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc att agc aat gtg cag tct        240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                   70                   75                   80
gaa gac ttg gca gat tat ttc tgt cag caa tat aac agc tat ccg tac        288
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
                 85                   90                  95
acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg                        324
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                 105
<210>46
<211>108
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>46
Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Ile Ser Thr Ser Val Gly
1                5                   10                   15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Val Val Gly Ser Ala
            20                   25                   30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                   40                   45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                   70                   75                   80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
                 85                   90                   95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                   105
<210>47
<211>324
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>47
gac att gtg atg acc cag tct caa aaa ttc atg tcc aca tca gta gga         48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                     10                   15
gac agg gtc agc gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt act aat         96
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
             20                  25                   30
gtt gcc tgg tat caa cac aaa cca gga caa tcc cct aaa ata atg att        144
Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ile Met Ile
         35                  40                   45
tat tcg gcg tcc tcc cgg tac agt gga gtc cct gat cgc ttc aca ggc        192
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
agt gga tct ggg aca ctt ttc act ctc acc atc aac aat gtg cag tct        240
Ser Gly Ser Gly Thr Leu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65                   70                   75                   80
gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt cag caa tat aac agc tat cct ctc        288
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
                 85                   90                   95
acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg                        324
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                   105
<210>48
<211>108
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1                5                   10                   15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
             20                   25                   30
Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ile Met Ile
         35                   40                   45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
Ser Gly Ser Gly Thr Leu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65                   70                   75                   80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
                 85                   90                   95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                   105
<210>49
<211>342
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(342)
<400>49
cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag         48
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1                5                    10                   15
aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ctc aca agc tac        96
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
             20                   25                   30
gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg       144
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                   40                   45
ggc tgg ata aac acc tac act gga gaa cca aca tat gct gat gac ttt       192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                   55                   60
aag gga cgt ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt       240
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe
65                   70                   75                   80
ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt       288
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                 85                   90                  95
gta aga cgc ggg ttt gct tact gg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc       336
Val Arg Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
             100                 105                  110
tct gca                                                               342
Ser Ala
<210>50
<211>114
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>50
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1                5                    10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
            20                   25                   30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                   40                   45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                   55                   60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe
65                   70                   75                   80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                 85                   90                   95
Val Arg Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
             100                    105               110
Ser Ala
<210>51
<211>342
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(342)
<400>51
cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag         48
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1                5                    10                   15
aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca aac tct         96
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
            20                   25                   30
gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg        144
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                   40                   45
ggc tgg ata aac acc tac act gga gag ccg aca tat gct gat gac ttc        192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                   55                   60
aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc tct gcc tat       240
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ser Ala Tyr
65                   70                   75                   80
ttg cag atc agt aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt       288
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                 85                   90                   95
gca aga agg ggt ttt gtt tac tgg ggc caa ggg act ctg gta act gtc       336
Ala Arg Arg Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
             100                 105                   110
tct gca                                                               342
Ser Ala
<210>52
<211>114
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>52
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1                5                   10                   15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
            20                   25                   30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                   40                   45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                   55                   60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ser Ala Tyr
65                   70                   75                   80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Arg Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
             100                  105                 110
Ser Ala
<210>53
<211>360
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>53
cag gtt cag ctc cag cag tct ggg gct gag ctg gca aga cct ggg act         48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Thr
1                5                   10                   15
tca gtg aag ttg tcc tgt aag gct tct ggc tac acc ttt act gac tac         96
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
             20                   25                   30
tgg atg cag tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg gag tgg att        144
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                   40                   45
ggg act att tat cct gga gat ggt gat act ggg tac gct cag aag ttc        192
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                   55                   60
aag ggc aag gcc aca ttg act gcg gat aaa tcc tcc aaa aca gtc tac        240
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65                   70                   75                   80
atg cac ctc agc agt ttg gct tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt        288
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gca aga ggg gat tac tac ggt agt aat tct ttg gac tat tgg ggt caa        336
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
             100                 105                   110
gga acc tca gtc acc gtc tcc tca                                        360
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                   120
<210>54
<211>120
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>54
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Thr
1                5                   10                   15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
             20                   25                   30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                   40                   45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                   55                   60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65                   70                   75                   80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala ValTyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
             100                  105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
<210>55
<211>357
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<400>55
cag gtc cag tta cag caa tct gga cct gaa ctg gtg agg cct ggg gcc         48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1                5                   10                   15
tca gtg aag att tcc tgc aaa act tct ggc tac gca ttc agt ggc tcc         96
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Gly Ser
            20                   25                   30
tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga cag ggt cta gag tgg att        144
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                   40                   45
gga cgg att tat ccg gga gat gga gat atc att tac aat ggg aat ttc       192
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Ile Tyr Asn Gly Asn Phe
    50                   55                   60
agg gac aag gtc aca ctg tct gca gac aaa tcc tcc aac aca gcc tac       240
Arg Asp Lys Val Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
atg cag ctc agc agc ctg acc tct gtg gac tct gcg gtc tat ttt tgt       288
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                 85                   90                   95
tcg aga tgg ggg aca ttt acg ccg agt ttt gac tat tgg ggc caa ggc       336
Ser Arg Trp Gly Thr Phe Thr Pro Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
             100                  105                 110
acc act ctc aca gtc tcc tca                                           357
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>56
<211>119
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>56
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Gly Ser
            20                   25                   30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                   40                   45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Ile Tyr Asn Gly Asn Phe
    50                   55                   60
Arg Asp Lys Val Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                   70                   75                   80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                 85                   90                   95
Ser Arg Trp Gly Thr Phe Thr Pro Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
             100                 105                  110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>57
<211>351
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(351)
<400>57
gac gtg aag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga ggg         48
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1                5                    10                   15
tcc ctg aaa ctc tcc tgt gaa gcc tct gga ttc act ttc agt agc tat         96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                   25                   30
acc ctg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag acg agg ctg gag tgg gtc        144
Thr Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Thr Arg Leu Glu Trp Val
         35                  40                   45
gca acc att agt att ggt ggt cgc tac acc tat tat cca gac agt gtg        192
Ala Thr Ile Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                   55                   60
gag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac        240
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                   70                   75                   80
ctg caa atg aac agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat tac tgt        288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
aca aga gat ttt aat ggt tac tct gac ttc tgg ggc caa ggc acc act       336
Thr Arg Asp Phe Asn Gly Tyr Ser Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
             100                  105                  110
ctc aca gtc tcc tca                                                   351
Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>58
<211>117
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>58
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1                5                    10                   15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                   25                   30
Thr Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Thr Arg Leu Glu Trp Val
        35                   40                   45
Ala Thr Ile Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                   55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                   70                   75                   80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Thr Arg Asp Phe Asn Gly Tyr Ser Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                   105                  110
Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>59
<211>360
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>59
aat gta cag ctg gta gag tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga ggg         48
Asn Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                     10                   15
tcc cgg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt aac ttt        96
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
             20                   25                   30
gga atg cac tgg gtt cgt cag gct cca gag aag ggt ctg gag tgg gtc       144
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                   40                   45
gca tac att cgt agt ggc agt ggt acc atc tac tat tca gac aca gtg       192
Ala Tyr Ile Arg Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
    50                   55                   60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat ccc aag aac acc ctg ttc       240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65                   70                   75                   80
ctg caa atg acc agt cta agg tct gag gac acg gcc atg tat tac tgt       288
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gca aga tcc tac tat gat ttc ggg gcc tgg ttt gct tac tgg ggc caa       336
Ala Arg Ser Tyr Tyr Asp Phe Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
            100                  105                   110
ggg act ctg gtc act gtc tct gca                                       360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
        115                  120
<210>60
<211>120
<212>PRT
<213>Mus sp.
<400>60
Asn Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                5                   10                   15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
            20                   25                   30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                   40                   45
Ala Tyr Ile Arg Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
    50                   55                   60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65                   70                   75                   80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Ser Tyr Tyr Asp Phe Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
             100                 105                  110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
        115                  120
<210>61
<211>324
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>61
gat atc gta atg acc cag tcc cac ctg agt atg agt acc tcc ctg gga         48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1                5                   10                   15
gat cct gtg tca atc act tgc aag gcc tca cag gat gtg agc acc gtc         96
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
             20                   25                   30
gtt gct tgg tat cag cag aag ccc ggg caa tca ccc aga cgt ctc atc        144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
         35                   40                   45
tac tca gca tca tac cgt tac atc ggg gtg cct gac cga ttt act ggc        192
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
     50                  55                   60
tct ggc gct ggc aca gat ttc acc ttt aca att agt tcc gtc cag gcc        240
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                   70                   75                   80
gaa gac ctg gcc gtg tac tac tgc cag cag cac tac agt ccc cca tac       288
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
                 85                   90                   95
act ttc ggg gga ggg act aag ctc gaa atc aaa cgt                       324
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
                 100             105
<210>62
<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>62
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1                5                    10                  15
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
             20                   25                   30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
        35                   40                   45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
     50                   55                   60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                   70                   75                   80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
                 85                   90                   95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                   105
<210>63
<211>324
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>63
gac att gtt atg gct caa agc cat ctg tct atg agc aca tct ctg gga         48
Asp Ile Val Met Ala Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1                5                    10                   15
gat cct gtg tcc atc act tgc aaa gcc agt caa gac gtg tct aca gtt         96
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
             20                   25                   30
gtt gca tgg tat caa cag aag cca ggc cag tca ccc aga cgg ctc att        144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
         35                   40                   45
tac tca gct tct tac cga tac atc ggg gtc cct gac aga ttt aca ggt        192
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
agt ggg gcc ggt act gac ttc act ttt act atc tca tcc gta caa gcc        240
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                   70                   75                   80
gaa gac ctg gca gta tat tac tgc cag caa cat tat tcc cca ccc tac        288
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
                 85                   90                   95
aca ttc ggc ggg ggt act aag ctg gaa att aaa cgt                        324
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                 105
<210>64
<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>64
Asp Ile Val Met Ala Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1                5                   10                   15
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
             20                   25                   30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
         35                   40                   45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                   70                   75                   80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
                 85                   90                   95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                 105
<210>65
<211>360
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(360)
<400>65
cag gta cag ctc gtt cag tcc ggc gcc gag gta gct aag cct ggt act        48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1                5                   10                   15
tcc gta aaa ttg tcc tgt aag gct tcc ggg tac aca ttt aca gac tac        96
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
             20                  25                   30
tgg atg cag tgg gta aaa cag cgg cca ggt cag ggc ctg gag tgg att       144
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                   40                   45
gga aca ata tat ccc ggc gac ggc gac aca ggc tat gcc cag aag ttt       192
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                   55                   60
caa ggc aag gca acc ctt act gct gat aaa tct tcc aag act gtc tac       240
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65                   70                   75                   80
atg cat ctg tct tcc ttg gca tct gag gat agc gct gtc tat tac tgt       288
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
gct agg ggg gac tac tat ggg tca aat tcc ctg gat tac tgg ggc cag       336
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                   105                 110
ggc acc agt gtc acc gtg agc agc                                   360
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
         115                 120
<210>66
<211>120
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1                5                    10                   15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
             20                   25                   30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                   40                   45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                   55                   60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65                   70                   75                   80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                   90                   95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                   105                   110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                   120
<210>67
<211>324
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>67
gac acc gtg atg acc cag tcc ccc tcc acc atc tcc acc tct gtg ggc         48
Asp Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Ile Ser Thr Ser Val Gly
1               5                     10                   15
gac cgg gtg tcc atc acc tgt aag gcc tcc cag gtg gtg ggc tcc gcc         96
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Val Val Gly Ser Ala
             20                   25                   30
gtg gcc tgg tat cag cag aag cct ggc cag tcc cct aag ctg ctg atc       144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                   45
tac tgg gcc tcc acc cgg cat acc ggc gtg cct gac cgg ttc acc ggc       192
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
tcc ggc agc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc tcc aac gtg cag tcc       240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                   70                   75                   80
gac gac ctg gcc gac tac ttc tgc cag cag tac aac tcc tac cct tac       288
Asp Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
                 85                  90                  95
acc ttt ggc ggc gga aca aag ctg gag atc aag cgt                       324
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                  105
<210>68
<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>68
Asp Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Ile Ser Thr Ser Val Gly
1                5                   10                   15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Val Val Gly Ser Ala
             20                  25                   30
ValAla Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                   45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
     50                  55                   60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                   70                  75                     80
Asp Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
                 85                  90                   95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                  105
<210>69
<211>324
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>69
gac acc gtg atg acc cag tcc ccc tcc tcc atc tcc acc tcc atc ggc         48
Asp Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Ile Ser Thr Ser Ile Gly
1                5                    10                  15
gac cgg gtg tcc atc acc tgt aag gcc tcc cag gtg gtg ggc tcc gcc         96
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Val Val Gly Ser Ala
             20                  25                   30
gtg gcc tgg tat cag cag aag cct ggc cag tcc cct aag ctg ctg atc        144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                   45
tac tgg gcc tcc acc cgg cat acc ggc gtg cct gcc cgg ttc acc ggc        192
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly
     50                  55                   60
tcc ggc agc ggc acc gac ttc acc ctg acc atc tcc aac gtg cag tcc        240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                   70                  75                    80
gag gac ctg gcc gac tac ttc tgc cag cag tac aac tcc tac cct tac        288
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
                 85                  90                  95
acc ttt ggc ggc gga aca aag ctg gag atc aag cgt                        324
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                 105
<210>70
<211>108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>70
Asp Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Ile Ser Thr Ser Ile Gly
1                5                    10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Val Val Gly Ser Ala
             20                  25                   30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                   45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly
    50                   55                   60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                   70                   75                   80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
                 85                   90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
             100                  105
<210>71
<211>351
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(351)
<400>71
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggc ggc gga ctg gtg aag cct ggc ggc         48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1                5                    10                  15
tcc ctg agg ctg tcc tgt gag gcc tcc ggc ttc acc ttc tcc tcc tac         96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                    25                  30
acc ctg tcc tgg gtg agg cag acc cct ggc aag ggc ctg gag tgg gtg        144
Thr Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                   45
gcc acc atc tcc atc ggc ggc agg tac acc tac tac cct gac tcc gtg        192
Ala Thr Ile Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                   55                   60
aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgg gac aac gcc aag aac acc ctg tac        240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                   70                   75                   80
ctg cag atg aac tcc ctg aag tcc gag gac acc gcc atg tac tac tgt       288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                   90                  95
acc cgg gac ttc aac ggc tac tcc gac ttc tgg ggc cag ggc acc aca       336
Thr Arg Asp Phe Asn Gly Tyr Ser Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
             100                  105                  110
ctg acc gtg tcc tcc                                                   351
Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>72
<211>117
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1                5                    10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                   25                  30
Thr Leu Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                   40                  45
Ala Thr Ile Ser Ile Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
    50                   55                   60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                   70                   75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                   90                  95
Thr Arg Asp Phe Asn Gly Tyr Ser Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
             100                  105                  110
Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210>73
<211>36
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>73
ggaggatcca tagacagatg ggggtgtcgt tttggc                                 36
<210>74
<211>32
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>74
ggaggatccc ttgaccaggc atcctagagt ca                                        32
<210>75
<211>32
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(32)
<223>混合的碱基被定义如下：H＝A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，K＝
     G+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，V＝A+C+G，N＝A+C+G+T
<400>75
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tc                                        32
<210>76
<211>35
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(35)
<223>混合的碱基被定义如下：H＝A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，K＝
     G+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，V＝A+C+G，N＝A+C+G+T
<400>76
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg                             35
<210>77
<211>31
<212>DNA
<213>Mus sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(31)
<223>混合的碱基被定义如下：H＝A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，K＝
     G+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，V＝A+C+G，N＝A+C+G+T
<400>77
ggagctcgay attgtgmtsa cmcarwctmc a                                 31
<210>78
<211>46
<2l2>DNA
<213>Mus sp.
<400>78
tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc                 46
<210>79
<211>21
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>79
atggagtcac agattcaggt c                         21
<210>80
<211>32
<212>DNA
<213>Mus sp.
<400>80
ttttgaattc cagtaacttc aggtgtccac tc             32
PCT/RO/134表
  申请人或代理人档案号：FR2006/043   国际申请号：PCT/IB07/04172
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003898301551
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
  申请人或代理人档案号：FR2006/043   国际申请号：PCT/IB07/04172
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003898301561
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
  申请人或代理人档案号：FR2006/043   国际申请号：PCT/IB07/04172
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003898301571
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
  申请人或代理人档案号：FR2006/043   国际申请号：PCT/IB07/04172
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003898301581
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
  申请人或代理人档案号：FR2006/043   国际申请号：PCT/IB07/04172
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003898301591
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
  申请人或代理人档案号：FR2006/043   国际申请号：PCT/IB07/04172
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure A20078003898301601
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)

Claims (77)

1.特异性结合CD38的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够通过凋亡、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖型细胞毒性(CDC)杀死CD38+细胞。
2.根据权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死所述CD38+细胞。
3.根据权利要求1～2任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合位点是单克隆抗体。
4.根据权利要求1～3任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述CD38+细胞是淋巴瘤细胞、白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。
5.权利要求4的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述CD38+细胞是非何杰金淋巴瘤(NHL)细胞、伯基特淋巴瘤(BL)细胞、多发性骨髓瘤(MM)细胞、B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)细胞、B和T急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞、T细胞淋巴瘤(TCL)细胞、急性骨髓细胞性白血病(AML)细胞、多毛细胞白血病(HCL)细胞、何杰金淋巴瘤(HL)细胞以及慢性骨髓细胞性白血病(CML)细胞。
6.根据权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死至少24％的Daudi淋巴瘤细胞。
7.根据权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死至少7％的Ramos淋巴瘤细胞。
8.根据权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死11％的MOLP-8多发性骨髓瘤细胞。
9.根据权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死36％的SU-DHL-8淋巴瘤细胞。
10.根据权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死62％的DND-41白血病细胞。
11.根据权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死27％的NU-DUL-1淋巴瘤细胞。
12.根据权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死9％的JVM-13白血病细胞。
13.根据权利要求1的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段能够在不存在基质细胞或基质细胞产生的细胞因子时通过凋亡杀死4％的HC-1白血病细胞。
14.根据前述权利要求任一项的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段以3×10-9M或更低的kD结合CD38蛋白。
15.根据权利要求1-14的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有选自下列的氨基酸序列的一个或者多个互补性决定区：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36。
16.根据权利要求15的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合位点包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的互补性决定区，该互补性决定区具有选自SEQ ID NO：1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、25、26、27、31、32和33的氨基酸序列，所述轻链包含三个连续的互补性决定区，该互补性决定区具有选自SEQ ID NO：4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35和36的氨基酸序列。
17.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合位点包含轻链可变区，该轻链可变区具有选自SEQID NO：38、40、42、44、46和48的氨基酸序列。
18.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合位点包含重链可变区，该重链可变区具有选自SEQID NO：50、52、54、56、58和60的氨基酸序列。
19.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：1、2和3表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：4、5和6表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
20.根据权利要求19的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：38构成的氨基酸序列的轻链可变区。
21.根据权利要求19的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：50构成的氨基酸序列的重链可变区。
22.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：7、8和9表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：10、11和12表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
23.根据权利要求22的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：40构成的氨基酸序列的轻链可变区。
24.根据权利要求22的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：52构成的氨基酸序列的重链可变区。
25.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：13、14和15表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：16、17和18表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
26.根据权利要求25的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：42构成的氨基酸序列的轻链可变区。
27.根据权利要求25的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：54构成的氨基酸序列的重链可变区。
28.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：19、20和21表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：22、23和24表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
29.根据权利要求28的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：44构成的氨基酸序列的轻链可变区。
30.根据权利要求28的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：56构成的氨基酸序列的重链可变区。
31.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：25、26和27表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：28、29和30表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
32.根据权利要求31的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：46构成的氨基酸序列的轻链可变区。
33.根据权利要求31的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：58构成的氨基酸序列的重链可变区。
34.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：31、32和33表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：34、35和36表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
35.根据权利要求34的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：48构成的氨基酸序列的轻链可变区。
36.根据权利要求34的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：60构成的氨基酸序列的重链可变区。
37.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段是由选自于2006年6月21日被保藏在美国典型培养物保藏中心(10801 University Bid，Manassas，VA，20110-2209，USA)，保藏号为PTA-7667、PTA-7669、PTA-7670、PTA-7666、PTA-7668和PTA-7671的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞系产生的。
38.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段包含至少一个人恒定区。
39.根据权利要求38的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述恒定区是人IgG1/Igκ恒定区。
40.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段是人源化或表面重建抗体。
41.根据权利要求40的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：1、2和3表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQID NO：4、5和6表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
42.根据权利要求40的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：7、8和9表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQID NO：10、11和12表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
43.根据权利要求40的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：13、14和15表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：16、17和18表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
44.根据权利要求43的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：66构成的氨基酸序列的重链可变区。
45.根据权利要求43的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含具有选自SEQ ID NO：62和64的氨基酸序列的轻链可变区。
46.根据权利要求40的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：19、20和21表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：22、23和24表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
47.根据权利要求40的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：25、26和27表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：28、29和30表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
48.根据权利要求47的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含具有SEQ ID NO：72构成的氨基酸序列的重链可变区。
49.根据权利要求47的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含具有选自SEQ ID NO：68和70的氨基酸序列的轻链可变区。
50.根据权利要求40的人源化或表面重建抗体或其表位结合片段，其特征在于所述人源化或表面重建抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含具有SEQ ID NO：31、32和33表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区，所述轻链包含具有SEQ ID NO：34、35和36表示的氨基酸序列的三个连续互补性决定区。
51.根据权利要求16的抗体或其表位结合片段，其特征在于所述抗体或其表位结合片段是Fab、Fab’、F(ab)2’或Fv片段。
52.一种缀合物，其包含连接到细胞毒性剂上的根据权利要求1～51任一项的抗体或其表位结合片段。
53.权利要求52的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂选自类美登素、小分子药物、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物、前药、紫杉醇类化合物、CC-1065或CC-1065类似物。
54.权利要求53的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂是下式的美登素DM1：
Figure A2007800389830008C1
55.权利要求53的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂是下式的美登素DM4：
Figure A2007800389830008C2
56.权利要求53的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂是选自下列的茅屋霉素衍生物：
·8，8′-[1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830008C3
-5-酮]
·8，8′-[5-甲氧基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830008C4
-5-酮]
·8，8′-[1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[1，4-亚丁基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C1
-5-酮]
·8，8′-[3-甲基-1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[2，6-亚吡啶基双(氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C3
-5-酮]
·8，8′-[4-(3-叔丁氧羰基氨基丙氧基)-2，6-亚吡啶基双-(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C4
-5-酮]
·8，8′-[5-(3-氨基丙氧基)-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C5
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-3-叔丁氧羰基氨基丙基)-1，3-亚苯基双-(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C6
-5-酮]
·8，8′-{5-[3-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)丙氧基]-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)}-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C7
-5-酮]
·8，8′-[5-乙酰基硫代甲基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C8
-5-酮]
·双-{2-[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-5-氧代-1，3，，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C9
-8-基氧基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯
·8，8′-[3-(2-乙酰基硫代乙基)-1，5-亚戊基双(氧基)]-双[(S)-2-亚甲基-7-甲氧基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[5-(N-4-巯基-4，4-二甲基丁酰基)氨基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C11
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-4-甲基二硫基-4，4-二甲基丁酰基)-氨基-1，3-亚苯基双(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830009C12
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-N-(2-巯基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-亚苯基(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830010C1
-5-酮]
·8，8′-[5-(N-甲基-N-(2-甲基二硫基-2，2-二甲基乙基)氨基-1，3-亚苯基(亚甲基氧基)]-双[7-甲氧基-2-亚甲基-1，2，3，11a-四氢-5H-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830010C2
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-(4-巯基-4-甲基)-戊酰氨基-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830010C3
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830010C4
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830010C5
-5-酮]
·8，8′-[(4-(4-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基-丁氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830010C6
-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830010C7
-5-酮]
·8，8′-[(1-(3-[4-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-丙基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830010C8
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830010C9
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830011C1
-5-酮]
·8，8′-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830011C2
-5-酮]
·8，8′-[(1-(2-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-乙氧基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[甲基(4-甲基-4-甲基二硫基-戊酰基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂-5-酮]
·8，8′-[(4-(3-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-氨基]-丙基)-吡啶-2，6-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830011C5
-5-酮]
·8，8′-[(1-(4-甲基-4-甲基二硫基)-戊酰氨基)-苯-3，5-二甲基)-二氧基]-双[(S)-2-亚乙-(E)-基-7-二甲氧基-1，2，3，11a-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂
Figure A2007800389830011C6
-5-酮]。
57.权利要求53的缀合物，其特征在于所述细胞毒性剂是选自下列的来普霉素衍生物：
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基硫基-乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸]的二-[(2-巯基乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基二硫基-乙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基-2-甲基二硫基-丙基)-酰胺
·(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九碳-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-2-甲基-丙基)-酰胺。
58.根据权利要求1～51任一项的抗体或其表位结合片段，或者根据权利要求52～57任一项的缀合物，其用于药物。
59.药物组合物，其含有根据权利要求1～51任一项的抗体或其表位结合片段，或者根据权利要求52～57任一项的缀合物以及药物上可以接受的载体或赋形剂。
60.权利要求59的药物组合物，其特征在于所述组合物还含有进一步的治疗剂。
61.权利要求60的药物组合物，其特征在于所述进一步的治疗剂是表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂，或者表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的受体包括HER2受体、HER3受体、c-MET和其他受体酪氨酸激酶的拮抗剂。
62.权利要求60的药物组合物，其特征在于所述进一步的治疗剂是针对选自CD3、CD14、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD36、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138和CD152的分化簇抗原的抗体。
63.根据权利要求1～51任一项的抗体或其表位结合片段，或者根据权利要求52～57任一项的缀合物用于制备药物的应用，所述药物用于治疗癌症或自体免疫疾病。
64.权利要求63的应用，其中所述癌症选自癌包括膀胱癌、乳癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、***、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞片状细胞癌；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、***瘤、tetratocarcinoma、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢神经***和外周神经***的肿瘤，包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和施旺细胞瘤；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、***瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。
65.权利要求63的应用，其特征在于所述癌症是淋巴谱系的造血***肿瘤，包括白血病、非何杰金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、多毛细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病；骨髓谱系的造血***肿瘤，包括急性和慢性骨髓型白血病以及前髓细胞肿瘤。
66.权利要求63的应用，其特征在于所述自体免疫或炎性疾病选自***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胃炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、丙型肝炎相关冷球蛋白血症血管炎、慢性局灶脑炎、大疱性类天疱疮、甲型血友病、膜性增生性肾小球肾炎、肖格伦氏综合症、成人和少年型皮肌炎、成人多肌炎、慢性荨麻疹、夏科氏肝硬变、特发性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、格雷夫氏甲状腺机能障碍性疾病、大疱性类天疱疮、膜性增生性肾小球肾炎、许尔-斯特劳斯综合症和哮喘。
67.根据权利要求63的应用，其还包括在制备相同或不同组合物中使用进一步的治疗剂。
68.权利要求67的应用，其特征在于所述进一步的治疗剂是表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂，或者表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白质C、蛋白质S、血小板衍生生长因子(PDGF)、Heregulin、巨噬细胞-刺激蛋白(MSP)或血管内皮生长因子(VEGF)的受体包括HER2受体、HER3受体、c-MET和其他受体酪氨酸激酶的拮抗剂。
69.权利要求67的应用，其特征在于所述进一步的治疗剂是针对选自CD3、CD14、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD36、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD70、CD79、CD80、CD103、CD134、CD137、CD138和CD152的分化簇抗原的抗体。
70.诊断个体中癌症的方法，其中已知或怀疑所述个体患有癌症，所述方法包括：
a)将所述患者的细胞与根据权利要求1～51的抗体或其表位结合片段接触，
b)测量所述抗体或其表位结合片段与所述细胞的结合，以及
c)将b)部分中的表达与正常参照个体或标准的表达进行比较。
71.权利要求70的方法，其特征在于所述癌症选自癌，包括膀胱癌、乳癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、***、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞片状细胞癌；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、***瘤、tetratocarcinoma、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢神经***和外周神经***的肿瘤，包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和施旺细胞瘤；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、***瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。
72.权利要求70的方法，其中所述癌症是淋巴谱系的造血***肿瘤，包括白血病、非何杰金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、多毛细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病；骨髓谱系的造血***肿瘤，包括急性和慢性骨髓型白血病以及前髓细胞肿瘤。
73.权利要求70的方法，其特征在于所述细胞是冷冻的或固定的来自所述患者的组织或细胞。
74.多核苷酸，其编码选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70和72的多肽。
75.根据权利要求74的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸与选自SEQ ID NO：37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69和71的多核苷酸具有至少80％的同一性。
76.重组载体，其包含权利要求74或75任一项的核酸。
77.宿主细胞，其包含权利要求76的载体。
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