JP2023535501A

JP2023535501A - Ｓｏｃｓ１に欠陥のある免疫細胞

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Publication number: JP2023535501A
Application number: JP2023506042A
Authority: JP
Inventors: ローリー・メンガー; シルヴィア・メネガッティ; セバスティアン・アミゴレナ
Original assignee: アンスティテュ・クリー; アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2023-08-17
Also published as: AU2021316727A1; EP4188395A1; CA3190266A1; WO2022023576A1; US20230303974A1; CN116096864A; KR20230074713A

Abstract

本発明は、SOCS1に欠陥のある操作された免疫細胞に関する。好ましくは、操作された免疫細胞は、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体を更に含む。本発明は、免疫細胞におけるSOCS1の発現及び/又は活性を阻害することからなる工程を含み;任意選択で、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体を免疫細胞に導入することからなる工程を更に含む、遺伝子操作された免疫細胞を獲得するための方法にも関する。本発明は、とりわけ癌の治療のための、養子療法におけるそれらの使用のための操作された免疫細胞も包含する。

Description

本発明は、養子療法の分野に関する。本発明は、インビボにおける増大、生存、及び機能性の増強を有する、SOCS1に欠陥のある免疫細胞を提供する。

序論
組み換えT細胞受容体(TCR)又はキメラ抗原受容体(CAR)又は腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を用いて操作されたT細胞を含めた、養子T細胞療法(ATCT)は、有力な癌療法として浮上しつつある。

インビトロ製造過程は、複雑な感知-応答挙動を有するCD4及びCD8 T細胞生薬物(live drug)の不均一な混合物を遺伝学的にリプログラミングし得る(Lim及びJune 2017)。CD8又はCD4 T細胞単独で、かなりの治療効果をもたらし得るものの(Freitas及びRocha 2000)、両サブセットの共注射が、最適で且つ継続的な抗腫瘍活性の決定的な要件であることが多い(Linnemann、Schumacher、及びBendle 2011;Sadelain 2015;Borstら2018)。CD4 T細胞は多面的効果及び可塑性を呈し、両ヘルパーを通じた抗腫瘍免疫応答(Corthayら2005;Bos及びSherman 2010;Z. Zhuら2015)、及び細胞傷害機能(Xieら2010;Quezadaら2010;Kitanoら2013;Sledzinskaら2020a)をブーストし得る。

しかしながら、活性化CD4及びCD8 T細胞は、インビボで増殖する及び持続するそれらの能力が異なる。CD8 T細胞は、幅広く且つ自律的なクローン増大を生じる一方で、CD4 T細胞は、繰り返しの抗原誘発を必要とし、早期***において増殖停止を呈し、およそ10～20分の1の増大につながる(Homann、Teyton、及びOldstone 2001;Fouldsら2002;Seder及びAhmed 2003;Ravkov及びWilliams 2009)。

CD4及びCD8 T細胞増大の大きさ及び継続期間の相違は、外部シグナルにも資源の競合にも起因しない(上記参考文献を参照されたい)。その代わりに、抗原刺激後の免疫応答へのナイーブ及び抗原経験(Ag-exp)CD4 T細胞の参入を比較することによって、いくつかの調査は、Ag-exp CD4 T細胞が、それら自身の増殖を特異的に減らし、IL2産生の低下を呈することを報告した(Fouldsら2002;Mericaら2000;MacLeod、Kappler、及びMarrack 2010;Helftら2008)。本発明者らは、進行中の免疫応答の間のAg-exp CD4 T細胞の機能不全の増大を再現するインビボモデルを以前に開発した。いくつかのCD4 TCRトランスジェニック(Tg)T細胞に一般化可能なこの生理学的に関連するモデルにおいて、Ag-exp CD4 T細胞増大は本質的に消滅し、一方でナイーブCD4 T細胞増殖は維持され、Ag-exp CD4増殖の非存在が、不十分なプライミングとは関係がないことを実証している(Helftら2008)。彼らが以前に報告した強い阻害はAg特異的であり、2日目(Ag消失のずっと前)に始まり、調節性T細胞(Treg)、抗原提示細胞(APC)教育の欠如等の外生的因子にも、Agの競合にも起因しない(Helftら2008)。その代わりに、彼らは、Ag-exp CD4 T細胞が、固有の活発で且つ支配的な現象によって止まり、それは、新たな、AgをロードしたDCを提供することによって克服され得ないことを示した。

操作過程の前にT細胞がインビトロで活性化される養子T細胞療法(ATCT)の背景において、Ag-exp CD4 T細胞は、インビボにおけるリコール条件下で限定的サブセットになり得、効率的な防御免疫応答に支障をきたす(Homann、Teyton、及びOldstone 2001)。この限定された増大に関わる根底にある分子メカニズムは不明であるが、少用量のT細胞が患者に注入されることから、ATCT効力を妨げ得る。

故に、養子移入の後に増大能及び生存の増強を呈する、操作された免疫細胞、とりわけ操作されたT細胞の必要性が残る。効率的で且つ広範囲の癌治療を支持するであろう、機能的効力の向上を有する、特に細胞傷害潜在力の向上を有する操作されたT細胞の必要性もまだある。

更に、自家T細胞の製造は、時間及び費用がかかり且つしばしば非効率である。薬物としてのATC療法の安定な確立を確保するために、健常ドナーからの十分に特徴付けされ、貯蔵され、且つ事前に製造された治療用細胞が、これらの制限に対処するであろう。それ故に、レシピエントの免疫系によって拒絶されない強力な同種T細胞を開発するための努力は、重要な臨床的必要性を満たす。

それ故、本発明者らは、健常ドナーから普遍的な細胞療法を作出することを目的として、宿主免疫排除に対するT細胞の固有の抵抗性を検討しているところである。自家治療用CAR T細胞の使用は、これまで際立った臨床データをもたらしているものの(Neelapuら2017;Maudeら2018)、それはある特定の周知の欠点を有する。

第一に、複雑な個別化製造は、それらの拡張性を低下させる(Grahamら2018)。加えて、現在の製造過程はおよそ3週間かかり(Kohlら2018)、それは、殊に、高度に増殖性の疾患を有する患者にとってそれらの利用可能性を限定する(Depilら2020)。最後に、自家T細胞効能は、以前の一連の治療、又は腫瘍微小環境に由来する免疫抑制によって負の影響を受け得る(Thommen及びSchumacher 2018)。

逆に、健常ドナー由来の同種T細胞産物(HLA不一致)の使用は、T細胞の標準化されたバッチへの即時アクセスを可能にし、それらの効力を向上させ(複数の細胞改変、標的の組み合わせ)、それらのコスト及び産業化過程を減少させるが(Linら2019)、それにもかかわらずそれは2つの大きな難題を伴う。第一に、同種T細胞の移入は、命を脅かす疾患である、ドナーTリンパ球によって誘導される移植片対宿主病(GVHD)を引き起こし得る。それを阻止する1つのストラテジーは、TCRα定常(TRAC)遺伝子の遺伝学的不活性化である。第二に、TCR陰性の同種T細胞は、なおも、宿主の免疫系によって非自己HLAとして認識され得且つ迅速に排除され得、それはそれらの抗腫瘍活性を限定するであろう。これに関して、普遍的CAR-T細胞注入の前の化学療法又は放射線を用いたリンパ球枯渇は、レシピエント免疫系が回復するまで拒絶を遅延させることが提唱されている(Gattinoniら2005)が、それらは、かなりの毒性及び問題のあるウイルス再活性化を伴う(Chakrabarti、Hale、及びWaldmann 2004)。

HLA-I分子は、免疫拒絶の主な媒介因子であることから、別の提唱されるストラテジーは、細胞表面に機能的HLAクラスI分子を形成するのに必須であるβ2-ミクログロブリンの遺伝学的破壊であった(Poirotら2015;D. Wangら2015;Torikaiら2013)。しかしながら、これらの細胞は、低下したHLA発現に感受性であるNK細胞の標的になり得る(自己喪失(missing-self)メカニズム)(Bernら2019)。NK媒介性拒絶を阻止する解決策は、阻害性複合体CD94/NGK2Aのリガンドである(Braudら1998)HLA-E分子(Gornalusseら2017)、又は阻害性受容体KIR2DL4/IT2に結合する、細胞栄養芽層によって通常発現されるHLA-G(Rajagopalan及びLong 1999;Pazmanyら1996;Gonen-Grossら2010)の過剰発現に依存し得る。

最後に、CAR技術と組み合わせた、低免疫原性細胞の誘導性多能性幹(iPS)を使用することは、抗原特異性、及びHLA拘束性からの独立を有するリンパ球の有望で且つ無制限の供給源も提供し得る(Themeliら2013)。しかしながら、特に、医薬品の製造管理及び品質管理の基準(good manufacturing practice)(GMP)に現在適合しない分化方法に関する難題が依然としてあり、というのも、それらは血清及びマウス由来フィーダー細胞の存在を含むためである。また、それは、多工程の分化過程を伴うことから、発生移行は種々の効率で生じ得る。

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それ故に、臨床適用のための、とりわけ同種移入のための、成熟したシングルポジティブT細胞の産生は依然として課題となっている(Nianias及びThemeli 2019)。

本発明者らは、CRISPR技術を使用して、ゲノムワイド(GW)なレベルで初代T細胞を遺伝子操作するストラテジーを開発した。この革新的手法は、インビボで機能的に非冗長な、T細胞固有の限定因子の迅速で系統的で且つ先入観のない同定を可能にする(13、14)。まず、本発明者らは、インビボにおける再負荷されたCD4 T細胞増大を限定する固有の因子を調べた。それらのスクリーニングは、サイトカインシグナル伝達サプレッサー1(Suppressor of Cytokine Signaling 1)(SOCS1)をCD4⁺ T細胞増殖及び生存の非冗長で且つ固有のインヒビターとして同定した。それらは、SOCS1が、CD4⁺ T細胞機能を活発に限定するサイトカインシグナル(IFN-γ及びIL-2)を統合する重大なノードであることを実証した。本発明者らは、マウス及びヒトCD4⁺及びCD8⁺抗腫瘍養子細胞療法の両方においてSOCS1の機能を検討した。SOCS1不活性化は、CD4⁺ Tヘルパー-1(Th1)細胞増大並びに細胞傷害機能を回復させ、一方でCD8⁺ T細胞において、それは細胞傷害潜在力を大いにブーストした。

次いで、インビボで同様のゲノムワイドなスクリーニングストラテジーを使用し、且つ十分に免疫能力のあるBALB/c(H2-Kd)MHC不一致マウスにおいてC57BL6マウス(H2-Kb)由来のゲノムワイドに変異したマリリン(Marilyn)Tのプールを移入することによって、本発明者らは、その発現の低下が、天然における(Lanza、Russell、及びNagy 2019)、特に癌における(Koopmanら2000;Heら2017)免疫回避と同時に起こる経験的標的であるβ2mを再同定した。更に且つ完全に予想外に、本発明者らは、インビボにおける同種T細胞の生存を向上させる主要な標的として、彼らが今や検証するFas(CD95、Tnfrsf6)を同定した。これらの結果は、同種移植に基づく普遍的(同種)細胞療法(免疫細胞療法等)の開発にとって大きな進歩である。

本発明者らは、SOCS1及びFAS不活性化の組み合わせが、「同胞殺滅/同種死滅抵抗性」の普遍的なT細胞産物を提供することを支持する結果を更に提供する。

それ故に、本発明は、SOCS-1が不活性化されている、改変された又は操作された免疫細胞、とりわけ改変されたT細胞に関する。一部の実施形態において、免疫細胞は、FAS及び/又はSuv39h1にも欠陥がある。

典型的に、本出願1の操作された免疫細胞は、T細胞又はNK細胞である。より特に、T細胞は、CD4+又はCD8+ T細胞である。好ましい細胞は、ナイーブT細胞(T_N細胞)、幹メモリーT細胞(TSC_M細胞)、メモリーT細胞(TC_M細胞)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、又はエフェクターメモリーT細胞(TE_M細胞)、及びその組み合わせから選択され得る。

また典型的に、操作された免疫細胞は対象から単離されている。好ましくは、対象は癌に罹患している又は癌に罹患するリスクがある。

遺伝子操作された抗原受容体が特異的に結合する標的抗原は、好ましくは癌細胞上で発現され、且つ/又は普遍的な腫瘍抗原である。

遺伝子操作された抗原受容体は、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であり得る。遺伝子操作された抗原受容体は、T細胞受容体(TCR)でもあり得る。

好ましくは、操作された免疫細胞における、SOCS-1の、並びに一部の実施形態ではまた、FAS及び/又はSuv39h1の活性及び/又は発現は選択的に阻害又は遮断されている。1つの実施形態において、操作された免疫細胞は、それぞれ非機能的SOCS-1、FAS、又はSuv39h1タンパク質をコードするSOCS-1、FAS、又はSuv39h1核酸を発現する。

本出願は、SOCS-1及び/又はFASの発現及び/又は活性を阻害すること、並びに一部の実施形態では、免疫細胞におけるβ2m及び/又はSuvh39h1の発現及び/又は活性を更に阻害することからなる工程;並びに任意選択で、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体を免疫細胞に導入することからなる工程を含む、遺伝子操作された免疫細胞、とりわけ普遍的な免疫細胞(同種移植において、特に同種養子細胞療法において使用可能な)を産生する方法にも関する。

一部の実施形態において、SOCS-1、FAS、Suv39h1、又はβ2m活性及び/又は発現の阻害は、細胞と、SOCS-1、FAS、Suv39h1、若しくはβ2mタンパク質の発現及び/若しくは活性を阻害し、且つ/又はFAS、β2m、SOCS-1、及び/若しくはSuv39h1遺伝子を破壊する少なくとも1つの作用物質とを接触させる工程又は接触させる工程を含む。作用物質は、小分子インヒビター;抗体誘導体、アプタマー、転写若しくは翻訳を遮断する核酸分子、又はそれぞれSOCS1、FAS、Suv39h1、若しくはB2N遺伝子を標的にする遺伝子編集剤から選択され得る。

本発明は、養子細胞療法、とりわけ癌の養子療法における使用のための、本明細書に記載される操作された免疫細胞、又は操作された免疫細胞を含む組成物にも関する。

インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、進行中の免疫応答の間の抗原経験(Ag-exp)CD4 T細胞増大の非冗長なインヒビターとしてSOCS1を同定することを示した図である。(A)B～Dにおいて使用される、進行中の免疫応答の経過におけるナイーブ及びAg-exp CD4 T細胞増大を査定する2つのコホート実験設計。(B)C57BL/6マウスにおける進行中の免疫応答の間の、10⁶個のナイーブ又はインビトロAg-expのいずれかの、増殖性マリリンCD4 T細胞のフロープロット及びパーセンテージ(強調されるパーセンテージは、シングレット生CD45.1⁺ CD4 T細胞からのものである)。マウスに106個細胞を静脈内に注射し、足蹠への10⁶個の、DbyペプチドをロードしたLPS成熟DCの注射によってインビボでプライムした。(C、D)インビボにおけるリコール応答の間の、ナイーブCD45.1マリリンCD4 T細胞と比較した、CD45.1 Ag-exp CD4 T細胞の生存及びIL2産生。(E)ピューロマイシン選択及びインビボ注射の前の、Ag-exp Cas9-マリリンCD4 T細胞CD44/CD62L表現型及びレンチウイルスライブラリー形質導入効率(BFP+)。(F)ピューロマイシン選択(5μg/mL)の4日後の、元のプラスミドDNAライブラリーにおける及び形質導入されたT細胞におけるsgRNA正規化リードカウントを比較した散布図。(G)CD45.1モック形質導入Cas9-マリリンCD4 T細胞と比較した、増殖性CD45.1ライブラリー形質導入Cas9-マリリンCD4 T細胞の代表的なフロープロット及び定量。マウスに12.10⁶個のCD4 T細胞をIVに注射し、0日目及び7日目に足蹠において4.10⁶個の、DbyペプチドをロードしたLPS成熟DCでプライムした。(H)インビボでの進行中の免疫応答における、CFSE^hiサブセットと比較した、CD45.1ライブラリー形質導入CD4 T細胞のCFSE^loサブセットにおけるヒットの富化。(I)14日目の時点の、リコール応答の間の増殖性Ag-expモックマリリン又はsgSOCS1マリリン細胞の代表的なプロット及びパーセンテージ(シングレット生CD45.1+ CD4 T細胞でゲートをかけた)。マウスに2.10⁶個のCD4 T細胞をIVに注射し、0日目及び7日目に10⁶個のペプチドパルスLPS成熟DCでプライムした。(G、H)示されるデータは、2回の独立した一次GWスクリーニングからのものである。(H)p値は、遺伝子レベルで富化されたp値に相当し、log2倍変化(LFC)は、富化されたRRAスコアを支持するすべてのsgRNAのLFC中央値に相当する。FDR<0.5を有する標的は黒色で強調されている。各点は個々のマウスであり、白抜きの符号は、独立した実験からの複製物である(FP:足蹠、DC:樹状細胞、pept:ペプチド、Ag-exp:抗原経験した)。 SOCS1は、多サイトカイン(polycytokine)放出を活発にサイレンスするいくつかのサイトカインシグナルを統合するノードであることを示した図である。(A)進行中の免疫応答からのCFSE^lo(緑色)及びCFSE^hi(赤色)ナイーブ又はAg-expマリリン細胞のSORTingストラテジー。(B)増殖性の又は阻害されたマリリン細胞による、選択されたリストのサイトカイン受容体の発現を呈したヒートマップ(最初の7種の受容体p<0.01、FDR<0.5)。(C)コホート1増大のあり又はなし(w/o)での、14日目の細胞移入及び足蹠ワクチン接種の後の、インビボにおける10⁶個のマリリンナイーブIFNγ-R^+/-又はマリリンAg-exp IFNγ-R^+/-又はAg-exp IFNγ-R^-/-増大の代表的なフロープロット(強調されるパーセンテージは、シングレット生CD45.1⁺ CD4 T細胞からのものである)及び定量。(D)7日目、9日目、11日目に腹腔内注射されたブロッキング抗体(200μg):アイソタイプ、抗体IL2Rβ、抗IFNγRαの存在下における、リコール応答の間のインビボにおける10⁶個のマリリンAg-exp増大の代表的なフロープロット(強調されるパーセンテージは、シングレット生CD45.1⁺ CD4 T細胞からのものである)及び定量。(E)インビトロにおけるペプチドパルスLPS成熟DCとの一晩の共培養の後の、モック細胞と比較した、sgSOCS1 Ag-expマリリンにおけるCD69、CD25、IRF4発現のフローサイトメトリー評価。(F)IFN-γ、TNFα、及びIL-2を産生するモック又はsgSOCS1マリリンのフロープロット及びパーセンテージ。値は、平均又は平均±SDとして示されている。各点は個々のマウスであり、白抜きの符号は、マン・ホイットニーU検定又は二元配置ANOVAによって分析された、独立した実験からの複製物である(E)。図３Ａは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(A)雄DBY発現膀胱腫瘍株MB49を持つC57BL/6雌マウスにおけるマリリンCD4 T細胞(ACT)の概略。図３Ｂは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(B)ACT後の腫瘍なし生存期間、ログ・ランク(マンテル・コックス)検定。データは、2回の独立した実験、n=4～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図３Ｃは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(C)抗CD8a及び抗アシアロGM1(抗GM1)枯渇抗体を受けたマウスにおける、種々のACT:PBS対照、10⁶個のモックAg-expマリリン又は10⁶個のsgSOCS1 Ag-expマリリンCas9の養子移入、の後のC57BL6マウスにおけるMB49腫瘍の成長曲線。データは、2回の独立した実験、n=4～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図３Ｄは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(D)ACT後7日目の時点の、腫瘍排出リンパ節(tumor draining lymph node)(TdLN)における、腫瘍における、及び無関係のリンパ節LN(irr-LN)における、モック又はsgSOCS1マリリン細胞の代表的なフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験、n=4～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図３Ｅは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(E)ACT後7日目の時点の、TdLNにおけるモック及びsgSOCS1マリリン細胞増殖の代表的なフロープロット及びパーセンテージ。データは、2回の独立した実験、n=4～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図３Ｆは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(F)TdLNにおけるAg-exp sgSOCS1対Ag-expモックマリリンT細胞における、FDR値<0.05を有する、選択された特色である転写シグネチャー(MSigDB)についての遺伝子セットエンリッチメント分析(GSEA)(2匹のプールされたマウスからのn=3複製物)。図３Ｇは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(G)マリリンモック細胞と比較した、腫瘍排出リンパ節(TdLN)浸潤CD45.1マリリンsgSOCS1細胞における差次的に発現した遺伝子。FDR値<0.05を有する転写産物は薄緑色で強調されている。データは、2回の独立した実験、n=4～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図３Ｈは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(H)移入後7日目の時点の、TdLNにおけるIFNγ⁺ IL2⁺及びIFNγ⁺ TNFα⁺を産生するモック又はsgSOCS1マリリンCD4 T細胞の代表的なフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験、n=4～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図３Ｉは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(I)MB49腫瘍によって発現されたMHC-II分子の代表的なフロープロット。データは、2回の独立した実験、n=4～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図３Ｊは、Ag-exp sgSocs1マリリンCD4 T細胞は、多機能的Th細胞傷害性表現型を取得し、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強することを示した図である。(J)7日目の時点の、腫瘍浸潤sgSOCS1マリリンCD4 T細胞によって発現されたグランザイムB(GZMB)のフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験、n=4～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。向上したACTを用いたB16-OVA腫瘍拒絶:Socs1遺伝子不活性化は、OT2細胞の増殖を回復させ、OT1細胞生存及び細胞傷害性を増強することを示した図である。(A)B16-OVA黒色腫腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける、OT1 CD8及びOT2 CD4養子T細胞療法(ACT)の概略。(B)OT1(2.10⁶個のモック又は2.10⁶個のsgSOCS1)及びOT2細胞(2.10⁶個のモック又は2.10⁶個のsgSOCS1)を用いた養子移入後の、C57BL6マウスにおけるB16-OVA腫瘍の成長曲線。(C)ACT後のB16-OVAを持つマウスのカプラン・マイヤー生存分析、ログ・ランク(マンテル・コックス)検定。(D)シングレット生Vα2⁺ T細胞でゲートをかけた、ACT後7日目の時点の、腫瘍排出リンパ節(TdLN)における、腫瘍における、又は無関係のリンパ節(Irr-LN)における、モック又はsgSOCS1 OT1及びOT2細胞の代表的なプロット及び定量。(E)7日目の時点の、TdLNにおいて増殖するモック又はsgSOCS1 OT1及びOT2細胞の代表的なフロープロット及びパーセンテージ。(F、G)移入後7日目の時点の、IFN-γ及びグランザイムB分子を産生するモック又はsgSOCS1 OT2及びOT1腫瘍浸潤細胞の代表的なフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験、n=5～8匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図５Ａは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(A)CAR-T細胞操作、並びにNALM6-Lucを持つマウスの2.10⁶個のCD4 CAR(CAR4)及び2.10⁶個のCD8 CAR(CAR8)T細胞を用いた養子T細胞療法(ATCT)の概略。図５Ｂは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(B)NSG注射前の、CD19/Fc融合タンパク質及びセントラルメモリー表現型を使用して査定されたCAR発現。データは、2回の独立した実験(n=5～6匹のマウス/群)からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として表されている。図５Ｃは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(C)シングレット生HLA-I⁺、CD45.2^-マウス細胞でゲートをかけた、移入後7日目及び28日目の時点の、NALM6-Lucを持つNSGマウスにおけるCAR4及びCAR8モック及びsgSOCS1を用いた骨髄浸潤の代表的なフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験(n=5～6匹のマウス/群)からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として表されている。図５Ｄは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(D)シングレット生HLA-I⁺、CD45.2^-マウス細胞でゲートをかけた、移入後7日目及び28日目の時点の、NALM6-Lucを持つNSGマウスにおけるCAR4及びCAR8モック及びsgSOCS1を用いた骨髄浸潤の代表的なフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験(n=5～6匹のマウス/群)からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として表されている。図５Ｅは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(E)移入後7日目の時点の、活性化(赤色)、増殖/生存(青色)、及びエフェクター機能(緑色)と関係した、モック及びsgSOCS1 CAR T細胞の間の選択された差次的発現遺伝子(FDR<0.05)のヒートマップ。データは、2回の独立した実験(n=5～6匹のマウス/群)からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として表されている。図５Ｆは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(F)CAR4/8 sgSOCS1対CAR4/8モック(n=6匹のマウス)における特色シグネチャーからの転写シグネチャーについての遺伝子セットエンリッチメント分析。図５Ｇは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(G)28日目の時点の、浸潤されたBMからCAR T細胞によって産生されたエフェクター分子の代表的なフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験(n=5～6匹のマウス/群)からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として表されている。図５Ｈは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(H)28日目の時点の、浸潤されたBMからCAR T細胞によって産生されたエフェクター分子の代表的なフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験(n=5～6匹のマウス/群)からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として表されている。図５Ｉは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(I)図5Aに詳述される、2.10⁶個のCAR4/8モック又は2.10⁶個のCAR4 sgSOCS1/8モック又は2.10⁶個のCAR4モック/8 sgSOCS1又は2.10⁶個のCAR4/8 sgSOCS1を用いたATCT後のNALM6-LUC腫瘍成長。データは、2回の独立した実験(n=5～6匹のマウス/群)からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として表されている。図５Ｊは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(J)NSGマウスの生存のカプラン・マイヤー分析、ログ・ランク(マンテル・コックス)検定。データは、2回の独立した実験(n=5～6匹のマウス/群)からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として表されている。図５Ｋは、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCAR4 T細胞増大を回復させ、B-ALL疾患を制御することにおけるCAR8 T細胞効力をブーストすることを示した図である。(K)NALM6-LUCを持つマウスを4.10⁶個のCAR-T細胞で処理した。35日間の期間にわたる、動物あたりの定量された生物発光シグナルとして示される腫瘍量、n=5匹のマウス/群。データは、2回の独立した実験(n=5～6匹のマウス/群)からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として表されている。図６Ａは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(A)静脈内(IV)注射の4日後の、十分に免疫能力のあるC57BL6(同系)及びBALB/c(同種)マウスの脾臓における生CD45.1(H2-Kb)マリリンCD4 T細胞の代表的なフロープロット及び絶対数。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図６Ｂは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(B)静脈内(IV)注射の4日後の、十分に免疫能力のあるC57BL6(同系)及びBALB/c(同種)マウスの脾臓における生CD45.1(H2-Kb)マリリンCD4 T細胞の代表的なフロープロット及び絶対数。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図６Ｃは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(C)インビボゲノムワイドCRISPRスクリーニング設計の概略。図６Ｄは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(D)10⁷個のCD4 T細胞のIV注射の4日後の、十分に免疫能力のあるC57BL6及びBALB/cマウスにの脾臓における生CD45.1モック又はライブラリー変異マリリンCD4 T細胞の代表的なフロープロット及び絶対数。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図６Ｅは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(E)10⁷個のCD4 T細胞のIV注射の4日後の、十分に免疫能力のあるC57BL6及びBALB/cマウスにの脾臓における生CD45.1モック又はライブラリー変異マリリンCD4 T細胞の代表的なフロープロット及び絶対数。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図６Ｆは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(F)MAGeCK分析を使用した、C57BL6浸潤マウスからの多様性と比較した、BALB/cマウスにおけるライブラリー変異マリリン細胞生存のインビボゲノムワイドCRISPRプール化スクリーニングのメタ分析。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図６Ｇは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(G)C57BL6マウスと比較して、BALB/cマウスにおいて富化された遺伝子(Fas、B2m)を示す、各実験にわたる有意な個々のsgRNA分布の遺伝子レベルの表示。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図６Ｈは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(H)IV注射の4日後の、C57BL6マウス(同系)又はBALB/cマウス(同種)において共注射されたモック(コンジェニックマーカーCD45.1/2を発現する)及びFas不活性化マリリンCD4 T細胞(sgFas、CD45.1/1)によって浸潤された脾臓の代表的なフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図６Ｉは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(I)C57BL6マウス及びBALB/cマウスにおけるFas陰性マリリン細胞のパーセンテージ。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図６Ｊは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(J)IV注射の4日後の、C57BL6マウス又はBALB/cマウスにおいて共注射されたモック(コンジェニックマーカーCD45.1/2を発現する)及びB2m不活性化マリリンCD4 T細胞(sgB2m、CD45.1/1)によって浸潤された脾臓の代表的なフロープロット及び定量。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図６Ｋは、インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定することを示した図である。(K)C57BL6マウス及びBALB/cマウスにおけるB2m陰性マリリン細胞のパーセンテージ。データは、2回の独立した実験、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ａは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(A)BALB/cマウスにおけるC57BL6 T細胞の完全にMHC不一致な拒絶の実験設計の概略(スクリーニングモデル)。図７Ｂは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(B)IgG又は抗CD8a(200ug/日あたり)又は抗アシアロGM1(抗GM1、30ug/日あたり)枯渇抗体のいずれかを受けたマウスにおける、2.10⁶個のT細胞のIV注射の4日後の、十分に免疫能力のあるC57BL6及びBALB/cマウスの脾臓における、生CD45.1ポリクローナル(CD4及びCD8)T細胞の代表的なフロープロット及び絶対数。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｃは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(C)IgG又は抗CD8a(200ug/日あたり)又は抗アシアロGM1(抗GM1、30ug/日あたり)枯渇抗体のいずれかを受けたマウスにおける、2.10⁶個のT細胞のIV注射の4日後の、十分に免疫能力のあるC57BL6及びBALB/cマウスの脾臓における、生CD45.1ポリクローナル(CD4及びCD8)T細胞の代表的なフロープロット及び絶対数。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｄは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(D)sgRNA及びHIFI-Cas9を用いたエレクトロポレーションの4日後の、ポリクローナルCD45.1 T細胞(H2-Kb)におけるFasの注射前発現。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｅは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(E)Tide分析を使用した、sgSOCS1をエレクトロポレーションされたポリクローナルCD45.1 T細胞(H2-Kb)におけるインデル(indel)のパーセンテージ。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｆは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(F)Tide分析を使用した、sgSIOCS1及びFasをエレクトロポレーションされたポリクローナルCD45.1 T細胞(H2-Kb)におけるインデルのパーセンテージ。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｇは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(G)2.10⁶個のT細胞のIV注射の4日後の、十分に免疫能力のあるC57BL6及びBALB/cマウスの脾臓における、生ポリクローナルCD45.1 T細胞(H2-Kb)の代表的なフロープロット及び絶対数。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｈは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(H)同系及び同種マウスにおける、モック細胞と比較した、不活性化ポリクローナルCD45.1 T細胞倍変化生存。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｉは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(I)C57BL6マウスにおける、F1 T細胞(C57BL6×BALB/c)の半同種拒絶の実験設計の概略。図７Ｊは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(J)IgG又は抗CD8a(200ug/日あたり)又は抗NK1.1(30ug/日あたり)枯渇抗体のいずれかを受けたマウスにおける、2.10⁶個の細胞のIV注射の4日後の、C57BL6マウスの脾臓におけるF1マリリン細胞の数。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｋは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(K)抗NK1.1で処理されたC57BL6マウス由来のCD45.1 F1マリリンCD4 T細胞におけるH2-Kb及び(et)H2-Kdの発現。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｌは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(L)2.10⁶個のF1細胞のIV注射の4日後の、C57BL6マウスにおけるF1マリリンCD4 T細胞生存の代表的なフロープロット及び絶対数。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図７Ｍは、Fas標的化は、T細胞及びNK媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得ることを示した図である。(M)2.10⁶個のF1細胞のIV注射の4日後の、C57BL6マウスにおけるF1マリリンCD4 T細胞生存の代表的なフロープロット及び絶対数。データは、2回の独立した実験(G、H)、n=3～6匹のマウス/群からの、マン・ホイットニーU検定によって分析された平均として示されている。図８Ａは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(A)MHCバリアを越えたCD4又はCD8腫瘍特異的T細胞機能性を査定するための免疫能力のあるマウスモデルの概略。図８Ｂは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(B)2.10⁶個のF1 OT1細胞を用いたIV注射の15日後の、B16-OVAを持つC57BL6マウスの脾臓に浸潤したCD45.1 F1 OT1細胞の代表的なフロープロット及び絶対数。データは平均として示されている、n=3～5匹のマウス/群。図８Ｃは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(C)2.10⁶個のF1 OT1細胞を用いたIV注射の15日後の、B16-OVAを持つC57BL6マウスの腫瘍に浸潤し且つグランザイムBを発現する(GZB+)CD45.1 F1 OT1細胞の代表的なフロープロット及び絶対数。データは平均として示されている、n=3～5匹のマウス/群。図８Ｄは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(D)ヒトCAR-T細胞を使用した実験設計の概略。図８Ｅは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(E)sgTRACによるエレクトロポレーション後の、CD4及びCD8 T細胞の組成、CD19-CARbbz及びTCRbの発現を示すCAR-T細胞注射前表現型。データは平均として示されている、n=3～5匹のマウス/群。図８Ｆは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(F)エレクトロポレーションの4日後の、フローによる、操作されたCAR-T細胞におけるFasの発現。データは平均として示されている、n=3～5匹のマウス/群。図８Ｇは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(G)エレクトロポレーションの4日後の、TRAC不活性化A2-CAR-T細胞と比較した、TRAC/FAS/SOCS1不活性化A2-CAR-T細胞における、RT-qPCRによって査定されたSOCS1 mRNAの相対的発現。データは平均として示されている、n=3～5匹のマウス/群。図８Ｈは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(H)2.10⁶個のTRAC不活性化 A2-CAR-T細胞を用いたIV注射の15日後の、NSGマウスの骨髄(BM)におけるHLA、A、B、C+細胞の代表的なフロープロット。データは平均として示されている、n=3～5匹のマウス/群。図８Ｉは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(I)CAR-T細胞注射の15日後の、NSGマウス骨髄に浸潤したA2-CAR-T細胞の数。データは平均として示されている、n=3～5匹のマウス/群。図８Ｊは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(J)CAR-T細胞注射の15日後の、NSGマウス骨髄に浸潤したNalm6-sgB2mの数。データは平均として示されている、n=3～5匹のマウス/群。図８Ｋは、Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護することを示した図である。(K)CAR-T細胞注射の15日後の、NSGマウス骨髄に浸潤したA2+ T細胞の数。データは平均として示されている、n=3～5匹のマウス/群。

詳細な説明
定義
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、無傷抗体を含めたポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにフラグメント抗原結合(Fab)フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント、組み換えIgG(rlgG)フラグメント、抗原に特異的に結合し得る可変重鎖(VH)領域、単鎖可変フラグメント(scFv)を含めた単鎖抗体フラグメント、及び単一ドメイン抗体(例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ)フラグメントを含めた機能的(抗原結合)抗体フラグメントを含む。該用語は、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ、タンデムdi-scFv、タンデムtri-scFv等、遺伝子操作され且つ/又は別様に改変された形態の免疫グロブリンを包含する。別様に記述されない限り、「抗体」という用語は、その機能的抗体フラグメントを包含すると理解されるべきである。該用語は、IgG及びそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、並びにIgDを含めた、任意のクラス又はサブクラスの抗体を含めた、無傷又は全長抗体も包含する。

「抗体フラグメント」とは、無傷抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体の一部分を含む、無傷抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例は、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;直鎖状抗体;可変重鎖(VH)領域、scFv等の単鎖抗体分子、及び単一ドメインVH単一抗体;並びに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含むが、それらに限定されるわけではない。特定の実施形態において、抗体は、scFv等、可変重鎖領域及び/又は可変軽鎖領域を含む単鎖抗体フラグメントである。

「単一ドメイン抗体」とは、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部分、又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部分を含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。

本明細書において使用するとき、遺伝子発現の「抑制」とは、抑制の非存在下における遺伝子産物の発現のレベルと比較して、細胞における対象遺伝子によってコードされる1種又は複数の遺伝子産物の発現の排除又は低下を指す。例示的な遺伝子産物は、遺伝子によってコードされるmRNA及びタンパク質産物を含む。一部の場合における抑制は、一過性又は可逆的であり、他の場合には永続的である。一部の場合における抑制は、切り取られた又は非機能的な産物が産生され得るという事実にかかわらず、機能的な又は全長のタンパク質又はmRNAのものである。本明細書における一部の実施形態において、発現とは対照的に、遺伝子活性又は機能が抑制される。遺伝子抑制は、一般的に、人為的方法によって、すなわち化合物、分子、複合体、若しくは組成物の添加若しくは導入によって、及び/又はDNAレベルにおいて等、遺伝子の若しくは遺伝子と関連した核酸の破壊によって誘導される。遺伝子抑制のための例示的な方法は、遺伝子編集等、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウト、及び/又は遺伝子破壊技法を含む。例は、一般的に発現の一過性の低下をもたらすRNAi、siRNA、shRNA、及び/又はリボザイム等のアンチセンス技術、並びに、例えば断裂の誘導及び/又は相同組み換えによって、標的遺伝子不活性化又は破壊をもたらす遺伝子編集技法を含む。

本明細書において使用するとき、遺伝子の「破壊」とは、DNAレベルにおける、遺伝子の配列の変化を指す。例は、挿入、変異、及び欠失を含む。破壊は、典型的に、遺伝子によってコードされる正常な又は「野生型の」産物の発現の抑制及び/又は完全な非存在をもたらす。そのような遺伝子破壊の例は、挿入、フレームシフト、及びミスセンス変異、遺伝子全体の欠失を含めた、遺伝子又は遺伝子の一部の欠失、ノックイン、及びノックアウトである。そのような破壊は、終止コドンの挿入等によって、コーディング領域において、例えば1つは又は複数のエクソンにおいて生じ得、全長産物、機能的産物、又は任意の産物の産生不能をもたらす。そのような破壊は、プロモーター若しくはエンハンサー又は転写の活性化に影響を及ぼす他の領域における破壊によっても生じて、遺伝子の転写を阻止し得る。遺伝子破壊は、相同組み換えによる標的遺伝子不活性化を含めた遺伝子標的化を含む。

本発明の細胞
本発明に従った細胞は、典型的に、哺乳類細胞(本発明において動物細胞とも名付けられる)等の真核細胞、例えばヒト細胞である。

より特に、本発明の細胞は、血液、骨髄、リンパ液、又はリンパ系臓器(とりわけ胸腺)に由来し、自然又は適応免疫の細胞等の免疫系の細胞(すなわち、免疫細胞)、例えばリンパ球、典型的にはT細胞及び/又はNK細胞を含めた骨髄細胞又はリンパ系細胞である。

好ましくは本発明によれば、細胞は、とりわけ、T細胞、B細胞、及びNK細胞を含めたリンパ球である。

本発明に従った細胞は、リンパ系前駆体等の免疫細胞前駆体、及びより好ましくはT細胞前駆体でもあり得る。

T細胞前駆体は、典型的に、CD44、CD117、CD135、及びSca-1を含めたコンセンサスマーカー一式を発現するが、Petrie HT、Kincade PW、Many roads, one destination for T cell progenitors. The Journal of Experimental Medicine. 2005;202(1):11～13頁も参照されたい。

細胞は、典型的に、対象から直接単離されたもの及び/又は対象から単離され且つ冷凍されたもの等、初代細胞である。

治療されるべき対象に関して、本発明の細胞は同種且つ/又は自家であり得る。

一部の実施形態において、細胞は、機能、活性化状態、成熟度、分化の潜在力、増大、再循環、局在、及び/若しくは持続能、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器若しくはコンパートメントにおける存在、マーカー若しくはサイトカイン分泌プロファイル、並びに/又は分化の程度によって規定されるもの等、T細胞集団全体、CD4+細胞、CD8+細胞、及びその部分集団等、T細胞又は他の細胞タイプの1種又は複数のサブセットを含む。

T細胞並びに/又はCD4+及び/若しくはCD8+ T細胞のサブタイプ及び部分集団の中には、ナイーブT(T_N)細胞、エフェクターT細胞(T_EFF)、メモリーT細胞、並びに、幹細胞メモリーT(TSC_M)、セントラルメモリーT(TC_M)、エフェクターメモリーT(T_EM)、若しくは最終分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連不変T(MAIT)細胞、天然に存在し且つ適応性の調節性T(Treg)細胞、TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞等のヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞、及びデルタ/ガンマT細胞等、そのサブタイプがある。好ましくは、本発明に従った細胞は、幹/メモリー特性及びSuv39h1の阻害に起因したより高い再構成能を有するT_EFF細胞、並びにT_N細胞、TSC_M、TC_M、TE_M細胞、及びその組み合わせである。

一部の実施形態において、T細胞集団の1種又は複数は、表面マーカー等の1種若しくは複数の特定のマーカーに陽性である若しくはその高いレベルを発現する、又は1種若しくは複数のマーカーに陰性である若しくはその相対的に低いレベルを発現する細胞について富化される又は枯渇される。一部の場合において、そのようなマーカーは、T細胞のある特定の集団(非メモリー細胞等)に非存在である又は相対的に低いレベルで発現されるが、T細胞のある特定の他の集団(メモリー細胞等)に存在する又は相対的により高いレベルで発現されるものである。1つの実施形態において、細胞(CD8⁺細胞又はT細胞、例えばCD3⁺細胞等)は、CD117、CD135、CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127、及び/若しくはCD62Lに陽性である若しくはその高い表面レベルを発現する細胞について富化され(すなわち、正に選択される)、且つ/又はCD45RAに陽性である若しくはその高い表面レベルを発現する細胞について枯渇される(例えば、負に選択される)。一部の実施形態において、細胞は、CD122、CD95、CD25、CD27、及び/又はIL7-Ra(CD127)に陽性の又はその高い表面レベルを発現する細胞について富化される又は枯渇される。一部の例において、CD8+ T細胞は、CD45ROに陽性(又はCD45RAに陰性)且つCD62Lに陽性の細胞について富化される。

例えば、本出願によれば、細胞は、CD4+ T細胞集団及び/又はCD8+ T細胞部分集団、例えばセントラルメモリー(T_CM)細胞について富化された部分集団を含み得る。代替的に、細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞、MAIT細胞、自然リンパ系細胞(ILC)、及びB細胞を含めた、他のタイプのリンパ球であり得る。

本発明に従った操作のための細胞及び細胞を含有する組成物は、例えば対象から獲得された又は対象に由来するサンプル、とりわけ生物学的サンプルから単離される。典型的に、対象は、細胞療法(養子細胞療法)を必要とし、且つ/又は細胞療法を受けるであろう。対象は、好ましくは哺乳類、とりわけヒトである。本出願の1つの実施形態において、対象は癌を有する。

サンプルは、組織、体液、及び対象から直接採取された他のサンプル、並びに分離、遠心分離、遺伝子操作(例えば、ウイルスベクターを用いた形質導入)、洗浄、及び/又はインキュベーション等の1種又は複数の処理工程により生じるサンプルを含む。それ故に、生物学的サンプルは、生物学的供給源から直接獲得されたサンプル又は処理されているサンプルであり得る。生物学的サンプルは、それに由来する処理されたサンプルを含めた、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、及び汗等の体液、組織、並びに臓器サンプルを含むが、それらに限定されるわけではない。好ましくは、細胞が由来する又は単離されるサンプルは、血液若しくは血液由来サンプルである、又はアフェレーシス若しくは白血球アフェレーシス産物である若しくはそれに由来する。例示的なサンプルは、全血、末梢血単核細胞(PBMC)、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、脾臓、他のリンパ系組織、及び/又はそれに由来する細胞を含む。サンプルは、細胞療法(典型的に養子細胞療法)の背景において、自家及び同種供給源由来のサンプルを含む。

一部の実施形態において、細胞は、細胞株、例えばT細胞株に由来する。細胞は、マウス、ラット、非ヒト霊長類、又はブタ等の異種供給源からも獲得され得る。好ましくは、細胞はヒト細胞である。

SOCS-1に欠陥のある細胞
本開示は、SOCS1に欠陥のある細胞、より具体的には免疫細胞を包含する。一部の実施形態において、SOCS1欠陥細胞は、FAS、β2m、SUV39h1、又はその組み合わせに更に欠陥があり得る。

本明細書において使用するとき、「SOCS-1」又は「サイトカインシグナル伝達サプレッサー1」という用語は、当技術分野におけるその一般的意味を有し、サイトカインシグナル変換を調節する古典的な負のフィードバックシステムの一部を形成するSOCSファミリータンパク質に対する一部である。ヒトゲノムにおいてコードされる8種のSOCSタンパク質、SOCS1～7及びCISがある。8種すべては、SH2ドメイン及び短いC末端ドメインのSOCSボックス1の存在によって規定される。すべてのSOCSタンパク質のSOCSボックスは、アダプター複合体のエロンギン(elongin)B、Cと結び付いて見い出される。この結び付きは、E3ユビキチンリガーゼ足場(キュリン(Cullin)5)の導きを可能にして、それらのSH2ドメインによって導かれるシグナル伝達中間体のユビキチン化を触媒する(Kamizono Sら、「The SOCS box of SOCS-1 accelerates ubiquitin-dependent proteolysis of TEL-JAK2」、J Biol Chem. 2001年4月20日;276(16):12530～8頁)。

それらのユビキチンリガーゼ活性に加えて、SOCS1及びSOCS3は、JAK(ヤヌスキナーゼ)のキナーゼ活性を直接阻害する能力も有することが独特である。この活性は、KIR(キナーゼ阻害領域)として知られる、SH2ドメインのすぐ上流にある短いモチーフに依存する。SOCS1のKIRは、JAKの高度に進化したインヒビターであり、基質チロシンを模倣するヒスチジン残基を含めた、このモチーフ内の任意の残基の変異は、アフィニティーの有意な減少につながる。SOCS1は、特に、とりわけJAK1及びJAK2並びにTYK2触媒活性の直接的な強力で且つ選択的なインヒビターであり、故に、典型的に、インターロイキン-4(IL-4)、IL-6、IL-2、インターフェロン(IFN)-アルファ、インターフェロン(IFN)-ガンマ、プロラクチン、成長ホルモン、及びエリスロポエチンを含めた多数のサイトカイン、JAK/STAT3経路を通じたそのシグナルの負の調節に関わる。(とりわけSOCS1活性に関する詳細に関しては、Sharma J、Larkin J 3rd.「Therapeutic Implication of SOCS1 Modulation in the Treatment of Autoimmunity and Cancer」、Front Pharmacol. 2019;10:324;Liau NPD、Laktyushin A、Lucet ISら「The molecular basis of JAK/STAT inhibition by SOCS1」、Nat Commun. 2018;9(1):1558;Sporri B、Kovanen PE、Sasaki A、Yoshimura A、Leonard WJ.「JAB/SOCS1/SSI-1 is an interleukin-2-induced inhibitor of IL-2 signaling」、Blood. 2001;97(1):221～226頁;Alexander WS、Starr R、Fenner JEら「SOCS1 is a critical inhibitor of interferon gamma signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of this cytokine」、Cell. 1999;98(5):597～608頁、並びにKamizono S、Hanada T、Yasukawa Hら「The SOCS box of SOCS-1 accelerates ubiquitin-dependent proteolysis of TEL-JAK2」、J Biol Chem. 2001;276(16):12530～12538頁;及びFrantsve J、Schwaller J、Sternberg DW、Kutok J、Gilliland DG.「Socs-1 inhibits TEL-JAK2-mediated transformation of hematopoietic cells through inhibition of JAK2 kinase activity and induction of proteasome-mediated degradation」、Mol Cell Biol. 2001;21(10):3547～3557頁を参照されたい)。このタンパク質は、JAK結合タンパク質(JAB)、STAT誘導性STATインヒビター1(SSI-1)、又はTec相互作用タンパク質3(TIP-3)としても知られる。ヒトSOCS-1タンパク質は、UNIPROTにおいてO15524として言及され、第16染色体(11,254,408～11,256,204逆鎖)に位置する遺伝子SOCS-1によってコードされ、EnsemblデータベースにおいてENSG00000185338として言及される。SOCS-1という用語は、すべてのSOCS-1オルソログも包含する。一部の実施形態において、本発明に従ったタンパク質SOCS-1は、配列番号1のものである:

本明細書において使用するとき、本発明に従った「SOCS1に欠陥のある」という表現は、例えば、JAKに対するSOCS1の結合の遮断及び/又はエロンギンBCを通じたE3ユビキチンリガーゼ足場(キュリン5)の導きの遮断等、SOCS-1活性の阻害又は遮断を指す。一部の実施形態において、SOCS1の阻害は、JAK(JAK1/2及び/又はTYK2を含む)に対するSOCS1の結合を阻止することによって、及び/又はSOCS1ボックスが、E3複合体導きの重要な中間体であるエロンギンCに結合するのを阻止することによって獲得され得る。

また本明細書において使用するとき、「Suv39h1」又は「H3K9ヒストンメチルトランスフェラーゼSuv39h1」という用語は、当技術分野におけるその一般的意味を有し、モノメチル化H3-Lys-9を基質として使用してヒストンH3のLys-9残基を特異的にトリメチル化するヒストンメチルトランスフェラーゼ「斑入り3-9ホモログ1のサプレッサー(suppressor of variegation 3-9 homolog 1)(ショウジョウバエ(Drosophila))」を指す(Aagaard L、Laible G、Selenko P、Schmid M、Dorn R、Schotta G、Kuhfittig S、Wolf A、Lebersorger A、Singh PB、Reuter G、Jenuwein T(1999年6月)「Functional mammalian homologues of the Drosophila PEV-modifier Su(var)3-9 encode centromere-associated proteins which complex with the heterochromatin component M3 1」、EMBO J 1 8(7):1923～38頁も参照されたい)。ヒストンメチルトランスフェラーゼは、MG44、KMT1A、SUV39H、SUV39H1、ヒストン-リジンN-メチルトランスフェラーゼSUV39H1、H3-K9-HMTase 1、OTTHUMP00000024298、Su(var)3-9ホモログ1、リジンN-メチルトランスフェラーゼ1A、ヒストンH3-K9メチルトランスフェラーゼ1、位置効果斑入り3-9ホモログ(position-effect variegation 3-9 homolog)、ヒストン-リジンN-メチルトランスフェラーゼ、又はH3リジン-9特異的1としても知られる。ヒトSuv39h1メチルトランスフェラーゼは、UNIPROTにおいてO43463として言及され、x染色体に位置する遺伝子Suv39h1(NCBIにおけるgene ID:6839)によってコードされる。本発明に従ったSuv39h1という用語は、SU(VAR)3-9等、SUV39H1のすべてのオルソログも包含する。一部の実施形態において、本発明に従ったタンパク質SUV39H1は、配列番号2又は3のものである。

配列番号2:

配列番号3:

本明細書において使用するとき、「Fas」又は「Fas細胞表面デス受容体」という用語は、当技術分野におけるその一般的意味を有し、TNFSF6/FASLGに対する受容体を指す。Fas受容体(FasR)、アポトーシス抗原1(APO-1又はAPT)、分化抗原群95(CD95)、又は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー6(TNFRSF6)としても知られ、Fasは、ヒトではFAS遺伝子によってコードされるタンパク質である。FASは、それがそのリガンドのFasリガンド(FasL)に結合し、故に細胞死誘導シグナル伝達複合体(DISC)を形成し、且つアダプター分子FADDを介して後続のカスパーゼ8活性化を誘導した場合に、プログラム細胞死(アポトーシス)につながる、細胞の表面に位置するデス受容体である。それは、2つのアポトーシス経路の一方であり、他方はミトコンドリア経路である。ヒトFasは、UNIPROTにおいてP25445(TNR6_HUMAN)として言及され、第10染色体(88,990,531～89,017,059順鎖)に位置する遺伝子FASによってコードされ、EnsemblデータベースにおいてENSG00000026103として言及される。FASという用語は、すべてのFAS1オルソログも包含する。

一部の実施形態において、本明細書において意図されるタンパク質FASは、配列番号4のものである。

配列番号4:

ベータ-2-ミクログロブリン(β2m)は、クラスI主要組織適合性複合体(MHC)の成分である。免疫系に対するペプチド抗原の提示に関わる。ヒトβ2mは、染色***置15q21.1(第15染色体:44,711,487～44,718,851順鎖)を有するB2M遺伝子によってコードされ、Ensembl データベースにおいてB2M ENSG00000166710(又はHGNC ID:HGNC:914)として言及される。

β2m前駆体は、典型的に配列番号(SEQ US NO)5のものであり、それは成熟形態に更にプロセシングされる。

本明細書において使用するとき、本出願に従った「SOCS1に欠陥のある」、「Suv39h1に欠陥のある」、「FASに欠陥のある」、又はβ2mに欠陥のあるという表現は、細胞における、上で詳述されるSOCS1及び/若しくはSuv39h1及び/若しくはFAS活性、並びに/又はβ2m活性の阻害又は遮断を指す。

本出願において意図される「SOCS1活性の阻害」又は「Suv39h1活性の阻害」又は「FAS活性の阻害」又は「β2m活性の阻害」とは、相当する野生型細胞において阻害されないSOCS1、Suv39h1、又はFASタンパク質の活性又はレベルと比較して、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、若しくは99%、又はそれを上回る割合の、SOCS1活性の、Suv39h1の、FASの、又はβ2m活性の減少を指す。好ましくは、SOCS1活性の、Suv39h1の、又はFAS活性の阻害は、それぞれSOCS1、Suv39h1、又はFASの実質的な検出可能な活性の、細胞における非存在につながる。

SOCS1及び/又はSuv39h1及び/又はFAS及び/又はβ2mに欠陥のある細胞は、それぞれSOCS1及び/又はSuv39h1及び/又はFAS及び/又はB2M遺伝子の抑制又は破壊によって、しかしまた転写後レベル(SOCS1 mRNA及び/又はSuv39h1及び/又はFAS mRNA及び/又はβ2m mRNA)でも、SOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1及び/又はβ2mの翻訳後又はタンパク質レベルでも獲得され得ることが留意されるべきである。

故に、SOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1及び/又はβ2m活性の阻害はまた、SOCS1及び/若しくはFAS及び/若しくはSuv39h1及び/若しくはβ2m遺伝子発現の抑制を通じて、又はSOCS1及び/若しくはFAS及び/若しくはSuv39h1及び/若しくはB2M遺伝子破壊を通じて達成され得る。本発明によれば、抑制は、抑制の非存在下において又は相当する野生型細胞において方法によって産生される同じ細胞(すなわち、相当する細胞)に関する少なくとも50、60、70、80、90、又は95%分、細胞、とりわけ本発明の免疫細胞におけるSOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1及び/又はβ2mの発現を低下させる(本明細書に含まれる結果において例示されるように)。遺伝子破壊はまた、SOCS1及び/若しくはFAS及び/若しくはSuv39h1及び/若しくはβ2mタンパク質の発現の低下に、又は非機能的SOCS1タンパク質及び/若しくは非機能的FASタンパク質及び/若しくは非機能的Suv39h1タンパク質及び/若しくは非機能的β2mタンパク質の発現につながり得る。

「非機能的SOCS1タンパク質」、「非機能的FASタンパク質」、「非機能的Suv39h1タンパク質」、又は「非機能的β2mタンパク質」によって、それは、本明細書において、上で記載される活性の低下又は検出可能な活性の欠如を有するタンパク質を意図する。

一部の実施形態において、本発明に従った細胞におけるSOCS1活性のインヒビターは、JAK及び/若しくはエロンギンCへのSOCS1の結合を阻止する又はSOCS1遺伝子発現を阻害する能力を有する天然又は非天然の任意の化合物又は作用物質の中から選択され得る。本発明に従った細胞におけるSOCS1活性のインヒビターは、とりわけ上で触れられるSOCS1活性を阻害する又はSOCS1遺伝子発現を阻害する能力を有する天然又は非天然の任意の化合物又は作用物質の中から選択され得る。

一部の実施形態において、Lilian W Waiboci、Howard M Johnson、James P Martin、及びChulbul M Ahmed、J Immunol 2007年4月1日、178(補足1)S170;又はWaiboci LW、Ahmed CM、Mujtaba MGら、J Immunol. 2007;178(8):5058～5068頁に記載されるSOCS1のペプチド模倣体又は自己リン酸化部位pJAK2(1001～1013)が使用され得る。

一部の実施形態において、本発明に従った細胞におけるFAS活性のインヒビターは、FAS受容体活性化を阻止する又はFAS遺伝子発現を阻害する能力を有する天然又は非天然の任意の化合物又は作用物質の中から選択され得る。

一部の実施形態において、本発明に従った細胞におけるSuv39h1活性のインヒビターは、H3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼによるヒストンH3のLys-9のメチル化を阻害する又はH3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1遺伝子発現を阻害する能力を有する天然又は非天然の任意の化合物又は作用物質の中から選択され得る。本発明に従った細胞におけるSuv39h1活性のインヒビターは、H3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼによるヒストンH3のLys-9のメチル化を阻害する又はH3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1遺伝子発現を阻害する能力を有する天然又は非天然の任意の化合物又は作用物質の中から選択され得る。

本出願に従った免疫細胞におけるSOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1及び/又はβ2mの阻害(遺伝子及び/又はタンパク質レベルにおける)は、永続的であり且つ不可逆的又は一過性又は可逆的であり得る。しかしながら、好ましくは、SOCS1阻害及び/又はFAS阻害及び/又はSuv39h1阻害は、永続的且つ不可逆的である。細胞におけるSOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1の阻害は、下で記載されるように、標的患者における細胞の注射前又は後に達成され得る。

本発明に従った遺伝子操作された細胞
一部の実施形態において、細胞は、1種又は複数の抗原受容体をコードする、遺伝子操作により導入された1種又は複数の核酸を含む。

典型的に、核酸は異種である(すなわち、例えば、操作されている細胞に及び/又はそのような細胞が由来する生物に通常では見い出されない)。一部の実施形態において、核酸は、複数の異なる細胞タイプ由来の様々なドメインをコードする核酸のキメラ組み合わせを含めて、天然に存在しない。

本発明に従った抗原受容体の中には、遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)及びその成分、並びにキメラ抗原受容体(CAR)等の機能的非TCR抗原受容体がある。

キメラ抗原受容体(CAR)
一部の実施形態において、操作された抗原受容体は、活性化若しくは刺激性CAR、共刺激性CAR(WO2014/055668を参照されたい)、及び/又は阻害性CAR(iCAR、Fedorovら、Sci. Transl. Medicine、5(215)(2013年12月)を参照されたい)を含めた、キメラ抗原受容体(CAR)を含む。

キメラ抗原受容体(CAR)(キメラ免疫受容体、キメラT細胞受容体、人工T細胞受容体としても知られる)は、免疫エフェクター細胞(T細胞)上に任意の特異性を接ぎ木する操作された受容体である。典型的に、これらの受容体を使用して、レトロウイルスベクターによって促されるそれらのコード配列の移入を用いて、T細胞上にモノクローナル抗体の特異性を接ぎ木する。

CARは、一部の実施形態において、リンカー及び/又は膜貫通ドメインを介して、1種又は複数の細胞内シグナル伝達成分に連結された細胞外抗原(又はリガンド)結合ドメインを一般的に含む。そのような分子は、典型的に、天然抗原受容体を通じたシグナル、共刺激性受容体との組み合わせでのそのような受容体を通じたシグナル、及び/又は共刺激性受容体単独を通じたシグナルを模倣する又は近似する。

一部の実施形態において、CARは、癌マーカー等、養子療法によって標的にされる対象となる特定の細胞タイプにおいて発現される抗原等の特定の抗原(又はマーカー又はリガンド)に対する特異性を有するように構築される。故に、CARは、典型的に、その細胞外部分に、1種若しくは複数の抗原結合フラグメント、ドメイン、若しくは一部分、又は1種若しくは複数の抗体可変ドメイン及び/若しくは抗体分子等、1種又は複数の抗原結合分子を含む。

抗原に結合させるために使用される部分は、抗体に由来する単鎖抗体フラグメント(scFv)、ライブラリーから選択されるFab'、又はそれらの同族受容体に関与する天然リガンド(第1世代のCARに対する)のいずれか、という3つの一般的カテゴリーに入る。これらのカテゴリーのそれぞれにおける成功例は、とりわけSadelain M、Brentjens R、Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer discovery. 2013;3(4):388～398頁(とりわけ表1を参照されたい)において報告され、本出願に含まれる。マウス免疫グロブリンに由来するscFvは、それらが、十分に特徴付けされたモノクローナル抗体から容易に得られることから、よく使用される。

典型的に、CARは、モノクローナル抗体(mAb)の可変重鎖(VH)及び可変軽鎖(VL)に由来する単鎖抗体フラグメント(scFv)等、抗体分子の1つ又は複数の抗原結合部分を含む。

一部の実施形態において、CARは、本明細書に記載される又は当技術分野において公知の標的抗原のいずれか等の腫瘍細胞又は癌細胞等、標的にされる対象となる細胞又は疾患の癌マーカー又は細胞表面抗原等の抗原に特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む。

一部の実施形態において、CARは、細胞の表面で発現される無傷抗原等の抗原を特異的に認識する抗体又は抗原結合フラグメント(例えば、scFv)を含有する。

一部の実施形態において、CARは、MHC-ペプチド複合体として細胞表面に提示される腫瘍関連抗原等の細胞内抗原を特異的に認識する、抗体又は抗原結合フラグメント(例えば、scFv)等のTCR様抗体を含有する。一部の実施形態において、MHC-ペプチド複合体を認識する抗体又はその抗原結合部分は、抗原受容体等の組み換え受容体の一部として細胞上で発現され得る。抗原受容体の中には、キメラ抗原受容体(CAR)等の機能的非TCR抗原受容体がある。一般的に、ペプチド-MHC複合体に向けられたTCR様特異性を呈する抗体又は抗原結合フラグメントを含有するCARは、TCR様CARとも称され得る。

一部の態様において、抗原特異的結合又は認識成分は、1種又は複数の膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。一部の実施形態において、CARは、CARの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含む。1つの実施形態において、CARにおけるドメインの1つと天然に結び付く膜貫通ドメインが使用される。一部の場合において、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を避けるように選択される又はアミノ酸置換によって改変される。

一部の実施形態における膜貫通ドメインは、天然又は合成の供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通領域は、T細胞受容体のアルファ、ベータ、又はゼータ鎖、CD28、CD3エプシロン、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来するものを含む(すなわち、その少なくとも膜貫通領域を含む)。膜貫通ドメインは合成でもあり得る。

一部の実施形態において、短いオリゴ又はポリペプチドリンカー、例えば長さが2～10個のアミノ酸のリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に存在し且つ連結を形成する。

CARは、一般的に、少なくとも1種又は複数の細胞内シグナル伝達成分を含む。第1世代CARは、典型的に、内因性TCRからのシグナルの主たる伝達物質であるCS3ζ鎖由来の細胞内ドメインを有した。第2世代CARは、典型的に、T細胞への付加的なシグナルを提供するために、CARの細胞質尾部に、様々な共刺激性タンパク質受容体(例えば、CD28、41BB、ICOS)由来の細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。前臨床調査は、第2世代がT細胞の抗腫瘍活性を向上させることを示した。より最近では、第3世代CARは、効能を増進させるために、CD3z-CD28-41BB又はCD3z-CD28-OX40等、複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせる。

例えば、CARは、T細胞活性化及び細胞傷害性を媒介するTCR CD3+鎖等、TCR複合体の細胞内成分、例えばCD3ゼータ鎖を含み得る。故に、一部の態様において、抗原結合分子は、1種又は複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。一部の実施形態において、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、及び/又は他のCD膜貫通ドメインを含む。CARは、Fc受容体γ、CD8、CD4、CD25、又はCD16等、1種又は複数の付加的な分子の一部分も更に含み得る。

一部の実施形態において、CARのライゲーションがあると、CARの細胞質ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインは、相当する操作されていない免疫細胞(典型的にT細胞)の正常なエフェクター機能又は応答の少なくとも1つを活性化する。例えば、CARは、細胞溶解活性又はTヘルパー活性、サイトカイン若しくは他の因子の分泌等、T細胞の機能を誘導し得る。

一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞受容体(TCR)の細胞質配列、及び一部の態様ではまた、天然の背景においてそのような受容体と協調して作用して、抗原受容体関与後のシグナル変換を始動する共受容体のもの、及び/又はそのような分子の任意の誘導体若しくは変種、及び/又は同じ機能的能力を有する任意の合成配列を含む。

T細胞活性化は、一部の態様において、2つのクラスの細胞質シグナル伝達配列;TCRを通じて抗原依存的一次活性化を始動するもの(一次細胞質シグナル伝達配列)、及び抗原非依存的様式で作用して二次又は共刺激性シグナルを提供するもの(二次細胞質シグナル伝達配列)、によって媒介されるものとして記載される。一部の態様において、CARは、そのようなシグナル伝達成分の一方又は両方を含む。

一部の態様において、CARは、刺激性方式又は阻害性方式のいずれかでTCR複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激性様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例は、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3エプシロン、CDS、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66dに由来するものを含む。一部の実施形態において、CARにおける細胞質シグナル伝達分子は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部分、又はCD3ゼータに由来する配列を含有する。

CARは、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、及びICOS等、共刺激性受容体のシグナル伝達ドメイン及び/又は膜貫通部分も含み得る。一部の態様において、同じCARが、活性化及び共刺激性成分の両方を含む;代替的に、活性化ドメインは一方のCARによって提供され、一方で共刺激性成分は、別の抗原を認識するもう一方のCARによって提供される。

一部の実施形態において、CARは、文献において典型的に公知のCD19 BBz CARである。典型的に、そのようなCARは、以下の構築物を含む:scFv抗CD19(FMC63)-CD8ヒンジ及び膜貫通-CD3z細胞内。任意選択で、構築物は、以下のようにCD8シグナルペプチドを含む:CD8シグナルペプチド-scFv抗CD19(FMC63)-CD8ヒンジ及び膜貫通-CD3z細胞内。

CAR又は他の抗原受容体は、阻害性CAR(例えば、iCAR)でもあり得、免疫応答等の応答を弱める又は抑止する細胞内成分を含む。そのような細胞内シグナル伝達成分の例は、PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受容体、A2ARを含むEP2/4アデノシン受容体を含めた、免疫チェックポイント分子上に見い出されるものである。一部の態様において、操作された細胞は、そのような阻害性分子の又はそれに由来するシグナル伝達ドメインを含む阻害性CARを含み、それにより、それは応答を弱める働きをする。そのようなCARを使用して、例えば、活性化受容体、例えばCARによって認識される抗原が正常細胞の表面でも発現される又は発現され得る場合のオフターゲット効果の可能性を低下させる。

TCR
一部の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、組み換えT細胞受容体(TCR)及び/又は天然に存在するT細胞からクローン化されたTCRを含む。

「T細胞受容体」又は「TCR」とは、可変a及びβ鎖(それぞれTCRa及びTCRpとしても知られる)又は可変γ及びδ鎖(それぞれTCRy及びTCR5としても知られる)を含有し、且つMHC受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合し得る分子を指す。一部の実施形態において、TCRはαβ形態にある。典型的に、αβ及びγδ形態で存在するTCRは、一般的に構造上同様であるが、それらを発現するT細胞は、個別の解剖学的位置又は機能を有し得る。TCRは、細胞の表面に又は可溶性形態で見い出され得る。一般的に、TCRは、T細胞(又はTリンパ球)の表面に見い出され、それは、一般的に、主要組織適合性複合体(MHC)分子に結合した抗原を認識することに関与する。一部の実施形態において、TCRは、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、及び/又は短い細胞質尾部も含有し得る(例えば、Janewayら、Immunobiology: The Immune System in Health and Disease、第3編、Current Biology Publications、4頁:33、1997を参照されたい)。例えば、一部の態様において、TCRの各鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びC末端における短い細胞質尾部を所有し得る。一部の実施形態において、TCRは、シグナル変換を媒介することに関わるCD3複合体の不変タンパク質と結び付く。別様に記述されない限り、「TCR」という用語は、その機能的TCRフラグメントを包含すると理解されるべきである。該用語は、αβ形態又はγδ形態のTCRを含めた、無傷又は全長TCRも包含する。

故に、本明細書における目的上、TCRへの言及は、MHC分子に結合した特異的抗原ペプチド、すなわちMHC-ペプチド複合体、に結合するTCRの抗原結合部分等、任意のTCR又は機能的フラグメントを含む。互換可能に使用され得る、TCRの「抗原結合部分」又は「抗原結合フラグメント」とは、TCRの構造ドメインの一部分を含有するが、完全なTCRが結合する抗原(例えば、MHC-ペプチド複合体)に結合する分子を指す。一部の場合において、抗原結合部分は、一般的に各鎖が3つの相補性決定領域を含有する場合等、特異的MHC-ペプチド複合体への結合のための結合部位を形成するのに十分な、TCRの可変a鎖及び可変β鎖等、TCRの可変ドメインを含有する。

一部の実施形態において、TCR鎖の可変ドメインは会合して、ループ、又は免疫グロブリンに類似した相補性決定領域(CDR)を形成し、それは、抗原認識を付与し、TCR分子の結合部位を形成することによってペプチド特異性を決定し、ペプチド特異性を決定する。典型的に、免疫グロブリンのように、CDRは、フレームワーク領域(FR)によって分離される(例えば、Joresら、Pwc. Nat'lAcad. Sci. U.S.A. 87:9138頁、1990;Chothiaら、EMBO J. 7:3745頁、1988を参照されたい;Lefrancら、Dev. Comp. Immunol. 27:55頁、2003も参照されたい)。一部の実施形態において、CDR3は、プロセシングされた抗原を認識することに関与する主要なCDRであるが、とはいえアルファ鎖のCDR1も、抗原ペプチドのN末端部分と相互作用することが示されており、一方でベータ鎖のCDR1は、ペプチドのC末端部分と相互作用する。CDR2は、MHC分子を認識すると考えられる。一部の実施形態において、β鎖の可変領域は、更なる超可変性(HV4)領域を含有し得る。

一部の実施形態において、TCR鎖は定常ドメインを含有する。例えば、免疫グロブリンのように、TCR鎖(例えば、a鎖、β鎖)の細胞外部分は、2つの免疫グロブリンドメイン、N末端における可変ドメイン(例えば、Va又はVp;典型的に、Kabat番号付けに基づくアミノ酸1～116、Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、US Dept. Health and Human Services、Public Health Service National Institutes of Health、1991、第5編)、及び細胞膜に近接した1つの定常ドメイン(例えば、a鎖定常ドメイン又はCa、典型的に、Kabatに基づくアミノ酸117～259、β鎖定常ドメイン又はCp、典型的に、Kabatに基づくアミノ酸117～295)を含有し得る。例えば、一部の場合において、2本の鎖によって形成されるTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメイン、及びCDRを含有する2つの膜遠位可変ドメインを含有する。TCRドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、2本の鎖の間に連結を作る、短い接続配列を含有する。一部の実施形態において、TCRは、a及びβ鎖のそれぞれに付加的なシステイン残基を有し得、それにより、TCRは、定常ドメインに2つのジスルフィド結合を含有する。

一部の実施形態において、TCR鎖は膜貫通ドメインを含有し得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは正に帯電している。一部の場合において、TCR鎖は細胞質尾部を含有する。一部の場合において、構造は、TCRが、CD3のような他の分子と結び付くのを可能にする。例えば、膜貫通領域とともに定常ドメインを含有するTCRは、細胞膜にタンパク質を固定し得、CD3シグナル伝達装置又は複合体の不変サブユニットと結び付き得る。

一般的に、CD3は、哺乳類における3種の個別の鎖(γ、δ、及びε)、及びζ鎖を所有し得る多タンパク質複合体である。例えば、哺乳類において、複合体は、CD3y鎖、CD35鎖、2つのCD3s鎖、及びCD3ζ鎖のホモ二量体を含有し得る。CD3y、CD35、及びCD3s鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に近縁の細胞表面タンパク質である。CD3y、CD35、及びCD3s鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、それは、これらの鎖が、正に帯電したT細胞受容体鎖と結び付くのを可能にする特徴である。CD3y、CD35、及びCD3s鎖の細胞内尾部それぞれは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はITAMとして知られる単一の保存されたモチーフを含有し、一方で各CD3ζ鎖は3つ有する。一般的に、ITAMは、TCR複合体のシグナル伝達能に関わる。これらの補助分子は、負に帯電した膜貫通領域を有し、TCRから細胞内にシグナルを伝えることにおいて役割を果たす。CD3鎖及びζ鎖は、TCRとともに、T細胞受容体複合体として知られるものを形成する。

一部の実施形態において、TCRは、2種の鎖a及びβ(又は任意選択で、γ及びδ)のヘテロ二量体であり得る、又はそれは単鎖TCR構築物であり得る。一部の実施形態において、TCRは、1つ又は複数のジスルフィド結合等によって連結されている2種の別個の鎖(a及びβ鎖又はγ及びδ鎖)を含有するヘテロ二量体である。

HLA非依存的様式で関心対象の抗原に結合する組み換えHLA非依存的(又は非HLA拘束)T細胞受容体(「HI-TCR」と称される)は、国際出願第WO2019/157454号に記載される。そのようなHI-TCRは、(a)HLA非依存的様式で抗原に結合する抗原結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変領域の抗原結合フラグメント;及び(b)CD3ζポリペプチドと結び付き得る(且つその結果として活性化する)定常ドメイン、を含む抗原結合鎖を含む。典型的に、TCRはHLA依存的様式で抗原に結合するため、HLA非依存的様式で結合する抗原結合ドメインは異種であるはずである。好ましくは、抗原結合ドメイン又はそのフラグメントは、(i)抗体の重鎖可変領域(VH)、及び/又は(ii)抗体の軽鎖可変領域(VL)、を含む。TCRの定常ドメインは、例えば天然の若しくは改変されたTRACポリペプチド、又は天然の若しくは改変されたTRBCポリペプチドである。TCRの定常ドメインは、例えば天然TCR定常ドメイン(アルファ又はベータ)又はそのフラグメントである。典型的にそれら自身が細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体とは異なり、HI-TCRは、活性化シグナルを直接産生せず;その代わりに、抗原結合鎖がCD3ζポリペプチドと結び付き且つその結果として活性化する。組み換えTCRを含む免疫細胞は、抗原が、細胞あたり約10,000分子未満の細胞表面での低い密度を有する場合、優れた活性を提供する。

CD3ζポリペプチドは、例えば天然のCD3ζポリペプチド又は改変されたCD3ζポリペプチドである。CD3ζポリペプチドは、任意選択で、共刺激性分子又はそのフラグメントの細胞内ドメインに融合される。代替的に、抗原結合ドメインは、抗原への抗原結合鎖の結合があると免疫応答性細胞を刺激し得る共刺激性領域、例えば細胞内ドメインを任意選択で含む。例となる共刺激性分子は、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP-10、そのフラグメント、又はその組み合わせを含む。一部の実施形態において、組み換えHI-TCRは、免疫応答性細胞の内因性遺伝子座、例えばCD3δ遺伝子座、CD3ε遺伝子座、CD247遺伝子座、B2M遺伝子座、TRAC遺伝子座、TRBC遺伝子座、TRDC遺伝子座、及び/又はTRGC遺伝子座に組み込まれる導入遺伝子によって発現される。ほとんどの実施形態において、組み換えHI-TCRの発現は、内因性TRAC又はTRBC遺伝子座から推進される。一部の実施形態において、組み換えHI-TCRの一部分をコードする導入遺伝子は、天然TCRα鎖及び/又は天然TCRβ鎖を含むTCRの内因性発現を破壊する又は消滅させる様式で、内因性TRAC及び/又はTRBC遺伝子座に組み込まれる。この破壊は、免疫応答性細胞における組み換えTCRと天然TCRα鎖及び/又は天然TCRβ鎖との間の誤対合を阻止する又は排除する。内因性遺伝子座は、改変された転写ターミネーター領域、例えばTK転写ターミネーター、GCSF転写ターミネーター、TCRA転写ターミネーター、HBB転写ターミネーター、ウシ成長ホルモン転写ターミネーター、SV40転写ターミネーター、及びP2Aエレメントも含み得る。

組み換えHI-TCRは、本発明の免疫細胞における他の特質と更に組み合わせられ得る。例えば、免疫細胞は、抗原特異的受容体が、異種抗原結合ドメイン及び天然TCR定常ドメイン又はそのフラグメントを含む改変されたTCRであり、抗原特異的受容体がCD3ゼータポリペプチドを活性化し得る、細胞である。例えば、免疫細胞は、少なくとも1種のキメラ共刺激性受容体(CCR)及び/又は少なくとも1種のキメラ抗原受容体を更に含み得る。

更に、免疫細胞において、HI-TCRの抗原結合ドメインをコードする核酸は、免疫細胞の内因性TRAC遺伝子座及び/又はTRBC遺伝子座に挿入され得る。HI-TCR核酸配列の挿入又は別のより小さな変異は、天然TCRアルファ鎖及び/又は天然TCRベータ鎖を含むTCRの内因性発現を破壊し得る又は消滅させ得る。挿入又は変異は、内因性TCR発現を少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%低下させ得る。ベータ鎖をコードする2種の遺伝子ではなく、単一遺伝子がアルファ鎖(TRAC)をコードするため、TRAC遺伝子座は、TCRαβ受容体発現を低下させるための典型的な標的である。故に、抗原特異的受容体(例えば、CAR又はTCR)をコードする核酸は、機能的TCRアルファ鎖の発現を有意に低下させる位置におけるTRAC遺伝子座に、好ましくは第1エクソンの5'領域に組み込まれ得る。例えば、Jantzら、WO2017/062451;Sadelainら、WO2017/180989;Torikaiら、Blood、119(2):5697～705頁(2012);Eyquemら、Nature. 2017年3月2日;543(7643):113～117頁を参照されたい。内因性TCRアルファの発現は、少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%低下し得る。そのような実施形態において、抗原特異的受容体をコードする核酸の発現は、任意選択で、内因性TCR-アルファ又は内因性TCR-ベータプロモーターの制御下にある。

任意選択で、免疫細胞は、単一の活性ITAMドメインを有する改変されたCD3も含み得、任意選択で、CD3は、1種若しくは複数の又は2種以上の共刺激性ドメインを更に含み得る。一部の実施形態において、CD3は、2種の共刺激性ドメイン、任意選択でCD28及び4-1BBを含む。単一の活性ITAMドメインを有する改変されたCD3は、例えば、ITAM2及びITAM3が不活性化されている又はITAM1及びITAM2が不活性化されている改変されたCD3ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一部の実施形態において、改変されたCD3ゼータポリペプチドはITAM1のみを保持し、残りのCD3ζドメインは欠失される(残基90～164)。別の例として、ITAM1はITAM3のアミノ酸配列で置換され、残りのCD3ζドメインは欠失される(残基90～164)。

故に、本発明の改変された免疫細胞は、前述の態様の2つ以上又は3つ以上又は4つ以上の組み合わせを更に含み得る。

例えば、改変された免疫細胞は、(a)抗原特異的受容体が、異種抗原結合ドメイン及び天然TCR定常ドメイン又はそのフラグメントを含む改変されたTCRであり、抗原特異的受容体がCD3ゼータポリペプチドを活性化し得、且つ/又は抗原特異的受容体がCARであり、任意選択で(b)免疫細胞は、例えばITAM2及びITAM3が不活性化されている、単一の活性ITAMドメインを有する改変されたCD3を含み、任意選択で(c)TCRが、内因性TRAC及び/又はTRBCプロモーターの制御下にあり、任意選択で(d)天然TCR-アルファ鎖及び/又は天然TCR-ベータ鎖の発現が破壊されている又は消滅している、免疫細胞である。更なる実施形態において、細胞は、少なくとも1種のキメラ共刺激性受容体(CCR)を含み得る。

CAR及び組み換えTCRを含めた例示的な抗原受容体、並びに細胞を操作し且つ細胞に受容体を導入するための方法は、例えば国際特許出願公開第WO200014257号、第WO2013126726号、第WO2012/129514号、第WO2014031687号、第WO2013/166321号、第WO2013/071154号、第WO2013/123061号、米国特許出願公開第US2002131960号、第US2013287748号、第US20130149337号、米国特許第6,451,995号、第7,446,190号、第8,252,592号、第8,339,645号、第8,398,282号、第7,446,179号、第6,410,319号、第7,070,995号、第7,265,209号、第7,354,762号、第7,446,191号、第8,324,353号、及び第8,479,118号、並びに欧州特許出願第EP2537416号に記載されるもの、並びに/又はSadelainら、Cancer Discov. 2013年4月;3(4):388～398頁;Davilaら(2013)PLoS ONE 8(4):e61338;Turtleら、Curr. Opin. Immunol.、2012年10月;24(5):633～39頁;Wuら、Cancer、2012年3月、18(2):160～75頁によって記載されるものを含む。一部の態様において、遺伝子操作された抗原受容体は、米国特許第7,446,190号に記載されるCAR、及び国際特許出願公開第WO/2014055668 A1号に記載されるものを含む。

抗原
遺伝子操作された抗原受容体によって標的にされる抗原の中には、養子細胞療法により標的にされる対象となる疾患、病態、又は細胞タイプの背景において発現されるものがある。疾患及び病態の中には、増殖性、新生物性、及び悪性疾患及び病態、より特に癌があり、故に一部の実施形態において、1種又は複数の抗原は、腫瘍抗原(例えば、腫瘍細胞によって発現される、とりわけ具体的には癌細胞によって発現される)から選択される。

癌は、固形癌、又は、とりわけ白血病及びリンパ腫を含む、造血組織及びリンパ系組織の腫瘍としても知られる、血液、骨髄、及びリンパ系に影響を及ぼす癌等の「液体腫瘍」であり得る。液体腫瘍は、例えば急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ球性白血病(ALL)、及び慢性リンパ球性白血病(CLL)を含む(マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)等の様々なリンパ腫、腺腫、扁平上皮細胞癌腫、咽頭癌腫、胆嚢及び胆管癌、網膜芽細胞腫等の網膜の癌を含む)。
を含む。

固形癌は、とりわけ、結腸、直腸、皮膚、子宮内膜、肺(非小細胞肺癌腫を含む)、子宮、骨(骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫瘍、アダマンチノーマ、及び脊索腫等)、肝臓、腎臓、食道、胃、膀胱、膵臓、頸部、脳(髄膜腫、膠芽細胞腫、軽度星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、下垂体腫瘍、神経鞘腫、及び転移性脳腫瘍等)、卵巣、***、頭頸部領域、精巣、前立腺、及び甲状腺からなる群から選択される臓器の1つに影響を及ぼす癌を含む。

好ましくは、本発明に従った癌は、上で記載されるように、血液、骨髄、及びリンパ系に影響を及ぼす癌である。典型的に、癌は、多発性骨髄腫である又はそれと関連している。

本発明に従った疾患は、ウイルス、レトロウイルス、細菌、及び原虫感染症、免疫欠損、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バールウイルス(EBV)、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス等であるがそれらに限定されない感染性疾患又は病態;関節炎、例えば関節リウマチ(RA)、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息、及び/又は移植と関連した疾患若しくは病態等、自己免疫性又は炎症性疾患又は病態も包含する。

一部の実施形態において、抗原はポリペプチドである。一部の実施形態において、それは炭水化物又は他の分子である。一部の実施形態において、抗原は、正常又は非標的細胞又は組織と比較して、疾患又は病態の細胞、例えば腫瘍又は病原性細胞上で選択的に発現される又は過剰発現される。他の実施形態において、抗原は、正常細胞上で発現され且つ/又は操作された細胞上で発現される。一部のそのような実施形態において、本明細書において提供される多標的化及び/又は遺伝子破壊手法を使用して、特異性及び/又は効力を向上させる。

一部の実施形態において、抗原は、癌細胞において発現され且つ/又は普遍的腫瘍抗原である。「普遍的腫瘍抗原」という用語は、一般的に非腫瘍細胞においてよりも腫瘍細胞においてより高いレベルで発現され、また種々の起源の腫瘍において発現されるタンパク質等の免疫原性分子を指す。一部の実施形態において、普遍的腫瘍抗原は、ヒト癌の30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%を上回る、又はそれより高い割合において発現される。一部の実施形態において、普遍的腫瘍抗原は、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、又はそれを上回る異なるタイプの腫瘍において発現される。一部の場合において、普遍的腫瘍抗原は、正常細胞等の非腫瘍細胞において、しかしそれが腫瘍細胞において発現されるよりも低いレベルで発現され得る。一部の場合において、普遍的腫瘍抗原は、正常細胞において発現されない等、非腫瘍細胞において全く発現されない。例示的な普遍的腫瘍抗原は、例えばヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、サバイビン、マウス二重微小染色体2ホモログ(MDM2)、シトクロムP450 1B1(CYP1B)、HER2/neu、ウィルムス腫瘍遺伝子1(WT1)、リヴィン(livin)、アルファフェトプロテイン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)、ムチン16(MUC16)、MUC1、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、p53、又はサイクリン(D1)を含む。普遍的腫瘍抗原を含めた腫瘍抗原のペプチドエピトープは、当技術分野において公知であり、一部の態様において、TCR又はTCR様CAR等のMHC拘束抗原受容体を作出するために使用され得る(例えば、公開されたPCT出願第WO2011009173号又は第WO2012135854号、及び公開された米国出願第US20140065708号を参照されたい)。

一部の態様において、CD38、CD138、及び/又はCS-1等、抗原は、多発性骨髄腫で発現される。他の例示的な多発性骨髄腫抗原は、CD56、TIM-3、CD33、CD123、及び/又はCD44を含む。そのような抗原に向けられた抗体又は抗原結合フラグメントは公知であり、例えば米国特許第8,153,765号;第8,603477号、第8,008,450号;米国公開出願第US20120189622号;及び公開された国際PCT出願第WO2006099875号、第WO2009080829号、又は第WO2012092612号に記載されるものを含む。一部の実施形態において、そのような抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、scFv)を使用して、CARを作出し得る。

一部の実施形態において、抗原は、癌又は腫瘍細胞上で発現される又は上方調節されるが、休止又は活性化T細胞等の免疫細胞においても発現され得るものであり得る。例えば、一部の場合において、hTERT、サバイビン、及び他の普遍的腫瘍抗原の発現は、活性化Tリンパ球を含めたリンパ球に存在することが報告されている(例えば、Wengら(1996)J Exp. Med.、183:2471～2479頁;Hathcockら(1998)J Immunol、160:5702～5706頁;Liuら(1999)Proc. Natl Acad Sci.、96:5147～5152頁;Turksmaら(2013)Journal of Translational Medicine、11:152を参照されたい)。同じように、一部の場合において、CD38及び他の腫瘍抗原は、活性化T細胞において上方調節される等、T細胞等の免疫細胞においても発現され得る。例えば、一部の態様において、CD38は、公知のT細胞活性化マーカーである。

本明細書において提供される一部の実施形態において、T細胞等の免疫細胞を、免疫細胞における抗原をコードする遺伝子を抑制する又は破壊するように操作し得、それにより、発現した遺伝子操作された抗原受容体は、免疫細胞それ自身上でのその発現の背景において抗原に特異的に結合しない。故に、一部の態様において、これは、例えば養子細胞療法と関連して、操作された免疫細胞の効力を低下させ得る、それら自身への操作された免疫細胞の結合等、オフターゲット効果を避け得る。

一部の実施形態において、阻害性CARの場合において等、標的は、罹患細胞又は標的にされる対象となる細胞上で発現されないが、同じ操作された細胞において活性化又は刺激性受容体によって標的にされる疾患特異的標的も発現する正常又は非罹患細胞上で発現される抗原等、オフターゲットマーカーである。例示的なそのような抗原は、例えば、そのような分子が非標的細胞において下方調節されるが依然として発現される疾患又は病態を治療することと関連して、MHCクラスI分子等のMHC分子である。

一部の実施形態において、操作された免疫細胞は、1種又は複数の他の抗原を標的にする抗原を含有し得る。一部の実施形態において、1種又は複数の他の抗原は、腫瘍抗原又は癌マーカーである。提供される免疫細胞上の抗原受容体によって標的にされる他の抗原は、一部の実施形態において、オーファンチロシンキナーゼ受容体ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、及びB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、若しくは4、FBP、胎児アセチルコリン(acethycholine)e受容体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13R-アルファ2、kdr、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子、MAGE-A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胎児抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胎児性抗原(CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2、及びMAGE A3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT-1)、サイクリンA1(CCNA1)等のサイクリン、並びに/又はビオチン化分子、並びに/又はHIV、HCV、HBV、若しくは他の病原体によって発現される分子を含み得る。

例えば、1種又は複数の抗原は、pHER95、CD19、MUC16、MUC1、CAIX、CEA、CD8、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CD70、CLL1、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、EGP-2、EGP-40、EpCAM、Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4、FBP、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体-a、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、κ-軽鎖、KDR、LeY、L1細胞接着分子、MAGE-A1、メソテリン、MAGEA3、p53、MART1、GP100、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、サバイビン、hTERT、EphA2、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、癌胎児抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2、WT-1、BCMA、CD123、CD44V6、NKCS1、EGF1R、EGFR-VIII、CD99、CD70、ADGRE2、CCR1、LILRB2、LILRB4、PRAME、及びERBBを含む群からの腫瘍抗原から選択され得る。

一部の実施形態において、CARは病原体特異的抗原に結合する。一部の実施形態において、CARは、ウイルス抗原(HIV、HCV、HBV等)、細菌抗原、及び/又は寄生虫抗原に特異的である。

一部の実施形態において、CARは、1つ又は複数の4-1BB共刺激性ドメインを含み、CD19抗原(文献において19BBz CARとしても知られる)に結合する。

一部の実施形態において、本発明の細胞は、それぞれが異なる抗原を認識し、典型的にそれぞれが異なる細胞内シグナル伝達成分を含む、細胞上で2種以上の遺伝子操作された受容体を発現するように遺伝子操作される。そのような多標的化ストラテジーは、例えば国際特許出願公開第WO 2014055668 A1号(例えば、オフターゲット、例えば正常細胞上では個々に存在するが、治療される対象となる疾患又は病態の細胞上でのみ一緒に存在する2種の異なる抗原を標的にする、活性化及び共刺激性CARの組み合わせを記載する)、及びFedorovら、Sci. Transl. Medicine、5(215)(2013年12月)(活性化CARは、正常又は非罹患細胞及び治療される対象となる疾患又は病態の細胞の両方で発現される1種の抗原に結合し、阻害性CARは、正常細胞又は治療することが望まれない細胞でのみ発現される別の抗原に結合するもの等、活性化及び阻害性CARを発現する細胞を記載する)に記載される。

一部の背景において、刺激因子(例えば、リンフォカイン又はサイトカイン)の過剰発現は、対象にとって有毒であり得る。故に、一部の背景において、操作された細胞は、養子免疫療法における投与時等、細胞をインビボにおける陰性選択の影響を受けやすくさせる遺伝子セグメントを含む。例えば、一部の態様において、細胞は、それらが投与される患者のインビボ病態の変化の結果として、それらが排除され得るように操作される。陰性選択可能な表現型は、投与される作用物質、例えば化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入により生じ得る。陰性選択可能な遺伝子は、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV-I TK)遺伝子(Wiglerら、Cell II :223、1977);細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(phosphribosyltransferase)(HPRT)遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(APRT)遺伝子、細菌シトシンデアミナーゼ(Mullenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33頁(1992))を含む。

本発明の他の実施形態において、細胞、例えばT細胞は、組み換え受容体を発現するように操作されるのではなく、むしろ、腫瘍浸潤リンパ球、及び/又は特定の抗原特異性を有する細胞の増大を促進するために、例えばインキュベーション工程の間に、インビトロ若しくはエクスビボで培養されたT細胞等、所望の抗原に特異的な天然に存在する抗原受容体を含む。例えば、一部の実施形態において、細胞は、腫瘍特異的T細胞、例えば自家腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の単離によって、養子細胞療法のために産生される。自家腫瘍浸潤リンパ球を使用したヒト腫瘍の直接標的化は、一部の場合において、腫瘍退縮を媒介し得る(Rosenberg SAら(1988)N Engl J Med. 319:1676～1680頁を参照されたい)。一部の実施形態において、リンパ球は、切除された腫瘍から抽出される。一部の実施形態において、そのようなリンパ球はインビトロで増大する。一部の実施形態において、そのようなリンパ球は、リンフォカイン(例えば、IL-2)とともに培養される。一部の実施形態において、そのようなリンパ球は、同種腫瘍又は自家正常細胞ではなく、自家腫瘍細胞の特異的溶解を媒介する。

付加的な核酸、例えば導入のための遺伝子の中には、移入された細胞の生存能及び/又は機能を促進する等によって療法の効力を向上させるもの;インビボ生存又は局在を査定する等のための、細胞の選択及び/又は評価のための遺伝子マーカーを提供する遺伝子;Lupton S. D.ら、Mol. and Cell Biol.、11:6(1991);及びRiddellら、Human Gene Therapy 3:319～338頁(1992)によって記載されるように、例えば細胞をインビボにおける陰性選択の影響を受けやすくすることによって、安全性を向上させる遺伝子があり;支配的な陽性選択可能なマーカーと陰性選択可能なマーカーとを融合させることにより得られる二機能性の選択可能な融合遺伝子の使用を記載するLuptonらによるPCT/US91/08442及びPCT/US94/05601の刊行物も参照されたい。例えば、Riddellら、米国特許第6,040,177号、14～17列を参照されたい。

本発明に従った細胞を獲得するための方法
本発明は、免疫細胞におけるSOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1の発現及び/又は活性を阻害することからなる工程を含む、改変された又は操作された免疫細胞を産生する方法にも関する。

好ましくは、本発明に従った細胞を獲得するための方法は、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体、又はT細胞受容体を、免疫細胞に導入することからなる工程を更に含む。

SOCS1の発現及び/又は活性の阻害(及び一部の実施形態において、FAS及び/又はSuv39h1の発現及び/又は活性の付加的な阻害)、並びに免疫細胞における、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体の導入は、同時に又は任意の順序で逐次的に行われ得る。

SOCS1、FAS、Suv39h1、及び/又はβ2mの阻害
遺伝子発現又はタンパク質の活性の阻害のための本明細書に記載される方法は、関心対象の4種の遺伝子/タンパク質、すなわちSOCS1、FAS、Suv39h1、及び任意選択でβ2mに適用される。細胞がSOCS1だけでなく欠陥がある場合、同じ又は異なる方法を使用して、細胞をFAS及び/又はSuv39h1に更に欠陥のある状態にし得る。それ故に、本明細書に記載される実施形態は、当業者の知識に従って組み合わせられ得る。

本発明によれば、操作された免疫細胞は、SOCS1の発現及び/又は活性を阻害する又は遮断する少なくとも1種の作用物質と、並びに任意選択で、一部の実施形態において、Suv39h1、FAS、及び/又はβ2mの発現及び/又は活性を阻害する又は遮断する少なくとも1種の付加的な作用物質と接触され得る。本発明は、任意選択でSuv39h1及び/又はβ2mとの組み合わせで、Fasが免疫細胞(とりわけ、細胞)において不活性化される実施形態も提供する。

作用物質は、小分子インヒビター;ペプチドインヒビター、イントラボディ、ナノボディ、又はアフィボディ等の抗体誘導体;アプタマー;SOCS1、FAS、又はSuv39h1に相補的なアンチセンス分子等、転写又は翻訳を遮断する核酸分子;低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、又はpiwiRNA(piRNA)等のRNA干渉剤;リボザイム、及びその組み合わせから選択され得る。

少なくとも1種の作用物質は、a)SOCS1、Suv39h1、FAS、若しくはβ2mゲノム核酸配列とハイブリダイズする、1種又は複数の操作された天然に存在しないクラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート(CRISPR)ガイドRNA、及び/又はb)CRISPRタンパク質(典型的にII型Cas9タンパク質)をコードするヌクレオチド配列、を含む外因性核酸でもあり得、任意選択で細胞は、Cas9タンパク質を発現することに関してトランスジェニックである。作用物質は、ジンクフィンガータンパク質(ZFN)又はTALタンパク質でもあり得る。

「有機小分子」という用語は、医薬品において一般的に使用されるそうした有機分子に匹敵するサイズの分子を指す。該用語は、生物学的高分子(例えば、タンパク質、核酸等)を除外する。好ましい有機小分子は、サイズが最高約5000Da、より好ましくは最高2000Da、最も好ましくは最高約1000Daに及ぶ。

一部の実施形態において、H3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1のインヒビターは、Greiner D、Bonaldi T、Eskeland R、Roemer E、Imhof A.「Identification of a specific inhibitor of the histone methyltransferase SU(VAR)3-9」、Nat Chem Biol. 2005年8月;1(3):143～5頁;Weber, H. P.ら、「The molecular structure and absolute configuration of chaetocin」、Acta Cryst、B28、2945～2951頁(1972);Udagawa, S.ら、「The production of chaetoglobosins, sterigmatocystin, O-methylsterigmatocystin, and chaetocin by Chaetomium spp. and related fungi」、Can. J. microbiol、25、170～177頁(1979);及びGardiner, D. M.ら、「The epipolythiodioxopiperazine (ETP) class of fungal toxins: distribution, mode of action, functions and biosynthesis」、Microbiol、151、1021～1032頁(2005)によって記載されるケトシン(chaetocin)(CAS 28097-03-2)である。例えば、ケトシンは、Sigma Aldrich社から市販されている。

Suv39h1の別のインヒビターは、エピジチオジケトピペラジン・アルカロイド・ケトシンAのラセミ類似体であるETP69(Rac-(3S,6S,7S,8aS)-6-(ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル)-2,3,7-トリメチル-1,4-ジオキソヘキサヒドロ-6H-3,8a-エピジチオピロロ[1,2-a]ピラジン-7-カルボニトリル)でもあり得る(WO2014066435を参照されたいが、Baumann M、Dieskau AP、Loertscher BMら、Tricyclic Analogues of Epidithiodioxopiperazine Alkaloids with Promising In Vitro and In Vivo Antitumor Activity. Chemical science(Royal Society of Chemistry:2010)、2015;6:4451～4457頁、及びSnigdha S、Prieto GA、Petrosyan Aら、H3K9me3 Inhibition Improves Memory, Promotes Spine Formation, and Increases BDNF Levels in the Aged Hippocampus. The Journal of Neuroscience. 2016;36(12):3611～3622頁も参照されたい)。

化合物の阻害活性は、Greiner D.ら、Nat Chem Biol. 2005年8月;1(3):143～5頁、又はEskeland, R.ら、Biochemistry 43、3740～3749頁(2004)に記載される様々な方法を使用して判定され得る。

細胞におけるSOCS1、FAS、Suv39h1、及び/又はβ2mの阻害は、標的患者における注射の前又は後に達成され得る。一部の実施形態において、以前に規定される阻害は、対象への細胞の投与の後にインビボで実施される。例えば、本明細書において規定されるSuv39h1インヒビターは、細胞を含有する組成物に含まれ得る。1種又は複数のSOCS1、FAS、Suv39h1、又はβ2mインヒビターも、対象への細胞の投与の前に、付随して、又は後に別個に投与され得る。

典型的に、本出願に従ったSOCS1、FAS、Suv39h1、及び/又はβ2mの阻害は、本発明に従った細胞と以前に記載される少なくとも1種の薬理学的インヒビターを含有する組成物とのインキュベーションを用いて達成され得る。インヒビターは、インビトロにおける抗腫瘍T細胞の増大の間に含まれ、故に、養子移入後のそれらの再構成、生存、及び治療効力を改変する。

本発明に従った細胞におけるSOCS1、FAS、Suv39h1、及び/又はβ2mの阻害は、イントラボディを用いて達成され得る。イントラボディとは、同じ細胞において産生された後、それらの抗原に細胞内で結合する抗体である(総説に関しては、例えばMarschall AL、Dubel S、及びBoldicke T「Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies」、MAbs. 2015;7(6):1010～35頁を参照されたいが、Van Impe K、Bethuyne J、Cool S、Impens F、Ruano-Gallego D、De Wever O、Vanloo B、Van Troys M、Lambein K、Boucherie Cら「A nanobody targeting the F-actin capping protein CapG restrains breast cancer metastasis」、Breast Cancer Res 2013;15:R116;Hyland S、Beerli RR、Barbas CF、Hynes NE、Wels W.「Generation and functional characterization of intracellular antibodies interacting with the kinase domain of human EGF receptor」、Oncogene 2003;22:1557～67頁;Lobato MN、Rabbitts TH.「Intracellular antibodies and challenges facing their use as therapeutic agents」、Trends Mol Med 2003;9:390～6頁;及びDonini M、Morea V、Desiderio A、Pashkoulov D、Villani ME、Tramontano A、Benvenuto E.「Engineering stable cytoplasmic intrabodies with designed specificity」、J Mol Biol. 2003年7月4日;330(2):323～32頁も参照されたい)。

イントラボディは、既存のハイブリドーマクローンからそれぞれのcDNAをクローニングすることによって作出され得、又はより好都合には、新たなscFv/Fabが、ファージディスプレイ等のインビトロディスプレイ技法から選択され得、それは、始まりから抗体をコードする必要な遺伝子を提供し且つ抗体微細特異性についてのより詳細な事前設計を可能にする。加えて、細菌、酵母、哺乳類細胞表面ディスプレイ及びリボソームディスプレイが採用され得る。しかしながら、特異的抗体の選択のための最もよく使用されるインビトロディスプレイシステムは、ファージディスプレイである。パンニングと呼ばれる手順(アフィニティー選択)において、組み換え抗体ファージは、抗体ファージレパートリーと抗原とのインキュベーションによって選択される。この過程は数回繰り返され、ほぼ任意の考え得る標的への特異的抗原結合因子を含む富化された抗体レパートリーにつながる。これまで、インビトロで組み立てられた組み換えヒト抗体ライブラリーは、数千種の新規の組み換え抗体フラグメントを既に産出している。細胞質イントラボディによってノックダウンされる特異的タンパク質の前提条件は、抗原が、抗体結合により中和される/不活性化されることであることが留意されるべきである。適切な抗体を作出するための5種の異なる手法:1)酵母等の真核生物における及び大腸菌(E. coli)等の原核生物における機能的イントラボディのインビボ選択(抗原依存的及び非依存的);2)細胞質安定性を向上させるための抗体融合タンパク質の作出;3)細胞質安定性を向上させるための特別なフレームワークの使用(例えば、安定な抗体フレームワークにおける、CDRを接ぎ木すること又は合成CDRの導入による);4)細胞質安定性を向上させるための単一ドメイン抗体の使用;並びに5)ジスルフィド結合のない安定なイントラボディの選択、が浮上している。そうした手法は、とりわけ、上で触れられるMarschall, A. Lら、mAbs 2015に詳述される。

イントラボディに対する最もよく使用される形式は、完全なIgG又はFab分子の2本の抗体鎖の別個の発現及び会合の必要性を避けるために、短く柔軟性のあるリンカー配列(高頻度には(Gly4Ser)3)によってつなぎ合わされたH及びL鎖可変抗体ドメイン(VH及びVL)からなるscFvである。代替的に、重鎖のC1ドメイン及び軽鎖の定常領域を付加的に含むFab形式が使用されている。最近では、イントラボディに対する新たな考え得る形式であるscFabが記載されている。scFab形式は、細胞内発現ベクターへの利用可能なFab遺伝子のより容易なサブクローニングを約束するが、これが、十分に確立されたscFv形式と比して任意の利点を提供するかどうかはまだ確認されていない。scFv及びFabに加えて、二重特異性形式がイントラボディとして使用されている。ERを標的にした二重特異性Tie-2×VEGFR-2抗体は、単一特異性抗体対応物と比較して延長した半減期を示した。関連した単一特異性抗体の個別の特質、すなわち自己リン酸化の阻害及びリガンド結合を組み合わせた、上皮成長因子の細胞内及び細胞外エピトープを同時に認識する特別な形式として二重特異性膜貫通イントラボディが開発されている。

細胞質発現に特に適切な別のイントラボディ形式は、ラクダに由来する又は1つのヒトVHドメイン若しくはヒトVLドメインからなる、単一ドメイン抗体(ナノボディとも呼ばれる)である。これらの単一ドメイン抗体は、有利な特性、例えば高い安定性;良好な溶解性;ライブラリークローニング及び選択の容易さ;大腸菌及び酵母における高い発現収率、をしばしば有する。

イントラボディ遺伝子は、発現プラスミドのトランスフェクション又は組み換えウイルスを用いたウイルス形質導入の後、標的細胞の内側で発現され得る。典型的に、選定は、最適なイントラボディトランスフェクション及び産生レベルを提供することを目的としている。トランスフェクション及び後続のイントラボディ産生の成功は、産生された抗体の免疫ブロット検出によって分析され得るが、正しいイントラボディ/抗原相互作用の評価に関しては、相当する抗原及びイントラボディ発現プラスミドを一過性に共トランスフェクトされたHEK 293細胞抽出物からの共免疫沈降が使用され得る。

本発明に従った細胞におけるSOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1の阻害は、それぞれSOCS1、FAS、又はSuv39h1発現又は活性を阻害する又は遮断するアプタマーを用いてももたらされ得る。アプタマーとは、分子認識という観点から抗体に代わるものである分子のクラスである。アプタマーは、事実上任意のクラスの標的分子を高いアフィニティー及び特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチド(DNA又はRNA)又はオリゴペプチド配列である。

オリゴヌクレオチドアプタマーは、Tuerk C.及びGold L.、1990に記載されるランダム配列ライブラリーの試験管内進化法(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)(SELEX)により単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、DNAのコンビナトリアル化学合成によって獲得可能である。このライブラリーにおいて、各メンバーは、独自の配列の、最終的には化学的に改変された、直鎖状オリゴマーである。このクラスの分子の考え得る改変、使用、及び利点は、Jayasena S.D.、1999に総説されている。

ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択される、大腸菌チオレドキシンA等のプラットフォームタンパク質が呈する立体配置的に制約された抗体可変領域からなる(Colas P、Cohen B、Jessen T、Grishina I、McCoy J、Brent R.「Genetic selection of peptide aptamers that recognize and inhibit cyclin-dependent kinase 2」、Nature. 1996年4月11日;380(6574):548～50頁)。

本発明に従った細胞におけるSOCS1、FAS、Suv39h1、及びβ2mの阻害は、アフィボディ分子を用いてももたらされ得る。アフィボディとは、モノクローナル抗体を真似た、多数の標的タンパク質又はペプチドに高いアフィニティーで結合するように操作された小さなタンパク質であり、それ故に、抗体模倣体のファミリーのメンバーである(総説に関しては、Lofblom J、Feldwisch J、Tolmachev V、Carlsson J、Stahl S、Frejd FY. Affibody molecules: engineered proteins for therapeutic, diagnostic and biotechnological applications. FEBS Lett. 2010年6月18日;584(12):2670～80頁を参照されたい)。アフィボディ分子は、理論上任意の所与の標的に対する特異的結合を有する、ブドウ球菌(staphylococcal)プロテインAの免疫グロブリン結合領域におけるBドメインの操作された変種(Zドメイン)に基づく。アフィボディ分子ライブラリーは、一般的に、Zドメインの元のFc結合表面を含むヘリックス1及び2における13個のアミノ酸箇所の組み合わせ無作為化によって構築される。ライブラリーは、典型的にファージ上に呈示されており、その後に所望の標的に対するバイオパンニングが続く。最初のもののアフィニティーを増加させるべきであり、アフィニティー成熟は、一般的に結合因子の向上をもたらし、指向性コンビナトリアル変異導入と組み合わせられたヘリックスシャッフリング又は配列アライメントのいずれかによって達成され得る。それらの変更された結合表面を有する新たに同定された分子は、一般的に、元のヘリックス構造並びに高い安定性を保つが、とはいえ興味深い特性を有する独自の例外が報告されている。それらの小さなサイズ及び迅速なフォールディング特性に起因して、アフィボディ分子は、化学的ペプチド合成によって産生され得る。

本発明の他の実施形態において、SOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1及び/又はβ2m活性の阻害は、RNA又はDNA、とりわけ組み換えDNA又はRNAを使用した、典型的にはdsRNA(二本鎖RNA)、miRNA(マイクロRNA)、短い干渉RNA(siRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)、アンチセンスRNA若しくはDNA、又はリボザイムをコードする配列等のRNA干渉(RNAi)を使用した遺伝子ノックダウンによる遺伝子抑制/抑止によって達成され得る。本発明の目的上、「組み換えDNA又はRNA」という用語は、遺伝子操作によって変更されている、再編されている、又は改変されている核酸配列を指す。「組み換え」という用語は、自然発生的変異等の天然に存在する事象により生じる、又は非自然発生的変異導入、それに続く選択的育種により生じる、核酸配列の変更を指すわけではない。

本明細書において使用するとき、「RNA」という用語は、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。「リボヌクレオチド」によって、a.ベータ.-D-リボフラノース部分の2'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。該用語は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、二本鎖及び一本鎖領域の両方を有するRNA、部分的に精製されたRNA等の単離RNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組み換えで産生されたRNA、並びに1つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び/又は変更によって天然に存在するRNAとは異なる変更されたRNA又は類似体RNAを包含する。そのような変更は、RNA分子の末端又は内部等への、例えばRNAの1つ又は複数のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。目下開示される主題のRNA分子におけるヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチド等、非標準的ヌクレオチドも含み得る。これらの変更されたRNAは、類似体、又は天然に存在するRNAの類似体と称され得る。

siRNA技術は、遺伝子から転写されるmRNAのヌクレオチド配列と相同な配列及びヌクレオチド配列と相補的な配列を有する二本鎖RNA分子を利用したRNAiに基づくものを含む。siRNAは、一般的に、遺伝子から転写されるmRNAの1つの領域と相同/相補的である、又は異なる領域と相同/相補的である複数のRNA分子を含むsiRNAであり得る。

アンチセンスRNA分子及びアンチセンスDNA分子を含めたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、SOCS1、FAS、H3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSuv39h1、又はβ2mの翻訳を直接遮断し、故にタンパク質翻訳を阻止する又はmRNA分解を増加させるように作用すると考えられ、故にそれぞれSOCS1、FAS、H3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1、又はβ2mのレベル、故に細胞におけるその/それらの活性を減少させる。例えば、少なくとも約15個の塩基で、且つSOCS1、FAS、H3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1、又はβ2mをコードするmRNA転写産物配列の独自の領域と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば従来のホスホジエステル技法によって合成され得、例えば静脈内注射又は注入によって投与され得る。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技法を使用するための方法は、当技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,566,135号;第6,566,131号;第6,365,354号;第6,410,323号;第6,107,091号;第6,046,321号;及び第5,981,732号を参照されたい)。

本明細書において使用される「RNA干渉剤」とは、RNA干渉(RNAi)によって標的バイオマーカー遺伝子の発現に干渉する又は阻害する任意の作用物質として定義される。そのようなRNA干渉剤は、本発明の標的遺伝子(例えば、Suv39h1)に相同である、RNA分子を含めた核酸分子又はそのフラグメント、短い干渉RNA(siRNA)、及びRNA干渉(RNAi)によって標的核酸の発現に干渉する又は阻害する小分子を含むが、それらに限定されるわけではない。

低分子阻害性RNA(siRNA)は、本出願に従った使用のための発現のインヒビターとしても機能し得る。SOCS1遺伝子発現、FAS発現、H3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1、及び/又はB2M遺伝子発現は、対象又は細胞と、低分子二本鎖RNA(dsRNA)、又は低分子二本鎖RNAの産生を引き起こすベクター若しくは構築物とを接触させることによって低下し得、それによりSOCS1遺伝子発現、FAS発現、H3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1、又はB2M遺伝子発現は特異的に阻害される(すなわち、RNA干渉又はRNAi)。適当なdsRNA又はdsRNAコードベクターを選択するための方法は、配列が公知である遺伝子に関して、当技術分野において周知である(例えば、Tuschl, T.ら(1999);Elbashir, S. M.ら(2001);Hannon, GJ.(2002);McManus, MT.ら(2002);Brummelkamp, TR.ら(2002);米国特許第6,573,099号及び第6,506,559号;並びに国際特許公開第WO 01/36646号、第WO 99/32619号、及び第WO 01/68836号を参照されたい)。本発明のsiRNAのホスホジエステル結合のすべて又は一部は、有利に保護される。この保護は、一般的に、当技術分野によって公知である方法を使用して化学的経路を介して実行される。ホスホジエステル結合は、例えばチオール若しくはアミン官能基によって、又はフェニル基によって保護され得る。本発明のsiRNAの5'及び/又は3'末端も、例えば、ホスホジエステル結合を保護することに関して上で記載される技法を使用して有利に保護される。siRNA配列は、有利には、少なくとも12個の連続的ジヌクレオチド又はそれらの誘導体を含む。

shRNA(短いヘアピンRNA)は、本発明における使用のための発現のインヒビターとしても機能し得る。shRNAは、典型的に、短い(例えば、19～25個のヌクレオチド)アンチセンス鎖、それに続く5～9個のヌクレオチドループ、及び類似したセンス鎖から構成される。代替的に、センス鎖は、ヌクレオチドループ構造に先行し得、アンチセンス鎖が後に続き得る。

本明細書において使用するとき、「マイクロRNA」(miRNA又はRNA)という用語は、遺伝子発現を調節し得る、長さが21～23個のヌクレオチド、好ましくは21～22個のヌクレオチドの一本鎖RNA分子を指す。miRNAそれぞれは、より長い前駆体RNA分子(「前駆体miRNA」)からプロセシングされる。前駆体miRNAは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体miRNAは、それらがステム-ループ様又は折り返し様構造を形成するのを可能にする、相補的な2つの領域を有する。プロセシングされたmiRNA(「成熟miRNA」とも称される)は、大きな複合体の一部になって特定の標的遺伝子を下方調節する。

一部の実施形態において、本明細書に記載される組み換えDNAは、リボザイムをコードする組み換えDNAである。リボザイムは、本発明における使用のための発現のインヒビターとしても機能し得る。リボザイムとは、RNAの特異的切断を触媒し得る酵素的RNA分子である。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレアーゼ的切断を伴う。それによって、H3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1 mRNA配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的且つ効率的に触媒する操作されたヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、典型的に以下の配列GUA、GUU、及びGUCを含むリボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって最初に同定される。いったん同定されると、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に相当する約15～20個のリボヌクレオチドの短いRNA配列が、オリゴヌクレオチド配列を不適切な状態にし得る二次構造等、予測される構造的特質について評価され得る。

発現のインヒビターとして有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの両方とも、公知の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホロアミダイト(phosphoramadite)化学合成によるもの等、化学合成のための技法を含む。代替的に、アンチセンスRNA分子は、RNA分子をコードするDNA配列のインビトロ又はインビボ転写によって作出され得る。そのようなDNA配列は、T7又はSP6ポリメラーゼプロモーター等の適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込まれている多種多様なベクターに組み込まれ得る。本発明のオリゴヌクレオチドへの様々な改変は、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入され得る。考え得る改変は、分子の5'及び/若しくは3'末端へのリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、又はオリゴヌクレオチド骨格内でのホスホジエステラーゼ連結よりはむしろホスホロチオエート若しくは2'-0-メチルの使用を含むが、それらに限定されるわけではない。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、及びリボザイムは、単独で又はベクターと併せてインビボで送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」とは、細胞、好ましくはSOCS1を発現する細胞、好ましくはSOCS1及びH3K9-ヒストンメチルトランスフェラーゼSUV39H1を発現する細胞への、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、又はリボザイム核酸の移入を促し得る任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で生じるであろう分解の程度と比べて、分解の低下を伴って細胞に核酸を輸送する。一般的に、本発明において有用なベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作されているプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス若しくは細菌供給源に由来する他のビヒクルを含むが、それらに限定されるわけではない。ウイルスベクターは好ましいタイプのベクターであり、以下のウイルス:モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス等のレトロウイルス;アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス;SV40タイプのウイルス;ポリオーマウイルス;エプスタイン・バールウイルス;パピローマウイルス;ヘルペスウイルス;ワクシニアウイルス;ポリオウイルス;並びにレトロウイルス等のRAウイルス、由来の核酸配列を含むが、それらに限定されるわけではない。名付けられていないが当技術分野にとって公知の他のベクターを手軽に採用し得る。

好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が関心対象の遺伝子で置き換えられている非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスは、生活環が、DNAへのゲノムウイルスRNAの逆転写を伴い、宿主細胞DNAへのプロウイルス組み込みがそれに続くレトロウイルス(例えば、レンチウイルス)を含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試行が承認されている。最も有用なのは、複製欠損である(すなわち、所望のタンパク質の合成を指揮する能力はあるが、感染粒子を製造する能力がない)そうしたレトロウイルスである。そのような遺伝子変更されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボにおける遺伝子の高効率な形質導入に対して一般的実用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的プロトコール(プラスミド内への外因性遺伝材料の組み込み、プラスミドのパッケージング細胞株へのトランスフェクション、パッケージング細胞株による組み換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、及びウイルス粒子による標的細胞の感染の工程を含む)は、Kriegler、1990及びMurry、1991において提供される。

ある特定の適用のための好ましいウイルスは、遺伝子療法におけるヒト使用が既に承認されている、二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルス及びアデノ随伴(AAV)ウイルスである。実際には、それぞれが異なる組織向性を有する、12種の異なるAAV血清型(AAV1～12)が公知である(Wu, Z Mol Ther 2006;14:316～27頁)。組み換えAAVは、依存性パルボウイルスAAV2に由来する(Choi, VW J Virol 2005;79:6801～07頁)。アデノ随伴ウイルス1～12型は、複製欠損であるように操作され得、広範な細胞タイプ及び種に感染し得る(Wu, Z Mol Ther 2006;14:316～27頁)。それは、熱及び脂質溶媒安定性;造血細胞を含めた、多様な系列の細胞における高い形質導入頻度;並びに重感染阻害の欠如等の利点を更に有し、故に、複数の一連の形質導入を可能にする。報告されるところによれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的様式でヒト細胞DNAに組み込み得、それによって、レトロウイルス感染に特徴的な、挿入変異導入の可能性及び挿入された遺伝子発現の変動性を最小限に抑える。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で100回よりも多くの継代の間、組織培養下で追跡されており、アデノ随伴ウイルスゲノム組み込みが比較的安定な事象であることを暗示する。アデノ随伴ウイルスは、染色体外の形でも機能し得る。

他のベクターはプラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において幅広く記載されており、当業者に周知である。例えば、Sambrookら、1989を参照されたい。ここ数年、プラスミドベクターは、インビボで細胞に抗原コード遺伝子を送達するためのDNAワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くに関してと同じ安全性懸念を有しないため、それらはこのことに対して特に有利である。しかしながら、宿主細胞に適合するプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動的にコードされた遺伝子からペプチドを発現し得る。一部のよく使用されるプラスミドは、pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40、及びpBlueScriptを含む。他のプラスミドは当業者に周知である。付加的に、プラスミドは、DNAの特異的フラグメントを除去し且つ付加するように、制限酵素及びライゲーション反応を使用して特注され得る。プラスミドは、多様な非経口、粘膜、及び局所経路によって送達され得る。例えば、DNAプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射され得る。それは、鼻腔内噴霧又は滴下、直腸座薬、及び経口的にも投与され得る。それは、遺伝子銃を使用して、表皮又は粘膜表面にも投与され得る。プラスミドは、水溶液の状態で、金粒子上で乾燥させて、又はリポソーム、デンドリマー、コクリエート(cochleate)送達ビヒクル、及びマイクロカプセル化を含むがそれらに限定されない別のDNA送達システムと併せて与えられ得る。

本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、又はリボザイム若しくはリボザイムをコードする核酸配列は、一般的に、異種調節領域、例えば異種プロモーターの制御下にある。プロモーターは、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞、内皮細胞、周皮細胞、及びアストロサイトに特異的であり得、例えばミュラーグリア細胞における特異的発現は、グルタミンシンテターゼ遺伝子のプロモーターを通じて獲得され得る。プロモーターは、例として、CMVプロモーター等のウイルスベクター、又は任意の合成プロモーターでもあり得る。

SOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1及び/又はβ2mの遺伝子抑制又は破壊
本発明に従った細胞におけるSOCS1、FAS、Suv39h1、及び/又はβ2mの阻害は、欠失、例えば遺伝子全体、エクソン、若しくは領域の欠失、及び/又は外因性配列での置き換えによって、並びに/或いは変異、例えば、遺伝子内、典型的には遺伝子のエクソン内でのフレームシフト若しくはミスセンス変異によって等、それぞれSOCS1遺伝子、FAS遺伝子、Suv39h1遺伝子、又はB2M遺伝子の抑制又は破壊によってももたらされ得る。一部の実施形態において、破壊は、遺伝子に組み込まれる未成熟終止コドンをもたらし、それによりSOCS1、FAS、Suv39h1、又はβ2mタンパク質は発現されない又は非機能的である。破壊は、一般的にDNAレベルで行われる。破壊は、一般的に、永続的、不可逆的である、又は一過性ではない。一部の実施形態において、SOCS1(及び/又はFAS及び/又はSuv39h1及び/又はβ2m)の誘導性の及び/又は可逆的な遺伝子不活性化が好まれ得る。

本出願に従った癌免疫療法のための免疫細胞を編集するためのよく適した方法は、とりわけLucibello F、Menegatti S、Menger L.「Methods to edit T cells for cancer immunotherapy」、Methods Enzymol. 2020;631:107～135頁に記載される。

一部の実施形態において、遺伝子破壊又は抑制は、遺伝子に特異的に結合する又はハイブリダイズする、DNA結合タンパク質若しくはDNA結合核酸、又はそれを含有する複合体、化合物、若しくは組成物等のDNA標的化分子等、遺伝子編集剤を使用して達成される。一部の実施形態において、DNA標的化分子は、DNA結合ドメイン、例えばジンクフィンガータンパク質(ZFP)DNA結合ドメイン、転写活性化因子様タンパク質(TAL)若しくはTALエフェクター(TALE)DNA結合ドメイン、クラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート(CRISPR)DNA結合ドメイン、又はメガヌクレアーゼ由来のDNA結合ドメインを含む。

ジンクフィンガー、TALE、及びCRISPRシステム結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。

一部の実施形態において、DNA標的化分子、複合体、又は組み合わせは、DNA結合分子、及び遺伝子の抑制又は破壊を促すエフェクタードメイン等の1種又は複数の付加的なドメインを含有する。例えば、一部の実施形態において、遺伝子破壊は、DNA結合タンパク質及び異種調節ドメイン又はその機能的フラグメントを含む融合タンパク質によって行われる。

典型的に、付加的なドメインはヌクレアーゼドメインである。故に、一部の実施形態において、遺伝子破壊は、ヌクレアーゼ、及びヌクレアーゼ等の非特異的DNA切断分子に融合した又は複合した配列特異的DNA結合ドメインから構成されるヌクレアーゼ含有複合体又は融合タンパク質等、操作されたタンパク質を使用した遺伝子又はゲノム編集によって促される。

これらの標的キメラヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ含有複合体は、標的二本鎖断裂又は一本鎖断裂を誘導し、エラーを起こしやすい非相同末端接合(NHEJ)及び相同指向修復(HDR)を含めた細胞DNA修復メカニズムを刺激することによって、精確な遺伝子改変を行う。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALEヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR関連(Cas)タンパク質等のRNAガイドエンドヌクレアーゼ(RGEN)、又はメガヌクレアーゼ等のエンドヌクレアーゼである。そのようなシステムは、当技術分野において周知である(例えば、米国特許第8,697,359号;Sander及びJoung(2014)Nat. Biotech. 32:347～355頁;Haleら(2009)Cell 139:945～956頁;Karginov及びHannon(2010)Mol. Cell 37:7;米国特許公開2014/0087426及び2012/0178169;Bochら(2011)Nat. Biotech. 29:135～136頁;Bochら(2009)Science 326:1509～1512頁;Moscou及びBogdanove(2009)Science 326:1501頁;Weberら(2011)PLoS One 6:el9722;Liら(2011)Nucl. Acids Res. 39:6315～6325頁;Zhangら(2011)Nat. Biotech. 29:149～153頁;Millerら(2011)Nat. Biotech. 29:143～148頁;Linら(2014)Nucl. Acids Res. 42:e47を参照されたい)。そのような遺伝学的ストラテジーは、当技術分野における周知の方法に従った構成的発現システム又は誘導性発現システムを使用し得る。

ZFP及びZFN;TAL、TALE、及びTALEN
一部の実施形態において、DNA標的化分子は、エンドヌクレアーゼ等のエフェクタータンパク質に融合した、1種又は複数のジンクフィンガータンパク質(ZFP)又は転写活性化因子様タンパク質(TAL)等のDNA結合タンパク質を含む。例は、ZFN、TALE、及びTALENを含む。Lloydら、Frontiers in Immunology、4(221)、1～7頁(2013)を参照されたい。

一部の実施形態において、DNA標的化分子は、配列特異的様式でDNAに結合する1種又は複数のジンクフィンガータンパク質(ZFP)又はそのドメインを含む。ZFP又はそのドメインは、構造が亜鉛イオンの配位により安定化する、結合ドメイン内のアミノ酸配列の1つ又は複数のジンクフィンガー領域を通じて配列特異的様式でDNAに結合する、タンパク質又はより大きなタンパク質内のドメインである。一般的に、ZFPの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の4つのヘリックス箇所(-1、2、3、及び6)にアミノ酸置換を行うことによって変更され得る。故に、一部の実施形態において、ZFP又はZFP含有分子は、天然に存在しない、例えば選定対象の標的部位に結合するように操作される。例えば、Beerliら(2002)Nature Biotechnol. 20:135～141頁;Paboら(2001)Ann. Rev. Biochem. 70:313～340頁;Isalanら(2001)Nature Biotechnol. 19:656～660頁;Segalら(2001)Curr. Opin. Biotechnol. 12:632～637頁;Chooら(2000)Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411～416頁を参照されたい。

一部の実施形態において、DNA標的化分子は、DNA切断ドメインに融合したジンクフィンガーDNA結合ドメインである又はそれを含むことで、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を形成する。一部の実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも1種のIIS型制限酵素由来の切断ドメイン(又は切断半ドメイン)、及び操作されていても操作されていなくてもよい1種又は複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。一部の実施形態において、切断ドメインは、IIS型制限エンドヌクレアーゼFok I由来のものである。例えば、米国特許第5,356,802号;第5,436,150号;及び第5,487,994号;並びにLiら(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275～4279頁;Liら(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764～2768頁;Kimら(1994a)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883～887頁;Kimら(1994b)J. Biol. Chem. 269:31、978-31、982を参照されたい。

一部の態様において、ZFNは、例えば標的遺伝子(すなわち、Suv39h1)のコード領域における所定の部位で、二本鎖断裂(DSB)を効率的に作出する。典型的な標的遺伝子領域は、エクソン、N末端領域をコードする領域、第1エクソン、第2エクソン、及びプロモーター又はエンハンサー領域を含む。一部の実施形態において、ZFNの一過性の発現は、操作された細胞における標的遺伝子の高度に効率的で且つ永続的な破壊を促進する。特に、一部の実施形態において、ZFNの送達は、50%を超える効率で遺伝子の永続的破壊をもたらす。多くの遺伝子特異的な操作されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Sangamo Biosciences社(Richmond、CA、USA)は、Sigma-Aldrich社(St. Louis、MO、USA)と連携して、ジンクフィンガー構築のためのプラットフォーム(CompoZr)を開発しており、研究者らがジンクフィンガー構築及び検証を完全に迂回することを可能にし、数千種のタンパク質に対して特異的標的化ジンクフィンガーを提供する。Gajら、Trends in Biotechnology、2013、31(7)、397～405頁。一部の実施形態において、市販のジンクフィンガーが使用される又は特注される。(例えば、Sigma-Aldrich社カタログ番号CSTZFND、CSTZFN、CTI1-1KT、及びPZD0020を参照されたい)。

一部の実施形態において、DNA標的化分子は、転写活性化因子様タンパク質エフェクター(TALE)タンパク質におけるもの等、天然に存在する又は操作された(天然に存在しない)転写活性化因子様タンパク質(TAL)DNA結合ドメインを含む。例えば、米国特許公開第20110301073号を参照されたい。一部の実施形態において、分子は、TALE-ヌクレアーゼ(TALEN)等のDNA結合エンドヌクレアーゼである。一部の態様において、TALENは、TALEに由来するDNA結合ドメイン、及び核酸標的配列を切断するヌクレアーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態において、TALE DNA結合ドメインは、標的抗原及び/又は免疫抑制分子をコードする遺伝子内の標的配列に結合するように操作されている。例えば、一部の態様において、TALE DNA結合ドメインは、CD38、及び/又はA2AR等のアデノシン受容体を標的にし得る。

一部の実施形態において、TALENは、遺伝子における標的配列を認識し且つ切断する。一部の態様において、DNAの切断は二本鎖断裂をもたらす。一部の態様において、断裂は、相同組み換え又は非相同末端接合(NHEJ)の速度を刺激する。一般的に、NHEJは、切断の部位におけるDNA配列に変化をしばしばもたらす不完全な修復過程である。一部の態様において、修復メカニズムは、直接再ライゲーションによる(Critchlow及びJackson、Trends Biochem Sci. 1998年10月;23(10):394～8頁)、又はいわゆるマイクロホモロジー媒介末端接合を介した、2つのDNA末端の残存するものの再接合を伴う。一部の実施形態において、NHEJを介した修復は、小さな挿入又は欠失をもたらし、遺伝子を破壊し且つそれによって抑制するために使用され得る。一部の実施形態において、改変は、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠失、又は付加であり得る。一部の態様において、切断誘導性変異導入事象、すなわちNHEJ事象に連続した変異導入事象が生じている細胞は、当技術分野における周知の方法によって同定され得且つ/又は選択され得る。

TALEリピートは会合して、Suv39h1遺伝子を特異的に標的にし得る。(Gajら、Trends in Biotechnology、2013、31(7)、397～405頁)。18,740種のヒトタンパク質をコードする遺伝子を標的にするTALENのライブラリーが構築されている(Kimら、Nature Biotechnology. 31、251～258頁(2013))。特注のTALEアレイは、Cellectis Bioresearch社(Paris、France)、Transposagen Biopharmaceuticals社(Lexington、KY、USA)、及びLife Technologies社(Grand Island、NY、USA)から市販されている。具体的には、CD38を標的にするTALENが市販されている(Gencopoeia社、www. genecopoeia.com/product/search/detail.php ?prt=26&cid=&key=HTN222870においてワールドワイドウェブで入手可能な、カタログ番号HTN222870-1、HTN222870-2、及びHTN222870-3を参照されたい)。例示的な分子は、例えば米国特許公開第US2014/0120622号及び第2013/0315884号に記載される。

一部の実施形態において、TALENは、1種又は複数のプラスミドベクターによってコードされる導入遺伝子として導入される。一部の態様において、プラスミドベクターは、ベクターを受けた細胞の同定及び/又は選択を提供する選択マーカーを含有し得る。

RGEN(CRISPR/Casシステム)
遺伝子抑制は、RNAガイドエンドヌクレアーゼ(RGEN)を介した破壊、又は別のRNAガイドエフェクター分子による他の形態の抑制等、1種又は複数のDNA結合核酸を使用して行われ得る。例えば、一部の実施形態において、遺伝子抑制は、クラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート(CRISPR)及びCRISPR関連タンパク質を使用して行われ得る。Sander及びJoung、Nature Biotechnology、32(4):347～355頁を参照されたい。

一般的に、「CRISPRシステム」とは、Cas遺伝子をコードする配列、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えば、tracrRNA又は活性のある部分的tracrRNA)、tracr-mate配列(内因性CRISPRシステムの背景において、「ダイレクトリピート」及びtracrRNAプロセシングによる部分的ダイレクトリピートを包含する)、ガイド配列(内因性CRISPRシステムの背景において「スペーサー」とも称される)、並びに/又はCRISPR遺伝子座由来の他の配列及び転写産物を含めた、CRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現に関わる又は活性を指揮することに関わる転写産物及び他のエレメントを集合的に指す。

典型的に、CRISPR/Casヌクレアーゼ又はCRISPR/Casヌクレアーゼシステムは、DNAに配列特異的に結合するノンコーディングRNA分子(ガイド)RNA、及びヌクレアーゼ機能性(例えば、2つのヌクレアーゼドメイン)を有するCRISPRタンパク質を含む。Casヌクレアーゼ等、CRISPRシステムの1種又は複数のエレメントは、I型、II型、又はIII型CRISPRシステムに由来し得る。好ましくは、CRISPRタンパク質は、9等のcas酵素である。Cas酵素は当分野において周知であり;例えば、S.ピオゲネス(S. pyogenes)Cas9タンパク質のアミノ酸配列は、アクセッション番号Q99ZW2の下でSwissProtデータベースに見い出され得る。一部の実施形態において、Casヌクレアーゼ及びgRNAは細胞に導入される。一部の実施形態において、CRISPRシステムは、標的部位でDSBを誘導し、その後に本明細書において論じられる破壊が続く。他の実施形態において、「ニッカーゼ」と見なされるCas9変種を使用して、標的部位で一本鎖にニックを入れ得る。例えば特異性を向上させるために、それぞれが、配列を標的にする異なるgRNAのペアによって指揮される、ペアになったニッカーゼも使用され得る。更に他の実施形態において、触媒不活性Cas9を、転写リプレッサー等の異種エフェクタードメインに融合させて、遺伝子発現に影響を及ぼし得る。

一般的に、CRISPRシステムは、標的配列の部位におけるCRISPR複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けされる。典型的に、CRISPR複合体の形成の背景において、「標的配列」とは、一般的に、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、CRISPR複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし且つCRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性があることを条件として、完全な相補性は必ずしも必要とされない。標的配列は、DNA又はRNAポリヌクレオチド等、任意のポリヌクレオチドを含み得る。一般的に、標的配列を含む標的遺伝子座への組み換えに使用され得る配列又は鋳型は、「編集鋳型」又は「編集ポリヌクレオチド」又は「編集配列」と称される。一部の態様において、外因性鋳型ポリヌクレオチドは編集鋳型と称され得る。一部の態様において、組み換えは相同組み換えである。

一部の実施形態において、触媒活性がない(catalytically dead)CAS9(dCas9)を、アクチベーター又はリプレッサードメインとともに使用して、遺伝子発現を制御し得ることが留意されるべきである。

一部の実施形態において、CRISPRシステムの1種又は複数のエレメントの発現を推進する1種又は複数のベクターが細胞に導入され、それにより、CRISPRシステムのエレメントの発現は、1つ又は複数の標的部位におけるCRISPR複合体の形成を指揮する。例えば、Cas酵素、tracr-mate配列に連結したガイド配列、及びtracr配列それぞれは、調節エレメントを別個のベクターに分離するように作動可能に連結され得る。代替的に、同じ又は異なる調節エレメントから発現されるエレメントの2種以上を、単一ベクターにおいて組み合わせ得、1種又は複数の付加的なベクターが、第1のベクターに含まれないCRISPRシステムの任意の成分を提供する。一部の実施形態において、単一ベクターにおいて組み合わされるCRISPRシステムエレメントは、任意の適切な配向で編成され得る。一部の実施形態において、CRISPR酵素、ガイド配列、tracr mate配列、及びtracr配列は、同じプロモーターに作動可能に連結され且つそれから発現される。一部の実施形態において、ベクターは、Casタンパク質等のCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。

一部の実施形態において、ガイド配列との組み合わせでの(任意選択で、と複合した)CRISPR酵素が細胞に送達される。典型的に、CRISPR/Cas9技術を使用して、操作された細胞におけるSuv39h1の遺伝子発現をノックダウンさせ得る。例えば、Cas9ヌクレアーゼ、及びSuv39h1遺伝子に特異的なガイドRNAは、例えば、Cas9分子及びガイドRNAを送達するためのいくつかの公知の方法又はビヒクルのいずれか等、細胞への移入のためのレンチウイルス送達ベクター又はいくつかの公知の送達法若しくはビヒクルのいずれかを使用して、細胞に導入され得る(下記も参照されたい)。

一部の実施形態において、誘導性遺伝子抑制システム、とりわけ誘導性CRISPR遺伝子不活性化は、Chylinski, K.、Hubmann, M.、Hanna, R.E.ら、CRISPR-Switch regulates sgRNA activity by Cre recombination for sequential editing of two loci. Nat Commun 10、5454(2019)、又は MacLeod, R.S.、Cawley, K.M.、Gubrij, I.ら、Effective CRISPR interference of an endogenous gene via a single transgene in mice. Sci Rep 9、17312(2019)に記載される等、好まれ得る。

遺伝子破壊分子及び複合体をコードする核酸の送達
一部の実施形態において、DNA標的化分子、複合体、又は組み合わせをコードする核酸が細胞に投与される又は導入される。典型的に、ウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子移入法を使用して、培養下の細胞に、CRISPR、ZFP、ZFN、TALE、及び/又はTALENシステムの成分をコードする核酸を導入し得る。

一部の実施形態において、細胞へのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入の結果として、ポリペプチドは細胞においてインサイチューで合成される。一部の態様において、ポリペプチドは細胞の外側で産生され得、次いでそこに導入され得る。

動物細胞にポリヌクレオチド構築物を導入するための方法は公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれる安定な形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれない一過性の形質転換法、及びウイルス媒介性の方法を含む。

一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば組み換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス)、リポソーム等によって細胞に導入され得る。一過性の形質転換法は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、又は粒子ボンバードメントを含む。核酸は発現ベクターの形態で投与される。好ましくは、発現ベクターは、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、DNAプラスミド発現ベクター、又はAAV発現ベクターである。哺乳類発現ベクターにおいて、Cas9発現を推進するプロモーターは構成的又は誘導性であり得ることが留意されるべきである。U6プロモーターは、典型的にgRNAに使用される。

核酸の非ウイルス送達の方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリステック、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質:核酸コンジュゲート、ネイキッドDNA、人工ビリオン、及び作用物質増強性のDNAの取り込みを含む。リポフェクションは、例えば米国特許第5,049,386号、第4,946,787号、及び第4,897,355号に記載され、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている(例えば、Transfectam(商標)及びLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適切であるカチオン性及び中性脂質は、Feigner、WO 91/17424;WO 91/16024のものを含む。送達は、細胞(例えば、インビトロ又はエクスビボ投与)又は標的組織(例えば、インビボ投与)へのものであり得る。一部の実施形態において、Cas9 RNP(リボ核タンパク質)が使用され得る。Cas9 RNPは、gRNAと複合した精製Cas9タンパク質からなる。それらはインビトロで会合し、標準的なエレクトロポレーション又はトランスフェクション技法を使用して細胞に直接送達され得る。Cas9 RNPは、Cas9/gRNAのプラスミドベースの発現と比較して、同様の効率でゲノム標的を切断し得る。Cas9 RNPは、無傷複合体として送達され、トランスフェクションの直後に高いレベルで検出可能であり、タンパク質分解経路を介して細胞から急速に取り除かれる。標的細胞へのCas9 RNP送達は、典型的に、脂質媒介性トランスフェクション又はエレクトロポレーションにより行われる(詳細に関しては、Wang, Mingら「Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles」、Proceedings of the National Academy of Sciences 113.11(2016):2868～2873頁;Liang, Xiquanら「Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection」、Journal of biotechnology 208(2015):44～53頁;Zuris, John A.ら「Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo」、Nature biotechnology 33.1(2015):73～80頁;又はKim, Sojungら「Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins」、Genome research 24.6(2014):1012～1019頁を参照されたい)。

RNA又はDNAウイルスベースのシステムは、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、及び単純ヘルペスウイルスベクターを含む。

遺伝子療法手順の総説に関しては、Anderson、Science 256:808～813頁(1992);Nabel & Feigner、TIBTECH 11:211～217頁(1993);Mitani & Caskey、TIBTECH 11:162～166頁(1993);Dillon、TIBTECH 11:167～175頁(1993);Miller、Nature 357:455～460頁(1992);Van Brunt、Biotechnology 6(10):1149～1154頁(1988);Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience 8:35～36頁(1995);Kremer & Perricaudet、British Medical Bulletin 51(1):31～44頁(1995);Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immunology、Doerfler及びBohm(編)(1995);並びにYuら、Gene Therapy 1:13～26頁(1994)を参照されたい。

グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、及び青色蛍光タンパク質(BFP)を含めた自家蛍光タンパク質を含むがそれらに限定されないレポーター遺伝子を細胞に導入して、遺伝子産物の発現の変更又は改変を測定するためのマーカーとして働く遺伝子産物をコードし得る。

細胞調製
細胞の単離は、当分野における周知の技法に従った1つ又は複数の調製及び/又はアフィニティーに基づかない細胞分離工程を含む。一部の例において、細胞は、洗浄され、遠心分離され、且つ/又は、例えば不要な成分を除去する、所望の成分について富化する、特定の試薬に感受性の細胞を溶解する若しくは除去するための、1種若しくは複数の試薬の存在下でインキュベートされる。一部の例において、細胞は、密度、接着特性、サイズ、特定の成分に対する感度及び/又は抵抗性等、1種又は複数の特性に基づいて分離される。

一部の実施形態において、細胞調製は、単離、インキュベーション、及び/又は操作の前又は後に、細胞を冷凍する、例えば凍結保存するための工程を含む。多様な公知の冷凍溶液及びパラメーターのいずれかが、一部の態様において使用され得る。

典型的に、細胞は、遺伝子操作及び/又はSOCS1(及び/又はSuv39h1及び/又はFAS及び/又はβ2m)阻害の前に又は一緒にインキュベートされる。

インキュベーション工程は、培養、インキュベーション、刺激、活性化、増大、及び/又は繁殖を含み得る。

一部の実施形態において、本発明に従ったSOCS1の(一部の実施形態において、及び/又はSuv39h1及び/又はFAS及び/又はβ2mの)阻害は、標的患者への細胞の注射の後にインビボでも達成され得る。典型的に、SOCS1の阻害は、以前に記載されるように薬理学的インヒビターを使用して実施され得る。

他の実施形態において、以前に記載される方法に従ったSOCS1の(一部の実施形態において、及び/又はSuv39h1及び/又はFAS及び/又はβ2mの)阻害は、刺激、活性化、及び/又は増大工程の間にも実施され得る。例えば、PBMC又は精製T細胞又は精製NK細胞又は精製リンパ系前駆体は、患者への養子移入の前に、SOCS1及び/又はFAS及び/又はSuv39h1及び/又はβ2mの薬理学的インヒビターの存在下でインビトロで増大する。一部の実施形態において、組成物又は細胞は、刺激条件又は刺激剤の存在下でインキュベートされる。そのような条件は、集団における細胞の増殖、増大、活性化、及び/若しくは生存を誘導する、抗原曝露を模倣する、並びに/又は遺伝子操作された抗原受容体の導入に対して等、遺伝子操作に対して細胞をプライムするように設計されたものを含む。

インキュベーション条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、並びに/又はサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組み換え可溶性受容体、及び細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質等の刺激因子、のうちの1種又は複数を含み得る。

一部の実施形態において、刺激条件又は刺激剤は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化し得る1種又は複数の作用物質、例えばリガンドを含む。一部の態様において、作用物質は、T細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードをオンにする又は始動する。そのような作用物質は、例えばビーズ等の固体支持体に結合した、TCR成分及び/若しくは共刺激性受容体に特異的なもの等の抗体、例えば抗CD3、抗CD28、並びに/又は1種若しくは複数のサイトカインを含み得る。任意選択で、増大法は、培養培地に抗CD3及び/又は抗CD28抗体を添加する工程を更に含み得る(例えば、少なくとも約0.5ng/mlの濃度で)。一部の実施形態において、刺激剤は、IL-2及び/又はIL-15、例えば少なくとも約10単位/mLのIL-2濃度を含む。

一部の態様において、インキュベーションは、Riddellらに対する米国特許第6,040,177号、Klebanoffら、J Immunother. 2012;35(9):651～660頁、Terakuraら、Blood. 2012;1:72～82頁、及び/又はWangら、J Immunother. 2012,35(9):689～701頁に記載されるもの等の技法に従って行われる。

一部の実施形態において、培養始動(culture-initiating)組成物に、非***末梢血単核細胞(PBMC)等のフィーダー細胞を添加し(例えば、それにより、結果として生じる細胞の集団は、増大させる対象となる初期集団における各Tリンパ球に対して、少なくとも約5、10、20、若しくは40個、又はそれよりも多いPBMCフィーダー細胞を含有する);且つ培養物をインキュベートする(例えば、T細胞の数を増大させるのに十分な時間)ことによって、T細胞は増大する。一部の態様において、非***フィーダー細胞は、ガンマ照射されたPBMCフィーダー細胞を含み得る。一部の実施形態において、PBMCに約3000～3600ラドの域内のガンマ線を照射して、細胞***を阻止する。一部の態様において、フィーダー細胞は、T細胞の集団の添加前に、培養培地に添加される。

一部の実施形態において、刺激条件は、ヒトTリンパ球の成長に適切な温度、例えば少なくとも約25セ氏温度、一般的に少なくとも約30度、及び一般的に37セ氏温度又は約37セ氏温度を含む。任意選択で、インキュベーションは、非***EBV形質転換リンパ芽球様細胞(LCL)をフィーダー細胞として添加する工程を更に含み得る。LCLは、約6000～10,000ラドの域内のガンマ線を照射され得る。LCLフィーダー細胞は、一部の態様において、少なくとも約10:1のLCLフィーダー細胞の初期Tリンパ球に対する比等、任意の適切な量で提供される。

実施形態において、抗原特異的CD4+及び/又はCD8+ T細胞等の抗原特異的T細胞は、ナイーブ又は抗原特異的Tリンパ球を抗原で刺激することによって獲得される。例えば、感染した対象からT細胞を単離し、細胞を同じ抗原でインビトロで刺激することによって、サイトメガロウイルス抗原に対して、抗原特異的T細胞株又はクローンが作出され得る。

一部の態様において、方法は、操作された細胞又は操作されている細胞の表面での1種又は複数のマーカーの発現を査定する工程を含む。1つの実施形態において、方法は、例えばフローサイトメトリー等によるアフィニティーベースの検出法によって、養子細胞療法によって標的にされることが求められる1種又は複数の標的抗原(例えば、遺伝子操作された抗原受容体によって認識される抗原)の表面発現を査定する工程を含む。

細胞遺伝子操作のためのベクター及び方法
一部の態様において、遺伝子操作は、遺伝子操作される成分、又は遺伝子破壊タンパク質若しくは核酸をコードする成分等、細胞への導入のための他の成分をコードする核酸の導入を伴う。

一般的に、免疫細胞(例えば、T細胞)内へのCARの操作は、形質導入及び増大を可能にするように細胞が培養されることを要する。形質導入は多様な方法を利用し得るが、操作された細胞をクローン的に増大させ且つ持続させることにおいて継続的なCAR発現を可能にするためには、安定な遺伝子移入が必要とされる。

一部の実施形態において、遺伝子移入は、まず、細胞成長、例えばT細胞成長、増殖、及び/又は活性化を刺激し、その後に、活性化された細胞の形質導入、及び臨床適用に十分な数までの培養下での増大が続くことによって遂行される。

遺伝子操作された成分、例えば抗原受容体、例えばCARの導入のための様々な方法は周知であり、提供される方法及び組成物とともに使用され得る。例示的な方法は、ウイルス、例えばレトロウイルス又はレンチウイルス形質導入、トランスポゾン、及びエレクトロポレーションを介したものを含めた、受容体をコードする核酸の移入のためのものを含む。

一部の実施形態において、組み換え核酸は、例えばシミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクター等、組み換え感染性ウイルス粒子を使用して細胞に移入される。一部の実施形態において、組み換え核酸は、ガンマ-レトロウイルスベクター等、組み換えレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを使用してT細胞に移入される(例えば、Kosteら(2014)Gene Therapy 2014年4月3日;Carlensら(2000)Exp Hematol 28(10):1137～46頁;Alonso-Caminoら(2013)Mol Ther Nucl Acids 2、e93;Parkら、Trends Biotechnol. 2011年11月;29(11):550～557頁を参照されたい)。

一部の実施形態において、レトロウイルスベクター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、骨髄増殖性肉腫ウイルス(MPSV)、マウス胚性幹細胞ウイルス(MESV)、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)、脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するレトロウイルスベクターは、長い末端反復配列(LTR)を有する。ほとんどのレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。一部の実施形態において、レトロウイルスは、任意の鳥類又は哺乳類細胞供給源に由来するものを含む。レトロウイルスは典型的に両種指向性であり、それらが、ヒトを含めたいくつかの種の宿主細胞に感染し得ることを意味する。1つの実施形態において、発現される対象となる遺伝子は、レトロウイルスgag、pol、及び/又はenv配列に取って代わる。いくつかの実例となるレトロウイルスシステムが記載されている(例えば、米国特許第5,219,740号;第6,207,453号;第5,219,740号;Miller及びRosman(1989)BioTechniques 7:980～990頁;Miller, A. D.(1990)Human Gene Therapy 1:5～14頁;Scarpaら(1991)Virology 180:849～852頁;Burnsら(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033～8037頁;並びにBoris-Lawrie及びTemin(1993)Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102～109頁)。

レンチウイルス形質導入の方法も公知である。例示的な方法は、例えばWangら(2012)J. Immunother. 35(9):689～701頁;Cooperら(2003)Blood. 101:1637～1644頁;Verhoeyenら(2009)Methods Mol Biol. 506:97～114頁;及びCavalieriら(2003)Blood. 102(2):497～505頁に記載される。

一部の実施形態において、組み換え核酸は、エレクトロポレーションによりT細胞に移入される(例えば、Chicaybamら(2013)PLoS ONE 8(3):e60298、及びVan Tedelooら(2000)Gene Therapy 7(16):1431～1437頁を参照されたい)。一部の実施形態において、組み換え核酸は、転位によりT細胞に移入される(例えば、Manuriら(2010)Hum Gene Ther 21(4):427～437頁;Sharmaら(2013)Molec Ther Nucl Acids 2、e74;及びHuangら(2009)Methods Mol Biol 506:115～126頁を参照されたい)。免疫細胞における、遺伝材料を導入し且つ発現させる他の方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York. N.Y.に記載される)、原形質融合、カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション;タングステン粒子により促される微粒子ボンバードメント(Johnston、Nature、346:776～777頁(1990));及びリン酸ストロンチウムDNA共沈降(Brashら、Mol. Cell Biol.、7:2031～2034頁(1987))を含む。

遺伝子操作された産物をコードする遺伝子操作された核酸の移入のための他の手法及びベクターは、例えば国際特許出願公開第WO2014055668号及び米国特許第7,446,190号に記載されるものである。

本発明の組成物
本発明は、本明細書に記載され、且つ/又は提供される方法によって産生される細胞を含有する組成物も含む。典型的に、組成物は、養子細胞療法のための等、投与のための医薬組成物及び製剤である。

本発明の医薬組成物は、一般的に、本発明の少なくとも1種の操作された免疫細胞、及び薬学的に許容される担体を含む。

本明細書において使用するとき、「薬学的に許容される担体」という言葉は、薬学的投与に適合する、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。補足的活性化合物が組成物に更に組み込まれ得る。一部の態様において、医薬組成物における担体の選定は、一部には、特定の操作されたCAR又はTCR、CAR又はTCRを発現するベクター又は細胞によって、並びにCARを発現するベクター又は宿主細胞を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、多様な適切な製剤がある。例えば、医薬組成物は防腐剤を含有し得る。適切な防腐剤は、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムを含み得る。一部の態様において、2種以上の防腐剤の混合物が使用される。防腐剤又はその混合物は、典型的に、組成物全体の約0.0001～約2質量%の量で存在する。

医薬組成物は、その意図される投与の経路に適合するように製剤化される。

治療法
本発明は、養子療法(とりわけ、養子T細胞療法)における、典型的にはそれを必要とする対象における癌の治療における、それらの使用に対して以前に規定される細胞にも関する。一部の実施形態において、本明細書に開示される細胞は、任意選択でSuv39h1及び/又はβ2mの不活性化との組み合わせで、とりわけSOCS1及び/又はFASに欠陥のある細胞の場合における同種移入において使用され得る。

本明細書において使用される「治療」又は「治療すること」とは、癌、又は疾患(例えば、癌)の任意の症状等、疾患を治す、治癒する、緩和する、軽減する、変更する、救済する、改善する、向上させる、又は影響を及ぼすことを目的とした、それを必要とする患者への、本発明に従った細胞の又は細胞を含む組成物の適用又は投与として定義される。特に、「治療する」又は「治療」という用語は、癌等の疾患と関連した少なくとも1つの有害な臨床症状、例えば疼痛、腫脹、低血球数等を低下させること又は緩和することを指す。

癌治療に関連して、「治療する」又は「治療」という用語は、新生物の無制御な細胞増量の進行を遅らせること又は逆転させること、すなわち既存の腫瘍を縮小すること及び/又は腫瘍成長を食い止めることも指す。「治療する」又は「治療」という用語は、対象において癌又は腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導することも指す。

本発明の対象(すなわち、患者)は、哺乳類、典型的にはヒト等の霊長類である。一部の実施形態において、霊長類はサル又は類人猿である。対象は、雄又は雌であり得、幼児、年少者、青年、成人、及び高齢の対象を含めた任意の適切な年齢であり得る。一部の実施形態において、対象は、齧歯類等の非霊長類哺乳類である。一部の例において、患者又は対象は、疾患、養子細胞療法に対して、及び/又はサイトカイン放出症候群(CRS)等の有毒な転帰を査定することに対して検証された動物モデルである。本発明の一部の実施形態において、対象は、癌を有する、癌を有するリスクがある、又は癌の寛解期にある。

癌は、固形癌、又は、とりわけ白血病及びリンパ腫を含む、造血組織及びリンパ系組織の腫瘍としても知られる、血液、骨髄、及びリンパ系に影響を及ぼす癌等の「液体腫瘍」であり得る。液体腫瘍は、例えば急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ球性白血病(ALL)、及び慢性リンパ球性白血病(CLL)を含む(マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)等の様々なリンパ腫、腺腫、扁平上皮細胞癌腫、咽頭癌腫、胆嚢及び胆管癌、網膜芽細胞腫等の網膜の癌を含む)。

一部の実施形態において、対象は、ウイルス、レトロウイルス、細菌、及び原虫感染症、免疫欠損、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バールウイルス(EBV)、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス等であるがそれらに限定されない、感染性疾患又は病態に罹患している又はそのリスクがある。一部の実施形態において、疾患又は病態は、関節炎、例えば関節リウマチ(RA)、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息、及び/又は移植と関連した疾患若しくは病態等、自己免疫性又は炎症性疾患又は病態である。

本発明は、以前に記載される組成物の、それを必要とする対象への投与を含む、治療及びとりわけ養子細胞療法、好ましくは養子T細胞療法の方法にも関する。

一部の実施形態において、細胞又は組成物は、癌又は上で触れられる疾患のいずれか1種を有する又はそのリスクがある対象等の対象に投与される。一部の態様において、それによって、方法は、操作された細胞によって認識される抗原を発現する癌における腫瘍量を減らすことによって、癌に関連したもの等の疾患又は病態を治療する、例えばその1つ又は複数の症状を改善する。

養子細胞療法のための細胞の投与のための方法は公知であり、提供される方法及び組成物と一緒に使用され得る。例えば、養子T細胞療法の方法は、例えばGruenberg らに対する米国特許公開第2003/0170238号;Rosenbergに対する米国特許第4,690,915号;Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577～85頁に記載される。例えば、Themeliら(2013)Nat Biotechnol. 31(10):928～933頁;Tsukaharaら(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84～9頁;Davilaら(2013)PLoS ONE 8(4):e61338を参照されたい。

一部の実施形態において、細胞療法、例えば養子細胞療法、例えば養子T細胞療法は、細胞が、細胞療法を受けるべきである対象から又はそのような対象に由来するサンプルから単離され且つ/又は別様に調製される、自家移入によって行われる。故に、一部の態様において、細胞は、治療を必要とする対象、例えば患者に由来し、細胞は、単離及び処理の後、同じ対象に投与される。

一部の実施形態において、細胞療法、例えば養子細胞療法、例えば養子T細胞療法は、細胞が、細胞療法を受けるべきである又は細胞療法を最終的に受ける対象、例えば第1の対象以外の対象から単離され且つ/又は別様に調製される、同種移入によって行われる。そのような実施形態において、細胞は、次いで同じ種の異なる対象、例えば第2の対象に投与される。一部の実施形態において、第1及び第2の対象は遺伝学的に同一である。一部の実施形態において、第1及び第2の対象は遺伝学的に同様である。一部の実施形態において、第2の対象は、第1の対象と同じHLAクラス又はスーパータイプを発現する。そのような実施形態において、任意選択でSUV39h1及び/又はβ2m不活性化との組み合わせでの、SOCS1及び/又はFASに欠陥のある細胞の使用が好まれる。

それを必要とする対象への本発明に従った少なくとも1種の細胞の投与は、同時に又は任意の順序で逐次的に、1種若しくは複数の付加的な治療剤と又は別の治療的介入と一緒に組み合わせられ得る。一部の背景において、細胞は、細胞集団が1種若しくは複数の付加的な治療剤の効果を増強するように、時間が十分に密接して別の療法と共投与される、又は逆もまた同様である。一部の実施形態において、細胞集団は、1種又は複数の付加的な治療剤の前に投与される。一部の実施形態において、細胞集団は、1種又は複数の付加的な治療剤の後に投与される。

癌治療に関連して、組み合わせられる癌治療は、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生剤(anti-angiogen)、放射性標識化合物、免疫療法、手術、凍結療法、及び/又は放射線療法を含み得るが、それらに限定されるわけではない。

免疫療法は、免疫チェックポイントモジュレーター(すなわち、インヒビター及び/又はアゴニスト)、モノクローナル抗体、癌ワクチンを含むが、それらに限定されるわけではない。

好ましくは、本発明に従った養子T細胞療法における細胞の投与は、免疫チェックポイントモジュレーター、とりわけチェックポイントインヒビターの投与と組み合わせられる。チェックポイントインヒビターは、例えば、PD-1インヒビター、PD-L1インヒビター、Lag-3インヒビター、Tim-3インヒビター、TIGITインヒビター、BTLAインヒビター、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)インヒビター、及びCTLA-4インヒビター、IDOインヒビターを含むが、それらに限定されるわけではない。共刺激性抗体は、ICOS、CD137、CD27、OX-40、及びGITRを含むがそれらに限定されない免疫調節受容体を通じて正のシグナルを送達する。最も好ましくは、免疫チェックポイントモジュレーターは、PD-1インヒビター(抗PD-1等)、PDL1インヒビター(抗PDL1等)、及び/又はCTLA4インヒビターを含む。

チェックポイント遮断との組み合わせに加えて又はそれに代わるものとして、本開示の免疫細胞(とりわけ、免疫細胞組成物)は、TALEN及びCrispr/Casを含むがそれらに限定されない遺伝子編集技術を使用して、それらを免疫チェックポイントに抵抗性の状態にするようにも遺伝子改変され得る。そのような方法は当技術分野において公知であり、例えばUS20140120622を参照されたい。遺伝子編集技術を使用して、PD-1 、Lag-3、Tim-3、TIGIT、BTLA、CTLA-4、及びこれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない、T細胞によって発現される免疫チェックポイントの発現を阻止し得る。本明細書において論じられる免疫細胞は、これらの方法のいずれかによって改変され得る。

本開示に従った免疫細胞は、腫瘍へのホーミングを増加させる分子を発現するように、又は、サイトカイン、可溶性免疫調節受容体、及び/又はリガンドを含むがそれらに限定されない炎症性媒介因子を腫瘍微小環境に送達するようにも遺伝子改変され得る。

本発明は、対象における癌、感染性疾患若しくは病態、自己免疫性疾患若しくは病態、又は炎症性疾患若しくは病態を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載される操作された免疫細胞を含む組成物の使用にも関する。

本発明は、任意選択でSuv39h1及び/又はβ2mの不活性化との組み合わせで、T細胞におけるFAS及び/又はSOCS1活性の抑制(以前に記載されるように、遺伝子、mRNA、又は遺伝子レベルにおける)の工程を含む、例えば癌の治療における、同種養子療法において使用可能な、普遍的免疫細胞、特に普遍的T細胞の製造のための方法も包含する。

本発明は、
- 対象から少なくとも1種の免疫細胞を獲得する工程
- Fas及び/又はSCO1を不活性化するように、少なくとも1種の免疫細胞を改変する工程
- それを必要とする別の対象に、典型的には医薬組成物の形態で、少なくとも1種の免疫細胞を投与する工程
を含む、同種養子療法のための、とりわけ同種癌養子療法、とりわけ同種ATCTのための方法であって、
任意選択で、少なくとも1種の免疫細胞は、以前に記載されるように1種又は複数の遺伝子改変された抗原受容体を発現するように更に改変され;
任意選択で、少なくとも1種の免疫細胞は、Suv39h1及び/又はβ2mを不活性化するように更に改変され;
任意選択で、少なくとも1種の細胞は、以前に記載されるようにCD4+ T細胞又はCD4+/CD8+ T細胞の混合集団である、
方法も包含する。

この方法は、以前に記載される実施形態とも組み合わせられ得る。

材料及び方法
細胞株及びマウス
E. Piaggio及びC. Theryによって快く提供されたB16-OVA及びMB49細胞株、O. Bernardによって提供されたFFLuc-BFP NALM6(NALM6)細胞株を、10%FBSを補足されたRPMI-1640中で維持した。HY雄抗原に特異的な、CD45.1及びCD45.2雌マリリンTCRトランスジェニックRag2^-/-マウスを、Rosa26-Cas9-EGFPノックインマウス(026179、Jackson lab)と交配させた。Thy1.1及びThy1.2 OT-II TCRトランスジェニックRag2^-/-マウス、OVAに特異的で且つ雌のCD45.1雌OT-I TCRトランスジェニックRag2^-/-マウス、雄NOD-scid IL2Rg^-/-(NSG)マウスもこの調査において使用した。雌C57BL/6マウスを、Charles River Laboratories社(L'Arbresle、France)から購入した。すべての実験を、関連する倫理委員会によって承認された倫理指針に従って、フランス獣医部門(French Veterinarian Department)による認可された動物施設において、6～12週齢のマウスを用いて行った(AP AF1S#6030-20 16070817147969 v2、許可#XX DAP 2017-023)。

細胞培養及び養子移入
ナイーブCD4+ T細胞を、マリリン又はOT-IIマウスの末梢リンパ節から獲得した。CD45.1マリリンマウス又はThy1.1 OT-IIマウスのリンパ節及び脾細胞を、それぞれ10nM Dby(NAGFN-SNRANSSRSS、Genscript社)及び5μM OVAIIペプチド(InvivoGen社)でプライムすることによって、抗原経験CD4⁺ T細胞をインビトロで作出した。IL-2(10ng/mL)、IL-7(2ng/mL)(Peprotech社)を、10%FBS及び0.55mM β-メルカプトエタノールを補足された完全RPMI-1640中に、4日目に開始し且つ3日ごとに添加した。リンパ節及び脾臓由来のAg-exp OT-I細胞を、0.5μM SIINFEKL(InvivoGen社)とともに培養し、2日ごとにIL15(50ng/mL)(Peprotech社)を用いて維持した。T細胞を、PBS中5μM CFSE(Invitrogen社)で37℃にて8分間標識した。インビボGSスクリーニングに関しては、4.10⁶個のナイーブCD45.2マリリンCD4⁺ T細胞を移入し、足蹠に4.10⁶個の、DbyをロードしたLPS成熟骨髄由来樹状細胞(BMDC)をワクチン接種した。7日後、12.10⁶個のライブラリー形質導入又は12.10⁶個のモック形質導入CD45.1 Cas9-マリリン細胞を静脈内注射し、マウスに、同じ時に4.10⁶個の、DbyをロードしたLPS成熟BMDCを足蹠にワクチン接種した。検証実験に関しては、10⁶個のナイーブCD45.2マリリン又はThy1.2 OT-II細胞の第1のコホートを、10⁶個の、ペプチドをロードしたLPS成熟BMDCを足蹠にワクチン接種されたCD45.2 B6宿主に移入した。7日後、10⁶個のナイーブCD45.1マリリン、Thy1.1 OT-558 II細胞、又は2.10⁶個のAg-exp CD45.1マリリン、Thy1.1 OT-II CD4+ T細胞のいずれかの第2のコホートを注射し、マウスに、10⁶個の、ペプチドをロードしたLPS成熟BMDCを足蹠にワクチン接種した。BMDCを、20ng/mlのGM-CSF(Peprotech社)を含有する完全IMDM中での10日間の培養によって作出し、1ug/mLリポ多糖(Sigma-Aldrich社)を用いた20時間の処理によって成熟を誘導し、50nM Dby又は20μM OVAIIペプチドで2時間パルスした。マウスを、ACT(10mg/kg)後7、11、及び11日目に、腹腔内において、アイソタイプ対照ラットIgG2b(クローンLTF2)、IgG2a(クローン2A3)、抗マウスCD122抗体(クローンTM-ベータ1)、抗マウスIFN-gR(クローンGR-20)を含めた、Bioxcell社製のブロッキング抗体で処理した。養子細胞療法に関しては、雌C57BL6宿主に、1.5.10⁶個の雄膀胱MB49腫瘍細胞又は4.10⁵個のB16-OVA黒色腫細胞のいずれかを皮下に埋め込んだ。MB49モデルに関しては10日目に及びB16-OVAに関しては7日目に、106個のマリリンCD4+ T細胞又は2.10⁶個のOT-I及び2.10⁶個のOT-II細胞を、腫瘍を持つマウスに養子移入した(n=4～6/群)。B16-OVAモデルに関しては、腫瘍が直径15mmを超えた時点でマウスを屠殺した。

健常ドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)を、密度勾配遠心分離によって単離した。Tリンパ球を、Pan T細胞単離キット(Miltenyi Biotech社)を使用して精製し、5%ヒト血清(Sigma社)及び0.5mM β-メルカプトエタノールを補足されたX-vivo 15培地(Lonza社)中にて、106個細胞/mLの密度で、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(1:1ビーズ:細胞)(ThermoFisher社)で活性化した。活性化の48時間後、T細胞に、抗CD19(FMC63)-CD8tm-4IBB-CD3ζ CAR構築物(rLV.EF1.19BBz、Flash Therapeutics社)のレンチウイルス上清をMOI 10で形質導入した。2日後、CD3/CD28ビーズを磁気的に除去し、CAR T細胞に、Cas9-リボ核タンパク質(Cas9-RNP)をエレクトロポレーションし、IL7(5ng/mL)及びIL15(5ng/mL)を補足されたX-vivo中で維持した。エレクトロポレーションの6日後、gDNAに関する変異導入定量及びSOCS1発現のウェスタンブロット分析のために、CD4⁺及びCD8⁺ CAR-T細胞を、CD8⁺ T Cell単離キット(Miltenyi社)を使用して分離した。雄又は雌8～12週齢NSGマウスに、4.10⁵個のNALM6細胞を尾静脈注射によって静脈内に注射した。3日後、2.10⁶個のCAR T細胞を、尾静脈注射によって静脈内に投与した(0日目)。腫瘍量を、Lumina IVIS Imaging System(PerkinElmer社)を使用して、生物発光イメージングによって測定した。放射輝度が>5.10⁶[p/s/cm≦/sr]である時点で、マウスを屠殺した。

細胞傷害性アッセイ
CARを形質導入されたT細胞の細胞傷害性を、X-vivo培地中にてウェルあたり100μlの総容積でCAR T細胞(エフェクター)とNalm6細胞(標的)とを、表示されるE/T比で三連で共培養することによって判定した。最大ルシフェラーゼ発現(相対的光単位;RLUmax)を、同じ細胞密度で播かれた標的細胞単独を用いて判定した。18時間後、100μlルシフェラーゼ基質(Perkin Elmer社)を各ウェルに直接添加した。発光を、SpectraMax ID3プレートリーダー(VWR)を使用して検出した。溶解を、(1-(RLUサンプル)/(RLUmax))×100として判定した。

抗体及びフローサイトメトリー分析
密度勾配媒体(Histopaque、Sigma社)で富化されたリンパ節細胞、脾細胞、及び腫瘍サンプルを、マウス抗体とともにインキュベートした(STAR法)。ヒト培養細胞、NSGマウス細胞由来の骨髄細胞及び脾細胞を、表示されるAb又はヒトに特異的な可溶性タンパク質:蛍光色素コンジュゲート抗体で染色した(STAR法)。細胞内染色を、細胞内染色用透過処理洗浄バッファー(BD Bioscience社)又はFoxp3キット(eBioscience社)のいずれかを用いて実施した。CAR発現を、9269-CD-050 Recombinant Human CD19 Fc Chimera Protein(Bio Techne社)を1/100希釈で4℃にて1時間使用して査定した。生存能を、Fixable Viability Dye eFluor 780(eBioscience社)又はAqua Live dead(Thermo Fisher社)を使用して評価した。再刺激を、20ng/mLのPMA(Sigma社)、1μMのイオノマイシン(Sigma社)、及びBD Golgi plugを37℃で4時間用いて実施した。Cell Sorting Set-up Beads(Life Technologies社)を使用して、細胞数を定量し、サンプル及び実験間で細胞数を正規化した。染色をブロッキング溶液:5%FCS及び2%抗FcR 2.4G2中で実施し、サンプルをLSRII/ Fortessa(BD社)で取得し、FlowJoソフトウェア(V10、Tree Star社)を用いて分析した。細胞選別をARIAII(BD社)で実施した。

ウェスタンブロット分析
T細胞(2.10⁶個)を、RIPA溶解バッファー(Thermofisher社)及び1×Protease Inhibitor Cocktail(Sigma社)を使用して溶解した。細胞残屑を4℃で15分間の14,000rpmでの遠心分離によって除去し、上清からの20～40μgのタンパク質をSDS-PAGEを使用して分離し、PVDF膜に転写した。SOCS1及びβ-アクチン(ローディング対照)を、Chemidoc Touch Imaging system(Biorad社)で、モノクローナル抗体抗SOCS1(1μg/mL)(ab62584;Abcam社)、抗アクチンマウス(Millipore社、クローンC4)、HRP抗ウサギIgG1(Cell Signaling Technology社)、HRP抗マウスIgG(Cell signaling社)を使用して可視化した。シグナル強度をImageJソフトウェアを用いて定量した。

ゲノムワイドCRISPR-Cas9スクリーニング
ゲノムワイドCRISPR-Cas9スクリーニングのためのレンチウイルスgRNAプラスミドライブラリー(Mouse Improved Genome-wide Knockout CRISPR Library v2、Pooled Library #67988#)及びモックベクター(#67974)をAddgene社から獲得した。Addgene社によって提供されるプロトコールに従って、ライブラリーを増幅した。簡潔には、4×25ulのNEB 10-beta Electrocompetent E. coli(NEB社、カタログ番号C3020K)に、4×10ng/μlをエレクトロポレーションし、4×500mLのアンピシリン処理ルリア・ベルターニ(LB)中で培養し、振とうさせながら37℃で一晩インキュベートした。プラスミドを、EndoFree plasmid Maxi kit(Qiagen社)の12本のカラムを用いて抽出した。ウイルスライブラリーを調製するために、20cmディッシュ(×15)における低継代(<7)の293T細胞に、11μgのgRNAライブラリー、11μgのpsPAX2、及び2.5μgのpVSV-Gをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、培地をDMEM-1%BSAに交換し、48時間、60時間、及び72時間の時点で回収し、次いで遠心分離し、0.45uM PVDF膜(Millipore社)を通して濾過し、Amicon Ultra 15ml遠心分離フィルター(Merck社)を使用して濃縮し、新鮮なものを使用した。T細胞形質導入の1日前に、CD4⁺ T細胞を、MagniSort Mouse CD4⁺ T cell Enrichment Kit(Thermofisher scientific社)を使用して富化し、新鮮な培地及びIL-2(10ng/ml)、IL-7(2ng/ml)を補足された培養培地を用いて、1,5.106個細胞/mlの密度で播種する。細胞を、10ug/mlの硫酸プロタミン(Sigma社)及び8ug/mlのDEAE-デキストラン(Sigma社)を用いて、32℃、900gで90分間スピンフェクト(spinfect)する。使用されたレンチウイルスライブラリーの容積は、5ug/mlのピューロマイシン(Sigma社)を用いた5日間の選択の後、0.3のMOIという最適な形質導入効率を達成するために必要とされるものである。CFSEhi及びCFSElo Cas9-CD45.1マリリンCD4⁺ T細胞を選別し、それらのgDNAを、10μlの溶解バッファー-AL(Qiagen社-DNeasy blood and tissue kit)、1μlプロテイナーゼK(Qiagen社)を使用して抽出し、その後に56℃で30分間のインキュベーション、95℃で30分間のインキュベーション、及び氷上で20μlのddH20中への再懸濁が続いた。gRNAsを、Herculase II Fusion DNA Polymerase(Agilent社)を使用して、2工程PCR法によって増幅した。第1の工程PCRに関しては、抽出されたすべてのgDNAを使用して、順方向プライマー50bp-F及び逆方向プライマー50bp-Rを用いておよそ30×50-μl PCR反応を実施する(STAR法);使用されたPCRプログラムは、94℃180秒間、94℃30秒間、60℃10秒間、及び72℃25秒間の16サイクル、並びに68℃で最終2分間の伸長である。

第1の工程PCRの産物をプールし、Ampure XP(Agencourt)を用いて精製し、dsDNA HSアッセイキットを使用して定量する。3回の50-μl PCR反応を、順方向プライマーIndex-F及び逆方向プライマー(Index-R1～R6)のうちの1種を用いて実施した。使用されたPCRプログラムは、94℃180秒間、94℃30秒間、54℃10秒間、及び72℃18秒間の18サイクル、並びに68℃で最終2分間の伸長である。

第2の工程PCR反応の産物を精製し、ライブラリー存在量(library representation)に対するMiseq又はHiSeq2500機器(Illumina社)を用いたシーケンシングの前に、DNAサンプルに対するCaliper Labchip(HT DNA High Sensitivity LabChip Kit;Perkin Elmer社)を用いて分析した。DNA品質を、Agilent DNA 1000シリーズIIアッセイ及びQubit fluorometer(Invitrogen社)を使用して査定し且つ定量した。

シーケンシングを、標的領域の反復構造を印付けする23ダークサイクルが先行する25-bpシングルエンドシーケンシングプロトコールを使用して、10% Phix対照を用いて実施した。

バルクmRNAシーケンシング及び分析
10⁴～3.10⁴個のマウス及びヒトT細胞を、1%のb-メルカプトエタノールを有するTCLバッファー(Qiagen社)中でリンパ節及び腫瘍から選別した。総RNAを、 DNAse処理(Qiagen社)の工程を含めて、メーカーの使用説明書に従ってSingle Cell RNA purification kit(Norgen社)を使用して精製した。次いで、RNAインテグリティーナンバー(RNA integrity number)を、Agilent RNA 6000 pico kitを用いて評価した。cDNA合成及びIllumina適合性ライブラリーを、メーカーの使用説明書に従ってSMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit-Pico Input Mammalianを使用して、キュリー研究所の次世代シーケンシングプラットフォームによって、総RNA(0,25～10ng)から作出した。次いで、ライブラリーを、100bpペアエンドモードを使用してIllumina NovaSeq-S1でシーケンシングした(OR HiSeq-Rapid Run-PE100)。FASTQファイルを、Hisat2を使用して参照ゲノムhg19(ヒト)又はmm10(マウス)にマッピングし、Subread RパッケージからのfeatureCountsによってカウントして、リードカウント表を作成した。次いで、EdgeRを使用してリードカウントを正規化し、少なくとも3組の複製物において>0.5cpmの発現を有する遺伝子を、後続の分析のために保った。差次的遺伝子発現をlimma-voom Rパッケージを用いて実施した。fgsea Rパッケージを使用してエンリッチメントスコアを計算した。Affymetrix分析に関しては、Mouse Clariom Dチップ(Thermo Fisher社)を使用して遺伝子発現を行った。RNAサンプルを、Ovation Pico WTA System v2(Nugen社)を用いて増幅し、Encore biotin module(Nugen社)で標識した。アレイを5μgの標識DNAとハイブリダイズさせ、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix社)でアッセイした。キュリー研究所ゲノム施設(Institut Curie Genomic facility)において、Expression console(Affymetrix社)を用いて生データを作出し且つ制御した。

ゲノムワイドデータ処理
シーケンシングの後に獲得されたFASTQファイルを、HiSeq Analysis software(Illumina社)を使用して逆多重化した。次いで、MAGeCK(Liら、2014)カウントコマンドを使用して、シングルエンドのリードとゲノム規模のsgRNA Yusaライブラリー(Koike-Yusaら、2014)からのsgRNA配列とをマッチさせることによって、per-sgRNAリードカウント表を作出した。マッピングの前に、ライブラリーから、まず、(i)参照ゲノム(本明細書ではmm10)にマッピングしなかったすべてのsgRNA、及び(ii)参照ゲノムにおける複数のスポットにマッピングした(マルチヒット)すべてのsgRNA、を除いた。冗長なsgRNAを統合した。次いで、各サンプルに対する正規化係数を、edgeR Rパッケージ(Robinson及びOshlack、2010)において実行されるM値のトリム平均(Trimmed Mean of M-value)(TMM)法を使用して算出した。正規化されたカウントを、低発現sgRNA(3つのサンプルにおいて100万あたり少なくとも4カウントを有するsgRNAのみを保つ)に対してフィルターにかけ、limma Rパッケージにおいて実行されるvoomを使用して、100万あたりlog2カウントに変換した。各sgRNAの差次的発現を、各スクリーニングからの高い及び低いCFSE細胞画分を使用して、limmaにおけるlmFit機能を使用して算出した。

各sgRNAに関して、富化及び枯渇p値を、対応のある片側スチューデントt検定を使用して計算した。これらから、各遺伝子に対するロバストランク集約(Robust Rang Aggregation)(RRA)スコア(10.1093/bioinformatics/btr709)を、各遺伝子の複数のsgRNA(n=5)の間で計算し、遺伝子レベルの関連p値及び相当する調整p値[誤発見率(False Discovery Rate)(FDR)]を、同じサイズの無作為化遺伝子セットを用いて、1,000,000回の反復を有する並べ替え検定を使用して獲得した。最後に、それらの富化p値、及びRRAスコアを支持するsgRNAの対数倍変化中央値に従って、遺伝子のグラフ表示を行った。

Cas9-RNP検証
マウスT細胞に関しては1μl Oligos crRNA(100nM)及び1μl tracrRNA(100nM)(STAR Methods)、並びにヒトT細胞に関しては1μl Oligos crRNA1+1μl Oligos crRNA2+1μl Oligos tracrRNAを95℃で5分間アニールさせ、10μg S.p Hifi Cas9 Nuclease V3とともに室温で10分間インキュベートした(STAR法)。2.10⁶個のT細胞を、3μl又は4μl RNPを有する20μlのヌクレオフェクション溶液に再懸濁し、ヌクレオフェクションキュベットストリップ(4D-Nucleofector X kit S;Lonza社)に移した。マウスT細胞に、4D nucleofector(4D-Nucleofector Core Unit:Lonza社、AAF-1002B)のDN110プログラムを使用して、ヒトCAR T細胞に、プログラムE0115を使用してエレクトロポレーションした。次いで、補足された新鮮な培地中への再懸濁の前に、T細胞を32℃で24～48時間インキュベートして、変異導入効力を増加させた(Doyonら、2010)。マウスCD4+ T細胞を、IL2(10ng/mL)及びIL-7(2ng/mL)を有する完全RPMI中で維持した。ヒトT細胞を、5%ヒト血清並びにIL7(5ng/mL)及びIL15(5ng/mL)を有するX-Vivo中で維持した。遺伝子座特異的PCR(STAR法)をゲノムDNAに対して実施し、NHEJ変異の頻度をシーケンシング(Eurofins社、Mix2seq)及びTIDE分析(https://tide.deskgen.com)によって査定した。

統計分析
p<0.05を用いた、一元配置ANOVA、二元配置ANOVA、又はマン・ホイットニーノンパラメトリック検定を、Prism 8.0ソフトウェア(GraphPad社)を使用して実施した。多重比較をボンフェローニ係数を用いて補正し、カプラン・マイヤー生存曲線をログ・ランク検定を用いて比較した。

結果
1)T細胞、とりわけCD4+ T細胞の主要な固有のチェックポイントとしてのSOCS1
インビボゲノムワイドスクリーニングは、抗原経験CD4⁺ T細胞増大の主要な非冗長なインヒビターとしてSOCS1を同定した
本発明者らは、Ag-exp CD4+トランスジェニックT細胞増殖が、進行中の免疫応答の間に阻害され、一方で同じ特異性のナイーブT細胞は効率的に増殖し得ることを以前に実証した(Helftら、2008)。Ag-exp CD4⁺ T細胞の増殖を制御する阻害メカニズムを解明するために、彼らは、A^b:Dby特異的マリリンモノクローナルCD4⁺ T細胞(TCR-Tg Rag2^-/-マリリンマウス由来(Lantzら、2000))を使用した。C57BL/6宿主へのナイーブCD45.2マリリンCD4⁺ T細胞の静脈内(i.v.)養子移入の後、彼らは、足蹠に、Dbyペプチドをロードした樹状細胞(DC)を注射することによって免疫応答を始動した(図1A)。そのような進行中の免疫応答に新たに導かれたAg特異的CD4⁺ T細胞の運命を追跡調査するために、彼らは、プライムされたマリリン細胞の第1のコホートを1週間増大させ、その後、ナイーブ又はインビトロ活性化CD45.1マリリンCD4+ T細胞(Ag-exp)の第2のコホートをi.v.注射した(Helftら、2008)。このモノクローナルリコール応答において、インビトロでプライムされたAg-exp CD45.1マリリンCD4+ T細胞は、ナイーブCD45.1マリリンT細胞と比較して、増殖及びIL-2を産生する能力の低下を呈する(図1B～図1D)。このモデルは、免疫応答の間のインビボにおけるそれらの運命を分析する前に、Ag-exp CD4+ T細胞を遺伝子操作する可能性を広げる。

CD4+ T細胞免疫応答の固有の負の調節因子を同定するために、彼らは、その不活性化が、免疫応答の間のAg-exp CD4+ T細胞の増殖を回復させるであろう遺伝子を探求するポジティブゲノムワイドCRISPRスクリーニングを実施した。彼らは、インビトロで作出されたAg-expマリリン-R26-Cas9(Cas9)T細胞に、ゲノムワイドノックアウト(GWKO)sgRNAレンチウイルスライブラリー(18400種の遺伝子、90K sgRNA)を形質導入し(Tzelepisら、2016)、20～25%の効率(BFP+)114を達成した(図1E)。ピューロマイシン選択の後、形質導入されたT細胞の40%が生存し、75%の単独感染率を示した(Chenら、2015)。養子宿主への注射の前に、モック及びライブラリー形質導入Ag-expマリリン-Cas9 T細胞は、セントラルメモリー表現型(CD62L+CD44+)を呈し、それらがdLNに同様にホーミングすることを可能にした(図1E)。形質導入されたマリリンCas9 T細胞におけるsgRNAの分析は、sgRNAの0.5%未満が、元のプラスミドライブラリーと比較して低く表されることを明らかにした(図1F)。彼らは、C57BL/6マウスあたり12×10⁶個のAg-expライブラリー形質導入又はモック形質導入マリリン-Cas9 T細胞を用いて、2回の独立したGWKOプール化スクリーニングを行った(図1A)。移入及びプライミングの7日後、モック形質導入マリリン-Cas9細胞増殖は消滅した。しかしながら、ライブラリー形質導入マリリン-Cas9細胞の増殖は、モック形質導入マリリン-Cas9細胞の比と比較して、CFSE^loサブセットにおけるBFP⁺/BFP^-のより高い比によって示されるように有意に回復し、一部のsgRNAによる増殖遮断の解放を示した(図1G)。

第1のコホートの非存在下において、ライブラリー形質導入マリリン細胞は、ある程度増大し、効率的なプライミングを立証した(図1G)。CD45.1マリリン-Cas9 T細胞のCFSEベースの細胞選別の後、CFSE^loサブセットにおいて富化された増幅されたsgRNA配列を、非***T細胞(CFSE^hi)からのsgRNAと比較した。CFSE^loサブセットにおいて表されたほんのわずかのsgRNAは、インビボ選択の有効性を立証する。2回の独立したスクリーニングからのCFSE^loサブセットにおいて富化された個々のsgRNAの分析は、インビボにおけるAg-exp CD4⁺ T細胞の増殖の回復に関わる主要な遺伝子としてSocs1を同定し(p<1.10^-6、誤発見率(FDR)<1%)(図1H)、一方で他のより低いランク付けの標的はFDR>0.5を表した。興味深いことに、Socs1 sgRNAは、CFSE^hiサブセットと比較して、単独で注射されたライブラリー形質導入マリリン細胞のCFSE^loサブセットにおいても有意に富化され、これは、互いを阻害するAg-exp CD4⁺ T細胞の能力と整合している。全体として、これらのデータは、T細胞生物学、特にまだ探索されていないCD4⁺ T細胞における、SOCS1の非冗長で且つ重大な役割を支持する。

本発明者らは、次に、2種の異なるCD4⁺ TCR-Tgモデルであるマリリン及びOT2細胞(後者は、MHC-II拘束オボアルブミンペプチドに特異的なTCRを発現する)において、個々のsgRNA Cas9リボ核タンパク質複合体(RNP)のエレクトロポレーションを使用して(Seki及びRutz、2018)、Ag-exp CD4⁺T細胞増殖に対するSOCS1不活性化の影響を査定した。

簡潔には、インビトロでプライムされたCD4⁺ TCR-Tg細胞にRNPをエレクトロポレーションした。2.10⁶個のナイーブ、Ag-expモック、又はAg-exp sgSOCS1 CD4⁺ T細胞をCFSE142標識し、その後、進行中の免疫応答の間にC57BL/6マウスに二次応答因子として注射した。両モデルにおいて、大きなナイーブCD4+ T細胞増大は、効率的なプライミングを示し、一方でSocs1遺伝子不活性化は、モックAg-exp CD4⁺ T細胞増殖において観察されるブレーキをかけた(図1I)。これらの結果は、進行中の免疫応答の間のAg-exp CD4+ T細胞停止に関与する主要な固有の調節因子としてのSOCS1の役割を明らかにする。とりわけ、本発明者らは、インビボにおけるマリリン及びOT2細胞移入の後にいかなるTreg転換も観察せず、別の報告(Akkayaら、2019)において示唆されたものに反して、Ag特異的Tregが、彼らのモデルにおいては関わらないことを示唆した。

SOCS1は、CD4⁺ T細胞機能を活発に阻害する複数のサイトカインシグナルを統合する重大なノードである
CD4⁺ T細胞のSOCS1媒介性阻害をメカニズム的に特徴付けするために、本発明者らは、潜在的誘導因子を探し、その後、Ag-exp CD4⁺ T細胞に対するSocs1不活性化の機能的結果を査定した。マウス脾細胞におけるSOCS1発現は、種々のスケジュール及び強度を用いたサイトカイン及びTCR刺激の両方によって誘導される(Sukka-Ganesh及びLarkin、2016)。SOCS1の基底レベルは未処理T細胞に存在するが、サイトカイン刺激に応答したSOCS1タンパク質レベルの増加は迅速に起こり(6時間)、一方でその最大発現は、TCR刺激の48時間後に生じる(Sukka-Ganesh及びLarkin、2016)。これは、プライミングの2日後にインビボで開始する、彼らのモデルにおける阻害の時間枠と一致している(Helftら、2008)。これらの結果は、サイトカインの存在下におけるTCR関与が、Ag-exp CD4⁺ T細胞におけるSOCS1誘導の理由であり得ることを示唆する。

サイトカインシグナル伝達に対する差次的感受性が、ナイーブ及び抗原経験細胞の間の選択的阻害活性を説明し得るかどうかを査定するために、本発明者らは、進行中の免疫応答の間の、選別された増殖性(*)及び阻害されたサブセット(**)の間のサイトカイン受容体の転写発現を比較した(図2A)。彼らは、CFSE^lo細胞と比較して、CFSE^hi細胞においてIl2ra(CD25とも呼ばれる、タンパク質レベルで確認された)、Ifngr1、及びIfngr2の発現の有意な増加を観察した(図2B)。阻害された細胞とサイトカイン受容体の発現との間のこの相関関係は、タンパク質レベルで確認された。更に、ナイーブ及びAg-exp CD4⁺ T細胞はIL-2を分泌し、一方でAg-expマリリンCD4⁺ T細胞のみがIL-2及びIFN-γの両方を産生した。

SOCS1はIFN-γシグナル伝達の公知の調節因子であることから(Alexanderら、1999)、彼らは、進行中の免疫応答の間のAg-exp IFN-γR^-/-マリリン細胞の増殖を評価したが、受容体の非存在は、インビボにおけるこれらの細胞の増大をわずかに回復させた(図2C)。SOCS1は、T細胞においてIL-2によっても誘導され得、IL-2Rβと結び付いて(Liauら、2018)IL-2誘導性Stat5機能を強力に阻害する(Sporriら、2001)。インビボにおけるAg-exp CD4⁺ T細胞のAg再刺激と付随してブロッキング抗体を使用して、本発明者らは、次いで、この阻害における単独での及び組み合わせでのIL-2及びIFN-γの役割を査定した。IL-2RへのIL-2の結合を阻害する抗マウスIL-2Rbを使用したIL-2シグナル伝達の遮断は、Ag-exp CD4⁺ T細胞の損なわれた増殖を逆転させなかった(図2D)。しかしながら、IL-2及びIFN-γシグナル伝達の両方の遮断(抗IFN-γRα及びAg-exp IFNγ-R^-/-マリリンTを使用した)は、再刺激されたAg-expマリリンT細胞の増大を有意にレスキューした(図2D)。

このことは、Ag-exp CD4⁺ T細胞増大を損なわせる、SOCS1の上流にある2種のサイトカイン受容体の間の冗長性を示している。

次いで、本発明者らは、早期活性化マーカーCD69、後期活性化マーカーCD25、及びT細胞受容体応答性転写因子インターフェロン調節因子4(IRF4)の発現によって反映される、Ag-exp CD4⁺ T細胞TCR誘導性活性化に対するSocs1欠失の機能的結果を推定した(図2E)。滴定されたペプチドパルスDCを用いた一晩の刺激の後、Ag-exp Socs1不活性化マリリン及びOT2細胞の両方は、モック処理細胞と比較して、Ag刺激に対する同様の感受性(最大応答の50%につながるAg用量)を呈した。しかしながら、本発明者らは、より高いAg用量で、CD25及びIRF4発現の顕著な増加を、上昇した「プラトー」とともに観察した(図2E)。このことは、SOCS1が、同族ペプチド刺激によって誘導される近位シグナルを直接調節するのではなく、むしろ下流シグナル伝達事象を阻害することを示唆する。このことは、培地におけるIL-2及びIFN-γの分泌に関係した、負のフィードバックループの解放を示唆するであろう。

IRF4は、CD4+ T細胞におけるTh1サイトカイン分泌の中心的な調節因子であることから(Mahnkeら、2016;Wuら、2017)、彼らは、多機能性を呈するSocs1不活性化CD4⁺ T細胞の能力を評価した。Socs1不活性化マリリン及びOT2細胞は、再刺激の後に、Th1多サイトカイン(IFN-γ、TNFα、及びIL-2)産生のより高いパーセンテージを呈した(図2F)。故に、いくつかのサイトカインシグナルを統合することによって、SOCS1は、Ag-exp CD4⁺ T細胞の多機能性を活発に妨害する。

これらの知見は、SOCS1が、いくつかの入力からのシグナル(IFN-γ及びIL2)を受けて、複数のシグナル伝達出力を妨げ得るノードであり、増殖性及びエフェクター機能の遮断につながることを示している。

腫瘍反応性マリリンCD4⁺ T細胞におけるSocs1不活性化は、雄膀胱MB49腫瘍の拒絶を増強する多機能的細胞傷害性表現型を誘導する
Socs1不活性化Ag経験CD4⁺ T細胞の機能が回復したことから、本発明者ら、養子移入された抗腫瘍CD4⁺ T細胞に対するSocs1欠失の治療的潜在性を評価した。本発明者らは、雌C57BL/6マウスにDby(HY)発現MB49雄膀胱癌腫細胞を負荷し、10日後に、モック又はsgSOCS1 Ag-expマリリン細胞を静脈内に移入した(図3A)。

マリリン細胞移入の非存在下において、免疫原性であるがそれにもかかわらず侵襲性のMB49腫瘍は、内因性免疫応答によってスムーズに成長した(図3B、図3C)。モックAg-expマリリン細胞の移入は、MB49腫瘍のCD8⁺ T細胞及びNK細胞依存的拒絶につながった(図3B、図3C)。しかしながら、Ag-exp sgSOCS1マリリンCD4⁺ T細胞の移入は、抗体を用いた枯渇の後に部分的に維持される腫瘍拒絶を誘導した(図3B、図3C)。

マリリンsgSOCS1 T細胞が、ACTにおけるヘルパー又は「独立型の」エフェクターであるかどうかを判定するために、研究者らは、7日目に、腫瘍拒絶の前の、腫瘍排出リンパ節(TdLN)における、腫瘍における、及び遠くにある無関係のLN(irr-LN)における、移入されたマリリンT細胞の数、表現型、及びトランスクリプトームを分析した。驚くべきことに、本発明者らは、Ag-exp sgSOCS1マリリンT細胞が、モックマリリン細胞よりも10倍近く効率的に腫瘍に浸潤することを観察した(図3D)。このことは、それらの増殖の支配的な停止を呈するモックマリリン細胞と比較して、TdLN浸潤における増殖性Ag-exp sgSOCS1マリリン細胞のより高いパーセンテージと関連した(図3E)。

この増殖の増加を正確に映し出して、TdLNから選別されたマリリン細胞ついてのバルクRNAseq分析は、sgSOCS1マリリン細胞における細胞周期及びDNA複製(G2Mチェックポイント、E2F転写因子、有糸***紡錘体)、並びにIL2/STAT5シグナル伝達に関わる遺伝子の上方調節を明らかにした(図3F)。この経路は、Il12rb2、Il2rb、Tbx21、Cxcr3、Cxcr5、Ifng、及びCtla2b等の分子とともに(図3G)、最近では、細胞傷害特質を有するCD4 Tヘルパー-1(Th1)細胞の分化プログラム(Kruegerら2021;Sledzinskaら2020b)及び多機能的抗腫瘍活性(Z.-C. Dingら2020)への関与が示唆されている。Ag-exp sgSOCS1マリリンT細胞におけるタンパク質発現の点検は、TdLNにおけるTh1サイトカインの発現によって強調される多機能性の増加、及び腫瘍部位でグランザイムBを産生する能力を裏付けた(図3H、図3I)。

全体として、これらのデータは、MB49腫瘍によるMHC-II分子の強い発現とともに(図3J)、ヘルパーT細胞としてのそれらの役割に加えて、Ag-exp sgSOCS1マリリンT細胞が、直接的に細胞傷害性及び殺腫瘍性であり得ることを示唆する。

故に、Socs1欠失は、マリリンCD4 T細胞がインビボでロバストな増大及び持続性を生じること、腫瘍に浸潤すること、並びにTh1細胞傷害特性を指し示す多機能的分子シグネチャーを有する抗腫瘍応答を引き出すことを可能にする(図3B、図3C、図3D、図3G、図3H、図3I)。

黒色腫腫瘍に対する養子移入に使用されたCD4⁺及びCD8⁺ T細胞の特性に対するSocs1不活性化の差次的効果
抗腫瘍応答に対するCD4⁺及び/又はCD8⁺ T細胞におけるSocs1欠失の生物学的影響を比較するために、本発明者らは、それらが、上で記載されるようにSOCS1を欠失した又は欠失していない、インビトロ活性化腫瘍特異的CD4⁺及びCD8⁺ T細胞を独立して作出した(図4A)。彼らは、それぞれMHC-II及びMHC-I拘束オボアルブミンペプチドを認識するCD90.1 OT2 CD4⁺及びCD45.1 OT1 CD8⁺ T細胞を使用し、条件付け又はサイトカイン供給なしで、腫瘍モデルとしてB16-OVA黒色腫細胞を皮下に埋め込んだ(図4A)。図3に呈示される結果と比較して、OT2細胞におけるSocs1の不活性化は、わずかな抗腫瘍効果を有した(図4B、図4C)。このことは、高度に免疫抑制性のB16黒色腫モデルの使用、又は多数の高アビディティー抗腫瘍特異的CD8⁺ T細胞の共移入のいずれかに関係し得た。

しかしながら、sgSOCS1 OT1 T細胞の養子移入の後(図4B、図4C)、本発明者らは、モックOT1 T細胞の移入と比較して、定着腫瘍の有意で且つ長続きする拒絶を観察した(p<0.001、ログ・ランク)。移入の7日後のT細胞の浸潤は、モック移入細胞と比較して、sgSOCS1 OT1及びsgSOCS1 OT2細胞の両方を受けた群に対するTdLNにおける及び腫瘍における蓄積の増加を示した(図4D)。

重要なことには、TdLNにおいて、Socs1不活性化は、完全に***したCD4+ T細胞の大きな増加を伴う、OT2 CD4⁺ T細胞増殖に対する絶大な効果を有し、一方でOT1 CD8⁺ T細胞増殖のパターンはほとんど影響を受けず、SOCS1が、増殖よりもCD8⁺ T細胞生存に影響を与えることを示唆した(図4E)。移入の60日後、sgSOCS1 OT2細胞の数は、B16-OVA負荷マウスの血中において最終的に減少し、一方でセントラルメモリーsgSOCS1 OT1細胞の集団は、依然としてモックOT1細胞よりも15倍豊富なままであった。

これらの結果は、SOCS1がAg-exp CD8+ T細胞の生存を減少させる、又はCD8⁺T細胞の長寿命サブセットの作出を阻止することを示唆する。移入の14日後に分析された腫瘍浸潤sgSOCS1 OT1細胞は、T細胞生存に関わる分子(Tnfaip3、Bcl2、Il2ra、Il2rb、Jak2)、及び細胞傷害性/エフェクター分子(Gzmb、Ifngr、Irf1、Fasl、Srgn、Tbx21)のより高いmRNAレベルを発現したことから、前者の仮説はより可能性が高い。更に、特色分析は、TNFa、IL-2、及びIFN-γ応答と関連した、腫瘍浸潤sgSOCS1 OT1細胞における経路を強調した(FDR<0.05)。興味深いことに、Socs1不活性化OT1 T細胞のGSEAは、エフェクター機能と関連した遺伝子が、疲弊に関わるものよりも多く発現されることを示す。

OT1及びOT2細胞の両方においてSocs1を標的にすることは、CD4⁺及びCD8⁺ T細胞の両方におけるエフェクター機能と関連したサイトカイン産生を保ち(図4F、図4G)、一方でGzmBはCD8⁺ T細胞において増加した(図4F)。滴定されたSIINFEKLパルスDCを用いたsgSOCS1 OT1細胞の一晩のインビトロ刺激は、Socs1不活性化後に、高い抗原用量でIFN-γ及びグランザイムB産生の増加につながり、Socs1がCD8⁺ T細胞においてこれらのサイトカインを活発に抑えることを示した。

sgSOCS1 OT2及びOT1細胞の両方の数の増加と関連した機能性の保存又は増加は、腫瘍部位におけるエフェクター細胞のはるかに高い数につながり(図4F、図4G)、Socs1不活性化T細胞のより強い抗腫瘍効果をおそらく説明した。全体として、これらの結果は、SOCS1が、インビボにおけるCD4⁺及びCD8⁺T細胞の両方の調節において固有で且つ差次的な役割を有することを示している。

SOCS1編集ヒトCD4+及びCD8+ CAR T細胞の免疫療法潜在性
ヒトT細胞養子移入に対するSOCS1の治療的潜在性を検討するために、本発明者らは、活性化されており、次いで、19BBzと称される、CD19を標的にする4-1BB共刺激性ドメインを包含するキメラ抗原受容体を形質導入されているヒト末梢血リンパ球(PBL)において、Cas9 RNPを使用してSOCS1遺伝子を不活性化した(図5A、図5B)。

CD8⁺ CAR-T細胞(CAR8)の生存を優先的に増強することが公知のこの構築物(Guedanら、2018)は、彼らが、限られたインビボ寿命を有するCD4⁺CAR-T細胞(CAR4)に対するSOCS1不活性化の影響を検討することを可能にした(Turtleら、2016;Yangら、2017b)。

急性リンパ芽球性白血病(ALL)FFLuc-BFP NALM6細胞株(NALM6)との一晩の共培養の後、sgSOCS1 CAR4及びsgSOCS1 CAR8は、2倍高い殺滅活性と整合して、3人の健常ドナーにおいて、モックCAR T細胞と比較してより高いレベルのエフェクター分子TNFα、IFN-γ、及びGzmBを産生した。

更に、本発明者らは、NALM6を注入されたNOD-scid IL2Rg^-/-(NSG)マウスにおいて、4.10⁶個のPBLモック又はsgSOCS1処理(2.10⁶個のCAR4及び2.10⁶個のCAR8細胞)を注射することによって、インビボにおけるCAR療法をモデル化した。移入の7日後、骨髄(BM)に蓄積しているsgSOCS1 CAR T細胞の数は、モックCAR T細胞のものよりも2倍高かった(図5C、図5D)。

骨髄におけるより高いT細胞浸潤及びより効率的な腫瘍制御を反映して、sgSOCS1 CAR4及びCAR8細胞のトランスクリプトームプロファイルは、活性化と関連した分子(FOS、JUND、CD69、SOCS3)、長寿命関連因子(IL7R、PIM1(Knudsonら、2017)、TCF7(Zhou及びXue、2012)、及びKLF2(Carlsonら、2006))、アポトーシスに対する抵抗性(BCL2L11(Hildemanら、2002)、NDFIP2(O'Learyら、2016))、細胞傷害性エフェクター機能の主な調節因子(GMZB、インターフェロン誘導性分子GBP5(Krappら、2016)及びIRF1、並びにキラー関連NKG7(Patilら、2018))の上方調節を証明した(図5E)。

CAR-T細胞反応速度論に関するいくつかの調査(Guedanら、2018)及びALL 患者におけるCD4/8 CAR Tサブセット分析(Turtleら、2016;Yangら、2017b)において観察されるように、CAR8は、本発明者らのモデルにおいてCAR4と比して優先的に増大した。それ故に、彼らは、移入の28日後に、sgSOCS1 CAR T細胞の持続性を調べた。モックCAR4は経時的に減衰した一方で、sgSOCS1 CAR4及びsgSOCS1 CAR8は、NSGマウスのBM及び脾臓の両方において有意に蓄積し、NALM6拒絶と相関した。最も顕著には、sgSOCS1 CAR4は、sgSOCS1 CAR8のレベルまで増大した(図5C、図5D)。従って、骨髄におけるそれらのモックCAR対応物と比較して、sgSOCS1 CAR4及びCAR8の両方は、sgSOCS1 CAR-T細胞の抗腫瘍活性と整合して(Liら、2019)、増加したレベルの、IFNG、FCRL6(Wilsonら、2007)、CTSB(Balajiら、2002)、TBX21を含めた細胞傷害性/エフェクター関連分子、並びにIL2RB、JAK3、BCL3、及びCXCL13等のSOCS1の公知の標的/生存遺伝子を発現した。

興味深いことに、本発明者らは、SOCS1不活性化CAR4及びCAR8細胞におけるサブセット特異的トランスクリプトームパターンを観察した。一方では、CAR4は、E2F標的によって表される増殖シグネチャーと関連した遺伝子(図5F)、並びにインスリン成長因子調節因子HTRA1(H. Ding及びWu 2018)及びAMPK-TORC1代謝チェックポイントNUAK1(Monteverdeら2018)等の代謝に関わる遺伝子の発現の増加を持した。他方では、CAR8は、細胞傷害性(GZMB、GZMH、TNFSF10(TRAIL)、分泌及び膜貫通1(Secreted And Transmembrane 1)SECTM1(T. Wangら2012)、キラー細胞レクチン様受容体D1 KLRD1(H. Liら2019))の増強の兆候を呈し、その一部は、フローサイトメトリー分析によって確認された(図5G、図5H)。

更に、sgSOCS1 CAR4細胞に反して、sgSOCS1 CAR8は、より低いレベルのE2F標的をインビボで発現し(図5F)、細胞周期及びDNA複製に関わる遺伝子を下方調節し、BMに見い出されるより高い数の細胞は、増殖よりも生存により関係することを示唆した(Renら2002)。

sgSOCS1 CAR細胞は、PD1⁺LAG3⁺表現型を呈し、増加したレベルの活性化を示唆したものの、28日目の及び経時的な(28日目～7日目の)sgSOCS1 CAR8の転写シグネチャーは、疲弊表現型よりもエフェクターメモリーと同様であった(Wherry及びKurachi 2015)。

sgSOCS1 CAR4に関して、GSEA分析は、有意な疲弊表現型を明らかにせず、28日目の時点で、PRDM1(Blimp1)を除いて、BATF、TOX、EOMES、又はBCL6を含めた特異的転写因子は、モックCAR4細胞と比較して上方調節されなかった(図S5J)。全体として、このことは、たとえSOCS1阻害がCAR T細胞における過剰活性化につながるとしても、疲弊の証拠がないことを示す。

この後期の時点で、SOCS1不活性化は、CAR4及びCAR8の数の増加だけでなく、より高いサイトカイン分泌及び細胞傷害活性につながった(図5G、図5H)。

腫瘍拒絶へのCAR4対CAR8 T細胞の相対的寄与、及び各サブセットにおけるSOCS1不活性化の重要性を解明するために、本発明者らは、以下の組み合わせ:モックCAR4モックCAR8、sgSOCS1 CAR4 sgSOCS1 CAR8、モックCAR4 sgSOCS1 CAR8、sgSOCS1 CAR4モックCAR8で処理されたNALM6腫瘍の生物発光をインビボで追跡調査した。

本発明者らは、CAR4モックCAR8 sgSOCS1及びCAR4 sgSOCS1 CAR8モック群において腫瘍進行の有意な遅延を見たものの、両サブセットにおけるSOCS1標的化は、腫瘍根絶を達成するために必須であった(図5J、図5K)。このことは、sgSOCS1 CAR T細胞のロバストな増大、持続性、及び機能性のどれもが、それらの最適な相乗的抗腫瘍効果を説明することを示唆する。

全体として、CAR4及びCAR8の両方におけるSOCS1欠失は、固形癌及び血液癌に対してACT治療効力を向上させるための主要な標的である。

考察
抗原応答の間のCD4⁺ T細胞増殖の調節に関わるメカニズムを探求して、本発明者らは、 TCR及びリンフォカインシグナル伝達の下流にある負のフィードバックループにつながる、非冗長なシグナル伝達ノードとしてのSOCS1を発見した。SOCS1は、インビボにおけるT細胞増殖、生存、及びエフェクター機能を活発に抑えるように見える。

SOCS1は、CD4⁺及びCD8⁺ T細胞に対する異なる阻害効果を証明した:それは、CD4⁺ T細胞増殖、生存、及び多機能性を妨げ得、一方でそれは、CD8⁺ T細胞生存及びエフェクター機能をほぼ低下させる。目下のデータは、CD4 T細胞増大に対するSocs1遺伝子不活性化の強力な効果を更に実証し、それは、CAR-T細胞組成及び効力の向上に特に関連する。

全身感染又は抗原のI.V注射によって誘導され得る同期免疫応答の場合、すべてのナイーブCD4 T細胞は同時に導かれる。しかしながら、限局性の非同期免疫応答の間、新たなナイーブ細胞及び再循環Ag経験CD4 T細胞は、LNに入り続ける。

コホートシステムは、進行中の免疫応答の間のナイーブ及びAg-exp CD4 T細胞を区別し得、それらの固有の違いを評価し得る。本発明者らの以前のデータ(Helftら2008)及び現在の仕事は、それはリコール応答の間にしばしば起こるように、ナイーブ及びAg経験CD4 T細胞の両方が存在する場合、Ag-exp CD4 T細胞は、増殖に関して不利な立場にある。

CD4 T細胞応答多様性及びポリクローン性(polyclonality)におそらく関与する、Ag-exp CD4 T細胞のこの強く且つ非常に再現性のある阻害は、Agの消失、調節性T細胞による抑止、又はAPCをめぐる応答性T細胞の間の競合に関係しない。

その代わりに、調査は、エフェクター/メモリーCD4 T細胞増殖の固有で支配的で且つ優先的な阻害につながる、直接的T-T相互作用の存在を支持した(Helftら2008)。これは、Ag-exp CD4 T細胞がTdLNにおいて互いに相互作用し、新たに到着するナイーブCD4 T細胞を使わない、S.C注射された固形腫瘍にも当てはまる。

本発明者らは、この阻害がSOCS1及びサイトカイン受容体のTCR誘導性発現に起因することを今回実証した。驚くべきことに、本発明者らは構成的CRISPR/Cas9システムを使用したことから、おそらくインビトロ成長及び生存に必要な遺伝子は見逃されたために、彼らのインビボゲノムワイドポジティブスクリーニングはSocs1を証明しただけであった。

加えて、彼らのモデルにおける、IL2及びIFN-γ経路の両方を遮断することによるAg-expマリリン細胞の増殖の回復(図2D)は、彼らのスクリーニングストラテジーによって明らかにされ得なかった、不活性化受容体の間の遺伝学的冗長性及び補償を示唆する。現在の仕事において実証されなかったものの、本発明者らは、シナプスT-T相互作用の間、高レベルのSOCS1及びサイトカイン受容体を発現するAg-exp CD4 T細胞(TCR誘発の2日後に開始する)は、「シス」で産生されるIL2/IFN-γによって、及び「トランス」でナイーブ細胞によって産生されるIL2によって阻害され、それがSOCS1を活性化するのではないかと推測した。

最後に、研究者らは、個別のアビディティー呈し且つDC-ペプチド又は腫瘍負荷等の様々なタイプの抗原刺激を使用する2種の異なるCD4⁺ T細胞モデル(マリリン及びOT2)において、SOCS1が、インビボにおけるAg-exp CD4⁺ T細胞増大の主要な固有のインヒビターであることを実証した。

全体として、このことは、すべてのCD4⁺ T細胞で効果がある、本発明の一般化可能な態様を強調する。

本発明者のデータは、サイトカイン感知が、Ag再曝露/慢性刺激の後のCD4⁺ T細胞免疫を損なわせることにおいて役割を果たすことを示唆する。

CD4⁺ T細胞のこの逆説的なサイトカイン媒介性抑止は、持続的感染の間に慢性IFN-Iシグナル伝達を遮断することがCD4⁺ T細胞依存的ウイルスクリアランスを増強する場合に、既に記載されている(Teijaroら2013;Wilsonら2013)。

SOCS1は、いわゆる活性化誘導性細胞死(AICD)に関与し得、抗原刺激の後に尚早に提供されるIL-2(Lenardo 1991)又はIFN-γ(Bernerら2007)は、CD4⁺ T細胞のアポトーシスにつながる(Majriら2018)。

それ故、著者らは、SOCS1が、Bcl2、Bcl3、Tnfaip3、Hopx等、アポトーシスに対する抵抗性に関わる遺伝子の発現を阻止することを観察した(Albrechtら2010)。

SOCS1は、ヒト及びマウスCD4⁺ T細胞の両方において、細胞周期進行の主な調節因子であるE2F標的の発現を阻害することによって、インビボにおけるCD8⁺ T細胞と比較してCD4⁺ T細胞の増殖を選択的に調節するようにも見える(J. W. Zhuら2001)。

故に、SOCS1を標的にすることは、順序を外れたリンフォカイン誘導性細胞死に対してそれらを非感受性の状態にすることによって、CD4⁺ T細胞生存及び増殖を向上させる。この現象は、サイトカイン事前曝露の後のインビボにおけるヒト及びマウスCD4⁺ T細胞の損傷に関わる、SOCSファミリーの別のメンバーであるSOCS3に関して記載されている(Sckiselら2015)。しかしながら、SOCS3発現はTh2分化系列決定(lineage commitment)と関連し、一方でSOCS1はTh1分化に関わる(Egwuaguら2002)。

SOCS1は、インビトロで、抗腫瘍免疫に必須のいくつかのサイトカインを産生するAg-exp CD4⁺ T細胞能力を負に調節することから(Dobrzanski 2013)(図2)、本発明者らは、養子移入された抗腫瘍CD4⁺ T細胞に対するSocs1欠失の影響を調べた。SOCS1を標的にすることは、インビボにおけるAg-exp CD4⁺ T細胞多機能性も増加させ、それらのリンフォカイン分泌、特にTdLNにおけるIFN-γ(図3)及び腫瘍部位におけるGZMB(図3、図5)を増強する。

故に、SOCS1に標的化されたマウス及びヒトCD4⁺T細胞の両方は、腫瘍部位における細胞傷害特質を有するTh1表現型の発現の増加を呈する(図3、図5)。

CD4⁺ T細胞によるそのような多機能的特質の取得は、IL2/STAT5/BLIMP1(Sledzinskaら2020b)及びIFN-γ/IL12/ZEB2(Kruegerら2021)を伴う2工程のモジュール式プログラムとして最近記載されている。

これらの分子は、sgSOCS1 CD4⁺ T細胞において有意に上方調節され、STAT5の構成的活性化は、多機能的抗腫瘍活性を推進するのに必須である(Z.-C. Dingら2020)。

このことは、SOCS1を欠失させることがそのような分化プログラムの誘導に関与し、それが養子CD4⁺ T細胞抗腫瘍免疫応答を向上させることを示している。

OT1 CD8 T細胞CFSEパターンに対する効果を有することなく(図4E)、KEGG経路の下方調節は、7日目のsgSOCS1 CAR8及び28日目のE2F標的/G2Mチェックポイント遺伝子における細胞周期/DNA複製と関連し(図5F)、SOCS1不活性化は、インビボにおけるCD8 T細胞のAg依存的増殖をむしろ低下させるように思われる。

従って、Ag刺激後の欠陥のある増大は、インビボにおけるSOCS1欠損CD8⁺ T細胞において以前に報告されている(Ramanathanら2010)。

しかしながら、SOCS1標的化は、TCR依存的様式で、インビトロにおけるCD8 T細胞のサイトカイン推進性(Ag非依存的)増殖をなおも強化し得(Ramanathanら2010;Shifrutら2018)、腫瘍部位に蓄積する(図4D)CD8 T細胞の生存を促進し(図5E)、それらの細胞溶解活性をロバストに増加させる(図4F、図5G)(Shifrutら2018;Weiら2019;Zhouら2014))。

最後に、本発明者らは、TCR-Tg及びCAR CD8 T細胞の両方において、SOCS1不活性化が、疲弊の有意な兆候なく、エフェクター-メモリー表現型において分化を誘導することを実証する。

インビボにおける持続性が向上しているので、SOCS1標的CD4+ T細胞は、アネルギー及びTreg変換につながり得る慢性刺激におそらく供される(Alonsoら2018)。

しかしながら、SOCS1は、Foxp3発現の維持及びインビボにおけるTreg抑止機能に必須である(Takahashiら2011;2017)。

従って、Socs1不活性化CD4⁺ T細胞は、Treg遺伝子とは対照的に、従来のT細胞マーカーの富化、並びに、後期時点で、モックCAR4と比較して、sgSOCS1 CAR4においてFOXP3及びIKZF2の遺伝子発現の減少を呈する。

全体として、著者らは、CD4⁺ T細胞においてSOCS1を標的にすることが、それらがTregに転換するのを阻止することを確認した。

CD8⁺ CAR-T細胞における、サイトカインコード遺伝子、又はJAK/STATシグナル伝達ドメインを含有する構築物の強制発現は、インビボにおけるそれらの持続性及び抗腫瘍効果を向上させ、CAR-T細胞機能に対するシグナル3(サイトカインによって媒介され、CD3シグナル伝達:シグナル1及び共刺激:シグナル2の後に始動される)の重要性を強調する(Markley及びSadelain 2010;Quintarelliら2007;Kagoyaら2018)。

ここで、本発明者らは、CAR-T細胞におけるサイトカインシグナル伝達の主要なインヒビターを不活性化することが、それらの治療的潜在性も増強し、最も重要なことにはCD4⁺及びCD8⁺ CAR-T細胞に選択的に影響を及ぼすことを実証する。

これは、効力の向上及び最適化されたCD4/CD8組成を有する、癌及びウイルス感染症に対する次世代の養子T細胞療法の設計にとって大きな関連性を有する。

本発明者らは、CD4⁺ T細胞生物学的機能におけるシグナル3調節の重要性を解明し、臨床における効力を証し得る、T細胞免疫応答の大きさ、継続期間、及び品質にとって重大である主要な細胞内チェックポイントを同定した。

2)インビボゲノムワイドCRISPRスクリーニングは、宿主免疫拒絶を逃れるための標的を同定する
インビボゲノム規模(18400種の遺伝子)CRISPRプール化スクリーニングは、MHC不一致宿主におけるT細胞生存を可能にする非冗長な標的としてFas及びB2mを同定する
次世代ATCT¹の設計の大きな臨床的必要性に応えるために、本発明者らは、同種細胞死に対するT細胞抵抗性を可能にする因子を同定するためにゲノム規模(GS)CRISPRスクリーニングを開発した。

本発明者らは、完全にMHC不一致なBALB/cマウス(H2-Kd)に活性化マリリンCD4 T細胞(C57BL6、H2-Kb)を移入することによって同種拒絶のスクリーニング条件を設定し、注射の4日後に既に、ドナーT細胞のほとんどが脾臓から拒絶されたことを実証し(図6A、図6B)、彼らが標的ウィンドウを用いてスクリーニングを実施することを可能にした。

初代T細胞におけるCas9の送達課題を克服するために、本発明者らは、まず、Rosa26-Cas9ノックインマウス(Cas9広域発現及びeGFP)(41)を、CD45.1/1マリリン(CD4)抗Dby TCRトランスジェニック(42)TCRトランスジェニックRag2^-/-マウスと交配させた。

T細胞のゲノムワイドな遺伝学的不活性化を、18,400種のマウス遺伝子を標的にする90°230 sgRNAからなるMouse Improved Genome-wide Knockout CRISPR lentiviral Library v2(Addgene社 #67988、BFPレポーター)を使用して、特異的単一ガイドRNA(sgRNA)の組み込みにより達成した(図6C)。

この革新的手法は、インビボで機能的に非冗長な、T細胞固有の限定因子の迅速で系統的で且つ先入観のない同定を可能にする(Dongら2019;Weiら2019)。

完全にMHC不一致なBALB/cマウス(H-2K^d)に10⁷個のモック又はライブラリー変異CD45.1マリリンT細胞(C57BL6、H2-Kb)を移入することによって、本発明者らは、ライブラリー変異マリリンT細胞が、BALB/cマウスにおいてモックマリリンT細胞よりも有意に良好に生存し得ることを実証した(図6D、図6E)。生存しているライブラリー変異マリリンT細胞を、4日目に、収穫された脾臓から選別し、gDNAをディープシーケンシングによって分析した。

C57BL6マウス由来のsgRNAの多様性と比較した、BALB/cマウス由来のライブラリー変異CD45.1マリリンT細胞のgDNAを富化されたsgRNAについてのMAGECK分析(W. Liら2015)は、T細胞の同種拒絶の低下のための潜在的標的としてFas及びβ2mを強調した(p<10^-6、FDR<0.07)(図6F、図6G)。

検証実験に関して、本発明者らは、各マウスにおいて、モックマリリンT細胞(CD45.1/2)と比較して、Fas又はB2m不活性化T細胞(CD45.1/1)の生存を精確に制御することを可能にする、種々のコンジェニックマーカーを発現するマリリンT細胞を使用した。

増大したマリリンT細胞においてFas又はB2m遺伝子のいずれかを効率的に不活性化するために(60～70%の不活性化、データ示されず)、Cas9-リボ核タンパク質(RNP)ストラテジー(Doenchら2016)に切り替えて、著者らは、4日目の時点で、BALB/cマウス(H2-Kd)におけるFas不活性化T細胞(H2-Kb)の生存の有意な向上を実証した(図6H、図6I)。同様に、B2m不活性化マリリンT細胞は、モックマリリンT細胞と比較して、BALB/cマウスにおいてより良好に生存し、それは、本発明者らのスクリーニングストラテジーの成功及び技術的厳密性のベンチマークとなる(benchmark)(図6J、図6K)。

Fas標的化は、CD8 T細胞及びNK細胞媒介性同種拒絶の両方に対する抵抗性を向上させ、Socs1不活性化によってインビボで強化され得る
細胞性免疫拒絶は、活性化された宿主アロ反応性T及びNK細胞によって媒介されることが公知である(Elliott及びEisen 1988;Cicconeら1992;Ruggeriら2002)。

本発明者らの最初のモデル(BALB/cマウスにおけるC57BL6 T細胞)において、B2mを不活性化され且つH2-Kbを発現するマリリンT細胞は、C57BL6マウスから有効に排除され、一方でそれらは、4日目の時点でBALB/cマウスにおいて依然として生きていた(図6J、図6K)。

T細胞におけるB2m 不活性化はMHC-I分子の下方調節につながり、それは通常、NK細胞の自己喪失反応性によってそれらの破滅を誘発する(Bixら1991)。このメカニズムがC57BL6マウスにおいて効率的である場合、BALB/cマウスによって媒介される宿主細胞性拒絶は、しかしながら、大部分はアロ反応性T細胞によって媒介されるように思われる。

免疫能力のあるBALB/cマウスにおける同種拒絶に対する標的不活性化CD45.1ポリクローナルT細胞(CD4及びCD8)抵抗性における各サブセットの寄与を解明するために、本発明者らは、インビボ選択過程に付随して、NK細胞又はCD8 T細胞枯渇抗体(抗CD8a 2.43;抗アシアロGM1)のいずれかを使用した(図7A)。

抗GM1抗体を使用してBALB/cマウスからNK細胞を枯渇させた後、本発明者らは、BALB/c+IgGマウスと比較して、CD45.1 T細胞(H2-Kb)脾臓浸潤のいかなる有意な差も観察しなかった(図7B、図7C)。

しかしながら、抗CD8a抗体を使用したCD8 T細胞の枯渇は、モックCD45.1 T細胞生存をFas不活性化CD45.1 T細胞のレベルまで回復させるのに十分であった(図7B、図7C)。

全体として、このことは、BALB/cマウスにおけるFas不活性化H2-Kb T細胞の生存の増強が、アロ反応性CD8 T細胞溶解への抵抗性に起因することを実証した。

本発明者らは、Fas遺伝子の不活性化が、NK細胞及びアロT細胞による拒絶、並びにCAR T細胞同胞殺滅を阻止し得ると更に仮説を立てた。

実際には、CAR-T細胞は、トロゴサイトーシス(trogocytosis)を通じてそれらの標的抗原を活発に移動させ、それによって、同胞殺滅T細胞を促進することが最近示されている(Hamiehら2019a)。

その持続性に加えて、同種CAR T細胞療法の臨床的成功への主な態様は、生着ウィンドウの間のその力強く且つ即時の抗腫瘍応答である。

本発明者らは、活性化T細胞の非冗長な阻害性チェックポイントであるSOCS1の欠失が、CAR-T細胞増大及びエフェクター機能を向上させ得ることを以前に発見した(Del Galyら2021)(図1～図5)。

更に、SOCS1欠失CAR T細胞は、TRAIL及びFasL分子を上方調節し(図4、図5)、それは、母体免疫寛容に対して胎児栄養膜細胞によって使用される公知の逃避メカニズムである(Vacchio及びHodes 2005)。

それ故に、本発明者らは、ヒト身体の免疫特権のある部位に似た兵器化された移植片助長システムにおいて(Forresterら2008)、SOCS1及びFAS二重不活性化が、同種CAR T細胞がロバストに蓄積し、より機能的であり、且つ同胞殺滅に非感受性であることを可能にするであろうと仮説を立てた(Hamiehら2019b)。

最後に、強力なJAK/STATインヒビターであるSOCS1を標的にすることは、注入の前に、TRAC不活性化 CAR T細胞のサイトカイン依存的増殖及び生存も増加させ得た。

図7D、図7Eに示されるように、本発明者らは、コンジェニックマーカーCD45.1を発現する、C57BL6ドナーマウス由来のポリクローナルT細胞において、Fas及びSocs1遺伝子の両方を効率的に不活性化した。モック又は標的不活性化CD45.1 T細胞のIV注射の4日後、脾臓浸潤は、BALB/cマウスにおいて、Fas標的T細胞と比較して、生きたFas/Socs1不活性化T細胞の有意により高い数を明らかにした(図7G)。倍変化分析は、Fas不活性化T細胞がモックT細胞よりも10倍良好に生存し、Fas/Socs1二重不活性化が、BALB/cマウスにおいて同種T細胞の30倍増強した生存を誘導することを実証した(図7H)。

本発明者らは、OTI(H2^b)又はマリリン(H2^b)マウスのいずれかとBALB/c H2^dマウスを交配させることによって作出された注射F1 T細胞(H2^b/d)に基づく、インビボにおける半同種移入のモデルを設計した(図7I)。

このモデルにおいて、NK細胞(抗NK1.1抗体を用いた)又はCD8 T細胞(抗CD8a 2.43)のいずれかの枯渇は、モックF1 T細胞の生存を増加させ、両サブセットが、C57BL6レシピエントにおけるこの半同種移入においてアロ反応性であることを示唆した(図7J)。更に、本発明者らは、インビボ選択後のH2-Kb生T細胞と比較して、NK枯渇後の生存H2-Kd発現F1 T細胞のより高いパーセンテージを観察し、H2-Kd F1 T細胞の特異的標的化におけるNK細胞の役割を暗示した(図7K)。

以前のモデルと同様に、本発明者らは、Fas不活性化F1 T細胞が、C57BL6レシピエントにおいてモックF1 T細胞よりも良好に生存すること、及びSocs1標的化が、インビボにおける同種破滅に対するFas欠失T細胞抵抗性を強化し得ることを実証した(図7L、図7M)。

Fas及びSOCS1二重不活性化は、インビボにおける同種免疫細胞性拒絶からマウス及びヒト腫瘍反応性T細胞を保護する
主要組織適合性バリアを越えた、同定されたヒットの抗腫瘍効力を査定するために、本発明者らは、特異的腫瘍を持つ全身照射され(TBI)且つ再構成されたC57BL6レシピエントマウスへのF1マウス(H2^b/d)由来のTCR-TgドナーT細胞の移入に基づく以前に開発されたプロトコール(Boniら2008)を採用した。

条件付けレジメンを用いたこのタイプの半分一致(haploidentical)移入は、完全に不一致な宿主における本発明者らのインビボスクリーニングストラテジーよりも臨床設定に近い。

より重要なことには、それは、NSGマウスにおけるヒトCAR-T細胞を用いた機能的検証と補完的である、免疫能力のあるモデルにおける相乗的標的の長期挙動及び外生的効果を評価する可能性を与える。

OTI(H2-Kb)又はマリリン(H2-Kb)マウスをBALB/c H2-Kdマウスと交配させた後、F1世代T細胞(H2b/d)は、再構成されたC57BL6(H2^b)7Gy照射マウスにおいて最高24日間持続する能力を有すると考えられ(図8A)、B16-OVA黒色腫又は雄Dby発現膀胱腫瘍MB49の成長をそれぞれ制御すると考えられる。

F1 OT-1 T細胞(H2^b/d)をSocs1/Fasに関して効率的に不活性化し、B16-OVA腫瘍を持つ照射され且つ再構成されたC57BL6レシピエントマウスに注射した。15日目に、本発明者らは、養子移入された同種腫瘍特異的sgFas/sgSocs1 T細胞が、それらのモック対応物よりも、脾臓において10倍長く持続し(図8B)、腫瘍に100倍多く浸潤し、一方で細胞傷害能を維持する(図8C)ことを観察した。

利用可能なプロトコール(Moら2020)から適応させて、本発明者らは、急性リンパ芽球性白血病モデル(ヒトALL、NAML6-ルシフェラーゼ細胞)におけるFas及びFas/SOCS1不活性化CAR T細胞の機能を評価しており、CAR-T細胞は、同種T細胞からの免疫拒絶に抵抗し、一方で癌進行からNOD/SCID/IL2rγヌル(NSG)マウスを守るはずである(図8D)。

簡潔には、NSGマウスは、レシピエントT細胞(A2+ T細胞)のロバストな増大を促進する、前処理細胞アブレーション(cytoablation)(TBI)を受けるであろう。次いで、A2+ T細胞による非特異的同種拒絶を避けるために、HLA発現が腫瘍細胞から欠失され(NALM6-ルシフェラーゼ細胞におけるB2M 不活性化、Naml6 sgB2m)、ドナーCAR-T細胞(A2-)は、A2+ T細胞の破滅を阻止するためにTCR不活性化されるであろう。

健常ドナー由来のCD4及びCD8 T細胞にCD19 CAR bbz構築物を効率的に形質導入した後(図8E)、sgRNA及びHIFI Cas9を用いたエレクトロポレーションの後に、細胞をTRAC、FAS、及びSOCS1不活性化に供した(図8E、図8F、図8G)。

A2-CAR-T細胞注射の15日後のNSGマウスの骨髄浸潤は、A2+ T細胞の生着及び持続性、CAR-T細胞で処理されたすべての群における白血病根絶、並びにFAS不活性化並びにFAS/SOCS1不活性化A2-CAR T細胞の生存の増加を明らかにした(図8H、図8I、図8J、図8K)。

このデータは、FAS及びFAS/SOCS1標的化の両方が、同種レシピエントT細胞の存在下でCAR-T細胞の持続性を増強し、一方で抗腫瘍活性を保持することを示している。

(参考文献)

Claims

SOCS-1に欠陥がある、操作された免疫細胞。
少なくとも1種の付加的なタンパク質、特にFAS、Suv39h1、及び/又はβ2mに更に欠陥があり、任意選択で、少なくともSOCS1及びFASに欠陥がある、請求項1に記載の操作された免疫細胞。
標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体を更に含む、請求項1又は2に記載の操作された免疫細胞。
T細胞又はNK細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
CD4+又はCD8+ T細胞である、請求項1から4のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
対象から単離されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
対象は癌に罹患している又は癌に罹患するリスクがある、請求項6に記載の操作された免疫細胞。
前記操作された免疫細胞におけるSOCS-1、SOCS1及びFAS、SOCS-1及びSuv39h1、又はSOCS1、Suv39h1、及びFASの活性及び/又は発現は選択的に阻害又は遮断されている、請求項1から7のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
非機能的SOCS-1タンパク質をコードするSOCS-1核酸を発現し、任意選択で、非機能的Suv39h1タンパク質をコードするSuv39h1核酸、非機能的FASタンパク質をコードするFAS核酸、及び/又は非機能的β2mタンパク質をコードするβ2m核酸を更に発現する、請求項1から7のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
標的抗原は、癌細胞によって発現され且つ/又は普遍的腫瘍抗原である、請求項3から9のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
遺伝子操作された抗原受容体は、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)、又はTCRである、請求項3から10のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
遺伝子操作された抗原受容体はT細胞受容体(TCR)である、請求項2から10のいずれか一項に記載の細胞。
- 免疫細胞におけるSOCS1及び/若しくはFASの発現及び/若しくは活性を阻害する工程を含み;任意選択で、
- 免疫細胞におけるSuv39h1及び/若しくはβ2mの発現及び/若しくは活性を阻害する工程、並びに/又は
- 標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体を前記免疫細胞に任意選択で導入する工程
を含む、普遍的な遺伝子操作された免疫細胞を産生する方法。
SOCS1、FAS、Suv39h1、又はβ2m発現及び/又は活性の阻害は、細胞と、それぞれSOCS1、FAS、Suv39h1、若しくはβ2mの発現及び/若しくは活性を阻害し、且つ/又はそれぞれSOCS1、FAS、Suv39h1、若しくはB2M遺伝子を破壊する少なくとも1つの作用物質とを接触させる工程を含む、請求項13に記載の方法。
作用物質は、小分子インヒビター;抗体誘導体、アプタマー、転写若しくは翻訳を遮断する核酸分子、又は遺伝子編集剤から選択される、請求項14に記載の方法。
癌の養子細胞療法における使用のための、任意選択で癌の同種細胞療法のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、又は請求項13から15のいずれか一項に記載の方法に従って獲得された操作された免疫細胞、又は前記操作された免疫細胞を含む組成物。